使用氣溶膠化抗凝血酶治療急性肺損傷的製作方法

2023-09-17 05:42:20

專利名稱：使用氣溶膠化抗凝血酶治療急性肺損傷的製作方法
優先權要求
本申請要求USSN 60/538,678的優先權，其在2004年1月23日提交，其內容經引用併入本文。
背景技術：
在炎性肺病中，可以在氣道裡觀察到纖維蛋白。已知肺泡纖維蛋白的形成被作為急性和/或慢性肺病的檢驗標誌。在炎性病況中，因為肺部血管滲透性的增加，血漿滲出液進入氣道中。滲出血漿中的纖維蛋白原將通過表達在激活的肺泡巨噬細胞(1)和上皮細胞(2)上的組織因子被激活，這導致氣道中的血塊形成。支氣管內的纖維蛋白在肺部病理學中有幾個作用。首先，它阻塞了通氣。我們已經表明，在綿羊吸入煙和染上肺炎後，超過40％的支氣管和細支氣管被含纖維蛋白的凝塊(cast)阻塞(3)。當肺的一些部分被阻塞時，因為通氣/每錯配(ventilation/per mismatch)，氣體交換下降。如果病人被機械通氣，肺的通氣部分將被過度伸展，這是氣壓性創傷的一個原因。第二，纖維蛋白抑制表面活性劑的活性(4)。已經知道肝素霧化可有效預防氣道阻塞和隨後的急性肺損傷(5)。然而，有一篇報導提示肝素霧化對吸入煙誘導的急性肺損傷是無效的(6)。我們認為這種不一致的原因是因為肝素抗凝血能力是抗凝血酶依賴的，在其他工作中沒有恰當地考慮到抗凝血酶活性。
纖維蛋白凝塊導致氣道阻塞在吸入煙誘導的急性肺損傷(ALI)中是一個嚴重的問題。預防氣道凝塊可能對臨床效果是重要的。我們已經報導了肝素噴霧可以有效預防綿羊吸菸模型中氣道阻塞。但是，由於肝素的抗凝血性是抗凝血酶依賴的，肝素不總是有效，可以通過使用本發明的方法提高治療效果。
抗凝血酶是生理性絲氨酸蛋白酶抑制劑，不僅阻斷凝血酶而且阻斷凝血因子Xa、Ixa、XIa和XIIa。肝素將抗凝血酶的抑制反應加快了幾千倍。因此，在氣道中沒有適當水平的抗凝血酶時，氣溶膠化的肝素將不抑制纖維蛋白的形成，導致煙或者燃燒引起的肺損傷治療幾乎沒有改善。根據本發明，我們證實抗凝血酶噴霧在治療吸入煙損傷和/或燃燒誘導的損傷時更加有效和可靠，並要求保護更有效治療這些肺損傷的方法。


發明內容
本發明部分基於發現氣溶膠化抗凝血酶III(ATIII)可以有效治療肺病、例如肺炎症和損傷。已經發現在治療急性敗血性肺損傷中，較低劑量的氣溶膠化ATIII比較高劑量的靜脈注射ATIII更加有效。因此，吸入施用ATIII比靜脈施用提供更有效的肺病治療，如肺炎症和損傷。
根據本發明抗凝血酶的優選實施方案，發現專門氣溶膠化的抗凝血酶比肝素或其他藥劑是更有效防止氣道阻塞的抗凝血劑。當在吸入煙誘導ALI的綿羊模型中，測試比較氣溶膠化抗凝血劑與argatroban(一種特異性合成凝血酶抑制劑)時，發現也是如此。
抗凝血酶和argatroban噴霧都抑制氣道阻塞和減少氣體交換。除此之外，抗凝血酶似乎有抗炎症作用，這將減少肺炎症和隨後的水腫形成。
因此，一方面，本發明特徵在於治療具有肺病如肺炎症和/或損傷的對象的方法，其包括吸入施用治療有效量的ATIII。肺病可以是急性或者慢性。在一個實施方案中，肺病是急性肺損傷，例如，敗血性急性肺損傷或急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、或氣道阻塞。肺損傷和/或炎症可以是由於例如暴露於外用試劑，例如毒性劑(如肺炎假單胞菌)、煙或石棉。在另一些實施方案中，肺病可以是例如肺或胸膜瘤，間質性肺病和/或組織性胸膜炎(organizing pleuitis)。
在一個實施方案中，使用噴射氣溶膠或超音速噴霧器系統、或通過乾粉吸入系統施用ATIII。這樣的氣霧給藥系統是已知的。
在一個實施方案中，ATIII是人ATIII。ATIII可以是天然來源的，例如來自血漿，或重組生產的。血漿來源的ATIII是可商業獲得的。在一個優選實施方案中，抗凝血酶是轉基因生產的，例如，從轉基因產乳動物如奶牛、山羊、兔子、小鼠的乳汁中獲得ATIII。在美國專利號5,843,705中描述了在轉基因動物的乳汁中生產ATIII的方法，其內容經引用併入本文。
在一個優選實施方案中，向對象施用包括ATIII和藥物可接受載體的氣溶膠組合物。藥物可接受載體的實例包括水和鹽水。
在一個實施方案中，通過吸入周期性向對象施用ATIII，例如按照規律性間隔向對象施用ATIII。例如，可以在肺炎症和/或損傷發作時、然後在除此施用後固定間隔時間向對象施用氣溶膠ATIII，例如可以每1小時、2小時、3小時、4小時、6小時、一天兩次、或一天3、4、5、6次經吸入施用ATIII。給藥期間可以是超過24、48、72、96、120、144或168個小時的期間。在另一個實施方案中，根據需要向對象經吸入施用ATIII，例如在肺炎症或損傷的一個或者更多連續或者復發性症狀出現時進行ATIII給藥。
有效劑量的ATIII，例如轉基因生產的ATIII，可以是在10-300U/kg、25-125U/kg、50-100U/kg、或60-75U/kg體重之間。在另一方面，有效劑量可以超過約1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg，但是少於150mg/kg、100mg/kg、70mg/kg。
在一個優選實施方案中，治療相同的疾病，例如為了對肺炎症或損傷的一種或更多症狀有相同作用，使用氣溶膠ATIII的劑量少於靜脈注射ATIII劑量的10％、20％、30％、40％、50％、60％。
根據本發明，抗凝血酶和argatroban噴霧都抑制氣道阻塞和減少氣體交換。此外，抗凝血酶還具有額外和增強的抗炎症作用，其導致更好地減少肺炎症和隨後水腫形成。而且當抗凝血酶和argatroban一起使用來治療因為吸入煙和/或燃燒導致的肺損傷時還有協同作用。
在另一個實施方案中，本發明特徵在於治療肺損傷的藥盒。該藥盒優選包括治療有效量的氣溶膠形式的ATIII和使用說明。氣溶膠優選還包括藥物可接受的載體。藥物可接受的載體的實例包括水和鹽水。
在一個實施方案中，有效劑量的ATIII，例如，轉基因產生的ATIII，可以是在10-300U/kg、25-125U/kg、50-100U/kg、或60-75U/kg體重之間。在另一方面，有效劑量可以多於1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg，但是少於150mg/kg、100mg/kg、70mg/kg。
在一個優選實施方案中，該藥盒是用於治療急性或者慢性肺病的藥盒。優選地，肺病是急性肺損傷，例如敗血性急性肺損傷或急性呼吸窘迫症候群(ARDS)。肺損傷和/或炎症可以是由於例如暴露於外用試劑，例如毒性劑(如肺炎假單胞菌)、煙或石棉。在另一些實施方案中，肺病可以是如肺或胸膜瘤、間質性肺病和/或組織性胸膜炎。
在一個實施方案中，藥盒包括在噴射氣溶膠或超音速噴霧系統、或乾粉吸入系統中的ATIII。
在一個實施方案中，藥盒包括氣溶膠形式的人ATIII。ATIII可以是天然來源的，例如來自血漿，或重組生產的。在一個優選實施方案中，抗凝血酶III是轉基因生產的，例如從轉基因的產奶動物如奶牛、山羊、兔、小鼠的乳汁中獲得ATIII。
在下面的附圖和說明中有對本發明的一個或更多實施方案的細節。從說明和附圖、以及權利要求書中，本發明的其他特徵、目的和優點是顯而易見的。



圖1.血氣和肺功能。顯示PaO2/FiO2比率(A)和肺分流(shunt fraction)(B)的變化。空心方框表示受損的和鹽水處理對照組(n＝6)，空心菱形表示受損的和ATIII處理對照組(n＝6)，實心圓形表示受損的和argatroban處理組(n＝6)。數據表示為平均值±SE。*表示與鹽水處理組相比的差異(p＜0.05)。
圖2.氣道阻力。氣道阻力通過計算氣道壓力變化(ΔAP)進行評價。ΔAP計算如下ΔAP＝[峰值AP]-[平臺值AP]。空心方框表示受損的和鹽水處理組(n＝6)，空心菱形表示受損的和ATIII處理對照組(n＝6)，實心圓形表示受損的和argatroban處理組(n＝6)。數據表示為平均值±SE。
圖3.肺的組織病理學評分。在煙和細菌攻擊後24小時，評價在充血、水腫、炎症和出血方面的組織病理學變化。每種評分的總和計算為總組織學評分(A)。從我們的歷史數據(n＝6)表示來自假損傷組的數據。ATIII對每種組織學變量的影響，如充血(Con)、水腫(Ed)、炎症(Inf)和出血(Hem)顯示在B中。白色條代表受損和鹽水處理組(n＝6)，黑色條代表受損和ATIII處理組(n＝6)。數據表示為平均值±SE。*表示與假損傷組相比的差異(p＜0.05)。
圖4.顯微評價氣道阻塞。估算氣道阻塞百分比。在支氣管和細支氣管水平上分析數據，表示為平均值±SE。*表示與鹽水處理組相比的差異(p＜0.05)。
圖5.肺的溼/乾重比率。無血的肺溼/乾重比率計算作為肺水腫或肺水含量的指數。數據表示為平均值±SE。*表示與鹽水處理組相比的差異(p＜0.05)。
圖6.血漿中硝酸鹽和亞硝酸鹽(NOx)水平的變化。空心方框代表鹽水處理組(n＝6)；空心菱形代表ATIII處理組(n＝6)，實心圓形表示argatroban處理組(n＝6)。*表示與鹽水處理組相比的差異(p＜0.05)。
圖7顯示的是通過核移植產生克隆動物過程的一般性圖示。
具體實施例方式 以下縮寫在說明書中具有指定的含義 縮寫關鍵詞 體細胞核移植(SCNT) 核移植(NT) 合成輸卵管液(SOF) 胎牛血清(FBS) 聚合酶鏈式反應(PCR) 牛血清白蛋白(BSA) 術語解釋 牛的——各種牛物種的或與之相關的。
生物液——由生物體如哺乳動物、鳥、兩棲動物或爬行動物產生的水性溶液，它含有在水溶液中的細胞分泌的蛋白質。實例包括乳汁、尿、唾液、精液、陰道液、關節滑液、淋巴液、羊水、血液、汗液和淚液；以及由植物產生的水性溶液，包括，比如滲出液和吐出液、木質部、韌皮部、樹脂和花蜜。
生物液產生細胞——浸在生物液中並向生物液中分泌蛋白質的細胞。
生物藥物——意思是指其起源、合成或製造涉及使用微生物、重組動物(包括但不限於嵌合體或轉基因動物)、核移植、微注射或細胞培養技術的任何藥物、治療劑、疫苗或醫學有用的組合物。
山羊的——各種山羊物種的或與之相關的。
編碼——一般指以可翻譯形式存在的序列信息，通常可操作地連接至啟動子。當功能性啟動子增強序列的轉錄或表達時，該序列可操作地與啟動子連接。由於同樣的信息內容以容易接近的形式存在，特別是當與促進正義聯表達的序列連接時，反義鏈也被認為編碼該序列。使用標準或修飾的遺傳密碼可轉換該信息。
表達載體——遺傳工程改造的質粒或病毒，比如來源於噬菌體、腺病毒、逆轉錄酶病毒、痘病毒、皰疹病毒或人工染色體，其用於將可操作性連接至啟動子的ATIII蛋白質編碼序列轉移入宿主細胞中，使得編碼的重組ATIII蛋白在宿主細胞中表達。
功能蛋白質——具有生物或其他活性或用途的蛋白質，與內源性生產時可見的相似。
載波片——用於間隔固定距離的平行電極的玻璃片。細胞偶聯體放置在電極之間接受激活電流。
同源序列——指當比較時顯示相似性的遺傳序列。核酸中同源性的標準可以是本領域一般使用的同源性標準或者是雜交條件。對於核酸來說基本同源意味著，當比較時，任選地當比對時可以有適當的核苷酸插入或缺失，區段或其互補鏈具有至少約60％的殘基、通常至少約70％、更通常至少約80％、優選至少約90％、更優選至少約95至98％的核苷酸是一致的。作為替代，當區段在選擇性雜交條件下與一條鏈或其互補鏈雜交時，存在基本同源。當發生比整體缺乏特異性更有選擇性的雜交時，存在雜交選擇性。典型地，當在一段至少14個核苷酸鏈上具有至少約55％同源性時，優選至少約65％，更優選至少約75％，最優選至少約90％，將發生選擇性雜交。
先導序列或「信號序列」——編碼蛋白質分泌信號、並且當操作性連接至下遊編碼ATIII蛋白質的核酸分子時指導ATIII分泌的核酸序列。先導序列可以是天然的人ATIII先導序列，人工來源的先導序列，或者可以作為用於指導ATIII編碼序列轉錄的啟動子從相同基因獲得，或者可以從細胞正常分泌的另一種蛋白質獲得。
產乳細胞——分泌蛋白質到乳汁中的細胞(例如乳腺上皮細胞)。
乳汁特異性啟動子——天然指導分泌蛋白質到乳汁的細胞(例如乳腺上皮細胞)中基因表達的啟動子，例如，包括酪蛋白啟動子，如α-酪蛋白啟動子(如αS-1酪蛋白啟動子和αS2-酪蛋白啟動子)、β酪蛋白啟動子(如，山羊β酪蛋白基因啟動子(DiTullio，BIOTECHNOLOGY 1074-77，1992)、γ酪蛋白基因啟動子、和κ酪蛋白基因啟動子；乳清酸蛋白(WAP)啟動子(Gorton et al.，BIOTECHNOLOGY 51183-1187，1987)；β-乳球蛋白啟動子(Clark et al.，BIOTECHNOLOGY 7487-492，1989)；α-乳清蛋白啟動子(Soulier et al.，FEBS LETTS.29713，1992)。也包括在乳腺組織中特異性激活從而可用於本發明的啟動子，例如，小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)的長末端重複啟動子。
核移植——指一種克隆方法，其中核從供體細胞被移植至去核卵母細胞中。
可操作性連接——基因和一或多種調節序列以這種方式連接，當適當的分子(比如翻譯激活蛋白)結合至該調節序列上時，其允許基因表達。
綿羊的——綿羊的、與之相關或與之相似的。
單性生殖的——胚胎從未侵入精子的卵母細胞的發育。
藥物純的——表示適於確定無疑的生物學測試以及適於適當施用以治療人患者的蛋白質。基本藥物純的意味著至少約90％純的。
豬的——豬的或與之類似的。
啟動子——足以指導轉錄的最小序列。本發明中也包括足以提供啟動子依賴性基因表達的啟動子元件，這些元件可以控制細胞類型特異性、組織特異性、時間特異性表達、或可被外部信號或藥劑誘導表達；這些元件可以位於天然基因的5′端或3′端或內含子序列區域中。
蛋白質——如本文所用含義包括糖蛋白，以及具有附加物的蛋白質。這也包括保持生理功能的片段性或截短的多肽。
治療有效量——治療性分子或其片段的量，當施用於患者時，可以抑制或刺激由該分子調節的生物活性。
轉化、「轉染」、或「轉導」——將外來分子引入細胞中的任何方法。脂質體轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、顯微注射、核移植(參見例如Campbell et al.BIOL.REPROD.49933-942，1993；Campbell et al.，NATURE 385810-813，1996)，原生質體融合、磷酸鈣沉澱、轉導(如噬菌體、腺病毒、逆轉錄酶病毒或其他病毒遞送)、電穿孔、和基因槍(biolistic)轉化僅僅是本領域技術人員已知可以使用的方法中的幾種。
轉化細胞或轉染細胞——藉助重組DNA技術已經引入編碼ATIII的核酸分子的細胞(或其後代)。所述核酸分子可以穩定地整合入宿主染色體，也可以附加體形式維持。
轉基因——核酸分子的任何部分，所述核酸分子人工插入細胞或其祖先並成為由該細胞發育的動物的基因組的一部分。這樣的轉基因可以包括對該轉基因動物是部分或完全外源(即外來的)的基因，或可以代表與該動物的內源性基因具有一致性的基因。
轉基因的——細胞或其祖先中已經人工插入核酸分子的任何細胞，其中所述核酸分子已經成為從該細胞發育的動物的基因組的一部分。
轉基因生物——已經實驗轉入其他生物的遺傳材料的生物，除了其遺傳背景已經含有的遺傳信息以外，使宿主獲得轉入基因的遺傳信息。
有蹄動物——有蹄且典型食草的四足哺乳動物的或與之相關的，包括但不限於綿羊、豬、山羊、牛和馬。
載體——如本文所用表示質粒、噬菌體DNA、或其他DNA序列，其(1)能夠在宿主細胞中複製、(2)能夠轉化宿主細胞、和(3)含有適於鑑定轉化細胞的標誌物。
根據本發明，已經發現使用氣溶膠形式的ATIII可以比靜脈注射ATIII更低的劑量降低急性敗血性肺損傷。因此本發明特徵在於包括ATIII的氣溶膠製劑，以及使用這種氣溶膠形式ATIII治療具有肺病如肺損傷或炎症的對象的方法。
重組人抗凝血酶(「ATIII」)和argatroban噴霧都能在煙吸入損傷及隨後肺炎之後有效地防止氣道阻塞以及增進氣體交換。並且，ATIII降低肺炎症和隨後的水腫形成。ATIII的量少於靜脈注射的有效量。根據本文提供的數據和根據本發明的一個優選實施方案，沒有觀察到任何不利作用，包括出血傾向。因此使用氣溶膠化的ATIII噴霧是一種新的更有效的治療吸入煙的治療策略。
本文所用術語「治療」(″treat″或″treatment″)是指緩解或減少與肺病相關的一個或更多症狀。例如，肺損傷和/或炎症的症狀包括1)肺部氣體交換減少；2)肺分流減少；3)細胞外纖維蛋白沉積；4)血管通透性增加；5)脂蛋白表面活性劑沉積降低；6)組織重建；7)凝集；和/或8)肺泡張力增加。如本文所用，氣溶膠化形式ATIII有效治療肺病的量，或「治療有效量」指ATIII氣溶膠的量，當單劑或多劑量施用於對象時，可有效治癒、緩解、減輕或改善本文所述肺病對象至超過缺乏這種治療時的期望。
ATIII可以單獨給藥，例如，以乾粉製劑，或與藥物可接受載體一起。藥物可接受載體包括例如無菌水、鹽水和醇。ATIII氣溶膠藥物組合物可以進一步包括其他治療劑(例如緩解或減少肺炎症或損傷的其它藥劑)、或其他藥物輔助劑、稀釋劑等。ATIII可以例如作為與脂質體的複合物或包裹在脂質體中給藥。
對於吸入給藥，化合物可以從含有合適拋射劑如氣體如二氧化碳的加壓容器或分配器、或從噴霧器中以氣溶膠噴霧形式遞送。如本文所用，術語「氣溶膠」是指固體或液體顆粒在空氣中的分散體，顆粒大小足夠小，隨之具有低沉降速度，從而具有相對的空氣分散穩定性(參見Knight，V.，VIRAL AND MYCOPLASMALINFECTIONS OF THE RESPIRATORY TRACT.1973，Lea and Febiger，Phila.Pa.，pp.2)。
可以通過氣體壓力或超聲波實現ATIII的霧化。一般來講，噴霧器是一種可施用氣溶膠的設備。噴霧器可以是任何類型，它們的結構對於本領域技術人員來講是已知的，這些設備都是可商業獲得的。可以通過使用多種已知的霧化技術霧化含ATIII的溶液來製備本發明的氣溶膠。一種霧化系統是「wo-phase」系統，它由液體拋射劑中的活性成分的溶液或懸液組成。在加壓容器中同時存在液相和氣相，當容器的閥門打開時，釋放出含溶液或懸液的液體拋射劑。這可以生成精細的氣溶膠霧或氣溶膠溼噴霧。
有多種噴霧器可用於產生氣溶膠，包括小容量噴霧器。壓縮劑驅動的噴霧器結合噴射技術，並使用壓縮空氣或醫用氧氣產生氣溶膠。商品設備可以從以下獲得Healthdyne Technologies Inc.；Invacare Inc.；Mountain Medical Equipment Inc.；PariRespiratory Inc.；Mada Mediacal Inc.；Puritan-Bennet；Schuco Inc.；OmronHealthcare Inc.；DeVilbiss Health Care Inc；和Hospitak Inc.。超聲噴霧器，例如帶有高頻振動石英晶體的超聲型噴霧器液也可以用來遞送ATIII。
這種ATIII氣溶膠的毒性和治療效果可以通過標準的藥學方法用細胞培養或實驗動物確定，例如確定LD50(群體的50％致死的劑量)和ED50(群體的50％治療有效的劑量)。毒性和治療作用之間的劑量比率是治療指數，它可以表示為LD50/ED50。優選表現高治療指數的化合物。儘管可以使用表現毒副作用的化合物，需要仔細設計給藥系統，使這些化合物靶向受影響組織的部位，以使對未感染細胞的潛在破壞最小，從而減少副作用。
來自細胞培養實驗和動物研究的數據可以用於制定在人體上使用的劑量範圍。這些化合物的劑量優選處於包括ED50而很少或沒有毒性的循環濃度範圍內。劑量可以根據所用劑量形式和所用給藥途徑在此範圍內變化。對用於本發明方法的任何化合物，治療有效劑量可以從細胞培養實驗中做初步估計。劑量可以配製成在動物模型中實現循環血漿濃度範圍包括細胞培養中確定的IC50(也就是實現症狀的半數最大抑制的測試化合物濃度)。這樣的信息可以用來更準確地確定人身上的有用劑量。血漿水平可以測定，例如通過高效液相色譜測定。
測定ATIII劑量的其它方法包括在使用ATIII治療前測量對象的循環ATIII水平。基於循環ATIII水平，ATIII的劑量可以調節為超過初始循環水平的50％、100％、150％、250％、300％。
施用的氣溶膠製劑的量典型範圍是在約10U/kg至250U/kg體重，優選約25U/kg至175U/kg體重。
技術人員將知道，某些因素可以影響有效治療對象所需要的劑量和時間安排，包括但不限於疾病或紊亂的嚴重性、先前的治療、對象的一般健康和/或年齡、存在的其他疾病。而且，用治療有效量的蛋白質、多肽或抗體治療對象可以包括單次治療，或優選包括一系列治療。
實施例1 重組生產的ATIII溶解在鹽水中(42mg/ml)。使用母綿羊(n＝24)。48次呼吸棉花煙(＜40℃)之後，向雙肺中輸注P.aeruginosa(5×1011)。所有動物都用100％O2機械通氣(Tidal體積15ml/kg，30次呼吸/分鐘，PEEP 5cmH2O)。在損傷後2、4、8、12、16、20小時，用超聲噴霧器噴霧重組抗凝血酶(n＝6)、argatroban(n＝8)、或相同體積的生理鹽水(n＝10)。在研究期間沒有動物死亡。PaO2/FiO2比率，肺分流，組織學氣道阻塞評分都被抗凝血酶和argatroban降低。但是組織病理學變化和肺溼/乾重比率只被抗凝血酶降低，而不被argatroban降低。
材料和方法 材料 人重組抗凝血酶(ATIII)(7，8)獲贈於GTC Biotherapeutics(Framingham，MA)。Argatroban是從Daiichi Pharmaceutical Co.(Tokyo，Japan)購買的。所有其它試劑都是分析級的。
動物準備 德克薩斯大學醫學部動物保護和使用委員會(The Animal Care and UseCommittee of The University of Texas Medical Branch)批准了本草稿中報告的試驗。所有動物都按照美國生理學會和國立衛生研究院(the American Physiological Society和the National Institutes of Health)建立的準則操作。如前所述，在氟烷麻醉下手術準備24隻母綿羊用於研究(9)。測量了基線心血管數據後，綿羊接受如前所述的吸入煙和細菌輸注的組合損傷(3)。該動物模型表現了嚴重急性肺損傷以及過度的心血管反應，這模擬人的敗血性病況。
簡而言之，在棉花煙暴露(4組，每組12次呼吸，＜40℃)之後，將P.aeruginosa(5×109/kg)輸注入支氣管內。在煙吸入和細菌輸注後，動物隨機地分配到兩個治療組，ATIII噴霧組(n＝6)，argatroban-噴霧組(n＝8)，和鹽水噴霧對照組(n＝10)。在整個24小時研究期間所有動物都用100％O2機械通氣(Tidal體積12-15ml/kg，30次呼吸/分鐘，PEEP 7.5cmH2O)。Tidal體積調節到維持PaCO2正常。注入足夠體積的Ringer乳酸鹽溶液以防止血細胞比容增加。開始時，灌輸2ml/kg/h的Ringer乳酸鹽，然後我們基於血細胞比容的水平逐步調節到10ml/kg/h。鹽水處理對照組、抗凝血酶治療組、和argatroban治療組的體重(kg)分別是39.3±3.1、37.2±2.6、和36.2±1.4(沒有顯著性差異)。
治療 將重組人抗凝血酶(rhAT)溶解到蒸餾水中(250mg/30mL)。然後，ATIII溶液和60ml鹽水混合，每4個小時噴霧15ml含41.7mg ATIII的混合溶液。argatroban和鹽水混合(10mg/90ml)，每4小時噴霧15ml(含1.67mg)。對照組以相同的方式接受15ml鹽水噴霧。溶液用超聲噴霧器(Ultra-Neb99，DeVilbiss Co.，Somerset，PA)霧化，如前所示將其與氣管支氣管樹相連(10)。噴霧器得到的顆粒大小報告為小於4微米。在攻擊後一小時開始噴霧，此後每四小時一次。
血漿NO2/NO3(NOx)測量 如前所述用化學發光NO分析器(Antek，model 7020)測量血漿中NOx(氮氧化物代謝物的總量)的濃度(11)。
血液培養和凝集參數 培養動脈血來測試菌血症(Septi-check，Becton Dickinson，Sparks，MD)。在基線和3、6、12和24小時仔細從股動脈導管抽取肝素化血樣。
使用Hemochron 801型(International Technidyne Co.，Edson，NJ)在基線、損傷後12小時和24小時監測活化凝血時間。
在基線、和損傷後6小時和24小時收集檸檬酸化血漿用於抗凝血酶測試。用發色底物(S-2765，Diagnostica Stago，Parsippany，NJ)測量抗凝血酶的活性。數據表示為正常標準血漿的％。
肺組織學和免疫組織化學 由不知道動物分組情況的病理學家對來自右側低肺葉的肺切片進行組織評分(5)。實質對於充血、水腫、炎症和出血的變化根據0-4分量表分級(0正常；4嚴重)。也根據前述評價形成凝塊導致的氣道阻塞(3)。
氣道壓力 峰值和平臺期氣道壓力用呼吸機(Servo Ventilator 900C，Seimens-Elema，Sweden)監測。由於氣道峰值壓力反映了氣道阻力之和順應性的總和，而平臺期壓力主要反映了氣道順應性，我們從峰值壓力減去平臺期壓力(Δ氣道壓力)。因此，Δ氣道壓力是氣道阻力的指數。
統計學分析 用統計學軟體StatView 5.0(SAS Institute，Cary，NC)進行分析。數據表示為平均值±SEM。用重複測試方差分析(ANOVA)或帶Tuckey’s post hoc檢驗的ANOVA來比較各組之間的數據。用非成對數據的Student Newman-Keuls檢驗各個時間點處進行適當的組間比較。在組織學研究中，進行非參數Mann-Whitney U檢驗。p值＜0.05被認為有統計學顯著性。
結果 在鹽水處理組、ATIII處理組、和argatroban處理組的羧基血紅蛋白(％)的峰值水平分別是58.6±8.2、65.7±7.2、和57.5±6.1(沒有顯著性差異)，這提示所有分組幾乎接受相同量的煙吸入。在24小時研究期間沒有動物死亡。
血液培養 如方法部分在研究期間的幾個時間點仔細取冬麥血樣品用於細菌培養。在所有的基線樣品中P.aeruginosa顯陰性。在24小時研究期間，P.aeruginosa在鹽水對照組中檢測到33％(3/10)，但在ATIII和argatroban組中檢測到0％。雖然在ATIII和argatroban處理組中百分比較低，但是和鹽水處理組相比沒有統計學差異。
肺部氣體交換 在所有組受攻擊後，PaO2/FiO2(P/F)比率顯著下降。但是，在rhAT-噴霧組和argatroban-噴霧組中下降得明顯更少(圖1A)。ATIII和argatroban所致氣體交換減弱程度大約相同(圖1A)。肺分流在攻擊後顯著增加，但是在ATIII或argatroban噴霧組(圖1B)中增加明顯更少。
氣道壓力 在研究中，峰值和平臺期氣道壓力用呼吸機監測。計算氣道壓力變化(＝[峰值壓力]-[平臺期壓力])用於分析氣道阻力。氣道壓力變化在鹽水處理對照組中逐漸增加。雖然各組之間沒有統計學差異(圖2)，ATIII處理組和argatroban處理組顯示氣道壓力變化沒有增加。
肺組織病理學 在煙和細菌攻擊後24小時，在受影響綿羊的肺中有顯著的炎症反應，其特徵在於間質和氣體空間中的細胞浸潤。這些浸潤物主要由嗜中性粒細胞組成。也觀察到間質水腫、血管充血和出血。根據充血、水腫、炎症和出血的嚴重性和範圍，暴露於煙和細菌後的組織學評分顯著更高(圖3A)。我們歷史的假損傷和假處理的動物(n＝7)在所有單個組織病理學評分中表現為1.0或更小。ATIII組在充血、水腫、炎症和出血的每種評分更低，但沒有達到統計學差異。
argatroban顯示了和鹽水對照幾乎相同的評分。有意思的是，出血評分在ATIII處理組和argatroban處理組中不是都更高而是都更低。計算組織學總評分(圖3B)。由於每種充血、水腫、炎症、和出血評分為從0(正常)到4(強烈)，組織學總評分的最大值是16。在ATIII處理組中顯著更低(圖3B)。作為比較，argatroban噴霧沒有減少組織學總評分(圖3B)。歷史假損傷組(n＝7)中是3.3±0.7。
支氣管和細支氣管被嗜中性粒細胞浸潤、脫落的支氣管上皮細胞、粘液和纖維蛋白阻塞。在鹽水處理組中在支氣管和細支氣管水平上都發現超過30％截面積的氣道阻塞(圖4)。ATIII噴霧在支氣管水平顯著抑制氣道阻塞。argatroban同時在支氣管和細支氣管水平上顯著抑制阻塞(圖4)。
肺溼/乾重比 和歷史性假損傷數據(溼/幹比＝3.70±0.17，n＝7)相比，在煙吸入接著支氣管輸注細菌後24小時，肺溼/乾重比顯著增加。這種增加被ATIII噴霧顯著減弱，但沒有被argatroban顯著減弱(圖5)。
硝酸鹽/亞硝酸鹽(NOx)水平的變化 攻擊後，血漿NOx水平增加了基線水平的2-3倍。ATIII組在最初3小時顯示出類似的增加，但是在後面階段直至24小時增加顯著更少(圖6)。Argatroban似乎在6-15小時期間Nox水平較低，但它隨後達到了鹽水處理組相同的程度。在argatroban處理組與鹽水處理組之間沒有顯著的統計學差異(圖6)。
血計數和凝血參數 基線白細胞和血小板的數量在各組之間沒有差別。白細胞的數量在受損後24小時顯著減少(表1)。白細胞數的減少在ATIII組不嚴重(表1)。Argatroban不影響白細胞數的減少。血小板計數在受損後也明顯減少。ATIII沒有阻止這種減少(表1)。argatroban輕微地阻止了血小板的減少。
雖然沒有統計學差異，但是受損後在所有組中有延長激活凝血時間的趨勢(表2)。在各組之間沒有觀察到統計學差異(表2)。
討論 氣道中形成纖維蛋白已知被當作急性/慢性肺損傷的標誌(12)。在敗血性疾病中，血管通透性增加，含纖維蛋白原的血漿進入氣道，受細胞因子的刺激而表達組織因子(12)。因此，纖維蛋白原容易在氣道中凝集。在氣道中形成纖維蛋白是通過兩種方式引起肺損傷的原因。首先，它阻塞氣道部分並抑制氣體交換。其次，纖維蛋白抑制表面活性劑的活性，它是肺膨脹不全的一種因素。當給患者或者動物機械通氣時，氣道阻塞也引起呼吸機誘發的肺損傷。過度拉伸肺的通氣部分誘導趨化因子，如白細胞間介素8(13，14)。
我們已經證實肝素噴霧可以有效防止氣道阻塞和提高氣體交換(5)。我們確定肝素噴霧預防纖維蛋白凝集的形成，並減弱急性肺損傷。但是肝素的抗凝血性質是抗凝血酶依賴的。根據本發明，在實驗動物上引發煙吸入、肺損傷和肺炎，是設計用來模擬發生在人身上的相同損傷或者疾病狀態。根據該模型，測量並比較血漿抗凝血酶活性。
根據本發明的一個優選實施方案，血漿抗凝血酶活性的基線值在損傷後逐漸降低，24小時後達到約50％(15)。在燒傷或敗血症患者中報導了類似現象。在這樣的條件下，未見到肝素的作用。根據本發明的權利要求，我們證實輸注ATIII對治療肺損傷是有效的(15)。基於該靜脈內研究，已經確定更低劑量範圍的ATIII由噴霧器直接送入氣道也是有效的。這就是我們設計本研究的原因。我們也計算了施用的氣溶膠化ATIII的量(mol)，並測試了具有大致相同抗血栓能力的argatroban的作用。
抗凝血酶是主要生理抗凝血劑之一。除了抑制多種凝血因子如凝血酶、Fxa、FXIa、FXIIa和FIXa之外，抗凝血酶已知具有一些抗炎性(18)。多種動物和臨床研究表明靜脈內施用抗凝血酶有益於敗血症(19)、內毒素休克(20)、腎缺血一再灌注損傷(21)和燒傷(22)。現在考慮有兩種作用機制。第一，抗凝血酶促進環前列腺素從內皮細胞中的釋放(23)。由於環前列腺素抑制細胞因子生成、粘附分子表達和血小板凝集，抗凝血酶通過環前列腺素間接抑制炎症反應。第二，最近發現稱為syndecan-4的抗凝血酶受體(24)。當抗凝血酶結合到syndecan-4上時，它在白細胞和內皮細胞中抑制核因子kappa B的轉位並抑制炎症信號的轉導(25，26)。因此，抗凝血酶通過抑制NF-kappa B活化而直接改變炎症過程。
argatroban為抑制凝血酶活性而設計，其特異性非常高(27)。和抗凝血酶相比，argatroban是很小的分子(分子量為527Da)，直接抑制凝血酶。很少有關於argatroban消炎作用的報導。我們認為在抗凝血酶和argatroban之間的這些差異可能顯示了對吸入損傷的不同作用。在本研究中，ATIII和argatroban都相同程度地抑制煙吸入和肺炎之後的氣道阻塞。結果ATIII和argatroban都減少了肺部氣體交換。當它們一起使用的時候，它們表現出協同作用/對於氣道阻塞，argatroban在防止凝塊形成上比rhAT更加有效。由於argatroban比ATIII要小，它是非蛋白質材料，可以更好地傳送。然而，根據本發明的改進，組織病理學分析顯示ATIII改善了組織學變化，但是argatroban沒有。和此結果一致的是，ATIII噴霧提高了肺溼/乾重比，而argatroban沒有。從這些觀察中，我們能夠推測ATIII和argatroban的抗凝血能力都抑制氣道纖維蛋白的形成，並減弱氣體交換。此外，ATIII具有抗炎症性質，可以改善肺炎症和隨後的肺水腫形成。與argatroban處理組相比，ATIII處理組中白細胞計數降低的嚴重性要小，也表明ATIII能抑制炎症反應。
作為本發明的一部分，ATIII和argatroban也降低了敗血症的發病率。當氣道被阻塞時，細菌清除被中斷，封閉的非呼吸區域將是細菌生長的溫床。因此我們認為抑制氣道阻塞不僅有益於氣體交換，而且有益於預防系統性細菌轉位和敗血症。
如我們在圖6中所示那樣，氣溶膠化rhAT顯著抑制血漿NOx的增加，一氧化氮(NO)形成的指數。NO是由一氧化氮合酶(NOS)的3種異構體合成，已知內皮細胞NOS(eNOS)和神經元NOS(nNOS)是組成型NOS(cNOS)，所有時間都表達。第三種異構體被稱為誘導型NOS(iNOS)。iNOS被炎症細胞因子如組織壞死因子-α誘導。在本研究中，ATIII抑制NO的形成，特別是在後12小時的實驗中，但是未在最初12小時裡抑制其形成，提示ATIII抑制iNOS的表達。我們已經表明iNOS表達不僅僅來自肺泡巨噬細胞，而且也來自肺泡上皮細胞(28)。由於有報導說抗凝血酶抑制NFkB活化(18)，我們已經確定噴霧化ATIII抑制來自氣道上皮細胞的iNOS表達。 表I血計數變化 平均值±SE.*p＜0.05比 鹽水錶2 活化凝血時間的變化 平均值±SE(秒) *p＜0.05比 鹽水 即使ATIII總劑量是以前靜脈研究中的一半(參見Murakami(2001)AM.J.RESP.CRIT.CARE MED.163A553)，結果也比靜脈給藥更有效。沒有觀察到不利作用。因此，氣溶膠化ATIII在綿羊煙吸入和肺炎之後的敗血性急性肺損傷中是有用的。
已經描述了本發明的許多實施方案。然而，可以知道，在不脫離本發明的精神和範圍下可以進行多種修改。因此，其他實施方案也在下面的權利要求範圍內。
根據本發明用於轉基因動物的方法，通過轉染感興趣的蛋白質核酸構建體(例如，乳腺特異性轉基因，將人甲胎蛋白-β-幹擾素蛋白靶向至乳腺表達)創建適於體細胞核移植的轉基因原代細胞系(來自山羊、牛、綿羊、豬或者任何其他非人類的脊椎動物來源)。這種轉基因構建體既可以含有選擇標記(比如新黴素、卡那黴素、四環素、嘌呤黴素、zeocin、潮黴素或其他選擇標記)，也可以與能在細胞培養中表達選擇標記的盒一起轉染。
本發明提供含有本文所述核酸序列的表達載體，其可操作性連接至至少一個調節序列。許多這樣的載體已經商品化，技術人員也很容易製備其他合適的載體。「可操作性連接」或「操作性連接」意思是指核酸分子以允許宿主生物表達該核酸序列的方式連接至調節序列。調節序列是本領域已知的，可以選擇用來生產編碼的多肽或蛋白質。因此，術語「調節序列」包括啟動子、增強子、和描述於下文的其他表達調控元件Goeddel，GENE EXPRESSION TECHNOLOGYMETHODS INENZYMOLOGY 185，(Academic Press，San Diego，Calif.(1990))。例如，可以使用天然的調節序列或對轉化的宿主細胞為天然的調節序列。
應該知道表達載體的設計可以取決於這樣的因素，比如選擇待轉化的宿主細胞和/或期望表達的蛋白質類型。例如，可以通過將克隆基因或其一部分連接入適於在原核細胞、或真核細胞或同時兩者中表達的載體中，來生產本發明的多肽(ALABORATORY MANUAL，2nd Ed.，ed.Sambrook et al.(Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)Chapters 16 and 17)。
選擇期望核酸構建體的重組體菌落以後，分離並擴增細胞，根據本領域已知的方法取小份冷凍用作長期保存。可以使用標準的分子生物學方法表徵選定的轉基因細胞系(PCR、Southern印跡、FISH)。帶有核酸攜帶感興趣雙功能蛋白質的核酸構建體的細胞系然後可以作為核供體用於本領域已知的體細胞核移植操作中，其中核酸構建體具有適當的拷貝數，一般具有單整合位點(儘管相同的技術可用於多整合位點的情形)。在核移植後，將胚胎轉移至受體動物中，妊娠，從而獲得活的轉基因後代。典型地這種轉基因後代僅在特定染色體上攜帶一個轉基因整合，另外的同源染色體在相同位置不攜帶整合。因此，轉基因後代對轉基因是雜合體，滿足維持當前對至少兩個連續繁殖循環以產生純合轉基因動物的需要。
從生物液中純化ATIII蛋白質 可以使用標準蛋白質純化技術如親合層析(例如參見Ausubel et al.，CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，NY，1998；另見Lubon et al.，UNITED STATES PATENT5,831,141)或者本領域技術員已知的其它蛋白質純化方法從轉基因生物的生物液中純化本發明的ATIII蛋白質。分離之後，如果需要，ATIII蛋白可以進一步純化，例如用高效液相色譜(HPLC，例如參見Fisher，LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY ANDMOLECULAR BIOLOGY，eds.Work and Burdon，Elsevier，1980)和/或切向流過濾。純化後，ATIII蛋白質至少達到80％純度，優選90％，更優選95％，最優選99％。
動物啟動子 雖然可以使用任何分泌ATIII到乳汁中的啟動子，可用於在乳腺組織中表達ATIII的啟動子包括天然驅動乳腺特異性多肽如乳蛋白表達的啟動子。例如，這些包括天然指導乳清酸蛋白(WAP)、αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白表達的啟動子(例如參見Drohan et al.，U.S.Patent No.5,589,604；Meade et al.，U.S.Patent No.4,873,316；和Karatzas et al.，U.S.Patent No.5,780,009)，另一些在美國專利No.5,750,172中有描述。乳清酸蛋白(WAP；GenbankAccession No.X01153)，嚙齒類動物中主要的乳清蛋白，僅在妊娠晚期和哺乳期在乳腺中高水平地表達(Hobbs et al.，J.BIOL.CHEM.2573598-3605，1982)。對於期望的乳腺特異啟動子的另一些信息參見Richards et al.，J.BIOL.CHEM.256526-532，1981(α-乳清蛋白大鼠)；Campbell et al.，NUCLEIC ACIDS RES.128685-8697，1984(大鼠WAP)；Jones et al.，J.BIOL.CHEM.2607042-7050，1985(大鼠β-酪蛋白)；Yu-Lee & Rosen，J.BIOL.CHEM.25810794-10804，1983(大鼠γ-酪蛋白)；Hall，BIOCHEM.J.242735-742，1987(人α-乳清蛋白)；Stewart，NUCLEIC ACIDS RES.123895-3907，1984(牛α-s1和κ-酪蛋白cDNAs)；Gorodetsky et al.，GENE 6687-96，1988(牛β-酪蛋白)；Alexander et al.，EUR.J.BIOCHEM.178395-401，1988(牛κ-酪蛋白)；Brignon et al.，FEBS LETT.18848-55，1977(牛α-S2酪蛋白)；Jamiesonet al.，GENE 6185-90，1987，Ivanov et al.，BIOL.CHEM.Hoppe-Seyler 369425-429，1988，和Alexander et al.，NUCLEIC ACIDS RES.176739，1989(牛β-乳球蛋白)；和Vilotte et al.，BIOCHIMIE 69609-620，1987(牛α-乳清蛋白)。各種乳蛋白基因的結構和功能已經綜述於Mercier & Vilotte，J.DAIRY SCI.763079-3098，1993。如果另外的旁側序列可用於優化表達，這樣的序列可以使用已有序列作為探針進行克隆。可以使用已知的同源核苷酸序列或同源蛋白的抗體作為探針，通過篩選不同生物的文庫來獲得這些生物的乳腺特異性調節序列。
可用於將ATIII表達和分泌入乳中的信號序列是乳特異性信號序列。理想的是，信號序列選自乳特異性信號序列，也即選自編碼分泌至乳中的產物的基因。最理想的是，乳特異信號序列與上述的乳特異性啟動子相關。信號序列的大小對於本發明來說不是關鍵的。全部需要的就是序列應該有足夠分泌ATIII的大小，例如分泌在乳腺組織中。例如，編碼這些蛋白的基因的信號序列可用於本發明，酪蛋白，如α、β、γ、或κ酪蛋白，β乳球蛋白，乳清酸蛋白和乳清蛋白。也可以使用來自其他分泌蛋白的信號序列，比如肝細胞、腎細胞或胰腺細胞分泌的蛋白。
雖然可以使用將轉基因產物分泌到尿中的任何啟動子，但可用於在泌尿組織中表達重組多肽轉基因的啟動子是uroplakin和uromodulin啟動子(Kerr et al.，NAT.BIOTECHNOL.1675-79，1998；Zbikowska，et al.，BIOCHEM.J.3657-11，2002；andZbikowski et al.，TRANSGENIC RES.11425-435，2002)。
雖然可以使用將轉基因產物分泌到血液中的任何啟動子，但可用於由產血液或產血清細胞(例如肝臟上皮細胞)將ATIII表達和分泌至血液中的啟動子是白蛋白啟動子(例如參見，Shen et al.，DNA 8101-108，1989；Tan et al.，DEV.BIOL.14624-37，1991；McGrane et al.，TIBS 1740-44，1992；Jones et al.，J.BIOL.CHEM.26514684-14690，1990；and Shimada et al.，FEBS LETTERS 279198-200，1991)。
在美國專利No.6,201,167中描述了可用於在精液中表達ATIII的啟動子。有用的禽特異性啟動子是卵清蛋白啟動子和apo-B啟動子。在本領域中已知其他禽特異性啟動子。卵清蛋白啟動子可用於指導表達ATIII，然後將其沉積於卵的卵白中。apo-B啟動子也可用於指導在肝臟中表達重組多肽，在此它將最終沉積在卵黃中。禽卵是表達大量重組多肽的一種最佳載體，原因如下(1)大量蛋白質包裝到每個卵中，(2)卵容易非侵入性收集，然後保存相當長的時間，和(3)和乳汁不同，卵是無菌的，不含有細菌汙染物。特別地，對於每個卵，禽在輸卵管中產生三克清蛋白，其中卵清蛋白超過50％。另三克在肝臟中產生(血清脂蛋白)並沉積在卵黃中。此外，由於它們與哺乳動物的進化距離，禽典型地不免疫識別哺乳動物蛋白，所以在禽中表達ATIII更少可能對禽的存活和健康具有任何有害的作用。
可用於本發明中的其他啟動子包括誘導型啟動子。一般來講，在多數真核表達系統中，以組成型方式表達重組蛋白質。誘導型啟動子或增強子元件的加入對ATIII的表達提供了時間或空間上的控制，並提供了表達的一種替代性機制。誘導型啟動子包括熱休克蛋白、金屬硫蛋白和MMTV-LTR，而誘導型增強子元件包括蛻皮激素、muristerone A和四環素/強力黴素的這種元件。
Tet-On和Tet-Off基因表達系統(Clontech)是可用於本發明方法的誘導型系統的一個實例。該系統使用四環素(Tc)應答元件來維持ATIII表達在(組成型關閉，用Tc誘導)開啟的模式或(組成型開啟，用Tc或強力黴素抑制)關閉模式中。選擇標記也可以併入ATIII轉基因中，容易鑑定已經被轉化的細胞。選擇標記一般分成兩個功能類型隱性和顯性。隱性標記通常是編碼宿主細胞(缺少「標記「產物或功能的細胞)中不生成的產物的基因。屬於該類型的有胸腺嘧啶核苷激酶(TK)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶(APRT)、和次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT)的標記基因。顯性標記包括編碼提供對抑制生長化合物(抗生素，藥物)抗性和/或允許宿主細胞在代謝限制性環境中生長的產物的基因。通常使用的該類型標記包括提供對氨甲蝶呤抗性的突變體DHFR基因；黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶的gpt基因，它允許宿主細胞在含黴酚酸/黃嘌呤的培養基中生長；氨基糖苷3′-磷酸轉移酶的neo基因，其可以提供對G418、慶大黴素、卡那黴素和新黴素的抗性。
核酸載體 在一些實施方案中，本發明涉及載體，或重組體表達載體，其中包含本文所述核酸分子的任一種。載體在本文中用於擴增編碼蛋白質的DNA或RNA和/或用於表達編碼SSTR蛋白的DNA。載體包括但不局限於質粒，噬菌體，粘粒，附加體，病毒顆粒或病毒，和可整合的DNA片段(也就是可以通過同源重組整合進宿主基因組的片段)。病毒顆粒包括但不局限於腺病毒，杆狀病毒，細小病毒，皰疹病毒，痘病毒，腺相關病毒，Semliki森林病毒，痘苗病毒，逆轉錄酶病毒，微顆粒和裸DNA。在各種實施方案中，表達可以通過打靶配體靶向到特定細胞類型或細胞群體。表達載體包括但不局限性於pcDNA3(Invitrogen)和pSVL(Pharmacia Biotech)。其他表達載體包括但不局限於pSPORTTM載體，pGEMTM載體(Promega)，pPROEX載體TM(LTl，Bethesda，Md.)，BluescriptTM載體(Stratagene)，pQE.TM載體(Qiagen)，pSE420TM(Invitrogen)，和pYES2TM(Invitrogen)。表達構建體可以包含編碼蛋白質的多核苷酸，其操作性連接至內源或外源表達調控DNA序列和轉錄終止子。因為很多載體中核酸插入的空間有限，所以希望插入較小的報告基因或者報告基因構建體。例如，可以使用刪除全部或部分的生長激素抑制素受體羧基端。表達調控DNA序列一般包括啟動子、增強子、操作子(operator)和調節元件結合位點，典型地基於待使用該表達構建體的表達系統進行選擇。
啟動子和增強子序列一般根據其增加基因表達的能力選擇，而操作子序列一般根據其調節基因表達的能力選擇。本發明的表達構建體也可以包括編碼一種或多種選擇標記的序列，這些標記允許鑑定攜帶這種構建體的宿主細胞。表達構建體也可以包括促進宿主細胞中同源性重組的序列。在多種實施方案中，構建體也可以包括在宿主細胞中進行複製的必要序列。
多種示例性組織特異性啟動子列於此處(Pearse and Takor，1979；Nylen andBecker，1995)。雖然不是一個完整的清單，但是這些啟動子是可用於本發明某些實施方案的啟動子和增強子類型的示例。可用於本發明的其它啟動子，對本領域的技術員而言也是容易知道的。
誘導型啟動子包括但不局限於MT II、MMTV(小鼠乳腺腫瘤病毒)、c-jun、膠原酶、Stromelysin、鼠MX基因、GRP78基因、α-2-巨球蛋白、波形蛋白、I型MHC基因H-2kB、HSP70、多育曲菌素、腫瘤壞死因子和促甲狀腺激素-α。使用細胞特異性增強子和/或啟動子可以實現細胞或組織特異性表達(一般參見，Huber et al.，ADV.DRUG DELIVERY REVIEWS 17279-292，1995)。
表達構建體可以用來生產編碼蛋白，但也可以簡單地用來擴增編碼SSTR蛋白的多核苷酸序列。在一些實施方案中，所述載體是表達載體，其中所述多核苷酸可操作性連接至包含表達調控序列的多核苷酸。在一些實施方案中，自主複製重組表達構建體如質粒和病毒DNA載體併入多核苷酸。表達載體可以是可複製的DNA構建體，其中編碼SSTR蛋白的DNA序列可操作性連接至能實現SSTR蛋白在合適宿主中表達的合適調控序列上。當DNA區域功能性互相關聯時，它們是可操作性連接的。例如，如果啟動子能調控編碼序列的轉錄，則它可操作性連接至該編碼序列。擴增載體不要求表達調控結構域，而只需要在宿主中複製的能力，這通常由複製起點提供，和幫助識別轉化體的選擇基因。表達載體對調控序列的需求將根據選定宿主和選定的轉化方法而變化。一般來講，調控序列包括轉錄啟動子、任選的調控轉錄的操作子序列、編碼合適的mRNA核糖體結合的序列和調控轉錄與翻譯終止的序列。
在多種實施方案中，載體可以包含有被宿主生物識別的啟動子。啟動子序列可以是原核的、真核的、合成的或病毒的。合適的原核序列的實例包括λ噬菌體的啟動子(THE BACTERIOPHAGE LAMBDA，Hershey，A.D.，Ed.，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1973)；LAMBDA II，Hendrix，R.W.，Ed.，ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1980)；和Benoist et al.，The trp，recA，heat shock，and lacZ promoters of E.coli and the SV40 early promote，NATURE，290304-310，(1981)。其他的啟動子包括但不局限於小鼠乳腺腫瘤病毒、人免疫缺陷病毒的長末端重複、maloney病毒、巨細胞病毒立即早期啟動子、EpsteinBarr病毒、勞斯肉瘤病毒、人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸和人金屬硫蛋白。
載體中也可以包括其他調節序列。合適的調節序列的實例以噬菌體MS-2的複製酶基因和λ噬菌體的基因cII的Shine-Dalgarno為代表。Shine-Dalgarno序列後可以直接跟隨編碼SSTR蛋白質的DNA，導致成熟SSTR蛋白質的表達。
並且，合適的表達載體可以包括篩選轉化宿主細胞的適當標記。使用在Sambrook et al.，supra描述的以及本領域技術人員所熟知的多種技術的任一種實現選定宿主的轉化。
複製起始也可以通過構件包括外源起始的載體來提供或者由宿主細胞染色體複製機制提供。如果載體整合到宿主細胞染色體中，後者可以是足夠的。作為替代，相對於使用含病毒複製起始的載體，本領域技術人員可以通過用選擇標記和編碼SSTR蛋白的DNA共轉化的方法來轉化哺乳動物細胞。合適標記的實例是二氫葉酸還原酶或者胸苷激酶(參見美國專利No.4,399,216)。
編碼報告蛋白融合體如SSTR2蛋白質的核苷酸序列，可以根據常規技術與載體DNA重組，包括平端或粘端連接、限制性酶消化以提供合適末端、適當的填充粘性末端，鹼性磷酸酶處理以避免不期望連接、和用適當連接酶連接。這些技術公開於Sambrooket al.，supra中，並且是本領域公知的。構建哺乳動物表達載體的方法也已經公開，例如在Okayama et al.，MOL.CELL.BIOL.，3280，(1983)；Cosman et al.，MOL.IMMUNOL.，23935，(1986)；和Cosman et al.，NATURE，312768，(1984)。
轉基因構建體優選包括啟動子下遊的先導序列。當可操作性連接至編碼本發明ATIII蛋白質的下遊核酸分子時，先導序列是編碼蛋白質分泌信號的核酸序列，並指導ATIII分泌。先導序列可以從用來指導編碼ATIII核酸分子轉錄的啟動子的相同基因中得到(例如，編碼乳特異性蛋白的基因)。作為替代，可以使用編碼天然人ATIII蛋白質分泌信號(Genbank Accession No.V01514中胺基酸1-19)的先導序列。
治療應用 這裡的組合優選用於體外處理這些組織培養物。但是這種組合也可有效地用於體內應用。根據意圖使用的體內給藥方式，所用組合物可以是固體、半固體或液體劑量形式，例如片劑、丸劑、粉末、膠囊、凝膠、軟膏、液體、或懸液等。組合物優選以單位劑量形式給藥，所述單位劑量形式適於單次施用精確劑量。根據期望的劑型，組合物也可以包括藥物接受的載體或稀釋劑，所述稀釋劑被定義為通常用來配製動物或人用藥物組合物的水基載體。選擇稀釋劑使得其不影響人甲胎蛋白的生物活性。這種稀釋劑的實例是蒸餾水、生理鹽水、Ringer′s溶液、葡萄糖溶液、和Hank溶液。相同的稀釋劑可以用來重構凍幹的人甲胎蛋白。此外，藥物組合物也可以包括其他醫藥劑、藥物劑、載體、輔料、無毒、非治療性、無免疫原性穩定劑等。這些稀釋劑或載體的有效量將是可有效獲得關於組分溶解性、生物活性等的藥物可接受製劑的量。
本發明的組合物可以藉助氣溶膠化、噴霧化、肺部、胃腸道外或口腔施用以及其它系統性形式施用於人患者，用於因煙吸入和/或燒傷造成的急性肺損傷。
細菌表達 通過插入編碼期望蛋白的結構DNA序列、以及以可操作性閱讀框形式的合適的翻譯起始和終止信號和功能性啟動子，可以構建用於細菌的表達載體。載體將包含一個或更多表型選擇標記和複製起始來保證載體的維持，如果需要，也提供在宿主中擴增。雖然其他也可以作為選擇，但用於轉化的合適原核宿主包括大腸桿菌、枯草桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和假單孢菌、鏈黴菌和葡萄球菌屬的多種物種。在一個優選實施方案中，原核宿主是大腸桿菌。
細菌載體可以是，例如，基於噬菌體、質粒或者粘粒。這些載體可以包含選擇標記和細菌複製起始，它們可來自商品化質粒，其典型含有公知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)的元件。這樣的商品載體包括，例如，GEM1(Promega Biotec，Madison，Wis.，USA)、pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pKK232-8、pDR540和pRIT5(Pharmacia)。根據本發明優選的載體是THE Pt7I表達載體。
這些「骨架」部分與適當的啟動子和待表達結構序列組合。細菌啟動子包括lac、T3、T7、lambda PR或PL、trp和ara。T7是一個優選的細菌啟動子。
在轉化適當的宿主菌株並且宿主菌株生長到適當的細胞密度後，經適當方法(例如，溫度轉換或者化學誘導)去抑制/誘導選定的啟動子，繼續培養細胞一段時間。典型地，通過離心、物理或化學方法破碎來收穫細胞，所得粗提取物用於進一步純化。
真核表達 多種哺乳動物細胞培養系統也可以用來表達重組蛋白。哺乳動物表達系統的實例包括選定的小鼠L細胞，如胸苷激酶陰性(TK)和腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶-陰性(APRT)的細胞。其他實例包括Gluzman，Cell 23175(1981)描述的COS-7猴腎成纖維細胞系和能表達相容載體的其它細胞系，比如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK細胞系。特別地，對於酵母而言，可以提及酵母屬Saccharomyces、Kluyveromyces、Pichia、Schwanniomyces或Hansenula。能用於本發明的真菌中，更特別地可以提及Aspergillus ssp或Trichoderma ssp。
哺乳動物表達載體將包含複製起始、合適的啟動子和增強子，也可以包含任何必要的核糖體結合位點、多聚腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點、轉錄終止序列和5′旁側非轉錄序列。來自SV40病毒基因組的DNA序列，例如，SV40起始、早期啟動子、增強子、剪接和多聚腺苷酸化位點可以用來提供需要的非轉錄遺傳元件。
哺乳動物啟動子包括β-酪蛋白、β-乳球蛋白、乳清酸啟動子。其他包括HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆轉錄酶病毒的LTR、和小鼠金屬硫蛋白-1。哺乳動物載體的實例包括pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。在一個優選實施方案中，哺乳動物表達載體是pUCIG-MET。選擇標記包括CAT(氯黴素轉移酶)。
可用於本發明框架內的核酸序列可以用多種方法製備。一般地，它們可以通過按讀碼框組裝編碼多肽每個功能部分的序列來獲得。後者可以靠本領域技術人員的技術分離出來，例如直接從細胞信使RNA(mRNA)中分離出來，或者從互補DNA(cDNA)文庫中再次克隆，或者作為替代它們可以完全是合成的核苷酸序列。而且，可以知道，核苷酸序列也可以接著被修飾，例如，通過基因工程技術，以得到所述序列的衍生物或變體。
治療性組合物 可以根據已知的製備藥用組合物的方法來配製本發明蛋白質，由此本發明的分子或其功能性衍生物可以與藥物接受載體混合。合適的載體以及它們的配方，包括其他人蛋白如人血清白蛋白，已經描述，例如，從而形成適於有效給藥的藥物可接受組合物，這種組合物將含有有效量的一或多種本發明蛋白質以及適量的載體。
根據本發明使用的藥物組合物可以以常規方式用一或多種生理可接受載體或賦形劑配製。因此，雙功能分子及其生理可接受的鹽和溶劑化物溶劑可以配製成用於經吸入或吹入法(通過口或鼻)給藥或經口、含服、胃腸道外或直腸給藥。
對於口服給藥，例如，藥物組合物採用例如片劑或膠囊形式，它們可以經常規方法用藥物接受的賦形劑製備，如粘合劑(如預糊化玉米澱粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(如硬脂酸鎂、滑石或二氧化矽)；崩解劑(如馬鈴薯澱粉或羥乙酸澱粉鈉)；或潤溼劑(如月桂基硫酸鈉)。片劑可以用本領域公知的方法包衣。例如，口服液體製劑可以採取例如溶液、糖漿或懸液形式，或者它們可以乾產品提供，使用前再用水或其它合適載體重構。這種液體製劑可以經常規方式用藥物可接受添加劑來製備，如懸浮劑(如山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪)；乳化劑(如卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性載體(例如杏油、油酯、乙醇或分餾植物油)；和防腐劑(如對羥基苯甲酸甲基或丙基酯或山梨酸)。製劑也可以含有適當的緩衝鹽、呈味劑、著色劑和增甜劑。
口服製劑可以可以合適地配製成控制釋放活性化合物。對於含服給藥，組合物可以採取經常規方式配製的片劑或錠劑形式。
對於吸入給藥，根據本發明使用的雙功能分子可以方便地使用適當拋射劑(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體)從加壓包裝或噴霧器中以氣溶膠噴霧形式遞送。對於壓力氣溶膠，劑量單位可以由提供計量定量的閥確定。膠囊和藥筒(cartridges)，如由明膠製成用於吸入器或吹入器的，可以配製成含所述化合物和合適的粉末基如乳糖或澱粉的粉末混合物。
本發明的雙功能蛋白質可以配製成用於經注射進行胃腸道外給藥，如用推注或連續輸注。注射製劑可以含外加防腐劑的單位劑量形式提供，如在安瓿或多劑量容器中。組合物可以採用油或水載體的懸劑、溶液或乳液形式，可以含有劑型助劑，如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。做為替代，活性組分可以是粉末形式，使用前用合適載體如無菌無熱原水重構。
這些化合物也可以配製成直腸組合物，如栓劑或保留灌腸劑，例如含有常規栓劑基質如可可脂或其他甘油酯。
除了前面描述的劑型外，雙功能分子也可以配製成貯庫(depot)製劑。這種長效作用製劑可以經植入(如皮下或肌肉)或經肌肉注射給藥。因此，例如，化合物可以與適當聚合物或疏水材料(例如作為可接受油中的乳液)或離子交換樹脂一起配製，或配製成微溶性衍生物，如微溶性鹽。
如果需要，組合物可以在包或分配器中提供，其可以含有一或更多含活性成分的單位劑量形式。所述包例如可以含有金屬或塑料箔，如氣泡包。所述包或分配器可以附帶使用說明。
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權利要求
1.治療對象中急性肺損傷的方法，包括
吸入施用治療有效量的抗凝血酶III，從而治療肺損傷。
2.權利要求1的方法，其中肺損傷是敗血性急性肺損傷。
3.權利要求1的方法，其中肺損傷是急性呼吸窘迫症候群(ARDS)。
4.權利要求1的方法，其中肺損傷士是對暴露於毒性劑的應答。
5.權利要求1的方法，其中毒性劑是肺炎假單胞菌。
6.權利要求1的方法，其中肺損傷是對一或多次煙和石棉的應答。
7.權利要求1的方法，其中抗凝血酶III用超聲霧化器給藥。
8.權利要求1的方法，其中抗凝血酶III是血漿來源的抗凝血酶III。
9.權利要求1的方法，其中抗凝血酶III是重組生產的抗凝血酶III。
10.權利要求9的方法，其中重組生產的抗凝血酶III是轉基因生產的抗凝血酶III。
11.權利要求1的方法，其中向對象施用超過一個劑量的抗凝血酶III。
12.權利要求1的方法，其中抗凝血酶III以約10-300U/kg體重的劑量給藥。
13.權利要求1的方法，其中抗凝血酶III以約25-125U/kg體重的劑量給藥。
14.權利要求1的方法，其中肺損傷用ATIII和argatroban一起治療。
15.權利要求1的方法，其中治療的肺損傷由煙吸入引起。
16.權利要求1的方法，其中肺損傷由對肺的燒傷引起。
17.用含有蛋白質的組合物治療人急性肺損傷的方法，所述蛋白質由包含ATIII的轉基因DNA構建體編碼。
18.用含有蛋白質的組合物治療人急性肺損傷的方法，所述蛋白質由包含ATIII的轉基因DNA構建體編碼，改進包括用所述蛋白質的基本藥物純的組合物以及有效量argatroban治療患者。
全文摘要
本發明特徵在於通過經肺遞送施用抗凝血酶III治療具有肺疾病如肺炎症和損傷的對象。
文檔編號A61K38/48GK1946419SQ20058000816
公開日2007年4月11日 申請日期2005年1月14日 優先權日2004年1月23日
發明者村上和紀, 佩倫雷·恩赫巴塔, 羅伯特·A·科克斯, 哈爾·A·霍金斯, 莉蓮·D·特拉伯, 丹尼爾·L·特拉伯 申請人:Gtc生物治療有限公司