豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的製備方法及用途

2023-09-17 02:53:30

豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的製備方法及用途
【專利摘要】本發明公開了豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的製備方法，其包括：選取豬疫苗抗體陽性的豬屠宰，收穫豬脾臟；低溫保藏；解凍豬脾臟；去筋膜；絞碎；勻漿；裝瓶、儲存；反覆凍融；離心；微濾；超濾；滅活；pH調節；滲透壓調節；除菌；質量檢測。本發明在勻漿步驟中將注射用水的pH值調節至4-6，有利於提高核糖、多肽得率。本發明採用盒式膜包切向流過濾，系統殘留死體積小，易於線性放大生產。本發明將轉移因子粗製品經1-3KD盒式膜包進行切向流納濾，製得高濃度轉移因子，提高使用效果。本發明使用酚紅作酸鹼指示劑，方便客戶觀察轉移因子的pH值。本發明的轉移因子，使用β-丙內酯替代傳統甲醛滅活，加入滲透壓調節工藝，有利於轉移因子與疫苗的聯合免疫。
【專利說明】豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的製備方法及用途
【技術領域】
[0001] 本發明屬於轉移因子，具體涉及豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的製備方法及用途。
【背景技術】
[0002]轉移因子(Transfer Factor, TF)是T淋巴細胞釋放的一種能夠轉移致敏信息的物質，它能夠特異地將供體的細胞免疫信息轉移給受體，從而增強受體的免疫功能。上世紀50年代發現TF至今，國內外學者對其進行了大量研究，並於1979年將其引入獸醫免疫和臨床治療中，目前TF逐漸成為一種應用廣泛的免疫增強劑。
[0003]TF無種屬特異性，因此TF來源廣泛，人類臨床上常見的有人TF、豬TF、牛TF、羊TF、鵝TF等，而畜禽養殖中常見的有牛TF、豬TF，雞TF。
[0004]TF的分子量大約介於3KD和5KD之間，是具有生物活性的非均一性的小分子混合物，其內含物包含游離胺基酸、核酸、多肽及K、Na、Ca、Mg、Zn等金屬元素。各種TF的理化特性、組成成分差異不大，但含量有較大差異。
[0005]從免疫學上，TF分為特異性TF和非特異性TF。特異性TF採用特定病原感染或免疫人群、動物後再提取含該抗原特異活性的TF，目前臨床己經應用有B型肝炎病毒特異TF、各種腫瘤特異TF、流行性出血熱病毒TF、孢疹病毒TF、乙型腦炎TF、結核菌TF等。非特異性TF是指用自然人群或動物白細胞提取的具有多種免疫活性的TF，可非特異性調節機體的免疫機能，提高機體的抵抗力及疫苗的免疫效果。
[0006]隨著現代化養殖業的發展及規模化、集約化程度的不斷提高，目前疾病已成為困擾養殖業的難題。現有的普遍的解決方法就是免疫，然而由於種種原因，有時難免造成免疫失敗，爆發非典型性傳染病，給診斷和治療帶來一定困難。在免疫失敗後往往依賴抗生素治療，造成了耐藥菌株的增加和交叉感染的產生。TF作為免疫增強劑，可提高機體的抵抗力及疫苗的免疫效果，減少免疫失敗，在疾病防治中可發揮重要作用。
[0007]脾臟是機體的免疫器官之一。豬脾TF含有游離胺基酸、多肽等40多種小分子物質，等電點為4.48，分子量較低。豬脾TF與機體的免疫功能有著密切的關係，是一種免疫增強劑，且具有無抗原性、無致畸、無致突變等優點。畜禽脾臟為加工過程中的廢物，有著極廣的應用開發前景，己成為TF研究的熱點。
[0008]白扁豆，俗稱眉豆、南扁豆，含有蛋白質、脂肪、碳水化合物、鈣、磷、鐵、鋅、植酸鈣鎂、泛酸、豆留醇、磷脂、蔗糖、葡萄糖、半乳糖、澱粉及酪氨酸酶等。白扁豆氣味甘平，微溫，具有和中健脾、消暑化溼、補五臟之功。《本草綱目》中說，白扁豆「其性溫平，得乎中和，脾之谷也」；「止瀉痢，消暑，暖脾胃，除溼熱，止消渴」。現代藥理研究發現，白扁豆具有調節胃腸運動及免疫功能、抑菌、抗病原微生物、解毒、抗凝血等作用。在我國，白扁豆資源豐富，價格便宜。
[0009]丙內酯已用於多種疫苗的滅活，沸點155°C，常溫下是無色粘稠狀液體，對病毒具有很強的滅活作用，滅活時間短，可提高生產效率。丙內酯極易水解，37°C 2h即消失，無殘留，水解產物無毒無害，水解為無毒性的脂肪代謝產物β-羥基丙酸。而甲醛是一種有強烈刺激性的致癌物質，使用甲醛滅活時間長，殘留的甲醛不分解，注入機體後，會產生刺激性反應。
[0010]微生物對所處的滲透壓要求等滲，等滲溶液的滲透壓值為280-320mosm/kg。滲透壓值低於此值的溶液稱低滲溶液，如蒸餾水等；滲透壓值高於此值的溶液稱高滲溶液，如10%的葡萄糖液或50%的葡萄糖液等。微生物處於高滲溶液中，易發生質壁分離皺縮死亡；相反若處於低滲溶液中，易吸水膨脹破裂死亡。
[0011]豬瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由豬瘟病毒引起豬的一種急性或慢性、熱性和高度接觸性傳染病，是危害我國養豬業最為嚴重的疫病之一。我國一直採取以防為主的防制方針，目前主要應用豬瘟兔化疫苗(Hog Cholera Lapinized Virus，HCLV)來防控豬瘟。豬瘟的急性發生和大面積流行在我國已經得到有效的控制，但近年來豬瘟的流行和發病特點發生了很大的變化，其流行形式從過去頻發的大流行轉變為周期性、波浪式的地區散發性流行，臨床症狀和病理變化亦由典型性轉為非典型性。
[0012]偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒引起多種家畜的一種傳染病。豬是偽狂犬病病毒的天然宿主，該病是嚴重危害豬群的原發性疾病之一。
[0013]豬繁殖與呼吸症候群(PorcineR印roductive and Respiratory Syndrome,PRRS)於1987年首發於美國，現已遍布全世界。在我國1996年北京地區首次爆發PRRS，現己傳播到各省市，造成巨大經濟損失。各國科研人員紛紛致力於PRRS疫苗研發，現已研製出多種疫苗應用於生產實踐，顯示出一定效果，但至今PRRS仍然是造成我國養豬業經濟損失的重要疾病。PRRS病毒(PRRSV)特異的免疫學特徵給疫苗的設計與研製帶來一定困難，而免疫應答機制的研究和疫苗免疫佐劑的研發是今後重要工作。
[0014]流行性乙型腦炎(Japanese Encephalitis, JE)是由日本腦炎病毒(JapaneseEncephalitis Virus, JEV)引起的一種人畜共患的蟲媒介導的自然疫源性的嗜神經性急性傳染病。JEV感染豬稱為豬乙型`腦炎，屬於國家二類動物疫病，是引起豬繁殖障礙性症候群的主要病毒性疾病之一。
[0015]豬細小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)是引起豬繁殖障礙的一個非常重要的病原體。目前本病在我國乃至許多養豬國家都有流行。雖然近年來隨著豬細小病毒弱毒疫苗和滅活疫苗的廣泛使用，豬細小病毒的感染和流行得到了一定控制，但其在不少地區仍時有發生，給我國養豬業帶來了很大的損失。
[0016]口蹄疫(Food and Mouth Disease, FMD)是危害哺乳動物的一種高度接觸性傳染病，對易感偶蹄獸具有嚴重的經濟危害。牛(黃牛、水牛、奶牛)、豬、羊、駱駝、鹿等均易感。
[0017]豬圓環病毒(Porcine Circovirus, PCV)為圓環病毒科(Circoviridae)圓環病毒屬成員，是迄今已知最小的動物病毒之一。豬圓環病已成為嚴重危害養豬業的重要傳染病。
[0018]豬傳染性胃腸炎(PorcineTransmissible Gastroenteritis, TGE)、豬流行性腹?寫(Porcine Epidemic Diarrhea, PED)分別是由豬傳染性胃腸炎病毒(PorcineTransmissible Gastroenteritis Virus, TGEV)和豬流行性腹?寫病毒(Porcine EpidemicDiarrhea Virus, PEDV)引起的病毒性高度接觸性傳染性腸道疾病，都屬於冠狀病毒科冠狀病毒屬成員。
[0019]TGEV對各年齡段的豬均易感發病，但新生幾周內的仔豬的發病率和死亡率最高，幾乎達到100%死亡。隨著日齡的增大，患病豬的死亡率有所降低，但感染該病的豬生產性能下降，飼料報酬率低下，給全球養豬業帶來嚴重的經濟損失。
[0020]PEDV在結構、臨床症狀及對機體產生的損傷等方面均與TGEV相似。7日齡內哺乳仔豬感染髮病最為多見，嚴重時可導致全群發病，致使哺乳仔豬大量死亡，保育豬和育肥豬增重減慢，對養豬業造成很大的損失。[0021]目前國內生產豬脾TF的廠家很多，提取工藝也不盡相同，有超離心、超濾、透析凍幹、葡萄糖凝膠層析、冷乙醇抽提等方法。現有的轉移因子技術，通常是將動物脾臟中的脂肪、大血管、表麵筋膜等組織剔出後，進行組織搗碎，反覆凍融後，通過半透膜透析獲得。常規採用Lawrence方法，即利用兩次透析法回收轉移因子，此法操作簡單，但生產周期長、耗時長、浪費大、效果不好且費人力物力。另外，即使採用切向流過濾方法，大多採用中空纖維濾膜進行切向流過濾，中空纖維濾膜清洗困難、膜損壞後要更換整個組件、系統殘留死體積較大、纖維管內流動阻力很大、壓力損失較大、不宜處理黏稠液體、不易線性放大生產。這些方法較難進行大規模擴大生產來滿足市場的需要。
[0022]原有製備TF的方法因在滅活工藝中選用甲醛滅活及缺少滲透壓調節工藝，導致製備的TF不宜作為豬疫苗的稀釋液及免疫佐劑使用，即不能直接稀釋豬弱毒疫苗、不能與豬弱毒疫苗病毒液混合後凍幹。
[0023]酚紅，別名苯酚磺酞，是一種酸鹼指示劑。當酚紅所處溶液的PH≥7時，顏色由紅變深紫色；若PH≤7時，顏色則由紅色逐漸變成黃色。酚紅的變色範圍很適合作轉移因子的酸鹼度指示劑，酚紅會隨溶液的PH變化而改變顏色，成為觀察轉移因子pH的最直觀指標。

【發明內容】

[0024]本發明的目的為提供一種快速、高效、經濟且易線性放大的從動物脾臟中獲取豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的方法，及將其作為免疫增強劑及免疫佐劑科學使用的用途。
[0025]為了實現上述目的，本發明採用以下技術方案:
[0026]豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的製備方法，其包括以下步驟:
[0027]I)對健康豬免疫一種以上的豬疫苗，每種豬疫苗免疫2次以上，相鄰兩次免疫時間間隔為7天以上，最後一次免疫豬疫苗後14-28天，檢測豬疫苗抗體，選取豬疫苗抗體陽性的豬屠宰，收穫豬脾臟；
[0028]2)低溫保藏:收穫的豬脾臟立即保存於_40°C以下，保存時間不超過20天；
[0029]3)解凍豬脾臟:將低溫保藏的豬脾臟經流水解凍，解凍溫度低於37°C，解凍後用純化水洗3-5遍，棄去硬化、壞死的豬脾臟；
[0030]4)去筋膜:解凍後去除豬脾臟表面的筋膜、脂肪組織，經注射用水洗3-5遍；
[0031]5)絞碎:將經注射用水清洗過的豬脾臟放入絞肉機初絞1-2遍；
[0032]6)勻漿:用HCl溶液將注射用水的pH值調節至4-6，與絞碎後的豬脾臟按重量比1-2:1混合，經膠體磨勻漿，得勻漿液；
[0033]7)裝瓶、儲存:將勻漿液分裝於無熱源的瓶子後，立即保存於-40°C以下，保存時間不超過20天；
[0034]8)反覆凍融:將瓶裝勻漿液經流水解凍，解凍溫度低於37°C，解凍後立即於_40°C以下冷凍，反覆凍融3-6次；[0035]9)離心:將反覆凍融後的勻漿液於4°C、5500-8000r/min離心15_30min，收集上清液；
[0036]10)微濾:將步驟9)得到的上清液採用0.1-0.45 μ m盒式膜包進行切向流微濾:當微濾透過物體積達到上清液體積的2/3-3/4時，對微濾截留物進行恆體積透析，至微濾透過物體積增加了微濾截留物體積的0.1-1倍為止，收集微濾透過物即為澄清液；
[0037]11)超濾:將步驟10)得到的澄清液採用5-10KD盒式膜包進行切向流超濾:當超濾透過物體積達到澄清液體積的4/5-6/7時，對超濾截留物進行恆體積透析，至超濾透過物體積增加了超濾截留物體積的1-2.5倍為止，收集超濾透過物即為豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品；
[0038]12)滅活:將丙內酯與豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品，按體積比1:4000-100000混勻，在4°C下80_200r/min的轉速下滅活6_24h，滅活後置於37°C下水解2-8h ；
[0039]13)pH調節:將滅活後的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品的pH值調節至6.8-7.2 ；
[0040]14)滲透壓調節:將pH調節後的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品的滲透壓調節至 280_320mosm/kg ；
[0041]15)除菌:將滲透壓調節後的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品採用0.1 μ m的除菌過濾器除菌，即得豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子；
[0042]16)質量檢測:豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的性狀為微黃色或黃色透明液體，多肽含量不低於2.5mg/mL,核糖含量不低於50 μ g/mL,內毒素含量不超過10EU/mL,按照《中國獸藥典》的要求進行 檢測後應無菌，pH值為6.8-7.2，滲透壓值為280-320mosm/kg,磺基水楊酸蛋白質定性測定為陰性,鑑別檢驗中在250-260nm的波長處有最大吸收、0D260nm/0D280nm的比值應不低於1.9，脫E受體法效力檢驗不低於10.0%，安全檢驗合格，即為質量檢測合格。
[0043]本發明步驟6)中pH值為4-6的注射用水與絞碎後的豬脾臟混勻後經膠體磨勻漿，得勻漿液。因本發明在勻漿步驟中調節PH值，有利於蛋白絮凝、抑制細菌生長及內毒素產生，提高後期離心的收率及微濾、超濾的速度，提高轉移因子核糖和多肽的得率。而現有技術一般在勻漿、反覆凍融或細胞破碎儀破碎細胞步驟後，在離心步驟前，將料液PH值調節至4-6，導致蛋白絮凝效果差，較難抑制細菌生長及內毒素產生，核糖和多肽的得率較低。
[0044]本發明步驟10)及11)逐級採用0.1-0.45 μ m、5_10KD盒式膜包進行切向流過濾，而現有技術一般採用中空纖維濾膜進行切向流過濾。現有採用中空纖維濾膜進行切向流過濾，系統殘留死體積大，使用後清洗困難，使用過程中薄膜易受損。特別是，採用中空纖維濾膜進行切向流過濾從小試優化、中試放大到生產規模，無法線性放大，不便於從研發到投入生產再到擴大生產。而本發明採用的逐級盒式膜包進行切向流過濾，系統殘留死體積小，使用後清洗方便，使用過程中薄膜不易受損。同時，本發明採用的逐級盒式膜包進行切向流過濾方便從小試優化、中試放大到生產規模，可線性放大，方便從研發到投入生產再到擴大生產，加快產品上市過程，降低產品的研發成本。
[0045]本發明步驟12)中採用β -丙內酯對豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品滅活。而現有技術轉移因子一般採用甲醛滅活，滅活後，由於殘留甲醛的存在，導致轉移因子無法稀釋或混合豬弱毒疫苗，更無法與豬弱毒疫苗病毒液製成凍幹苗，並且殘留甲醛導致轉移因子注射動物後，對動物造成較大應激。
[0046]而本發明步驟12)中採用丙內酯對豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品滅活，因丙內酯極易水解，37°C2h即消失，無殘留，水解產物無毒無害，所以本發明製備的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子可稀釋或混合豬弱毒疫苗，還可與豬弱毒疫苗病毒液製成凍幹苗，注射動物後，應激很小。
[0047]在步驟14)中，對pH調節後的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品進行滲透壓調節。現有技術中，沒有滲透壓調節工藝，製成的轉移因子一般為160-250mOsm/kg的低滲溶液。這樣的轉移因子不僅不能稀釋或混合豬弱毒疫苗，而且也不能與豬弱毒疫苗病毒液製成凍幹苗(在低滲溶液中，豬弱毒疫苗病毒株易吸水膨脹破裂死亡，導致疫苗效價及免疫效果降低)。因此，這樣製備的轉移因子在使用過程中，弱毒疫苗與轉移因子必須分開使用，如:需要兩次注射，操作繁瑣。並且若採用低滲透壓的轉移因子注射，由於低滲溶液會導致豬局部組織細胞吸水膨脹甚至破裂，很容易使豬產生應激。
[0048]而本發明步驟14)中，將pH調節後的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品的滲透壓調節至280-320mOsm/kg。由於本發明豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品的滲透壓與血漿的滲透壓一致，所以為等滲溶液。因此，本發明製備的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子不僅可以稀釋或混合豬弱毒疫苗，而且也可以與豬弱毒疫苗病毒液製成凍幹苗。使用過程中，本發明的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子可與弱毒疫苗同針免疫，實踐中操作方便。同時，採用本發明製備的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子注射後，豬無應激。
[0049]所述步驟I)中，先用白扁豆飼餵健康豬，用量為每頭豬每天30_60g，飼餵15-30天，然後再用一種以上的豬疫苗免疫健康豬。本發明步驟I)中採用白扁豆飼餵健康豬，可和中健脾，提高豬的免疫力及豬疫苗抗體陽性率。經白扁豆飼餵後的健康豬，提取的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子採用脫E受體法效力檢驗大於`13.0%。而未採用白扁豆飼餵健康豬，豬疫苗抗體陽性率相對較低，脫E受體法效力檢驗一般為12.0%左右。
[0050]進一步，所述的豬疫苗為豬瘟疫苗、豬偽狂犬病疫苗、豬繁殖與呼吸症候群疫苗、豬乙型腦炎病疫苗、豬細小病毒病疫苗、豬口蹄疫疫苗、豬圓環病疫苗、豬傳染性胃腸炎疫苗、豬流行性腹瀉疫苗中一種或幾種。本發明能製備豬疫苗單特異性豬脾臟轉移因子，亦能製備豬疫苗多特異性豬脾臟轉移因子。而現有技術製備的豬脾臟轉移因子效果單一。
[0051]所述步驟13)中，將滅活後的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品的pH值調節至
6.8-7.2後，加入酚紅顯色；則步驟16)質量檢測時，豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的性狀為紅色或淡紅色透明液體。本發明中，採用酚紅作為酸鹼指示劑。因製備的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子在保存運輸過程中，由於保存或運輸環境不當，或由於其他因素發生變質，則豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子溶液的PH發生改變，從而通過酚紅可直接觀察保存的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子是否變質，方便客戶判斷所持有的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子是否可使用，極大地方便了客戶。
[0052]進一步，所述的步驟11)超濾後和步驟12)滅活前，將豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品經1-3KD盒式膜包進行切向流納濾，使納濾截留物體積達到轉移因子粗製品體積的1/6-1/1.1倍，收集納濾截留物即為高濃度豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品。由於本發明採用該步驟，使納濾後的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子核糖含量大於60 μ g/mL，多肽含量大於3.0mg/mL,脫E受體法效力檢驗大於13.0%，大大減少了轉移因子的使用體積，從而方便後期與豬弱毒疫苗病毒液混合製備凍幹疫苗，大大減少了凍幹體積，減少了凍幹操作次數，採用小體積的凍幹設備即可進行凍幹操作，降低生產成本。
[0053]所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的用途有以下幾種:
[0054]第一種:將所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子l_6mL免疫每頭豬。
[0055]第二種:將所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子作為稀釋液，用2_6mL稀釋液稀釋一種與步驟I)中豬體內豬疫苗抗體陽性相對應的豬弱毒疫苗1-3頭份，稀釋後的豬弱毒疫苗分別免疫每頭豬。
[0056]第三種:將所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子作為免疫佐劑，用0.05-0.1mL免疫佐劑混合一種與步驟I)中豬體內豬疫苗抗體陽性相對應的豬弱毒疫苗病毒液1-3頭份，加入凍幹保護劑後凍幹，製成凍幹豬弱毒疫苗，使用前將其稀釋，分別免疫每頭豬。
[0057]該處加入的凍幹保護劑可以是下列中的一種:明膠、脫脂奶粉、乳糖、海藻糖或蔗糖等。
[0058]第四種:將所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子作為免疫佐劑，用0.1-0.5mL免疫佐劑混合一種與步驟I)中豬體內豬疫苗抗體陽性相對應的豬滅活疫苗病毒液1-3頭份，再加入其他佐劑，製成豬滅活疫苗，分別免疫每頭豬。
[0059]該處加入的其他佐劑可以是下列中的一種:A1 (OH) 3>AlPO4, Ca3 (PO4) 2、弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑、礦物油白油等其他佐劑。
[0060]以上所述的免疫方式包括注射、飲水、拌料、滴鼻、噴霧等。
[0061]本發明採用以上技術方案，具有以下有益效果:通過提供一種快速、高效、經濟且易線性放大的從豬脾臟中獲取豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的方法，及將其作為免疫增強劑及免疫佐劑科學使用的用途。
[0062]本發明的優點具體為:1、本發明豬脾臟來源容易；白扁豆飼餵豬群，可和中健脾、提高豬的免疫力及豬疫苗的免疫效力。
[0063]2、本發明先後採用絞肉機、膠體磨破碎組織細胞，全機器化處理，有利於提高生產效率，節約成本。
[0064]3、本發明在勻漿步驟中將注射用水的pH值調節至4-6，有利於蛋白絮凝、抑制細菌生長及內毒素產生，提高後期離心的收率及微濾、超濾的速度，提高核糖和多肽的得率。
[0065]4、本發明將勻漿液分裝於無熱源的瓶子後，立即保存於_40°C以下，保存時間不超過20天，之後將瓶裝勻漿液經流水解凍，解凍溫度低於37°C，解凍後立即於_40°C以下冷凍，反覆凍融3-6次，使多肽、核糖含量大大提高，且節約成本。
[0066]5、本發明採用切向流逐級過濾的方式，依次經0.1-0.4511111、5-101(0及1-31(0盒式
膜包微濾、超濾及納濾，工藝簡單，盒式膜包切向流裝置牢固且系統殘留死體積小，適合在廣泛的壓力範圍內工作，流道間隙大小可調，流道不易被雜物堵塞，具有可拆性，清洗方便，通過增減膜及支撐板的數量可處理不同料液量，生產效率高、質量穩定、成本低、易於線性放大生產。
[0067]6、本發明將豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品經1-3KD盒式膜包進行切向流納濾，製得高濃度豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子，可減少轉移因子的使用劑量，提高使用效果O[0068]7、本發明使用酚紅作為轉移因子的酸鹼度指示劑，方便轉移因子pH值的直觀觀察。
[0069]8、本發明的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子，使用丙內酯替代傳統的甲醛滅活，加入滲透壓調節工藝，有利於轉移因子與疫苗的聯合免疫，即:使轉移因子可作為稀釋液，稀釋一種豬弱毒疫苗，之後免疫每頭豬，不需與豬弱毒疫苗分針免疫，使用方便；此外轉移因子還可作為免疫佐劑，混合一種豬弱毒疫苗病毒液，加入凍幹保護劑後凍幹，製成凍幹豬弱毒疫苗，方便保存運輸。同時，等滲溶液有利於減少免疫應激。[0070]9、轉移因子經0.1um的除菌過濾器除菌，比採用0.22um的除菌過濾器，更有利於
去除支原體等微生物。
[0071]10、本發明生產的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子，生產周期短，並且節省了大量的人力物力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0072]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細的說明:
[0073]圖1為本發明實施例1的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子與現有轉移因子增強豬繁殖與呼吸症候群病毒弱毒疫苗免疫保護力的對比實驗中攻毒後各組實驗豬的存活情況圖。
【具體實施方式】
[0074]下面結合【具體實施方式】，對本發明做進一步的說明。
[0075]豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的製備方法，其包括以下步驟:
[0076]I)用白扁豆飼餵健康豬，用量為每頭豬每天30_60g，飼餵15-30天，然後對飼餵白扁豆的健康豬免疫一種以上的豬疫苗，每種豬疫苗免疫2次以上，相鄰兩次免疫時間間隔為7天以上，最後一次免疫豬疫苗後14-28天，檢測豬疫苗抗體，選取豬疫苗抗體陽性的豬屠宰，收穫豬脾臟；
[0077]2)低溫保藏:收穫的豬脾臟立即保存於_40°C以下，保存時間不超過20天；
[0078]3)解凍豬脾臟:將低溫保藏的豬脾臟經流水解凍，解凍溫度低於37°C，解凍後用純化水洗3-5遍，棄去硬化、壞死的豬脾臟；
[0079]4)去筋膜:解凍後去除豬脾臟表面的筋膜、脂肪組織，經注射用水洗3-5遍；
[0080]5)絞碎:將經注射用水清洗過的豬脾臟放入絞肉機初絞1-2遍；
[0081]6)勻漿:用HCl溶液將注射用水的pH值調節至4-6，與絞碎後的豬脾臟按重量比
1-2:1混合，經膠體磨勻漿，得勻漿液；
[0082]7)裝瓶、儲存:將勻漿液分裝於無熱源的瓶子後，立即保存於-40°C以下，保存時間不超過20天；
[0083]8)反覆凍融:將瓶裝勻漿液經流水解凍，解凍溫度低於37°C，解凍後立即於_40°C以下冷凍，反覆凍融3-6次；
[0084]9)離心:將反覆凍融後的勻漿液於4°C、5500-8000r/min離心15_30min，收集上清液；
[0085]10)微濾:將步驟9)得到的上清液採用0.1-0.45 μ m盒式膜包進行切向流微濾:當微濾透過物體積達到上清液體積的2/3-3/4時，對微濾截留物進行恆體積透析，至微濾透過物體積增加了微濾截留物體積的0.1-1倍為止，收集微濾透過物即為澄清液；
[0086]11)超濾:將步驟10)得到的澄清液採用5-10KD盒式膜包進行切向流超濾:當超濾透過物體積達到澄清液體積的4/5-6/7時，對超濾截留物進行恆體積透析，至超濾透過物體積增加了超濾截留物體積的1-2.5倍為止，收集超濾透過物即為豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品；
[0087] 12)滅活:將丙內酯與豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品，按體積比1:4000-100000混勻，在4°C下80_200r/min的轉速下滅活6_24h，滅活後置於37°C下水解2-8h ；
[0088]13)pH調節:將滅活後的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品的pH值調節至6.8-7.2 ；
[0089]14)滲透壓調節:將pH調節後的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品的滲透壓調節至 280_320mosm/kg ；
[0090]15)除菌:將滲透壓調節後的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品採用0.1 μ m的除菌過濾器除菌，即得豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子；
[0091]16)質量檢測:豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的性狀為微黃色或黃色透明液體，多肽含量不低於2.5mg/mL,核糖含量不低於50 μ g/mL,內毒素含量不超過10EU/mL,按照《中國獸藥典》的要求進行檢測後應無菌，pH值為6.8-7.2，滲透壓值為280-320mosm/kg,磺基水楊酸蛋白質定性測定為陰性,鑑別檢驗中在250-260nm的波長處有最大吸收、0D260nm/0D280nm的比值應不低於1.9，脫E受體法效力檢驗不低於10.0%，安全檢驗合格，即為質量檢測合格。
[0092]所述步驟16)質量檢測的具體操作為:
[0093]A.性狀:豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的性狀為微黃色或淡黃色透明液體(若加入酚紅，豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的性狀為紅色或淡紅色透明液體)；
[0094]B.多肽含量測定:豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子按福林酚法進行測定，每毫升多肽含量應不低於2.5mg ；
[0095]福林酚法:
[0096]試劑:
[0097]a)鹼性銅溶液:溶液I進行5倍稀釋後與溶液II，以50:1的比例混合，混合後即為鹼性銅溶液，此試劑只能用I天，過期失效；
[0098]b)酚溶液；
[0099]操作法:
[0100]a)對照品溶液的製備:取牛血清白蛋白對照品，加水製成每毫升中含250ug的溶液；
[0101]b)供試品溶液的製備:取豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子適量，用水進行適當稀釋作為供試品溶液；
[0102]c)標準曲線的製備:取7支試管，精密量取對照品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、
0.8,1.0mL，分別置帶塞刻度試管中，各加水至1.0mL，再分別加入鹼性銅溶液5.0ml，搖勻，於室溫下放置IOmin,各加入酹溶液0.5mL,立即混勻，置室溫放置30min,然後於500nm的波長處測定吸收度；同時以不加標準蛋白試管(O管)中的溶液作為空白對照，以對照品溶液濃度為橫坐標，吸收度為縱坐標，繪製標準曲線並進行線性回歸；相關係數不低於0.99 ；
[0103]d)測定法:精密量取供試品溶液1.0mL，照標準曲線的製備項下的方法，自「再分別加入鹼性銅溶液」起，以標準曲線中的O管為空白，依法測定吸收度；根據吸收度從回歸方程中求得供試品溶液的濃度，並乘以稀釋倍數，求出供試品多肽含量；
[0104]C.核糖含量測定:豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子按核糖含量測定法進行測定，每毫升核糖含量不應低於50 μ g ;
[0105]核糖含量測定法:
[0106]試劑:
[0107]a) 5%三氯醋酸:稱取三氯醋酸5g，加蒸餾水溶解成IOOmL ；
[0108]b) 0.1%三氯化鐵-鹽酸溶液:稱取三氯化鐵(FeCl3.6Η20) 0.5g，加濃鹽酸溶解成500mL，可長期使用；
[0109]c) 1%3，5-二羥基甲苯(苔黑酚):稱取3，5-二羥基甲苯lg，溶於IOOmL0.1%三氯化鐵-鹽酸溶液中，臨用新配；
[0110]操作方法:
[0111]a)對照品溶液的製備:精密稱取D核糖對照品適量，用5%三氯醋酸製成每毫升含核糖20ug的溶液，搖勻；
[0112]b)供試品溶液的製備:取豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子適量，用5%三氯醋酸進行適當稀釋作為供試品溶液；·
[0113]c)標準曲線的製備:精密量取對照品溶液0.0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8、1.0mL,分
別置帶塞刻度試管中，各加入5%三氯醋酸溶液至2.0mL，再分別加入1%3，5- 二羥基甲苯溶液2.0mL，搖勻，置沸水浴中準確加熱30min，迅速冷卻至室溫，以O號管為空白，照分光光度法(見現行《中國藥典》附錄)，在650nm的波長處測定吸收度，以濃度為橫坐標，吸收度為縱坐標，繪製標準曲線並進行線性回歸；相關係數不低於0.995 ；
[0114]d)測定法:精密量取供試品溶液2.0mL，照標準曲線的製備方法，自「再分別加入1%3，5- 二羥基甲苯溶液2.0mL」起，依法測定吸收度；根據吸收度從回歸方程中求得供試品溶液的濃度，並乘以稀釋倍數，求出供試品核糖含量；
[0115]D.細菌內毒素測定:按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，內毒素含量不超過10EU/mL ；
[0116]E.無菌檢驗:按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，無菌生長；
[0117]F.pH值測定:按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，pH值應為6.8-7.2 ；
[0118]G.滲透壓值測定:按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，滲透壓值為280-320mOsm/kg ；
[0119]H.蛋白質定性測定:將20%磺基水楊酸2mL與樣品2mL,混勻，反應後無渾池沉澱，反應為陰性；
[0120]1.鑑別檢驗:豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子做適當稀釋後，按分光光度計法(按現行《中國獸醫典》附錄進行)測定0D260nm、0D280nm，並掃描圖譜，在250_260nm的波長處有最大吸收，0D260nm/0D280nm的比值應不低於1.9 ；
[0121]J.效力檢驗:按脫E受體法進行檢驗，樣品管淋巴細胞玫瑰花結百分率與對照管之差應不低於10.0% ；[0122]脫E受體法:
[0123]試劑:
[0124]a) Hank』 s液:將0.3%磷酸二氫鉀溶液、0.76%磷酸氫二鈉溶液、2%氯化鉀溶液及20%氯化鈉溶液依次按20:20:20:40比例混合，加葡萄糖lg，溶解後混勻，用水稀釋至1000ml，並用4%碳酸氫鈉溶液調節pH值至7.2-7.3 (臨用時配製)；
[0125]b)阿氏液:取氯化鈉0.420g、枸櫞酸0.055g、枸櫞酸鈉0.766g、葡萄糖2.05g，加水溶解並稀釋至1000mL,滅菌備 用；
[0126]c)分離液:為淋巴細胞分離液；
[0127]d)綿羊抗凝血:取綿羊靜脈血5mL，加入5mL阿氏液中，2_8°C冰箱保存；
[0128]e)固定液:用25%戊二醛溶液、3.5%碳酸氫鈉溶液及Hank’s液依次按1: 1:38比例混合；
[0129]f)姬姆薩染色液:取姬姆薩染料0.5g，加甘油33mL，55-60°C加熱至姬姆薩染料溶解，冷至室溫，加入甲醇33mL，室溫放置24h後，用濾紙過濾，濾液即為原液；取姬姆薩染色液原液2mL,加 Hank，s液6mL,搖勻，1500r/min離心10分鐘,取上清液即得；
[0130]操作方法:
[0131]a)脫E受體T淋巴細胞懸液的製備:取新鮮豬胸腺，去脂肪剪碎，加適量Hank’s液使成細胞懸液，經100目篩過濾，1500r/min離心3_5min,棄去上清液,加入少量Hank』 s液打勻，將此溶液加入已具等量分離液的離心管中，用水平離心機以2000r/min離心20min，小心吸出中間層的淋巴細胞，放入另一離心管中，加適量Hank』 s液洗漆,混勻，1500r/min離心3-5min，棄去上清液，洗滌一次後，在沉澱物中加入適量的Hank』 s液，混勻，45°C恆溫水浴保溫30min (每隔5min振搖一次)，1500r/min離心3_5min,棄去上清液；再加入適量的Hank』 s液，混勻後,45°C恆溫水浴保溫30min, 1500r/min離心3_5min,棄去上清液；用Hank』 s液洗滌3次(操作同前)，再用Hank』 s液適當稀釋並計數，使最終濃度約為ImL中3X 106-5X 106個細胞，為脫E受體淋巴細胞懸液；
[0132]b)綿羊紅細胞懸液的製備:取適量綿羊抗凝血，用適量Hank’s液洗滌3次，1500r/min離心3-5min,棄上清,加Hank’s液稀釋並計數，使綿羊紅細胞最終濃度為脫E受體淋巴細胞懸液的8-10倍；
[0133]c)供試品的製備:取供試品，用Hank』 s液配成每1.0mL中含0.5mg多肽的溶液；
[0134]d)取6支小試管,其中3支各加Hank』 s液0.1ml作對照管，另3支各加供試品0.1mL作測定管，每管中各加脫E受體淋巴細胞懸液0.2mL，37°C保溫Ih後，加入綿羊紅細胞懸液0.2mL,搖勻，以500r/min離心3min，放入4°C冰箱過夜，次日取出，吸棄上清液，每管中各加入固定液I滴，輕輕搖勻，靜置IOmin,滴加染色液2滴並搖勻,靜置15min開始計數(採用血細胞計數板)，共數計數板16大方格上所有淋巴細胞的個數(不少於200個)，統計其中的E玫瑰花結形成的淋巴細胞數(結合3個以上綿羊紅細胞的淋巴細胞)，求得結花百分率，取平均值，即為供試品管或對照管的E玫瑰花結百分率平均值；
[0135]樣品管淋巴細胞玫瑰花結百分率與對照管之差應不低於10.0% ；
[0136]K.安全檢驗
[0137]a)熱原質檢驗:採用體重1.7-3.0Kg健康家兔(雌兔應無孕)3隻,單獨飼養2日，無異常；每隔30min測體溫I次，測2次，兩次溫差不超過0.2°C，以此兩次的體溫的平均值作為該兔的正常體溫；當日使用的家兔，正常體溫在38.0-39.6°C的範圍內，且各兔間正常體溫之差不超過1°C;試驗用的注射器、針頭及一切與本品接觸的器皿，應滅熱原；家兔在測定其正常體溫15min內，自耳靜脈緩緩注入規定劑量(注射量為每公斤體重0.5mL)溫熱至約38°C的本品，然後每隔30min測溫一次，共測6次，以6次體溫中最高的一次減去正常體溫，即為該兔升高的體溫(當家兔升溫為負值時，均以0°C計);3隻家兔體溫升高的溫度均應低於0.6°C，且3隻家兔體溫升高總和應低於1.40C ；
[0138]b)用雞檢驗:用I日齡SPF雛雞10隻，將本品用無菌生理鹽水稀釋10倍後，每隻雞口服lmL，24h重複口服一次，觀察5日；雛雞應全部健活，且精神、採食、飲水、羽毛、糞便應均無異常；
[0139]c)異常毒性檢驗:用體重18_22g健康小鼠5隻，每隻小鼠腹腔注射本品0.5mL，觀察7日；小鼠應全部健活，且精神、採食、飲水、羽毛、糞便應均無異常；
[0140]d)動物過敏檢驗:用體重250_350g健康豚鼠6隻，隔日每隻每次腹腔注射本品1.0mL,共3次，進行致敏；然後將其均分為2組，每組3隻，分別在首次注射後第14日和第21日，由肌肉注射本品1.0mL進行攻擊；每日觀察每隻動物的行為和體徵；觀察攻擊後30min內，動物無豎毛、呼吸困難、抽搐等過敏反應症狀；肌肉注射本品2h內，不得出現過敏反應；如有豎毛、噴嚏、乾嘔、連續咳嗽3聲或呼吸困難等現象中的2種或2種以上，或出現抽搐、休克、死亡現象之一者,判本品不符合規定。
[0141]進一步，本發明所述的豬疫苗為豬瘟疫苗、豬偽狂犬病疫苗、豬繁殖與呼吸症候群疫苗、豬乙型腦炎病疫苗、豬細小病毒病疫苗、豬口蹄疫疫苗、豬圓環病疫苗、豬傳染性胃腸炎疫苗、豬流行性腹瀉疫苗中一種或幾種。
[0142]進一步，所述的步驟11)超濾後和步驟12)滅活前，將豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品經1-3KD盒式膜包進行切向流納濾，使納濾截留物體積達到轉移因子粗製品體積的1/6-1/1.1倍，收集納濾截留物即為高濃度豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品。
[0143]所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的用途有以下幾種:
[0144]第一種:將所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子l_6mL免疫每頭豬。
[0145]第二種:將所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子作為稀釋液，用2_6mL稀釋液稀釋一種與步驟I)中豬體內豬疫苗抗體陽性相 對應的豬弱毒疫苗1-3頭份，稀釋後的豬弱毒疫苗分別免疫每頭豬。
[0146]第三種:將所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子作為免疫佐劑，用0.05-0.1mL免疫佐劑混合一種與步驟I)中豬體內豬疫苗抗體陽性相對應的豬弱毒疫苗病毒液1-3頭份，加入凍幹保護劑後凍幹，製成凍幹豬弱毒疫苗，使用前將其稀釋，分別免疫每頭豬。
[0147]第四種:將所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子作為免疫佐劑，用0.1-0.5mL免疫佐劑混合一種與步驟I)中豬體內豬疫苗抗體陽性相對應的豬滅活疫苗病毒液1-3頭份，再加入其他佐劑，製成豬滅活疫苗，分別免疫每頭豬。
[0148]實施例1
[0149]豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的製備方法，其包括以下步驟:
[0150]I)用白扁豆飼餵健康豬，用量為每頭豬每天30g，飼餵18天，然後對飼餵白扁豆的健康豬免疫豬繁殖與呼吸症候群疫苗3次以上，相鄰2次免疫豬繁殖與呼吸症候群疫苗的時間間隔為7天，最後一次免疫豬繁殖與呼吸症候群疫苗後28天，檢測豬繁殖與呼吸症候群抗體，選取豬繁殖與呼吸症候群抗體陽性的豬屠宰，收穫豬脾臟；
[0151]2)低溫保藏:收穫的豬脾臟立即保存於_40°C，保存時間不超過20天；
[0152]3)解凍豬脾臟:將低溫保藏的豬脾臟經流水解凍，解凍溫度低於37°C，解凍後用純化水洗3遍，棄去硬化、壞死的豬脾臟；
[0153]4)去筋膜:解凍後去除豬脾臟表面的筋膜、脂肪組織，經注射用水洗3遍；
[0154]5)絞碎:將經注射用水清洗過的豬脾臟放入絞肉機初絞I遍；
[0155]6)勻漿:用HCl溶液將注射用水的pH值調節至4，與絞碎後的豬脾臟按重量比1:1混合，經膠體磨勻漿，得勻漿液；
[0156]7)裝瓶、儲存:將勻漿液分裝於無熱源的瓶子後，立即保存於-40°C，保存時間不超過20天；
[0157]8)反覆凍融:將瓶裝勻漿液經流水解凍，解凍溫度低於37°C，解凍後立即於_40°C冷凍，反覆凍融3次；
[0158]9)離心:將反覆凍融後的勻漿液於4°C、5500r/min離心30min，收集上清液；
[0159]10)微濾:將步驟9)得到的上清液採用0.1ym盒式膜包進行切向流微濾:當微濾透過物體積達到上清液體積的2/3時，對微濾截留物進行0.1倍恆體積透析，為使微濾截留物體積恆定，以與透過端流速相同的速度向微濾截留物補入注射用水，至微濾透過物體積增加了微濾截留物體積的0.1倍為止，收集微濾透過物即為澄清液；
[0160]0.1 μ m盒式膜包的平均參數為:
【權利要求】
1.豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的製備方法，其特徵在於:其包括以下步驟: . 1)對健康豬免疫一種以上的豬疫苗，每種豬疫苗免疫2次以上，相鄰兩次免疫時間間隔為7天以上，最後一次免疫豬疫苗後14-28天，檢測豬疫苗抗體，選取豬疫苗抗體陽性的豬屠宰，收穫豬脾臟； . 2)低溫保藏:收穫的豬脾臟立即保存於_40°C以下，保存時間不超過20天； . 3)解凍豬脾臟:將低溫保藏的豬脾臟經流水解凍，解凍溫度低於37°C，解凍後用純化水洗3-5遍，棄去硬化、壞死的豬脾臟； . 4)去筋膜:解凍後去除豬脾臟表面的筋膜、脂肪組織，經注射用水洗3-5遍； .5)絞碎:將經注射用水清洗過的豬脾臟放入絞肉機初絞1-2遍；. 6)勻漿:用HCl溶液將注射用水的pH值調節至4-6，與絞碎後的豬脾臟按重量比. 1-2:1混合，經膠體磨勻漿，得勻漿液； . 7)裝瓶、儲存:將勻漿液分裝於無熱源的瓶子後，立即保存於-40°C以下，保存時間不超過20天； . 8)反覆凍融:將瓶裝勻漿液經流水解凍，解凍溫度低於37°C，解凍後立即於-40°C以下冷凍，反覆凍融3-6次； . 9)離心:將反覆凍融後的勻眾液於4°C、5500-8000r/min離心15-30 min,收集上清液；. 10)微濾:將步驟9)得到的上清液採用0.1-0.45 μ m盒式膜包進行切向流微濾:當微濾透過物體積達到上清液體積的2/3-3/4時，對微濾截留物進行恆體積透析，至微濾透過物體積增加了微濾截留物體積的0.1-1倍為止，收集微濾透過物即為澄清液； . 11)超濾:將步驟10)得到的澄清液採用5-10KD盒式膜包進行切向流超濾:當超濾透過物體積達到澄清液體積的4/5-6/7時，對超濾截留物進行恆體積透析，至超濾透過物體積增加了超濾截留物體積的1-2.5倍為止，收集超濾透過物即為豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品； .12)滅活:將丙內酯與豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品，按體積比1:.4000-100000混勻，在4°C下80-200 r/min的轉速下滅活6-24 h，滅活後置於37°C下水解.2-8h ；. 13)pH調節:將滅活後的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品的pH值調節至.6.8-7.2 ； . 14)滲透壓調節:將pH調節後的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品的滲透壓調節至 280-320 mosm/kg ； . 15)除菌:將滲透壓調節後的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品採用0.1 μ m的除菌過濾器除菌，即得豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子； . 16)質量檢測:豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的性狀為微黃色或黃色透明液體，多肽含量不低於2.5 mg/mL,核糖含量不低於50 μ g/mL,內毒素含量不超過10 EU/mL,按照《中國獸藥典》的要求進行檢測後應無菌，pH值為6.8-7.2，滲透壓值為280-320 mosm/kg，磺基水楊酸蛋白質定性測定為陰性，鑑別檢驗中在250-260 nm的波長處有最大吸收、0D260nm/.0D280nm的比值應不低於1.9，脫E受體法效力檢驗不低於10.0%，安全檢驗合格，即為質量檢測合格。
2.根據權利要求1所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的製備方法，其特徵在於:所述步驟I)中，先用白扁豆飼餵健康豬，用量為每頭豬每天30-60 g，飼餵15-30天，然後再用一種以上的豬疫苗免疫健康豬。
3.根據權利要求1所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的製備方法，其特徵在於:所述的豬疫苗為豬瘟疫苗、豬偽狂犬病疫苗、豬繁殖與呼吸症候群疫苗、豬乙型腦炎病疫苗、豬細小病毒病疫苗、豬口蹄疫疫苗、豬圓環病疫苗、豬傳染性胃腸炎疫苗、豬流行性腹瀉疫苗中一種或幾種。
4.根據權利要求1所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的製備方法，其特徵在於:所述步驟13 )中，將滅活後的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品的pH值調節至6.8-7.2後，加入酚紅顯色；則步驟16)質量檢測時，豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的性狀為紅色或淡紅色透明液體。
5.根據權利要求1所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的製備方法，其特徵在於:所述的步驟11)超濾後和步驟12)滅活前，將豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品經1-3 KD盒式膜包進行切向流納濾，使納濾截留物體積達到轉移因子粗製品體積的1/6-1/1.1倍，收集納濾截留物即為高濃度豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子粗製品。
6.一種如權利要求1或5所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的用途，其特徵在於:將所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子1-6 mL免疫每頭豬。
7.—種如權利要求1或5所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的用途，其特徵在於:將所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子作為稀釋液，用2-6 mL稀釋液稀釋一種與步驟I)中豬體內豬疫苗抗體陽性相對應的豬弱毒疫苗1-3頭份，稀釋後的豬弱毒疫苗分別免疫每頭豬。
8.—種如權利要求1或5所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的用途，其特徵在於:將所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子作為免疫佐劑，用0.05-0.1 mL免疫佐劑混合一種與步驟I)中豬體內豬疫苗抗體陽性相對應的豬弱毒疫苗病毒液1-3頭份，加入凍幹保護劑後凍幹，製成凍幹豬弱毒疫苗，使用前將其稀釋，分別免疫每頭豬。
9.一種如權利要求1或5所述的豬疫苗特異性豬脾臟轉移因子的用途，其特徵在於:將所述的豬 疫苗特異性豬脾臟轉移因子作為免疫佐劑，用0.1-0.5 mL免疫佐劑混合一種與步驟I)中豬體內豬疫苗抗體陽性相對應的豬滅活疫苗病毒液1-3頭份,再加入其他佐劑，製成豬滅活疫苗，分別免疫每頭豬。
【文檔編號】A61K39/39GK103566370SQ201310506686
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月24日 優先權日:2013年10月24日
【發明者】徐磊, 劉友霖 申請人:福州派生特生物科技有限公司