人巨細胞病毒m抗原表位及其在醫藥研究領域中的應用的製作方法

2023-09-21 18:40:05

專利名稱：：人巨細胞病毒m抗原表位及其在醫藥研究領域中的應用的製作方法人巨細胞病毒M抗原表位及其在醫藥研究領域中的應用發明領域本發明涉及人巨細胞病毒外膜糖蛋白中的M抗原表位，以及所述M抗原表位在製備人巨細胞病毒診斷試劑或疫苗中的應用或在其它醫藥領域中的應用。發明背景人巨細胞病毒(humancytomegalovirus,HCMV)是一類在自然界普遍存在但又具有嚴格種屬特異性的病毒，屬P皰疹病毒亞科。人巨細胞病毒在人群中感染非常普遍，但大多數呈臨床不顯性感染或潛伏感染，多數人在兒童或少年期受HCMV感染後獲得免疫。在孕婦，原發或新的HCMV復發感染均可引起新生兒宮內感染或圍產期感染，可導致胎兒畸形，智力低下和發育遲緩等，嚴重者可引起全身性感染症候群，稱為巨細胞包涵體病。近20年來，隨著免疫低下狀態人群包括愛滋病、放射損傷、器官移植和惡性腫瘤等患者的增多，HCMV感染及其引發的嚴重疾病有日益增加的趨勢，這引起了人們對人巨細胞病毒分子生物學、流行病學、診斷技術、治療與預防等研究的重視。在巨細胞病毒外層嚢膜上含有多種糖蛋白，包括糖蛋白B(gB)、H(gH)、M(gM)/N(gN)、0(g0)/L(gL)等。gB是主要的中和性抗原，gH的作用是輔助膜蛋白B結合細胞膜受體EGFR使病毒完成對細胞的侵襲過程。相對於gB、gH來說，gM研究的文獻較少。gM或gM/gN複合物的中和性作用是最近才研究證實。gN的作用一方面與gM構成複合物在病毒感染過程中產生中和性抗體，另一方面與病毒的複製有關。gM是病毒的第三類膜蛋白，分子量約為42-45kDa，經計算機預測gM蛋白含有7個跨膜區段。在病毒外膜上gM與gN形成異源二聚體而存在。儘管其中和性抗原的性質已經得到確認，但到目前為止有關gM的表位研究還未見報導。gM的研究同樣具有重要的意義。(JVirol.2006.80(9):4591-4600).目前臨床診斷HCMV的主要方法是血清學診斷。血清學HCMV診斷主要是檢測IgM和(或)IgG。HCMV病毒感染機體首先出現IgM抗體，IgM抗體檢測陽性直接說明病毒正處於活動期或繁殖期，它是病毒感染的前期表現，所以IgM抗體檢測在臨床應用最多；但IgM抗體維持時間很短，從出現到消失僅僅一周左右的時間，如果檢測不及時很可能造成病例假陰性結果。IgG抗體儘管出現較晚，其維持時間最長，有時可達幾個月的時間。檢測HCMVIgG的變化曲線是臨床診斷的重要參考依據。在臨床上將檢測IgM和IgG相結合才能儘量避免假陰性或者假陽性結果。臨床血清學方法檢測HCMV試劑主要是商品化的ELISA試劑盒。由於國內試劑盒目前包被的抗原大部分為裂解後的病毒粒子，成分複雜，同一病毒科的成員具有很多相同的成分，所以檢測過程中很容易出現假陽性結果，導致臨床的誤診；而國外有些試劑盒已經開始包被重組的HCMV特異蛋白或人工合成的多肽，但其成本高，在臨床檢測過程中增加了患者醫療費用，導致國內臨床檢測時推廣受到限制。近年來多主張釆用重組表達HCMV蛋白及多肽作為檢測抗原，已發現具有較高的診斷價值。用重組表達的病毒特異蛋白及多肽作為抗原檢測HCMV具有兩方面的優勢l)避免了HCMV病毒粒子帶來的潛在危險；2)由於抗原是HCMV特異的蛋白或多肽，能夠減少假陽性或假陰性結果。[JClinMicrobiol.2005，43(9):4713-4718]HCMV疫苗的研究包括亞單位疫苗、質粒載體DM疫苗、病毒載體DNA疫苗、合成蛋白(肽)疫苗。除了近幾年研究的基因工程疫苗以夕卜，還包括已在臨床上有限制應用的Towne減毒活疫苗。目前在國外，有的疫苗已完成n期臨床試驗研究[ClinInfectDis.2004，39:233-239],而國內至今沒有疫苗進行臨床試驗的報導，只是對幾種病毒成分做了相關實驗室研究[軍事醫學科學院院刊.2003,27(5):38-41;青島醫學院學報.2003，39(1):12-15]。近年來抗原表位肽作為候選疫苗的研究越來越受到廣泛的重視，但由於抗原表位肽免疫原性差及免疫佐劑研製的限制，抗原表位肽在臨床上的應用研究還處於初級階段。隨著表位肽的研究進展，表位肽作為疫苗的應用具有廣闊的前景。因此HCMV特異多肽的發現對提高臨床檢測HCMV陽性率及預防HCMV感染的實驗研究具有重要的意義。
發明內容鑑於gM或gM/gN複合物中和性抗體能夠部分抑制病毒的感染力，且目前還沒有gM抗原表位的研究報導，我們以羊抗HCMV多克隆抗體為靶標，經過噬菌體線性隨機肽庫篩選獲得了多克隆抗體一個結合肽，通過與gM蛋白序列比較，發現結合肽序列與gM蛋白第32-38位胺基酸序列具有較高的一致性。將結合肽偶聯至鑰孔血蘭蛋白(KLH)後免疫Balb/c鼠，獲得了針對結合肽的多抗血清。該多抗血清不僅能夠結合天然的HCMV病毒粒子，而且還能夠結合重組表達的gM30-78多肽。本發明的一個方面，涉及HCMV中的新M抗原表位，其是具有用單字符表示的如下胺基酸序列的多肽LVLSNFP。本發明的另一方面，涉及與上述M抗原表位序列具有一個或多個保守性胺基酸殘基替換，且具有相同或相似的中和活性的多肽。在本發明的一個實施方案中，所述多肽具有用單字符表示的如下胺基酸序列LXLSQXP，其中X表示已知20中胺基酸中的任意一個。在本發明的又一實施方案中，所述多肽具有用單字符表示的如下胺基酸序列HLVLSNFP。在本發明中，有用的保守置換在表1中列出。將屬於一個類別的胺基酸替換為相同類別的另一個胺基酸的保守置換落入本發明的範圍內，只要這種置換實質上不改變所述表位多肽的生物活性。表1優選的胺基酸置換tableseeoriginaldocumentpage6本發明的又一方面涉及含有所述M抗原表位的多肽在製備HCMV診斷試劑或針對HCMV的疫苗中的應用。微量病毒中和實驗結果初步表明具有上述結構多肽的抗體具有中和活性。通過FITC標記HCMV即刻早期蛋白的表達情況，與陽性對照羊抗HCMV多抗B65275G和陰性對照正常小鼠血清、正常山羊血清及PBS相比，經過鼠抗結合肽多抗處理的HCMV粒子其感染HEL細胞後FITC螢光的數量明顯比陰性對照減少，HCMV病毒粒子感染能力降低，表明鼠抗結合肽抗體能夠部分中和病毒的活性。ELISA實驗證實結合肽與重組表達的HCMVB抗原表位區AD1和AD2均能特異結合已知的HCMVIgG陽性的人血清。將結合肽與AD1、AD2混合檢出的HCMVIgG陽性人血清率比單純AD1/AD2混合物檢出率高。下面以結合附圖和針對M抗原表位的實施例對本發明作進一步詳細說明。圖1顯示鼠抗M抗原表位多抗竟爭抑制羊抗HCMV多抗結合HCMV病毒的ELISA結果。圖2顯示鼠抗M抗原表位多抗的微量HCMV病毒中和實驗結果，其中A為HCMV多抗B65275G;B為M抗原表位多抗；C為B孔伊文斯蘭復染結果；D為正常小鼠抗體；E為正常山羊抗體；F為無抗體陰性對照。圖3顯示gM30-78多肽結合鼠抗M抗原表位多抗WesternBlot結果，其中1為鼠抗M抗原表位多抗；2為His單抗。實施例1.羊抗HCMV多抗抗原表位的篩選首先用100ul羊抗HCMV多抗IgG包被於酶聯板，置4'C過夜。經過3%的BSA封閉lh後，加入噬菌體展示隨機十二肽庫(NEB產品)，室溫孵育lh，用TBST(50mmol/LTris-HCl，0.1%TWEEN20，pH7.5)洗滌非特異結合的噬菌體，再用G.2mmol/L甘氨酸-HClpH2.2洗脫特異結合的噬菌體，洗脫液用lmol/LTris-HC1pH9.0中和。按照產品試劑盒提供的方法，測定洗脫液中的噬菌體的滴度，以正常山羊血清IgG的洗脫噬菌體的滴度作為對照，測定P/N比值。同時將洗脫的與TRAP抗體IgG結合的噬菌體擴增，並測定其滴度，用於下一輪的篩選。經過4輪篩選後，測定的P/N比值有了明顯的提高。將富集的噬菌體克隆進行ELISA鑑定，隨機挑取20個陽性克隆進行測序。分析後得到包含抗原表位序列的多肽序列。實施例2.篩選到的抗原表位序列和M蛋白序列進行比較將篩選抗原表位序列和M蛋白的原始序列進行分析發現，抗原表位序列與M蛋白的32-38位胺基酸序列存在高度同源性表4立序列xzx，xfM蛋白一級序列31HZV諸F戶38實施例3.抗原表位多抗竟爭抑制羊抗HCMV多抗結合病毒粒子將M抗原表位通過共價鍵與鑰孔血蘭蛋白(KLH)偶聯，免疫Balb/C鼠獲得了M抗原表位多抗血清。經過ProteinA純化後得到純度較高的M抗原表位多抗。按照試劑盒的方法，將HCMV病毒包被ELISA板孔，經過3。/。的BSA封閉lh後，加入抗原表位多抗與不同濃度的羊抗HCMV多抗，室溫孵育lh，用PBST(20mmol/LPBS，0.5%Tween-20，pH7.5)洗滌，然後加入HRP標記的兔抗小鼠二抗，用ECL液顯示抗原模擬表位抗體結合病毒的0D值。實驗結果發現隨著羊抗HCMV多抗量的增加，抗原表位多抗結合病毒的能力呈下降趨勢，直至最後達到與正常山羊血清水平。(參見圖l)實施例4.抗原表位多抗微量病毒中和實驗首先分別用標準羊抗HCMV多抗、M抗原表位多抗、正常小鼠多抗、正常山羊多抗以及PBS處理HCMV病毒粒子，然後將處理過的病毒感染HEL細胞。16小時後先用無水乙醇固定細胞，再加入單抗MAB8129與病毒表達的分子量為68kD的即刻早期蛋白反應，最後加入FITC標記的山羊抗小鼠抗體。通過計數螢光點數觀察M抗原表位多抗抑制病毒的能力。結果表明1:64倍稀釋的標準羊抗HCMV多抗幾乎完全抑制了病毒侵入細胞的能力，與1:2倍稀釋的正常小鼠多抗，正常山羊多抗以及PBS處理過的病毒相比，1:4倍稀釋的M抗原表位多抗能夠部分抑制病毒侵入HEL細胞。表明M抗原表位多抗具有中和病毒的活性。(參見圖2)實施例5.抗原表位序列展示在細菌鞭毛上及免疫動物的效果觀察利用鞭毛的在細菌表面的高拷貝數(每個細菌約二萬個拷貝)的性質，我們將M蛋白抗原表位序列對應的多肽展示在大腸桿菌GI826鞭毛蛋白的硫氧環蛋白區，將重組菌免疫小鼠，檢測特異抗體的產生，經過兩次加強免疫後。WestenBlot實驗結果顯示產生的抗血清能夠特異結合重組表達的gM30-78多肽，表明我們獲得的抗原表位肽與合適的載體偶聯後具有良好的免疫原性。實施例6.抗原表位聯合重組表達的已知的B抗原表位AD1和AD2檢測人血清應用我們從山東省圻南縣計劃生育服務站和北京兒童醫院獲得人血清40份，分別用兩個不同生物公司生產的HCMVIgGELISA試劑盒檢測此40份血清，結果有8份血清確定為IgG陽性(第6、10、11、17、18、40、41、42號)。在這8份HCMVIgG陽性的人血清中其中有3份血清(第6、11、41號)能夠特異結合M抗原表位，有6份血清(第6、10、11、17、40、42號)與重組表達的已知的B抗原AD1/AD2表位混合物發生特異的結合反應。將M抗原表位與重組表達的AD1、AD2混合作為抗原，發現該混合物能夠特異結合7份血清(第6、10、11、17、40、41、42號)。其中第41號血清只能與M抗原表位反應而不與AD1/AD2混合物反應，初步表明M抗原表位的發現提高了HCMV的檢出率。(參見表l)表1、本發明所述M抗原表位及已知B抗原AD1/AD2表位(MAD)與HCMVIgG標準試劑盒測定陽性人血清的比較結果樣品OD450.值標準試劑盒MAD10.203±0.020.189土0.0120.123±0.030.134±0.0130,172土0.010.09士0.0140.213±0.050.129士0.0250.134±0.030.2±0.0160.701±0.1020.642±0，70.205土0.020.135±0.0380.132±0.010.198士0.0490.2±0.010.19土0.01100.601±0,110.206±0.0211O'749士0.0970.808±0.109120.21士0.01o.no±o,oi130.121士0.020.203±0.0114(U35士0.040.124±0.05150.213±0.010.194±0.0216(U2士0.080.132±0.03170,628士0.127o.mo.oi180.151士0.03190.07±0.010.98±0,02200.152土0.0S0.14±0.05樣品OD450值標準試刑盒MAD210.168士0.030.112±0,08220.08±0.020.112土0.01230.23±0.010.154±0,04250.167土0.040.2±0.02260.147士0.020.152±0.0228(U73士0.020.131士0.09290.159±0.01(U62士0.01300.18土0.030.122±0.02310.087土0.120,064±0,09320.052±0.10.095士0.12330.147±0,050,193±0.01340.051±0,080.078±0.01350.181±0.01(U67士0.03360.209±0.030.187士0.02370.156±0.010.143土0.0538(U93土0.020.187士0.04390.32土0.010.135±0.02400.539±0.090.102±0.01410.801±0.0780.525士0.045420.725±0.0720.216土0.0權利要求1.人巨細胞病毒M抗原表位或其具有一個或多個保守性胺基酸殘基替換、添加或刪除且具有相同或相似的中和活性的保守性變體，其中所述M抗原表位具有以單字符表示的以下胺基酸序列LXLSQXP其中X表示已知20中胺基酸中的任意一個。2.權利要求1所述的M抗原表位，其具有以單字符表示的以下胺基酸序列LVLSNFP。3.權利要求1所述的M抗原表位，其具有以單字符表示的以下胺基酸序列HLVLSNFP。4.權利要求1所述的M抗原表位，其特徵在於所示序列中的胺基酸殘基可以根據胺基酸的相似性進行相互替代，其中絲氨酸殘基(S)和蘇氨酸殘基(T)之間可以相互替代；亮氨酸殘基(L)和異亮氨酸殘基(I)之間可以相互替代；穀氨醯胺殘基(Q)和天冬醯胺殘基(N)之間可以相互替代；苯丙氨酸殘基(F)和酪氨酸殘基(Y)之間可以相互替代。5.權利要求1-4中的任意一項的M抗原多肽在製備HCMV診斷試劑中的用途。6.權利要求l-4中的任意一項的14抗原多肽在製備針對110^的疫苗中的用途。全文摘要本發明涉及人巨細胞病毒外膜糖蛋白中的M抗原表位，以及所述M抗原表位在製備人巨細胞病毒診斷試劑或疫苗中的應用或在其它醫藥領域中的應用。文檔編號G01N33/68GK101274957SQ20071030143公開日2008年10月1日申請日期2007年12月27日優先權日2007年12月27日發明者玉劉,光楊,川柳,沈倍奮,芳王,王本旭,邵寧生,高亞萍申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所