小豹斑鵝膏半人工栽培的方法

2023-09-17 04:38:35 1

專利名稱：小豹斑鵝膏半人工栽培的方法
技術領域：
本發明涉及一種野生毒菌小豹斑鵝膏半人工栽培的方法，屬於生物技術領域，具體地說是屬於大型真菌培養範疇。
背景技術：
鵝膏菌屬—)隸屬於擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、鵝膏菌科 iaceae)，是有毒的大型真菌中較特殊、較有價值的一個世界性廣布大屬,其物種多樣性是非常豐富的。全球已報導近400種，中國已記錄的近100種(含亞種、變種及變型)。 據考證，目前中國仍有不少種尚未研究和命名。但是如今隨著全球生態危機的出現，我國的許多大型真菌資源已告危，處於嚴重衰退及瀕危狀態，而部份種面臨著可能還沒有被人類認識或發現其價值時，就已滅絕的風險。
鵝膏菌屬中的大部份種屬於著名劇毒菌，據知，因誤食野生蕈菌中毒死亡者95% 是因鵝膏菌所致。科學家們對鵝膏菌真正感興趣的是其毒性，因此，大約在140年前，人們就開始了鵝膏菌毒素的研究。鵝膏菌毒素可分為四類，其中最主要也是最重要的是肽類毒素，肽類毒素又包括鵝膏毒肽(amatoxins)、鬼筆毒肽(phallotoxins)和毒傘素類 (virotoxins)三種。目前鵝膏毒素的應用研究主要體現在以下幾方面①可用於研究真核生物基因的表達、調控及細胞定位(amatoxins對真核生物RNA聚合酶II的活性有專一性抑制作用)；②可開發抗菌、抗病毒特效新藥；③可篩選抗腫瘤藥物；④可開發鎮靜、麻醉及其它特效藥；⑤可用於生物防冶。
鵝膏菌屬大多屬於外生菌根真菌，目前尚不能人工栽培。其絕大部份種仍屬於自然界中難培養或未能培養的微生物，難以人工、半人工栽培，難以開發利用。雖然已有少數的種能進行菌絲的純培養，但也存在一些問題，如菌絲生長緩慢、菌絲中毒素含量不高。鵝膏多肽毒素是一種由7-8個被修飾了的稀有胺基酸組成的環肽，可能不是基因編碼的直接產物，而是經過加工後的次級產物，要克隆毒素的基因是複雜而困難的，且 其化學合成品也沒有活性。因此，至今國內外還沒有一種能規模化開發的毒素產品。現作為生化試劑的肽類毒素全部來源於歐美的毒鵝膏(Amanita phalloides)子實體，銷價在每克10萬美元以上。
鵝膏種群小，個體少，產量低，分布數量極其有限。加之對生境敏感，一旦生境受到破壞，極易消失或滅絕，屬於特殊的致危生物類群，這更增加了其進一步被研究、利用的難度。我國的毒蕈資源，在宋代陳仁玉的菌譜就有了記載，比西方最早的同類研究專著早數百年，可惜由於我們對其研究、保護不夠重視，如今當我們要進一步利用、開發它時， 面臨的卻是資源枯竭的危險。面對這些資源的悄然消失，我們還沒有被引起重視，我們還不積極採取各種措施來進行挽救，那這種損失將是無法彌補的。
鵝膏的人工馴化或栽培是保證鵝膏資源可持續性利用的前提或關鍵，但此目前仍然屬於難以攻克的問題及盲點。小豹斑鵝膏(A . parvipantherina)屬於漸危種,其種群分布及毒性具有代表性或共性，如以此作為研究對象，研究結果對其它種群將具有較好的借鑑作用。因此，本發明重點對小豹斑鵝膏的半人工馴化栽培進行了突破。發明內容
本發明的目的在於，探索一種鵝膏人工培養的可行方法。
本發明的技術方案，其步驟為(1)菌絲體的快速繁殖將已培養出的、長勢良好的菌絲體挑出，剔除上面的培養基，切分成4 6份，每份為O. 25cm2左右，將其輕輕嵌入500ml三角瓶的擴大培養基表面，培養基為改良 SPDM 培養基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L,MgSO4L 00g/L,CaCl21. 00g / L、KH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KNO3 0. 35g /L、維生素 B1 0. 10mg/L、瓊脂 12. OOg/L)， 補充麥芽汁(15. 0 16. 5波美)150 180ml，穀氨酸0. 10 0. 25g/L，生長活性物質10 15mg/L,調節PH值為5. 4 5. 6，培養溫度為22 24°C，暗培養10 15天，菌絲長滿三角瓶；(2)菌絲體栽培種的製作將以上生長良好的菌絲體，接種到1000ml三角瓶的栽培培養基(50%粉碎的原生境腐葉土 +50%麩皮)中，補充麥芽汁(15. O 16. 5波美)150 180ml， 穀氨酸0. 10 0. 25g/L，生長活性物質10 15mg/L，調節PH值為5. 4 5. 6，培養溫度為 22 24°C，暗培養25 30天，菌絲基本長滿三角瓶；(3)菌絲體的野外接種在6月份雨水較充足、氣溫較適合的季節，選擇武定獅子山闊葉林(小豹斑鵝膏生長的自然生境)，輕輕撥開腐葉層，將以上栽培種菌絲埋入陰蔽度較好的樹根下，插上標籤，記錄環境因子；(4)自然條件下菌絲的生長及發育在接種菌絲的菌塘表面及周圍，每5 7天，用濃度為20 30mg/L的生長 活性物質噴施一次，在平均土壤含水量為50±5%，空氣溫度為 19±1°C，空氣溼度為86±12%，光照為785±785Lux的條件下，80-95天有子實體長出。
本發明的有益效果是利用鵝膏生長的自然環境，使鵝膏的人工培養成為可能，其特點如下，(1)操作簡單只需培養大量菌絲，將菌絲直接埋入鵝膏生長環境的腐葉土中，偶噴施菌絲生長活性物質，三個月左右即可長出子實體；(2)生產成本低本發明主要是利用天然場所，節約了廠房，節約了能源，節約了人力等;(3)綠色生態無汙染本發明不破壞原生態環境，直接誘導菌絲在自然條件下出菇，是一種無汙染的綠色生產方式。
具體實施方式
以下的實施例子是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。
實例一將長勢良好的菌絲體挑出，剔除上面的培養基，切分成4 6份，每份為0. 25cm2左右， 將其輕輕嵌入500ml三角瓶培養基表面，培養基為改良SPDM培養基(馬鈴薯200. 00g/L、 葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl21. 00g /L、KH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KNO3 0. 35g /L、維生素B1 0. 10mg/L、瓊脂12. OOg/L)，補充麥芽汁(15. 5波美)180ml，穀氨酸 0. 20g/L,生長活性物質15mg/L，控制PH值為5. 4，培養溫度為23°C，暗培養15天，菌絲長滿二角瓶；將以上生長良好的菌絲體，接種到IOOOml三角瓶的栽培培養基(50%粉碎的原生境腐葉土 +50%麩皮)中，補充麥芽汁(16. 5波美)150ml，穀氨酸O. 10g/L,生長活性物質10mg/L， 調節PH值為5. 4，培養溫度為23°C，暗培養28天，菌絲基本長滿三角瓶；在6月份雨水較充足、氣溫較適合的季節，選擇武定獅子山闊葉林(小豹斑鵝膏生長的自然生境)，輕輕撥開腐葉層，將以上栽培種菌絲埋入陰蔽度較好的樹根下，插上標籤，記錄環境因子；在接種菌絲的菌塘表面及周圍，每5天，用濃度為20mg/L的生長活性物質噴施一次，在平均土壤含水量為50 土 5%，空氣溫度為19 ± I °C，空氣溼度為86 土 12%，光照為785 土 785Lux 的條件下，85天有子實體長出。
實例二將長勢良好的菌絲體挑出，剔除上面的培養基，切分成4 6份，每份為O. 25cm2左右， 將其輕輕嵌入500ml三角瓶培養基表面，培養基為改良SPDM培養基(馬鈴薯200. 00g/L、 葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl21. 00g /L、KH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KNO3 0. 35g /L、維生素B1 0. 10mg/L、瓊脂12. OOg/L)，補充麥芽汁(15. 5波美)180ml，穀氨酸 0. 20g/L,生長活性物質15mg/L，控制PH值為5. 4，培養溫度為23°C，暗培養15天，菌絲長滿二角瓶；將以上生長良好的菌絲體，接種到1000ml三角瓶的栽培培養基(50%粉碎的原生境腐葉土 +50%麩皮)中，補充麥芽汁(15. 5波美)180ml，穀氨酸0. 25g/L，生長活性物質15mg/L， 調節PH值為5. 5，培養溫度為24°C，暗培養30天，菌絲基本長滿三角瓶；在6月份雨水較充足、氣溫較適合的季節，選擇武定獅子山闊葉林(小豹斑鵝膏生長的自然生境)，輕輕撥開腐葉層，將以上栽培種菌絲埋入陰蔽度較好的樹根下，插上標籤，記錄環境因子；在接種菌絲的菌塘表面及周圍，每7天，用濃度為30mg/L的生長活性物質噴施一次，在平均土壤含水量為50 土 5%，空氣溫度為19 ± I °C，空氣溼度為86 土 12%，光照為785 土 785Lux 的條件下，80天有子實體長出。
實例三將長勢良好的菌絲體挑出，剔除上面的培養基，切分成4 6份，每份為0. 25cm2左右， 將其輕輕嵌入500ml三角瓶培養基表面，培養基為改良SPDM培養基(馬鈴薯200. 00g/L、 葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl21. 00g /L、KH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KNO3 0. 35g /L、維生素B1 0. 10mg/L、瓊脂12. OOg/L)，補充麥芽汁(15. 5波美)180ml，穀氨酸 0. 20g/L,生長活性物質15mg/L，控制PH值為5. 4，培養溫度為23°C，暗培養15天，菌絲長滿二角瓶；將以上生長良好的菌絲體，接種到1000ml三角瓶的栽培培養基(50%粉碎的原生境腐葉土 +50%麩皮)中，補充麥芽汁(15. O波美)160ml，穀氨酸0. 20g/L，生長活性物質13mg/L， 調節PH值為5. 6，培養溫度為22，暗培養25天，菌絲基本長滿三角瓶； 在6月份雨水較充足、氣溫較適合的季節，選擇武定獅子山闊葉林(小豹斑鵝膏生長的自然生境)，輕輕撥開腐葉層，將以上栽培種菌絲埋入陰蔽度較好的樹根下，插上標籤，記錄環境因子；在接種菌絲的菌塘表面及周圍，每6天，用濃度為25mg/L的生長活性物質噴施一次，在平均土壤含水量為50 土 5%，空氣溫度為19 ± I °C，空氣溼度為86 土 12%，光照為785 土 785Lux 的條件下，95天有子實體長出。
實例四將長勢良好的菌絲體挑出，剔除上面的培養基，切分成4 6份，每份為O. 25cm2左右， 將其輕輕嵌入500ml三角瓶培養基表面，培養基為改良SPDM培養基(馬鈴薯200. 00g/L、 葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl21. 00g /L、KH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KNO3 0. 35g /L、維生素B1 0. 10mg/L、瓊脂12. OOg/L)，補充麥芽汁(15. 5波美)180ml，穀氨酸 0. 20g/L,生長活性物質15mg/L，控制PH值為5. 4，培養溫度為23°C，暗培養15天，菌絲長滿二角瓶；將以上生長良好的菌絲體，接種到1000ml三角瓶的栽培培養基(50%粉碎的原生境腐葉土 +50%麩皮)中，補充麥芽汁(15. O波美)170ml，穀氨酸0. 25g/L，生長活性物質15mg/L， 調節PH值為5. 5，培養溫度為24°C，暗培養27天，菌絲基本長滿三角瓶；在6月份雨水較充足、氣溫較適合的季節，選擇武定獅子山闊葉林(小豹斑鵝膏生長的自然生境)，輕輕撥開腐葉層，將以上栽培種菌絲埋入陰蔽度較好的樹根下，插上標籤，記錄環境因子； 在接種菌絲的菌塘表面及周圍，每5天，用濃度為30mg/L的生長活性物質噴施一次，在平均土壤含水量為50 土 5%，空氣溫度為19 ± I °C，空氣溼度為86 土 12%，光照為785 土 785Lux 的條件下，81天有子實體長出。
權利要求
1.一種野生毒菌(小豹斑鵝膏)半人工栽培的方法，其特徵為，將實驗室大量固體培養的菌絲，直接接種到野外自然生境下，通過添加促生長物質，使其菌絲生長發育，最終長出子實體，主要包括下列步驟(1)菌絲體的快速繁殖將已培養出的、長勢良好的菌絲體挑出，剔除上面的培養基，切分成4 6份，每份為O. 25cm2左右，將其輕輕嵌入500ml三角瓶的擴大培養基表面，培養基為改良 SPDM 培養基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L,MgSO4L 00g/L,CaCl21. 00g / L、KH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KNO3 0. 35g /L、維生素 B1 0. 10mg/L、瓊脂 12. OOg/L)， 補充麥芽汁(15. 0 16. 5波美)150 180ml，穀氨酸0. 10 0. 25g/L，生長活性物質10 15mg/L,調節PH值為5. 4 5. 6，培養溫度為22 24°C，暗培養10 15天，菌絲長滿三角瓶；(2)菌絲體栽培種的製作將以上生長良好的菌絲體，接種到1000ml三角瓶的栽培培養基(50%粉碎的原生境腐葉土+50%麩皮)中，補充麥芽汁(15. O 16. 5波美)150 180ml， 穀氨酸0. 10 0. 25g/L，生長活性物質10 15mg/L，調節PH值為5. 4 5. 6，培養溫度為 22 24°C，暗培養25 30天，菌絲基本長滿三角瓶；(3)菌絲體的野外接種在6月份雨水較充足、氣溫較適合的季節，選擇武定獅子山闊葉林(小豹斑鵝膏生長的自然生境)，輕輕撥開腐葉層，將以上栽培種菌絲埋入陰蔽度較好的樹根下，插上標籤，記錄環境因子；(4)自然條件下菌絲的生長及發育在接種菌絲的菌塘表面及周圍，每5 7天，用濃度為20 30mg/L的生長活性物質噴施一次，在平均土壤含水量為50±5%，空氣溫度為 19±1°C，空氣溼度為86±12%，光照為785±785Lux的條件下，80-95天有子實體長出。
全文摘要
本發明涉及一種野生毒菌小豹斑鵝膏半人工栽培的方法，屬於大型真菌培養技術領域。其特徵是，將實驗室大量固體培養的菌絲，直接接種到野外自然生境下，通過添加促生長物質，使其菌絲生長發育，最終長出子實體。本發明利用自然生長條件，直接誘導菌絲體出菇，其操作簡單，原生態無汙染，節約了能源、廠房等，在目前是一種比較理想的培養方式。鵝膏屬是特殊珍貴的大型經濟真菌，其價值大應用範圍廣，在開發新特效藥如抗腫瘤、抗菌抗病毒、鎮靜或麻醉藥等領域具有潛在應用前景，但至今因其資源珍稀、難以人工馴化、毒素的化學合成品無活性等問題尚難以開發應用，作為生化試劑的肽類毒素，每克10萬美元以上。菌絲在培養條件下難以發育成子實體是制約人工培養的關鍵因素，本發明以小豹斑鵝膏為例，徵對這個問題進行了一定的突破，使鵝膏的人工培養成為可能，為資源的可持續性開發利用等創造了條件。
文檔編號A01G1/04GK103004456SQ20111028964
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月28日 優先權日2011年9月28日
發明者李宗菊, 張曦予, 劉弟 申請人:雲南大學