一種回收溶液中纖維素酶的方法與流程

2023-09-17 00:19:41 2

本發明屬於木質纖維素酶解技術領域，特別涉及利用ph響應型木質素兩性表面活性劑回收溶液中纖維素酶的方法。

背景技術：

木質纖維素生物煉製燃料乙醇是替代汽油有效可行的技術之一。在這一煉製過程中，纖維素酶能否高效水解木質纖維素底物是關鍵的技術瓶頸。同時，纖維素酶因其具有活力低、耗量大和價格貴等特點，直接阻礙了纖維素乙醇的工業化。實現纖維素酶的高效回收利用是降低生物乙醇成本的重要途徑。由於酶解結束後酶解液中的纖維素酶蛋白的濃度一般低於1g/l，且纖維素酶的組分較多，不同組分的酶有不同的等電點(pi)，所以常見的鹽析法和等電點沉降法不適合回收酶解液中的纖維素酶。目前，纖維素酶回收利用技術主要有超濾膜回收、纖維素酶的固定化回收和新鮮底物重吸附法回收。

超濾膜回收可以同時回收纖維素酶中的各種組分，且可以得到較高纖維素酶回收效率，但是超濾膜回收存在著設備貴、超濾膜易堵塞、操作費時、成本高等問題(bioresourcetechnology,2013.144:186-193.)。纖維素酶的固定化可以保持纖維素酶的穩定且利於纖維素酶的回收利用，但是固定化酶與纖維素之間存在很大的傳質障礙，且固定化過程會嚴重影響酶活，因此目前僅限於纖維二糖酶的固定化回收再用(nano,2015.10:2153-2157.)。纖維素酶具有高穩定性和對纖維素的強吸附的特性，使得酶通過新鮮底物吸附回收成為降低纖維素酶成本比例的潛在途徑，但是添加新鮮底物回收纖維素酶效率較低，操作過程中容易感染雜菌，且該方法無法回收纖維二糖酶(biotechnolbiofuels,2015.8(1):5.)。

木質素是自然界中在數量上僅次於纖維素的第二大天然高分子材料，製漿造紙工業每年都會得到5000萬噸左右的木質素副產品，但超過95％的木質素仍然主要作為工業製漿的廢棄物，造紙黑液的排放不僅造成資源的浪費，同時又汙染環境，對其進行綜合開發利用對經濟的發展和環境保護都具有現實意義。纖維素乙醇工業本身也會產生大量的酶解木質素，若能將其應用於回收纖維素酶將會有巨大的意義。

技術實現要素：

為了克服回收溶液中纖維素酶現有技術所存在的成本高和回收效率低等缺點和不足，本發明的目的在於提供一種只需要簡單的調節ph就可以快速地回收纖維素酶，有利於生物質資源的綜合利用的利用ph響應型木質素兩性表面活性劑回收溶液中纖維素酶的方法。

本發明的目的通過下述方案實現：

一種回收溶液中纖維素酶的方法，其特徵在於包括以下步驟：將ph響應型木質素兩性表面活性劑加入到纖維素酶溶液中溶解，再調節溶液的ph2.5-10，使ph響應型木質素兩性表面活性劑和纖維素酶同時沉澱析出，通過固液分離回收纖維素酶。

為進一步實現本發明目的，優選地，所述ph響應型木質素兩性表面活性劑為工業木質素或木質素的衍生物為原料經過化學反應引入陽離子基團和/或陰離子基團得到的具有ph響應的木質素兩性表面活性劑，其中陰離子基團為羧基、磺酸基、硫酸基或磷酸基，陽離子基團為季銨基或胺基。

優選地，所述工業木質素為鹼木質素、有機溶劑木質素或生物質煉製木質素，木質素的衍生物為木質素磺酸鹽、木質素羧酸鹽、木質素磷酸鹽、木質素季銨鹽或木質素胺鹽。

優選地，所述ph響應型木質素兩性表面活性劑為磺化季銨化木質素、磺化胺化木質素、硫酸化季銨化木質素、硫酸化胺化木質素、磷酸化季銨化木質素、磷酸化胺化木質素、羧化季銨化木質素或羧化胺化木質素。

優選地，所述ph響應型木質素兩性表面活性劑中的陰離子或陽離子基團的含量均大於0.3mmol/g木質素。

優選地，所述纖維素酶溶液的ph為3.5～7.0，離子強度為0～200mmol/l。

優選地，所述纖維素酶為celluclast1.5l或cellicctec2。本發明對纖維素酶沒有特定要求，對於目前普遍使用的celluclast1.5l和cellicctec2都可以進行回收。所述纖維素酶溶液中纖維素酶蛋白濃度為50-2000mg/l。

優選地，所述的固液分離的方法為自然沉降法、傾析法、過濾法、離心法或這些方法的聯合使用。

優選地，所述的ph響應型木質素兩性表面活性劑與纖維素酶溶液的質量比為0.05-2:100。

優選地，回收得到的纖維素酶用於製備纖維素酶溶液。所述的回收的纖維素酶能夠也能應用於纖維素或木質素纖維素的水解。

本發明ph響應型木質素兩性表面活性劑可以根據纖維素酶溶液的具體情況進行優選，使其可以溶解在纖維素酶溶液中並通過調節溶液的ph與纖維素酶一起沉澱出來。本發明調節溶液的ph值最低不超過2.5，最高不超過10.0。過高和過低的ph值都會導致纖維素酶的失活。調節酶解液體中可能用到的酸為有機酸或無機酸(如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、醋酸、乙酸、甲酸、馬來酸等)；可能用到的鹼為常規的鹼(如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氧化鈣，氫氧化鈣等)。

本發明的機理為：本發明以製漿造紙副產物木質素或酶解木質素為原料，經過化學反應改性成ph響應型木質素兩性表面活性劑，使其用於溶液中纖維素酶的回收。由於ph響應型木質素兩性表面活性劑的溶解度可以隨ph調節，選擇合適的ph響應型木質素兩性表面活性劑完全溶解於纖維素酶溶液中，當升高或降低溶液的ph時，ph響應型木質素兩性表面活性劑析出，由於其與纖維素酶存在一定的相互作用(靜電作用、疏水作用、氫鍵作用)，所以在ph響應型兩性表面活性劑析出時會將溶液中的纖維素酶一起沉澱下來。

本發明相對於現有技術，具有如下的優點及有益效果：

(1)本發明用ph響應型木質素兩性表面活性劑回收纖維素酶，回收的纖維素酶對微晶纖維素底物的活性可以達到初始纖維素酶活性的41.5-91.6％。

(2)本發明中回收纖維素酶的操作簡單、耗時短、不需要額外的設備，只需要簡單的調節ph就可以快速地回收纖維素酶。

(3)本發明以工業木質素和木質素衍生物為原料，將其應用於纖維素酶的回收，有利於生物質資源的綜合利用。

附圖說明

圖1(a)是tcsl-n28在純水中的ph響應情況；(b)是kl-n40在純水中的ph響應情況。

圖2是利用ph響應型木質素兩性表面活性劑(ph-las)回收纖維素酶的操作示意圖，實施例均按此操作完成。

具體實施方式

為更好地理解本發明，下面結合附圖和實施例對本發明作進一步的描述，但本發明的實施方式不限於此。下列實施例中所用試劑均可從市場購買得到。實施例中的微晶纖維素型號為ph101(購自西格瑪奧德裡奇)，纖維素酶是目前被廣泛使用的cellicctec2。實施例水解液中葡萄糖濃度是通過生物傳感分析儀(sba-40e，山東省生物科學研究院)測定的，實施例中微晶纖維素在50℃下水解24h的糖化率代表纖維素酶的活性。

實施例涉及到三種ph響應型木質素兩性表面活性劑，一種是由磺化木質素(tcsl，湖南通道神華林木有限公司生產)季銨化得到，等電點小於4.0；一種是由鹼木質素(kl，湖南湘江紙業有限公司生產)季銨化得到，等電點大於7.0；一種是由木質素磺酸鈉(sl，來源於楊木酸性亞硫酸鈉造紙廢液，由吉林石峴紙業有限責任公司生產)胺化得到，等電點小於4.0。三種ph響應型木質素兩性表面活性劑的具體合成方法如下：

季銨化磺化木質素(tcsl-nx)：配製ph＝12的350gtcsl水溶液(tcsl佔溶液質量分數為20％)，倒入500ml的三口燒瓶，控制攪拌速度為350rpm，用水浴鍋將溫度升到80℃後，用蠕動泵將1.0769xg質量分數為65wt％(3-氯-2-羥丙基)三甲基氯化銨溶液往燒瓶中緩慢滴加，控制滴加速度為1ml/min，滴加5min時加入0.3721xg質量分數為20％的naoh水溶液，再繼續滴加完(3-氯-2-羥丙基)三甲基氯化銨溶液後，在80℃下反應3個小時，將得到的反應液用純水稀釋50倍後調節到ph＝3，使產品析出；x為(3-氯-2-羥丙基)三甲基氯化銨佔tcsl的質量分數，x的取值範圍為10～80。

季銨化鹼木質素(kl-n40)：配製ph＝12的350gkl水溶液(kl佔溶液質量分數為20％)，倒入500ml的三口燒瓶，控制攪拌速度為350rpm，用水浴鍋將溫度升到80℃後，用蠕動泵將43.08g質量分數為65wt％(3-氯-2-羥丙基)三甲基氯化銨溶液往燒瓶中緩慢滴加，控制滴加速度為1ml/min，滴加5min時加入22.91g質量分數為20％的naoh水溶液，再繼續滴加完(3-氯-2-羥丙基)三甲基氯化銨溶液後，在80℃下反應3個小時，將得到的反應液用純水稀釋50倍後調節到ph＝7，使產品析出。

胺化木質素磺酸鈉(asl)：配製ph＝12的50gsl水溶液(sl佔溶液質量分數為20％)，倒入100ml的三口燒瓶，控制攪拌速度為350rpm，設定水浴鍋的溫度為80℃，當溫度升到50℃-55℃，加入1.5g甲醛溶液(甲醛沸點低，溫度低加入)，待溫度上升到80℃後，加入對應的3.657g二乙胺，在80℃下反應4h，將得到的反應液用純水稀釋50倍後調節到ph＝3，使產品析出。

實施例1

將5質量分的tcsl-n25加入到纖維素酶蛋白濃度為200mg/l的5000質量分的溶液中(純水配置，ph＝7.0)，用鹽酸調節溶液的ph至3.0使tcsl-n25和纖維素酶沉澱析出，通過固液分離回收纖維素酶。將回收的纖維素酶加入到5000質量分50mm的醋酸-醋酸鈉緩衝液中，添加100質量分的微晶纖維素，在50℃下酶解24h，通過生物傳感分析儀測定酶解液中的葡萄糖含量，統計結果如表1所示。

實施例2

將25質量分的asl加入到纖維素酶蛋白濃度為400mg/l的5000質量分的溶液中(純水配置，ph＝7.0)，用鹽酸調節溶液的ph至3.2使asl和纖維素酶沉澱析出，通過離心分離回收纖維素酶。將回收的纖維素酶加入到5000質量分50mm的醋酸-醋酸鈉緩衝液中，添加100質量分的微晶纖維素，在50℃下酶解24h，通過生物傳感分析儀測定酶解液中的葡萄糖含量，統計結果如表1所示。

實施例3

將5質量分的tcsl-n25加入到纖維素酶蛋白濃度為1000mg/l的5000質量分的溶液中(醋酸-醋酸鈉緩衝液配置，ph＝4.8,25mm)，用鹽酸調節溶液的ph至2.8使tcsl-n25和纖維素酶沉澱析出，通過離心分離回收纖維素酶。將回收的纖維素酶加入到5000質量分50mm的醋酸-醋酸鈉緩衝液中，添加100質量分的微晶纖維素，在50℃下酶解24h，通過生物傳感分析儀測定酶解液中的葡萄糖含量，統計結果如表1所示。

實施例4

將10質量分的tcsl-n30加入到纖維素酶蛋白濃度為100mg/l的5000質量分的溶液中(醋酸-醋酸鈉緩衝液配置，ph＝5.5，5mm)，用鹽酸調節溶液的ph至3.5使tcsl-n30和纖維素酶沉澱析出，通過離心分離回收纖維素酶。將回收的纖維素酶加入到5000質量分50mm的醋酸-醋酸鈉緩衝液中，添加100質量分的微晶纖維素，在50℃下酶解24h，通過生物傳感分析儀測定酶解液中的葡萄糖含量，統計結果如表1所示。

實施例5

將10質量分的kl-n40加入到纖維素酶蛋白濃度為100mg/l的5000質量分的溶液中(醋酸-醋酸鈉緩衝液配置，ph＝4.0，5mm)，用鹽酸調節溶液的ph至7.0使kl-n40和纖維素酶沉澱析出，通過離心分離回收纖維素酶。將回收的纖維素酶加入到5000質量分50mm的醋酸-醋酸鈉緩衝液中，添加100質量分的微晶纖維素，在50℃下酶解24h，通過生物傳感分析儀測定酶解液中的葡萄糖含量，統計結果如表1所示。

實施例6

將50質量分的tcsl-n25加入到纖維素酶蛋白濃度為200mg/l的5000質量分的溶液中(醋酸-醋酸鈉緩衝液配置，ph＝6.0，100mm)，用鹽酸調節溶液的ph至3.5使tcsl-n30和纖維素酶沉澱析出，通過離心分離回收纖維素酶。將回收的纖維素酶加入到5000質量分50mm的醋酸-醋酸鈉緩衝液中，添加100質量分的微晶纖維素，在50℃下酶解24h，通過生物傳感分析儀測定酶解液中的葡萄糖含量，統計結果如表1所示。

實施例7

將25質量分的tcsl-n28加入到纖維素酶蛋白濃度為400mg/l的5000質量分的葡萄糖溶液中(葡萄糖為100質量分，ph＝7.0)，用鹽酸調節溶液的ph至3.2使tcsl-n25和纖維素酶沉澱析出，通過離心分離回收纖維素酶。將回收的纖維素酶加入到5000質量分50mm的醋酸-醋酸鈉緩衝液中，添加100質量分的微晶纖維素，在50℃下酶解24h，通過生物傳感分析儀測定酶解液中的葡萄糖含量，統計結果如表1所示。

以上實施例同時做了空白對比例(向與實施例纖維素酶濃度相同的5000質量分50mm的醋酸-醋酸鈉緩衝液(ph＝4.8)中添加100質量分的微晶纖維素，相同條件下酶解24h)，與採用本發明方法的實施例進行纖維素酶活性(微晶纖維素24h酶解糖化率)的比較。

根據表1中可以看出，木質素兩性表面活性劑可以有效地回收溶液中的纖維素酶，回收的纖維素酶對微晶纖維素的酶解保持了較高的活性。實施例7與實施例2相比溶液中含有2％質量分數的葡萄糖，但是纖維素酶的回收沒有受到明顯的影響，說明該方法在木質纖維素酶解糖化後的溶液中進行纖維素酶回收具有重要的意義。

圖1(a)是1g/ltcsl-n28在純水中的ph響應情況；圖1(b)是1g/lkl-n40在純水中的ph響應情況。說明了tcsl-n28和kl-n40具有靈敏的ph響應性，可用於回收溶液中的纖維素酶。

圖2是利用ph響應型木質素兩性表面活性劑回收纖維素酶的操作示意圖，過程操作簡單，不需要額外的設備，能耗低，綠色環保。

表1木質素兩性表面活性劑回收纖維素酶的情況

本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。