同步去除腐植酸和菌體蛋白的總dna提取方法及試劑盒的製作方法
2023-09-17 01:49:25 1
同步去除腐植酸和菌體蛋白的總dna提取方法及試劑盒的製作方法
【專利摘要】同步去除腐植酸和菌體蛋白的總DNA提取方法及試劑盒，涉及土壤微生物及普通微生物學中宏基因組學的研究領域。方法：1）用腐植酸復溶液混懸樣品，得到沉澱；2）加入提取緩衝液和蛋白酶K，離心後得到上清液；3）加入混凝劑，混凝沉澱殘留的腐植酸和菌體蛋白，離心得到上清液；4）加入異丙醇沉澱DNA；5）加入70%乙醇洗滌沉澱，吹淨殘存的乙醇；6）加入DNA溶解液（TE）溶解沉澱得樣品總DNA。試劑盒組份：腐植酸復溶液；PBS緩衝液為；提取緩衝液；蛋白酶K；20%SDS水溶液；混凝劑；DNA洗滌劑：70%乙醇；DNA溶解液。採用本發明的方法並使用該試劑盒一次提取的總DNA量足以進行幾十次的PCR擴增。
【專利說明】同步去除腐植酸和菌體蛋白的總DNA提取方法及試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及土壤微生物及普通微生物學中宏基因組學的研究領域，具體來說就是一種簡單快速提取土壤微生物(也包括普通微生物)總DNA的方法。
【背景技術】
[0002]為了揭示不同生態系統中的微生物菌群結構、種類和分布的差異及特點，16SrRNA基因序列分析手段已被廣泛採用。這就要求首先能獲得合格的樣品微生物總DNA。土壤作為生態系統的一個主要組成部分，土壤微生物菌群分析就顯得尤為重要，雖然一般環境中的微生物總DNA還比較容易提取，但是土壤微生物總DNA的提取受到各種土壤成份的影響，特別是腐植酸的影響就比較難於進行了，好在現在有了很多相應的處理措施，有了各種土壤微生物總DNA提取方法或試劑盒，但是它們總有這樣或那樣的不足，如方便性、簡單性、經濟性等等的不足。自來水廠去除原水中的腐殖酸的方法主要是通過加入微量的聚氯化鋁來進行混凝沉澱去除，效果很好。受其啟發本發明成功地將其引用到了土壤總DNA的提取之中。聚氯化鋁是一種多羥基，多核絡合體的陽離子型無機高分子絮凝劑，在水解過程中伴隨電化學，凝聚，吸附和沉澱等物理變化，而達到水體淨化目的，在本發明的提取方法中雖然其混凝沉澱腐殖酸和菌體蛋白的同時也會損失一部分總DNA，但是與腐殖酸和蛋白的快速高效去除目的來比這種DNA的損失是可以接受的，而且剩下的總DNA量足以進行幾十次PCR擴增，能達到16SrRNA的序列分析和系統分類的目的。
【發明內容】
[0003]本發明提供同步去除腐植酸和菌體蛋白的總DNA提取方法及試劑盒，本發明採用本發明的方法並使用該試劑盒一次提取的總DNA量足以進行幾十次的PCR擴增。
[0004]本發明首次使用了水處理劑一聚氯化鋁，在提取步驟的下遊最大限度地混凝沉澱除去了殘存的腐植酸，同時也除去了殘留的蛋白，集除腐植酸和除蛋白作用於一體，DNA得到高效純化。
[0005]本發明採用如下技術方案:同步去除腐植酸和菌體蛋白的總DNA提取方法，包括以下步驟:
1)、用腐植酸復溶液混懸樣品使得樣品中的腐植酸鹽重新溶解而被洗去，得到沉澱，再用PBS緩衝液洗去殘留的腐植酸和腐植酸復溶液，取其沉澱；
2)、向上述步驟I)沉澱中加入提取緩衝液和蛋白酶K，經酶解、SDS裂解和90°C高溫裂解，即3步裂解菌體法而釋放出微生物總DNA，離心後得到上清液；
3)、向上述步驟2)上清液加入混凝劑，混凝沉澱殘留的腐植酸和菌體蛋白，離心得到上清液；
4)、向上述步驟3)上清液加入異丙醇沉澱DNA；
5)、向上述步驟4)沉澱加入70%乙醇洗滌沉澱，吹淨殘存的乙醇；
6)、向上述步驟5)沉澱加入DNA溶解液(TE)溶解沉澱得樣品總DNA。[0006]所述步驟I)中第一步先使用腐植酸復溶液溶解去除樣品中的腐植酸，第二步再用PBS緩衝液洗去殘留的腐植酸和腐植酸復溶液。
[0007]所述腐植酸復溶液為:100 mmol/L焦磷酸鈉(Na4P2O7 )、20 mmol/L EDTA _2Na和150 mmol/L NaCl,pH9_10。
[0008]所述步驟2)中細胞裂解是三步疊加裂解法，即37°C蛋白酶K酶解30min、65°C SDS裂解30min和90°C熱裂解2min。
[0009]所述步驟3)中使用的混凝劑為聚氯化招(Poly aluminum Chloride)代號PAC,化學分子式為 AL2 (OH) nCL6_nm.(式中，I ^ n ^ 5, m ^ 10)。
[0010]所述步驟3)中使用的聚氯化鋁也可用於普通樣品微生物總DNA的提取(用於PCR擴增)，取代了有毒的苯酚和氯仿達到了一步除蛋白的目的。
[0011]所使用的聚氯化鋁終濃度為0.13%--0.15% (以Al2O3質量含量為計量)。
[0012]同步去除腐植酸和菌體蛋白的總DNA試劑盒，包括如下組份:
1)、腐植酸復溶液:100mmol/L 焦磷酸鈉(Na4P2O7 )、20 mmol/L EDTA _2Na 和 150mmol /T, NaCl, pH9_10 ；
2),PBS緩衝液為:140mmol/L NaCl,2.7mmol/L KCl, 7.3mmol/L Na2HPO4 和 1.5mmol/L KH2PO4，pH 7.0—7.4 ；
3)、提取緩衝液:100mmol / L Tris -HCl ( pH 8.0) , 100 mmol /L EDTA _2Na (pH 8.0)，100 mmol/ L 磷酸鈉緩衝液(pH 8.0) , 1.5 mol/ L NaCl 溶液，10 g/ LCTAB溶液；
4)、蛋白酶K (20 mg/mL)`；
5)、20%SDS水溶液；
6)、混凝劑:2%聚氯化鋁(以A1203含量為計量)；
7)、DNA洗滌劑:70%乙醇；
8)、DNA溶解液:10 mmol / L Tris -HCl ( pH 8.0)和 lmmol /L EDTA _2Na ( pH
8.0)。
[0013]本發明的技術效果:運用本發明方法所組建的提取試劑盒可在150min之內完成土樣的總DNA提取，所提DNA的量可供幾十次的PCR擴增要求，整個提取過程只需6步，每個樣只需更換2個離心管，而且不用苯酚氯仿，成本低廉。對於不含腐植酸的樣品，側不需第一步的洗滌，這時的混凝劑僅起到代替苯酚氯仿去除菌體蛋白的作用。可以說這是一種快速、安全、經濟的DNA提取方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為應用本發明提取試劑盒提取的9個不同土壤樣品總DNA電泳圖；
圖2為應用本發明提取試劑盒提取的9個不同土壤樣品總DNA的細菌16SrRNA全長基因的PCR擴增產物電泳圖；
圖中的「陽性」是按傳統方法提取的大腸桿菌染色體DNA。圖中的「空」是PCR陰性對照，說明PCR體系乾淨沒有DNA汙染。1、2、3、4、5、8、9、10和11表示不同地區的土樣。
【具體實施方式】[0015]下面用最佳的實施例對本發明做詳細的說明。
[0016]供試土壤採自江西省鄱陽湖區不同地區的草洲中有釘螺聚集點及無釘螺點的表層泥土(釘螺接觸面及以下5cm的土壤)1、2、3、4、5、8、9、10和11號土樣。
[0017]提取總DNA的方法依次步驟如下:
1)、取0.4g 土樣裝於2ml離心管中，加Iml腐植酸復溶液[100 mmol/L焦磷酸鈉(Na4P2O7 )，20 mmol/L EDTA _2Na 和 150 mmol/L NaCl，pH9_10]，震蕩混勻 5min，使得土壤中的腐植酸鹽重新溶解，12000r/min離心5min，棄上清以便洗去腐植酸，再加入ImlPBS緩衝液[140mmol/L NaCl、2.7mmol/L KCl, 7.3mmol/L Na2HPO4 和 1.5mmol/L KH2PO4，pH
7.0—7.4],用牙籤攪拌混勻2min, 12000r/min離心5min,棄上清以便洗去殘留的腐植酸和有反混凝作用的焦磷酸鈉；
2)、向上述步驟I)的沉澱加入0.5ml提取緩衝液[100 mmol / L Tris -HCl ( pH 8.0) UOO mmol /L EDTA _2Na ( pH 8.0)，100 mmol/ L 磷酸鈉緩衝液(pH 8.0)，1.5mol/ L NaCl和10 g/ L CTAB]和3ul蛋白酶K (20 mg/mL)，用牙籤攪拌混勻，於37°C230 r/ min振蕩酶解30 min，加入50ul 20%SDS，混勻、置65°C水浴裂解細胞30min，再轉置90°C水浴2min高溫裂解革蘭氏陽性菌，經此3步裂解法釋放出微生物總DNA，12000r/min離心5min,取得500ul上清液；
3)、向上述步驟2) 的上清液加入2%聚氯化鋁(以Al2O3含量為計量)35ul，顛倒混勻5min,終端混凝沉澱腐植酸和菌體蛋白12000r/min離心5min,取得500ul上清液。此處聚氯化鋁是是一種多羥基，多核絡合體的陽離子型無機高分子絮凝劑，可高效沉澱腐植酸和菌體蛋白，當然也會沉澱掉一部分DNA，但是與其主導作用來比這種DNA的損失是可以接受的，而且剩下的總DNA量足以進行幾十次PCR擴增，能達到16SrRNA的序列分析和系統分類的目的:
4)、向上述步驟3)的上清液加入300ul異丙醇(_20°C預冷的)，冰浴20min，12000r/min離心IOmin,棄上清；
5)、向上述步驟4)的沉澱加入800ul70%乙醇，12000r/min離心5min,棄上清,沉澱置超淨工作檯中吹淨殘存的乙醇；
6)、向上述步驟5)的沉澱加入30ul—40ulDNA溶解液TE(10 mmol / L Tris -HCllmmol /L EDTA -2Na pH 8.0)，溶解沉澱得樣品總 DNA。
[0018]實驗結果；從上述步驟6)的樣品總DNA中各取5ul點樣電泳，結果見圖1，從圖1可以看出該方法從土壤中提取的總DNA與大腸桿菌的染色體DNA大小相等，說明提取得到的總DNA完整性較好，有的土壤含菌量高些，提到的總DNA量也就高些，反之也然，這應該不
難理解。
[0019]提取的總DNA質量驗證:主要是其PCR可擴性檢驗，如下:
1、2、4、5和11號樣品總DNA各自稀釋10倍，而3、8、9和10號樣品總DNA不作稀釋，然後作為PCR擴增的模板在25ul反應體系各取Iul，採用16SrRNA全長引物進行PCR擴增，結果見圖2。
[0020]從圖2可以看出:除了 8號樣外，本次提取的樣品總DNA都可用於16SrRNA全長基因的擴增，即使在圖1中看不到染色體DNA帶的3、9和10號樣也具有PCR可擴性，說明它們還是被提取到了微量的DNA，只是常規電泳檢測不到而已，但是不影響其作為DNA模板的可擴性，因為土壤樣品情況很複雜，影響因子眾多，所以能夠解釋多個土壤樣品用一種方法提取所得到的總DNA量肯定是不相同的，也許有的提取不到DNA，就像8號樣一樣，這時可以通過採樣點變動來重試而解決。
[0021]結論:本發明提供的方法和相應的試劑盒，在實際工作中得到了大量的運用，可以混凝沉澱同步去除腐植酸和菌體蛋白、快速、安全、經濟的土壤總DNA提取方法。
[0022]應當理解的是，對本領域普通技術人員來說可以根據上述說明加以改進或變換，例如步驟3)中加入聚氯化鋁混凝劑步驟，可以通過加入聚氯化鐵、聚氯化鋁鐵或聚丙烯醯胺來實現；而所有這些改進或變換都應屬於本發明所附權利要求的保護範圍。
[0023]最後應說明的是:顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而並非對實施方式的限定。對於所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這裡無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見的變 化或變動仍處於本發明的保護範圍之中。
【權利要求】
1.同步去除腐植酸和菌體蛋白的總DNA提取方法，其特徵在於，包括以下步驟: 1)、用腐植酸復溶液混懸樣品使得樣品中的腐植酸鹽重新溶解而被洗去，得到沉澱，再用PBS緩衝液洗去殘留的腐植酸和腐植酸復溶液，取其沉澱； 2)、向上述步驟I)沉澱中加入提取緩衝液和蛋白酶K，經酶解、SDS裂解和90°C高溫裂解，即3步裂解菌體法而釋放出微生物總DNA，離心後得到上清液； 3)、向上述步驟2)上清液加入混凝劑，混凝沉澱殘留的腐植酸和菌體蛋白，離心得到上清液； 4)、向上述步驟3)上清液加入異丙醇沉澱DNA； 5)、向上述步驟4)沉澱加入70%乙醇洗滌沉澱，吹淨殘存的乙醇； 6)、向上述步驟5)沉澱加入DNA溶解液溶解沉澱得樣品總DNA。
2.如權利要求1所述的同步去除腐植酸和菌體蛋白的總DNA提取方法，其特徵在於，所述步驟I)中第一步先使用腐植酸復溶液溶解去除樣品中的腐植酸，第二步再用PBS緩衝液洗去殘留的腐植酸和腐植酸復溶液。
3.如權利要求2所述的同步去除腐植酸和菌體蛋白的總DNA提取方法，其特徵在於，所述腐植酸復溶液為:100 mmol/L 焦磷酸鈉(Na4P2O7 )、20 mmol/L EDTA _2Na 和 150 mmol/L NaCl，pH9-10。
4.如權利要求1所述的同步去除腐植酸和菌體蛋白的總DNA提取方法，其特徵在於，所述步驟2)中細胞裂解是三步疊加裂解法，即37°C蛋白酶K酶解30min、65°C SDS裂解30min和90°C熱裂解2min。
5.如權利要求1所述的同步去除腐植酸和菌體蛋白的總DNA提取方法，其特徵在於，所述步驟3)中使用的混凝劑為聚氯化招(Poly aluminum Chloride)代號PAC,化學分子式為 AL2 (OH) nCL6-nm.(式中，I ≤ η ≤ 5，m ≤ 10)。
6.如權利要求1所述的同步去除腐植酸和菌體蛋白的總DNA提取方法，其特徵在於，所述步驟3)中使用的聚氯化鋁也可用於普通樣品微生物總DNA的提取(用於PCR擴增)，取代了有毒的苯酚和氯仿達到了一步除蛋白的目的。
7.如權利要求5或6所述的同步去除腐植酸和菌體蛋白的總DNA提取方法，其特徵在於，所使用的聚氯化鋁終濃度為0.13%—0.15%。
8.同步去除腐植酸和菌體蛋白的總DNA試劑盒，其特徵在於，包括如下組份: 1)、腐植酸復溶液:100mmol/L 焦磷酸鈉、20 mmol/L EDTA _2Na和 150 mmol/L NaCl,pH9-10 ；
2),PBS緩衝液為:140mmol/L NaCl、2.7mmol/L KCl, 7.3mmol/L Na2HPO4 和 1.5mmol/L KH2PO4，pH 7.0—7.4 ； 3)、提取緩衝液:100mmol / L Tris -HCl ，100 mmol /L EDTA _2Na，100 mmol/L磷酸鈉緩衝液，1.5 mol/ L NaCl溶液，10 g/ L CTAB溶液； 4)、蛋白酶K (20 mg/mL)； 5)、20%SDS水溶液； 6)、混凝劑:2%聚氯化鋁； 7)、DNA洗滌劑:70%乙醇； 8)、DNA溶解液:10 mmol / L Tris -HCl 和 lmmol /L EDTA _2Na。
【文檔編號】C12N15/10GK103627703SQ201310701970
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月19日 優先權日:2013年12月19日
【發明者】塗祖新 申請人:塗祖新