巨細胞病毒gb抗原的製作方法

2023-09-21 18:35:25 3

專利名稱：巨細胞病毒gb抗原的製作方法
技術領域：
本發明涉及免疫學領域。具體而言，本發明提供了引發對巨細胞病毒(CMV)特異性的免疫應答的組合物，諸如例如，疫苗，以及方法。技術背景
人巨細胞病毒(HCMV)是屬於皰疹病毒家族的普遍存在的DNA病毒。HCMV由DNA核心、外部衣殼構成，且被包含病毒特異性糖蛋白的脂質膜覆蓋。
HCMV在世界的大部分地區是地方性的。然而，原發感染通常導致亞臨床疾病，此後病毒變為潛伏，保留在以後任何時間再活化的能力。然而，在兩個群體中，HCMV導致嚴重的醫療狀況。HCMV是子宮內感染的新生兒中先天性缺陷的主要原因。這是發達國家中先天性感染的最常見的原因。先天性感染是指在新生兒出生前由母親傳遞給胎兒的感染。在先天性感染的新生兒中，5-10%在出生時具有主要臨床症狀，如小頭畸形、顱內鈣化和肝炎。許多具有先天性HCMV感染的嬰兒在出生時是無症狀的。然而，隨訪研究已經顯示，這些嬰兒的15%將具有後遺症，如聽力損失或中樞神經系統發育異常，尤其導致較差的智力表現。
第二個危險群體是免疫功能低下的患者，如患有HIV感染的那些和經受移植的那些。在這種情況下，病毒變成機會病原體，且引起具有高發病率和死亡率的嚴重疾病。臨床疾病引起各種症狀，包括發熱、肝炎、肺炎和傳染性單核細胞增多症。
為了解決HCMV-相關疾病，開發了候選疫苗，包括活減毒疫苗和亞單位疫苗。具體而言，最近，在II期臨床試驗中測試了包含缺失其跨膜結構域的修飾的糖蛋白B(gB)與 MF59 乳劑組合的亞單位疫苗(W0 2009/037359, N.Engl.J.Med.2009; 360:1191-9)。
發明概述 在本發明的第一個方面，提供了包含至少一部分gB蛋白細胞外結構域的巨細胞病毒(CMV) gB多肽，所述至少一部分gB蛋白細胞外結構域包含融合環I (FLl)結構域和融合環2 (FL2)結構域，其中FLl和FL2結構域中的至少一個包含至少一個胺基酸缺失或取代。
在第二個方面，提供了 CMV gB多肽，所述CMV gB多肽包含前導序列的胺基酸的至少40%、至少50%、至少70%、至少80%、至少90% 或整個前導序列的缺失。
在第三個方面，提供了具有選自以下所述序列的序列的CMV gB多肽:SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ IDNO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20 和 SEQ ID NO: 21。
在第四個方面，提供了包含CMV gB多肽群體的製劑，其中所述群體的至少50%、至少60%、或至少70%是三聚體形式。
在第五個方面，提供了免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含本發明的CMVgB多肽與合適的藥學載體的混合物。
在進一步的方面，提供了編碼本發明的CMV gB多肽的多核苷酸。
在又進一步方面，提供了具有選自以下所述序列的序列的多核苷酸:SEQ IDN0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:11、SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:15和 SEQ ID NO:17。
在又進一步方面，提供了包含本發明的多核苷酸的重組載體。
在又進一步方面，提供了本發明的重組載體轉化的宿主細胞。
在又進一步方面，提供了本發明CMV gB多肽在製備用於預防和/或治療CMV感染的藥物中的用途。
在又進一步方面，提供了本發明CMV gB多肽，其用於預防和/或治療CMV感染。
在又進一步方面，提供了用於誘發針對CMV的免疫應答的方法，所述方法包括將免疫有效量的包含本發明的CMV gB多肽的組合物施用於受試者的步驟。


圖1為源自AD169毒株的缺乏跨膜結構域的CMV gB多肽(gB-DeltaTM)以及其中公開的三個示例性CMV gB多肽的圖示:(i)其中融合環FLl和FL2都突變的缺失跨膜結構域的CMV gB(gB-SLP12)(參見SEQ ID NO: 3)，(ii)其中融合環FLl和FL2的突變與C末端細胞質結構域中缺失區域(Del2)相組合的缺失跨膜結構域的CMV gB (gB_SLP 12-Del2)(參見SEQ ID N0:4)，所述缺失的區域(Del2)包含富含脯氨酸結構域、保守疏水性模式和高度親水性帶負電荷區域，和(iii)其中融合環FLl的突變與多肽C末端細胞質結構域中缺失上述區域(Del2)相組合的缺失跨膜結構域的CMV gB (gB-SLPl-Del2)(參見SEQ IDNO: 5)。gB-SLP12、gB-SLP12-Del2 和 gB_SLPl_Del2 都包含兩個額外點突變，在 50 和 357 位處以絲氨酸(S)取代精氨酸(R)。gB-SLP12-Del2和gB-SLPl-Del2都包含進一步點突變，在778位處以丙氨酸(A)取代半胱氨酸(C)。TM代表跨膜結構域。FLl代表融合環I。FL2代表融合環2。Del2缺失以胺基酸825開始且以胺基酸877結束，即這兩個胺基酸分別是缺失區域的第一個胺基酸和最後一個胺基酸。指定編號是指源自AD169毒株且如SEQ IDNO:1所示的CMV gB序列的胺基酸位置。
圖2是其中公開的其他示例性CMV gB多肽的圖示。所有多肽都包含突變的融合環FLl和FL2。gB-SLP12-Deltall3額外缺失跨膜結構域和細胞質結構域的C末端部分，即胺基酸794至906。gB-SLP12-Delta725額外缺失整個細胞質結構域且保留部分跨膜結構域。LVL759 (或 gB-SLP12-Delta725-LVL759)、LVL776 (或 gB-SLP12-Delta725_LVL776)和 CD33 (或 gB-SLP12-Delta725-CD33)的骨架與 gB_SLP12_Delta725 相同，除 N 端末端以夕卜，其中胺基酸序列如所指示變化。指定編號是指源自AD169毒株且如SEQ ID NO:1所示的CMV gB序列的胺基酸位置。
圖3顯示對應於構建體gB_SLP12的pMax質粒圖譜。
圖4顯示對應於構建體gB-SLP12_Delta725的pTT5質粒圖譜。
圖5顯示與現有技術的缺失跨膜結構域的CMV gB多肽的表達和分泌水平相比，在CHO細胞中重組表達的三種不同示例性gB多肽的表達和分泌水平。顯示的是使用抗gB抗體的Western印跡分析,其表明由用指定gB構建體轉染的不同培養物產生的細胞部分(表示gB的未分泌形式)和培養物上清液(表 示gB的分泌形式)中存在的gB蛋白(位於150 kDa和100 kDa之間的印跡上)的水平。泳道MW:分子量梯度，泳道A:用gB-DeltaTM轉染的培養物的細胞部分(C-Fr)，泳道B:用gB-SLP12轉染的培養物的C_Fr，泳道C:用gB-SLPl-Del2轉染的培養物的C_Fr，泳道D:用gB_SLP12_Del2轉染的培養物的C_Fr，泳道E:用gB-DeltaTM轉染的培養物的培養物上清液(C-Sn)，泳道F:用gB_SLP12轉染的培養物的C-Sn，泳道G:用gB-SLPl-Del2轉染的培養物的C_Sn，泳道H:用gB-SLP12_Del2轉染的培養物的C-Sn。
圖6顯示與缺失跨膜結構域的現有技術CMV gB多肽的表達和分泌水平相比，在CHO細胞中重組表達的三種不同本發明示例性gB多肽(gB-SLP12、gB-SLP12_Deltall3、和gB-SLP12-Delta725)的表達和分泌水平。顯示的是使用抗gB抗體的定量Elisa測定，其顯示細胞部分(黑條-代表gB的未分泌形式)和培養物上清液(灰條-代表gB的分泌形式)中存在gB的蛋白的水平。
圖7顯示在CHO細胞中重組表達的本發明的其他示例性gB多肽的表達和分泌水平。顯示的是使用抗gB抗體的三次Western印跡分析,其表明由用指定gB構建體轉染的不同培養物產生的細胞部分(C-Fr,表不gB的未分泌形式)和培養物上清液(C-Sn,表不gB的分泌形式)中存在的gB蛋白(位於150 kDa和100 kDa之間的印跡上)的水平。圖7八-泳道麼、8^、1、1^和N代表總共2600個細胞中存在的蛋白的量。泳道C、D、G、H、K、L、0和P代表總共520個細胞中存在的蛋白的量。泳道MW:分子量梯度，泳道A和C:用gB-DeltaTM轉染的培養物的C_Fr，泳道B和D:用gB-DeltaTM轉染的培養物的C_Sn，泳道E和G:用gB-SLP12轉染的培養物的C-Fr，泳道F和H:用gB_SLP12轉染的培養物的C_Sn，泳道 I 和 K:用 gB-SLP12-Delta 725 轉染的培養物的 C_Fr，泳道 J和 L:用 gB_SLP12_Delta725轉染的培養物的C-Sn，泳道M和O:用gB-Delta725轉染的培養物的C-Fr (具有完整融合環)，泳道N和P:用gB-Delta725轉染的培養物的C-Sn (具有完整融合環)。圖7B -泳道1、2、5、6、1，、2，、5，和6』代表總共2600個細胞中存在的蛋白的量。泳道3、4、7、8、3』、4』、7』和8』代表總共520個細胞中存在的蛋白的量。泳道麗:分子量梯度，泳道I和3:用gB-SLP12-Delta725轉染的培養物的C-Fr，泳道2和4:用gB-SLP12_Delta725轉染的培養物的C-Sn，泳道5和7:用gB-Delta725轉染的培養物的C-Fr (具有完整融合環)，泳道6和8:用gB-Delta725轉染的培養物的C-Sn (具有完整融合環)，泳道I』和3』:用gB-SLP12-Deltall3轉染的培養物的C_Fr，泳道2』和4』:用gB_SLP12_Deltall3轉染的培養物的C-Sn，泳道5』和V:用gB-Deltall3轉染的培養物的C-Fr (具有完整融合環)，泳道6』和8，:用gB-S LP12-Deltall3轉染的培養物的C-Sn (具有完整融合環)。
圖8顯示在CHO細胞中重組表達的本發明的其他示例性gB多肽的表達和分泌水平。圖8A -顯示的是使用抗gB抗體的Western印跡分析,其表明由用指定gB構建體轉染的不同培養物產生的細胞部分(C-Fr，表示gB的未分泌形式)和培養物上清液(C-Sn，表示gB的分泌形式)中存在的gB蛋白(位於150 kDa和100 kDa之間的印跡上)的水平。泳道a、b、c、d、1、j、k和I代表總共11700個細胞中存在的蛋白的量，而泳道e、f、g、h、m、n、o和p代表總共5100個細胞中存在的蛋白的量。泳道麗:分子量梯度，泳道a和e:用gB-SLP12-Delta725轉染的培養物的C_Sn，泳道i和m:用gB-SLP12_Delta725轉染的培養物的C-Fr，泳道b和f:用⑶33轉染的培養物的C-Sn，泳道j和η:用⑶33轉染的培養物的C-Fr,泳道c和g:用LVL759轉染的培養物的C_Sn，泳道k和ο:用LVL759轉染的培養物的C-Fr,泳道d和h:用LVL776轉染的培養物的C_Sn，泳道I和p:用LVL776轉染的培養物的C-Fr。圖8B -顯示的是使用抗gB抗體的定量Elisa測定，其顯示細胞部分(黑條-代表gB的未分泌形式)和培養物上清液(灰條-代表gB的分泌形式)中存在gB的蛋白的水平。
圖9顯示如戊二醛誘導的交聯所分析，多肽gB-DeltaTM、gB_SLP12和gB-SLPl-Del2在CHO細胞中重組表達後的產物概況。顯示的是聚丙烯醯胺凝膠的圖像。箭頭表示不同大小的多聚體。已經使用遞增劑量(0、0.5,1%)的戊二醛。泳道MW:分子量梯度，泳道A:gB-DeltaTM - 0%戊二醛，泳道B:gB_DeltaTM - 0.5%戊二醛，泳道C:gB_DeltaTM-1% 戊二醛，泳道 D:gB-SLP12 - 0% 戊二醛，泳道 E:gB-SLP12 - 0.5% 戊二醛，泳道F:gB-SLP12 - 1% 戊二醛，泳道 G:gB-SLPl-Del2 - 0% 戊二醛，泳道 H:gB-SLPl-Del2 -0.5% 戊二醛，和泳道 1: gB-SLPl-Del2 - 1% 戊二醛。
圖10顯示如分析超離心(AUC)所分析，多肽gB-DeltaTM、gB_SLP12和gB-SLPl-Del2在CHO細胞中重組表達後的產物概況。如所示，峰表示不同大小的多聚體。如所示，還規定每個肽群體中所鑑定的多聚體的百分比。
圖11顯示如所示且如分析超離心(AUC)所分析,其他示例性CMV gB多肽在CHO細胞中重組表達後的產物概況。如所示，峰表示不同大小的多聚體。如所示，還規定每個肽群體中所鑑定的多聚體的百分比。圖1lA -顯示在有或沒有Pluronic存在的情況下獲得的gB-SLP12-Deltall3多肽(如圖中的gB-Deltall3所指示)的產物概況。圖1lB -顯示在有或沒有Pluronic存在的情況下獲得的gB-SLP12-Delta725多肽(如圖中的gB_Delta725所指示)的產物概況。
圖12顯示通過對在CHO細胞中重組表達和分泌後且在信號序列裂解掉之後生成的所示多肽的N端末端進行MS/MS圖譜分析的肽分析。圖12A指示信號序列裂解掉之後重組表達的gB-SLP12-Delta725群體內具有不同N端胺基酸的不同多肽的相對豐度。圖12B指示信號序列裂解掉之後重組表達的gB-SLP 12-Delta725_LVL759群體內存在的具有不同N端胺基酸的不同多肽的相對豐度。圖12C指示信號序列裂解掉之後重組表達的gB-SLP12-Delta725-LVL776群體內存在的具有不同N端胺基酸的不同多肽的相對豐度。圖12D指示信號序列裂解掉之後重組表達的gB-SLP12-Delta725-CD33群體內存在的具有不同N端胺基酸的不同多 肽的相對豐度。
圖13顯示如通過基於UV的大小排阻層析(SEC-UV)所分析的，多肽gB-DeltaTM、gB-S50-DeItaTM和gB_SLP12在CHO細胞中重組表達後的產物概況。峰表示所示大小的多聚體。
圖14顯示使用抗gB抗體或抗His抗體的Western印跡分析,其顯示所示多肽在重組表達、分泌、純化和去糖基化後的gB蛋白含量。圖14A對應於gB-DeltaTM且顯示以抗gB抗體探測的Western印跡。圖14B對應於gB_SLP12且顯示以抗gB抗體(泳道2)和抗gB抗體(泳道3)探測的Western印跡。圖14C對應於gB_SLP12_Deltall3且顯示以抗His抗體(泳道A)和抗gB抗體(泳道B)探測的Western印跡。圖14D對應於gB_SLP12_Delta725且顯示以抗His抗體(泳道C)和抗gB抗體(泳道D)探測的Western印跡。
圖15呈現免疫原性數據。圖15A顯示施用為注射而配製的所示多肽後誘導的中和滴度。圖15B顯示施用為注射而配製的所示多肽後誘導的ELISA抗gB抗體滴度。
圖16顯示如下文所述的序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 21。
序列表說明SEQ ID NO: 1-來自CMV AD169毒株的全長gB多肽的胺基酸序列。
SEQ ID NO:2 -來自CMV AD169毒株的gB-DeltaTM多肽的胺基酸序列。
SEQ ID NO:3 -來自CMV AD169毒株的gB- SLP12多肽的胺基酸序列。
SEQ ID NO:4 -來自CMV AD169毒株的gB_SLP12_Del2多肽的胺基酸序列。
SEQ ID NO:5 -來自CMV AD169毒株的gB_SLPl_Del2多肽的胺基酸序列。
SEQ ID NO:6 -編碼來自CMV AD169毒株的gB- SLP12多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7 -編碼來自CMV AD169毒株的gB_SLPl_Del2多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO:8 -編碼來自CMV AD169毒株的gB_SLP12_Del2多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 9 -編碼來自CMV AD169毒株的gB_SLP12_Delta725多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 10 -來自 CMV AD169 毒株的 gB_SLP12_Delta725 多肽的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 11 -編碼來自 CMV AD169 毒株的 gB_SLP12_Deltall3 多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 12 -來自 CMV AD169毒株的 gB_SLP12_Deltall3 多肽的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 13 -編碼來自 CMV AD169 毒株的 gB-SLP12-Delta725_LVL759 (或LVL759)多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 14 -來自 CMV AD169 毒株的 gB-SLP12-Delta725_LVL759 (LVL759)多肽的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 15 -編碼來自 CMV AD169 毒株的 gB-SLP12-Delta725_LVL776 (或LVL776)多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 16 -來自 CMV AD169 毒株的 gB-SLP12-Delta725_LVL776 (或LVL776)多肽的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 17 -編碼來自 CMV AD169 毒株的 gB-SLP12-Delta725_CD33 (或CD33)多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 18 -來自 CMV AD169 毒株的 gB-SLP12-Delta725_CD33 (或 CD33)多肽的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 19 -來自 CMV AD169 毒株的成熟形式的 gB-SLP12-Delta725_LVL759(或LVL759)多肽的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 20 -來自 CMV AD169 毒株的成熟形式的 gB-SLP12-Delta725_LVL776(或LVL776)多肽的胺基酸序列。
SEQ ID N0:21 -來自 CMV AD169 毒株的成熟形式的 gB-SLP12-Delta725_CD33(或CD33)多肽的胺基酸序列。
詳述 本發明涉及新的CMV gB多肽，其呈現優秀的免疫原性和優異的工藝特徵。本發明的gB多肽特別適合作為用於免疫原性組合物如疫苗中包含的抗原。具體而言，本發明的gB多肽顯示了改進的同質產品概況。事實上，本發明人觀察到，表達後，現有技術的gB多肽，如缺乏跨膜結構域的gB多肽(gB-DeltaTM)，組裝成不同大小的多聚體，包括高分子量多聚體，使群體不均勻。他們還觀察到，多聚體概況不是一致的，因為給定大小的多聚體的比例從一個實驗到另一個實驗變化。這種類型的可變性和不一致性在疫苗製劑的方面是不能接受的。因此，仍然需要呈現改進的同質且一致的概況產品的CMV gB多肽。此外，聚集成高分子量多聚體可以對重組多肽的後續的純化過程具有負面影響，因為聚集尤其可能導致可溶性較差形式的多肽。因此，仍然需要呈現改進的加工特徵的CMV gB多肽。
缺乏跨膜結構域的CMV gB多肽描述於EP O 802 979中。
令人驚訝的是，本發明人觀察到，在這樣的缺乏跨膜結構域的CMV gB多肽的特定區域引入突變導致改進的概況產品，使得該群體不僅比相應的非突變多肽更同質，而且它還顯示出從一個實驗到另一個實驗一致的概況。具體而言，減少高分子量多聚體且三聚體的比例增加了兩倍係數。通常，三聚體佔本發明的CMV gB多肽群體的至少50%，合適地至少60%，且更合適地至少70 %。與缺乏跨膜結構域的CMV gB多肽相比，這些突變既不影響表達水平,也不影響獲得的突變體的分泌水平。這些突變位於已知負責誘導免疫應答的CMVgB抗原表位之外。觀察到的從其中多肽組裝成高分子量多聚體(如現有技術的缺乏跨膜結構域的多肽)的群體轉 變為其中多肽具有改進的三聚體化概況的群體與多肽的更容易且更好純化相關。具體而言，本發明人觀察到，本發明的多肽的純化產率顯著高於用現有技術的缺乏跨膜結構域的CMV gB多肽獲得的純化產率。產率改進是至少2倍，且可能至少3至5倍。此外，還顯示本發明的新的多肽的進一步突變導致所述多肽比現有技術多肽更有效地表達和分泌。這種特性代表了在用於疫苗製造(在該領域中抗原生產通常是限制因素)的抗原生產方面的顯著優勢。
本發明人還觀察到，現有技術的gB多肽，如缺乏跨膜結構域的CMV gB多肽，呈現了在多肽的N末端和C末端的異質性。事實上他們觀察到，在gB的C末端胞質結構域中進行的剪切在細胞中重組表達和分泌後導致至少兩種不同形式的具有不同大小的多肽。對於免疫原性組合物如疫苗中包含的目的，在其主要由一種單一形式構成的意義上說，gB多肽優選具有同質群體。本發明人發現，在缺失C末端胞質結構域的至少一部分時，剪切不再發生且獲得的多肽群體主要由一種單一形式的gB構成。
同樣地，本發明人觀察到，現有技術的gB多肽，如缺乏跨膜結構域的CMV gB多肽，呈現了在多肽的N末端部分的異質性。事實上，本發明人觀察到，信號序列，當多肽重組表達和分泌後，被信號肽酶在不同的胺基酸位置裂解，因此產生在N末端具有不同末端的gB成熟多肽的群體，即由在N末端具有不同胺基酸的gB多肽構成的群體。這種現象也被稱為信號肽酶「woobling」。對於效力的目的，且尤其對於一致性，在疫苗領域重要的是，待包括在疫苗中的抗原儘可能地同質且儘可能地未降解，使得疫苗批次是可重複且一致的。
應當理解的是，在本發明的意義上，改進的同質產品概況是指本發明的CMV gB多肽的群體，在它們的重組表達後，由至少50%的三聚體構成，例如，如通過分析超離心所測量的(參見實施例2，第1.2部分)。通常，包含本發明的CMV gB多肽群體的製劑由至少50 %，合適地至少60 %，且更合適地至少70 %的三聚體構成。在本說明書中，這種至少50 %的三聚體的概況也將被稱為「改進的三聚體化概況」或「富含三聚體的概況」。這些術語被認為是同義的且可互換的。
當提到多肽的C末端部分的「同質/異質性」時，異質群體是指該群體由至少兩種具有不同大小的多肽構成，而同質群體應當被理解為主要由給定大小的單一多肽構成的群體。
當提到多肽的N末端部分的「同質/異質性」時，異質群體是指該群體由各自在N末端以不同胺基酸開始的不同成熟多肽構成。相反，根據本發明，同質群體應當被理解為主要由單一成熟多肽構成的群體，該多肽在N末端不變地以相同的給定胺基酸開始。在本發明中，「成熟」多肽是指其中信號序列已經被裂解掉的多肽。通常，在本發明的意義上，在N末端均質群體中，超過30 %，合適地至少80 %，更合適地80 %至90 %，更合適地至少99 %的裂解信號序列後產生的成熟多肽在N末端以相同的胺基酸開始。因此，在一個實施方案中，提供了製劑，其包含裂解信號序列後產生的成熟CMV gB多肽的群體，其中至少30%，至少80 %，80 %至90 %的成熟gB多肽在N末端包含相同的胺基酸。具體而言，本發明的成熟多肽合適地在N末端位置以絲氨酸或組氨酸開始。
gB是具有許多作用的包膜糖蛋白B，作用之一是參與巨細胞病毒與宿主細胞的融合。其由HCMV基因組的UL55基因編碼。gB的天然形式的大小依賴於開放讀碼框(ORF)的大小，其可能根據毒株存在一些變化。例如，AD169毒株的ORF(其長度為2717 bp)編碼906個胺基酸的全長gB,而Towne毒株的ORF編碼907個胺基酸的全長gB。雖然本發明適用於源自任何CMV毒株的gB蛋白，但是，為了便於理解，當本說明書提及胺基酸位置時，編號是相對於源自AD169毒株的SEQ ID NO:1的gB多肽的胺基酸序列而給出的，除非另有說明。然而，本發明不限於AD169毒株。本領域普通技術人員可以通過使用容易地可獲得且眾所周知的比對算法(如BLAST)來比對胺基酸序列，從而確定在任何其他CMV毒株的gB多肽的可比較的胺基酸位置。相應地，當提及「其他CMV gB多肽」時，其應當被理解為不同於AD169的任何毒株的CMV gB多肽。AD169 gB的天然形式在蛋白的N末端至C末端方向含有(也參見圖1)⑴已知參與多肽胞內運輸、包括朝向分泌靶向多肽的胺基酸信號序列，或信號肽，隨後為(ii)被稱為前導序列的區域，(iii)在SEQ ID NO:1中所示的序列的胺基酸456和460之間含有弗林蛋白酶類型的蛋白內切水解裂解位點的細胞外結構域，(iv)跨膜結構域和(V) C末端胞質結構域。此外，基於與源自不同的皰疹病毒(如HSV)的gB蛋白的序列比對，已經在CMV gB的胺基酸序列中將幾段胺基酸序列鑑定為推定的融合環(Backovic等人.2007.J.Virol.81(17): 9596-600)。實驗確定了 HSV 融合環(Hannah, B.P.等人.2009.J.Virol.83(13): 6825-6836)。如此稱呼所述幾段序列是因為它們參與病毒與宿主細胞融合。根據上述文獻，通過在CMV gB中的序列比對鑑定了兩個推定的融合環，其在本說明書的剩餘部分被稱為FLl和FL2。所述融合環位於跨膜結構域上遊的蛋白的細胞外結構域中。
令人驚訝地，本發明人觀察到，通過特異性胺基酸突變破壞具有非功能性跨膜結構域的CMV gB多肽的融合環FLl和FL2產生下列產物，與具有非功能性跨膜結構域、但具有完整的融合環的CMV gB多肽相比，所述產物在表達後呈現改進的三聚體化概況。相應地，在一些實施方案中，本發明的CMV gB多肽包含突變，如例如融合環FLl或FL2中至少一個(可能兩者)的胺基酸取代或缺失。合適地，本發明的多肽在融合環FLl中包含至少一個胺基酸取代或缺失。合適地，本發明的多肽在融合環FL2中包含至少一個胺基酸取代或缺失。更合適地，本發明的CMV gB多肽包含融合環FLl和FL2兩者的突變並且這樣突變的CMV gB多肽形成本發明的目的。例如，本發明的gB多肽在融合環FLl中包含至少一個胺基酸取代或缺失並且在融合環FL2中包含至少一個胺基酸取代或缺失。
在本發 明的意義上，包括CMV AD169 gB的融合環FLl的胺基酸序列，即，FLl的胺基酸序列被定義為SEQ ID NO:1所示的序列的155Y.1.Y157。同樣地，在本發明的含義內，包括融合環FL2的胺基酸，即FL2的胺基酸序列，被定義為SEQ ID NO:1所示的序列的24°W.L.Y242 0在來自其他CMV毒株的gB多肽內，例如，通過序列比對，可以鑑定對應的融合環FLl和FL2序列。破壞所述融合環可以包括任何類型對於這些胺基酸三聚體的突變，無論通過缺失或點突變，如胺基酸取代，其產生下列產物，所述產物在重組表達後具有富含三聚體的改進的概況，與非突變形式相比，其是具有更大比例的三聚體形式多肽的產物。關於FLl的非限制性的合適突變是選自SEQ ID N0:1所示序列的155Y.1.Y157胺基酸、或在源自不同毒株的其他CMV gB多肽的對應位置的至少一個、適當地至少兩個胺基酸的缺失或被一定胺基酸取代，所述胺基酸是極性胺基酸，具體而言，非芳族極性胺基酸，更具體地，選自帶正電荷的胺基酸賴氨酸(K)、組氨酸(H)和精氨酸(R)的胺基酸。相應地，在一些實施方案中，本發明的CMV gB多肽，特別是具有非功能性跨膜結構域的多肽，具有突變的融合環FLl，其中至少異亮氨酸(I156)，合適地至少酪氨酸(Y155)，合適地至少酪氨酸(Y157)，被組氨酸(H)取代，或缺失。可替代地，本發明的CMV gB多肽具有突變的融合環FL1，其中至少酪氨酸(Y157)被精氨酸(R)取代。在一個特定實施方案中，本發明的CMV gB多肽，特別是具有非功能性跨膜結構域的多肽，具有突變的融合環FL1，其中至少異亮氨酸(I156)和酪氨酸(Y157)分別被組氨酸(H156)和精氨酸(R157)取代，或缺失。在一個進一步實施方案中，本發明的具有非功能性跨膜結構域的CMV gB多肽具有突變的融合環FL1，其中至少酪氨酸(Y155)被甘氨酸(G)取代，或者缺失，任選地組合，異亮氨酸(I156)被組氨酸(H)取代或缺失，或者組合，酪氨酸(Y157)被精氨酸(R)取代或缺失，或組合上述兩種取代或缺失。在一個特定的實施方案中，本發明的具有非功能性跨膜結構域的CMV gB多肽具有突變的融合環FL1，其中SEQ ID NO:1所示的序列或在源自不同毒株的其他CMV gB多肽的對應位置的三個胺基酸155Y.1.Y157，被胺基酸155G.H.R157取代，或者缺失。FLl結構域的突變可以以另一種方式定義。如下所述，可以使用疏水性指數，如Kyte和Dolittle指數確定特定胺基酸序列的疏水性(Kyte等人.1982.J.Mol.Bi0.157: 105-132)。包括胺基酸155Y.1.Y157的FLl結構域在該指數上實現了 1.9的評分。在一個實施方案中，在本發明的CMV gB多肽中，位於SEQ ID N0:1所示的序列的155-157位、或在其他的CMV gB多肽的對應位置處的一段胺基酸序列Y.1.Y被下列一段三個胺基酸序列取代，所述胺基酸序列如使用Kyte和Doolittle指數所測量的小於-3，特別是小於-7，更特別是小於-8的疏水性評分。所有三個胺基酸可以不被同時取代，只要一段胺基酸序列的總評分達到上述規定值。例如，3個胺基酸長的一段序列中的只有一個或兩個胺基酸可以被取代，然後分別基於被取代的胺基酸(即一個或兩個)的同一性加上天然的胺基酸(兩個或一個)的同一性計算評分。
關於FL2的非限制性的合適突變是選自SEQ ID NO:1所示序列的24°W.L.Y242、或在源自不同毒株的其他CMV gB多肽的對應位置的至少一個、適當地至少兩個胺基酸的缺失或被一定胺基酸取代，所述胺基酸是選自賴氨酸(K)、組氨酸(H)和精氨酸(R)的胺基酸的帶正電荷的胺基酸，合適地組氨酸⑶。相應地，在一些實施方案中，本發明的CMV gB多肽具有突變的融合環FL2，其中至少酪氨酸(Y242)，合適地至少亮氨酸(L241)，合適地至少色氨酸(W24°)，被組氨酸(H)取代，或缺失，任選地組合，如上所述的突變的融合環FLl。在特定的實施方案中，本發明的CMV gB多肽具有突變的融合環FL2，其中SEQ ID NO:1所示的序列或在源自不同毒株的其他CMV gB多肽的對應位置的三個胺基酸24°W.L.Y242，被胺基酸24°A.F.H242取代，任選地組合，如上所述的突變的FLl突變。
關於FLl和/或FL2融合環的突變不限於上述突變。進一步突變，無論是否除上述的突變以外，可以進行，如，例如，突變SEQ ID NO:1所示序列、或在源自不同毒株的其他CMV gB多肽的對應位置的上述三聚體155Y.1.Y157和24°W.L.Y242周圍的胺基酸，只要獲得的突變體多肽呈現改進的富含三聚體的概況，且所述進一步突變不幹擾當在宿主細胞中重組表達時多肽的生產(表達和分泌)、加工或穩定性。
本發明人還觀察到，組合多肽的至少一個融合環(FLl和/或FL2)的突變，如任何上述突變，和多肽的C末端胞質結構域中的額外突變還提供了具有改進三聚體化概況的CMV gB多肽。在本發明的意義上，gB CMV多肽的C末端胞質結構域應當被理解為位於跨膜結構域下遊的結構域(還參見圖1)。具體而言，在C末端胞質結構域的額外突變合適地涉及疏水性區域的缺失，合適地富含脯氨酸的區域，合適地親水性高的、帶負電荷的區域，可能所有這些區域。作為非限制性實例，合適的突變對應於SEQ ID NO:1所示序列的胺基酸825至877的缺失，其被稱為Del2。上述缺失的序列的描述是不嚴格限於胺基酸位置825至877，且可能發生變化，只要獲得的突變體多肽呈現改進的富含三聚體的概況，且在當在宿主細胞中重組表達時的生產、處理或穩定性方面不受影響。相應地，在一些實施方案中，本發明的CMV gB多肽包含至少一個融合環(FLl和/或FL2)、合適地FLl的突變和在C末端胞質結構域中至少一個疏水區、一個富含脯氨酸區和一個高親水性區的缺失，特別是SEQID NO:1所示序列的胺基酸825至877的缺失(Del2)。
胺基酸序列或其片段的疏水性由組成該序列或其片段的胺基酸的類型決定。通常根據胺基酸的側鏈將胺基酸分成不同組。例如，一些側鏈被視為非極性的，即疏水性的，而一些其他的被視為極性的。在本發明的意義上，丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)和色氨酸(W)被視為是疏水性胺基酸的部分，而絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、天冬醯胺(N)、穀氨醯胺(Q)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)、賴氨酸(K)、精氨酸(R)、組氨酸(H)、天冬氨酸(D)和穀氨酸(E)被視為是極性胺基酸的部分。無論胺基酸的疏水性，也基於其側鏈共有的共同特性將胺基酸分成亞組。例如，苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸被共同分類成芳族胺基酸，且將被視為本發明的含義內的芳族胺基酸。天冬氨酸(D)和穀氨酸(E)是酸性或帶負電荷的胺基酸的部分，而賴氨酸(K)、精氨酸(R)和組氨酸(H)是鹼性或帶正電荷的胺基酸的部分，且它們將因此被視為本發明的意義內。可以獲得疏水性指數，其採用20個胺基酸中每一個的疏水性和親水性特性，且將疏水性評分分配到每個胺基酸，因此生成疏水性排序。僅僅作為示例性實例，可以引用如前所述的 Kyte 和 DolUtle 指數(Kyte 等人.1982.J.Mol.Bi0.157: 105-132)。此指數允許計算在一個預定長度的區段內的平均疏水性。相應地，技術人員可以將胺基酸序列中的疏水區鑑定為用於本發明的突變的潛在靶標。然後可以如下所述測試所述區域的突變誘導獲得的突變蛋白的改進的產品概況(即有利於群體內的三聚體群體)的能力。疏水性區域的突變可以在於如上所述的區域或其部分的缺失，或在於所述區域內用極性胺基酸取代疏水性胺基酸的點突變。將通過分析在宿主細胞中重組表達後所述突變對突變多肽的產物概況的獲得的作用測定突變的相關性，即相關突變將誘導其中至少50%，合適地至少60%，且更適合地至少70%三聚體存在於突變多肽群體中的改進的富含三聚體的概況。本發明人觀察到，C端細胞質結構域可以不同程度缺失，同時保持如上文所述的改進的產物概況。因此，本發明考慮CMV gB 多肽，其中合適地10%，更合適地20%，更合適地60%，更合適地80%，更合適地90%的細胞質結構域胺基酸缺失。可能缺失整個細胞質結構域。具體而言，本發明人觀察到，當缺失至少70%，合適地至少80%，或更多細胞質結構域時，獲得的CMVgB多肽在宿主細胞中重組表達時顯示更好的表達和分泌水平。因此，在一些實施方案中，本發明的CMV gB多肽包含至少一個融合環(FLl和/或FL2)，合適地FLl，或可能其兩者的突變，和整個細胞質結構域的缺失，例如SEQ ID NO:1中所示序列的胺基酸776至906或其他CMV gB多肽中的相應位置處的胺基酸的缺失。
允許根據大小或密度區分群體內成分(諸如可能彼此聚集的純化多肽)的任何方法可以用於監測產物概況，且因此用於確定給定突變是否賦予如上文所述的改進的概況產物。合適方法可以基於沉降，諸如分析型超離心(AUC)，或層析，具體而言，大小排阻層析法，諸如基於UV的大小排阻層析法(SEC-UV)。或者，用於評估蛋白或多肽樣品內的聚集水平的方法可以在於以交聯劑處理樣品，從而在兩種或多於兩種蛋白或多肽之間形成共價鍵。戊二醛可以合適地用作交聯劑。交聯後，將樣品上樣至變性條件下的凝膠(諸如SDS-PAGE)上，且針對蛋白的存在例如以考馬斯藍或硝酸銀染色凝膠，將表現聚集體(如果存在)，其根據其分子量進行分離。平行上樣由已知分子量的蛋白構成的階梯將允許測定不同聚集體的分子量。只要已知最小單元(諸如其單體形式的多肽)的分子量，那麼所觀察的聚集體分子量將提示聚集體內的多聚體化水平。例如，缺失跨膜結構域的CMV AD169 gB多肽的長度為838個胺基酸。如果認為胺基酸的平均分子量為110 kDa，那麼該多肽的預期分子量為92 kDa。因此，如果該多肽聚集，那麼獲得的多聚體的平均分子量預期將是92的倍數。具體而言，如果形成三聚體，那麼由3個缺失跨膜結構域的gB分子構成的這種三聚體的預期平均分子量為276 kDa ο
融合環FLl和/或FL2中的任何上述突變可以與其他突變組合。具體而言，本發明的CMV gB多肽應當理解為具有非功能跨膜結構域且包含進一步特定突變，諸如融合環突變。可以通過使用能夠從胺基酸序列用公式表示親水性指數的電腦程式，使用20個胺基酸的疏水性和親水性特性來預測跨膜結構域在多肽內的位置(Kyte等人.1982.J.Mol.Bi0.157: 105-132)。隨著程序移動通過序列，連續計算序列的預定長度區段內的平均親水性。然後將這些連續親水性評分從N端至C端繪圖，且中點線對應於大多數已知測序蛋白中發現的胺基酸組合物的總親水性平均值進行印記。膜結合蛋白表現在對應於嵌入膜的脂質雙分子層中的序列部分的 線的疏水性側的大的非中斷區域。跨膜結構域負責將多肽錨定至細胞膜。在病毒包膜糖蛋白中，跨膜結構域通常在多肽的C端部分附近含有幾段具有20-27個不帶電荷的主要疏水性胺基酸。如上文所述關於CMV gB的親水性分析的應用的實例可以是引用的Spaete等人的公開(Spaete等人，1988, Virology 167: 207-225)。實際上，作者在來自毒株AD169和Towne的CMV gB多肽中鑑定出gB多肽的C端附近的容易顯現為兩個相鄰寬疏水性峰的推定的疏水性跨膜結構域。第一個包含胺基酸715至748且第二個包含胺基酸752至772 (編號對應於來自如SEQ ID NO:1所示的AD169毒株的gB多肽的胺基酸序列)。Reschke等人的公開(Reschke等人，1995，J.0f Gen.Virology76:113-122)另外鑑定作為AD169 CMV gB的推定跨膜結構域的第二段胺基酸751至771。這兩個公開因此提出，AD169 CMV gB的推定跨膜結構域包括至少胺基酸751至771，且可能包括胺基酸714至771。在本發明的意義上，CMV gB多肽的跨膜結構域涵蓋至少SEQ IDNO:1中所示序列的胺基酸701至775或其他CMV gB多肽中的相應位置處的胺基酸，且因此長度為74個胺基酸。
「非功能跨膜結構域」在本發明含義中應當理解為至少部分推定跨膜結構域進行改變使得能夠在宿主細胞中表達後從宿主細胞分泌獲得的多肽。在一個實施方案中，本發明的gB多肽缺失整個跨膜結構域。在可替代的實施方案中，本發明的CMV gB多肽保留一部分跨膜結構域。具體而言，CMV gB多肽保留至少5%，合適地至少10%，更合適地至少20%，更合適地至少30%，或至少50%跨膜結構域胺基酸。因此，在一些實施方案中，本發明的CMVgB多肽中缺失至少50%跨膜結構域胺基酸數目，合適地至少70%，更合適地至少80%，更合適地至少90%和甚至95%跨膜結構域胺基酸數目缺失。根據一個特定實施方案，通過缺失SEQ ID NO:1中所示序列的胺基酸701至775或其他CMV gB多肽中的相應位置處的胺基酸使本發明的CMV gB多肽的跨膜結構域變得沒有功能。基於測定跨膜結構域在多肽內的位置的上述預測，缺失程度可以進一步變化，只要獲得的缺失的CMV gB多肽在宿主細胞中表達後從所述細胞分泌。跨膜結構域的功能改變不限於胺基酸缺失。改變可以在於任何其他類型的胺基酸突變，諸如插入和/或取代。胺基酸的缺失、插入和取代也可以任何方式組合，只要獲得的突變CMV gB多肽在宿主細胞中表達後從所述細胞分泌。評估給定突變(諸如例如缺失跨膜結構域的給定部分)對獲得的突變多肽從細胞分泌的能力的影響在技術人員的能力範圍內。可檢測多肽的分泌且通過本領域已知的任何技術評估分泌水平。作為非限制性說明性實例，可能分開測量保留於細胞內的表達多肽的含量，且其在表達後分泌至細胞培養物上清液或細胞培養基中。通常，在表達後收集細胞培養物上清液，隨後根據任何常用裂解方法裂解細胞，由此提供兩個部分，細胞部分和上清液部分。然後可以通過本領域中已知的任何蛋白檢測技術測量各部分中的多肽含量。例如，可以通過Western印跡或ELISA測定檢測多肽。
「包含至少一部分胞外結構域」在本發明含義中應當理解為至少部分胞外結構域包含或涵蓋融合環FLl和FL2。胞外結構域中在融合環之外的其他胺基酸的數目可以變化。本發明多肽中存在的胞外結構域的適當胺基酸數目或胺基酸百分比應當使得獲得的多肽包含抗原表位且呈現改良的三聚體化概況。合適地，至少50%、更合適地至少70%、更合適地至少80%和甚至90%胞 外結構域胺基酸保留於本發明多肽中，所述百分比必需涵蓋融合環FLl和FL2。在一個實施方案中，本發明的CMV gB多肽保留整個胞外結構域，所述結構域在兩個融合環FLl和FL2之一、可能兩者中包含至少一個突變。
保留「至少一部分細胞質結構域」意味著表達和分泌必需的胺基酸數目。合適地，本發明的CMV gB多肽包含至少5%，更合適地至少10%，且可能20%或20%以上細胞質結構域胺基酸。因此，在一些實施方案中，本發明的CMV gB多肽中至少80%，至少90%或至少95%細胞質結構域胺基酸缺失。在進一步實施方案中，本發明的CMV gB多肽缺失整個細胞質結構域。
跨膜結構域的突變(諸如例如缺失其至少部分)可以與細胞質結構域突變(諸如例如缺失其至少部分)組合。任何組合都考慮在本發明中，只要獲得的突變CMV gB多肽如上文所述在宿主細胞中表達後從所述細胞分泌且呈現改進的三聚體化概況。因此，在特定實施方案中，本發明的CMV gB多肽缺失整個跨膜結構域和整個細胞質結構域。在可替代的實施方案中，本發明的CMV gB多肽缺失整個跨膜結構域且保留至少部分細胞質結構域，諸如例如其10%。在進一步可替代的實施方案中，本發明的CMV gB多肽缺失整個細胞質結構域且保留至少30%跨膜結構域。
令人驚訝地，本發明人觀察到，融合環FLl和/或FL2的突變與缺失至少部分細胞質結構域(可能缺失其全部)和缺失至少部分跨膜結構域(可能缺失其全部)組合，提供與現有技術的多肽相比更有效表達和分泌的多肽。
此外，本發明人觀察到，現有技術的CMV多肽的信號序列，當多肽重組表達和分泌後，被信號肽酶在不同的胺基酸位置裂解，因此產生在N末端具有不同末端的gB成熟多肽的群體，即由在N末端具有不同胺基酸的gB多肽構成的群體。令人驚訝地，他們觀察到在gB多肽的前導序列中引入突變導致信號序列主要在一個位點處裂解，因此產生在N端具有相同胺基酸的成熟gB多肽的均質群體。因此，在一個實施方案中，提供了製劑，其包含裂解信號序列後產生的成熟CMV gB多肽的群體，其中至少30%，至少80%，80%至90%的成熟gB多肽在N末端包含相同的胺基酸。具體而言，本發明的成熟多肽合適地在N末端位置以絲氨酸或組氨酸開始。本發明的一個目標是提供包含至少40%，合適地至少50%，更合適地至少70%，更合適地至少80%，或甚至至少90%前導序列胺基酸缺失的CMV gB多肽。在一個實施方案中，提供包含整個前導序列缺失的CMB gB多肽。本發明人還觀察到，上述前導序列缺失可以與合適地在信號肽的C端部分中的信號序列中出現的突變(諸如至少一個胺基酸取代)組合。或者，所述信號序列可以包含至少一個胺基酸插入，合適地在信號肽的C端部分中。前導序列的缺失程度以及信號序列中的突變類型可以變化，只要獲得的gB多肽在重組表達和分泌後，在一個主要位點處通過信號肽酶裂解，由此產生在N端具有相同胺基酸的成熟gB多肽群體。N端胺基酸在多肽群體中的同一性可以通過本領域中已知的任何測序技術進行測定。或者，多肽群體中的不同多肽形式可以進行胰蛋白酶消化，且產生的不同肽可以通過質譜(諸如MS/MS)進行分析。與已知序列的標準肽的比較將允許測定消化肽的胺基酸組成。
本發明人注意到，上述前導序列缺失和/或信號序列突變可以與上述關於融合環FLl和FL結構域的突變和/或至少一部分TM結構域缺失和/或至少一部分細胞質結構域缺失中的任一者組合，同時仍保持各突變類型賦予的特性，諸如相比於現有技術的CMV gB多肽(諸如gB-DeltaTM)，改進的三聚體化概況、更好的表達和分泌、C端剪切不存在和信號序列裂解後N端的均質性。因此，在·一些實施方案中，本發明的CMV gB多肽包含前導序列突變，任選地與其中公開的信號序列突變、任何上文所述的FLl和/或FL2結構域突變、和細胞質結構域與TM結構域中的任何突變組合。
本發明的CMV gB多肽在其不與其在自然界中相同的狀態存在的意義上並非「天然存在的」，即其序列已經人工修飾。術語「多肽」或「蛋白質」是指其中單體是通過醯胺鍵連接在一起的胺基酸的聚合物。本文使用的術語「多肽」或「蛋白質」意指包括任何胺基酸序列並包括修飾序列(例如糖蛋白)。術語「多肽」具體是指涵蓋天然存在的蛋白質以及重組或合成產生的非天然存在蛋白質。提及多肽時，術語「片段」是指多肽的部分(即亞序列)。術語「免疫原性片段」是指保留全長參考蛋白質或多肽的至少一個顯性免疫原性表位的所有多肽片段。多肽內的方向一般以N端至C端方向列舉，由各個胺基酸的氨基和羧基部分的方向確定。多肽從N端或氨基端向C端或羧基端翻譯。
本發明也可能使用上文所述的具有進一步突變的gB多肽，諸如例如使得蛋白內切水解裂解位點變得無效的所述位點處的突變。例如，位於SEQ ID NO:1中所示序列的胺基酸456至460或源自不同毒株的其他CMV gB多肽中的相應位置處的胺基酸周圍的弗林蛋白酶裂解位點可以進行突變。合適地，進行至少一個選自下列的胺基酸取代:相對於SEQID NO:1中所示序列，以T456取代R456、以Q458取代R458和以T459取代R459。因此，在某些實施方案中，本發明的CMV gB多肽包含進一步點突變，其中SEQ ID NO:1中所示序列的精氨酸R456、R458和R459或源自不同毒株的其他CMV gB多肽中的相應位置處的胺基酸分別被蘇氨酸(T456)、穀氨酸(Q458)和蘇氨酸(T459)取代。在一些其他實施方案中，SEQ ID ΝΟ:1中所示序列的位置50和357處的精氨酸被絲氨酸取代。在仍進一步實施方案中，本發明的gB多肽，具體而言，包含C端細胞質結構域中疏水性區域缺失的多肽，包含進一步點突變，其中SEQID NO:1中所示序列的778位處的半胱氨酸被丙氨酸取代。任選地，為了便於表達和回收，本發明的gB多肽可以包括N端的信號肽。信號肽可以選自本領域中已知的多種信號肽，而且通常進行選擇以便於在選擇用於重組表達本發明的gB多肽的系統中的生成和加工。在某些實施方案中，信號肽是天然存在於來自AD169毒株的天然gB蛋白中的肽，即SEQ ID NO:1中所示序列的胺基酸1-20。可替代地，信號肽可以是序列由不同於gB的蛋白產生的異源序列。適合用於本發明的CMV gB多肽的上下文中的示例性信號肽包括下列的信號肽:組織纖溶酶原激活物(tPA)、單純皰疹病毒(HSV)gD蛋白、人內皮抑制素、HIV gpl20、CD33、人Her2Neu、或埃巴病毒(EBV) gp350。「信號肽」是一種短的胺基酸序列(例如長度為約18-25個胺基酸)，其將新合成的分泌性蛋白或膜蛋白引導至膜及穿過膜，例如內質網的膜。信號肽常常但不普遍位於多肽的N端，並且常常在蛋白質穿過膜後被信號肽酶裂解掉。該裂解通常被視為蛋白「成熟」過程中的步驟。具體而言，一旦信號肽裂解掉，該蛋白被稱為其「成熟」形式。信號序列通常含有三種常見的結構特徵:N端極性鹼性區(η區)、疏水性核心和親水性c區。根據一個實施方案，本發明的gB多肽包含天然gB中天然存在的信號肽。在可替代的實施方案中,本發明的gB多肽包含異源信號肽，如蛋白CD33的信號肽。信號序列可以是非天然的且可以包含突變，如胺基酸的取代、插入或缺失。因此在一些實施方案中，其中本發明的gB多肽包含信號肽，特別是天然信號肽，所述信號肽包含至少一個胺基酸取代，合適地在信號肽的C-末端部分中包含至少一個胺基酸取代。可替代地，所述信號肽包含至少一個胺基酸插入，合適地在信號肽的C-末端部分中包含至少一個胺基酸插入。
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任選地，其中公開的本發明的CMV gB多肽可以包括添加構成標記的胺基酸序列，其促進重組表達多肽的隨後加工或純化。這種標記可以是抗原標記或表位標記、酶促標記或聚組氨酸標記。通常，標記位於多肽的一端或另一端，諸如多肽的C端或N端處。因此，在一些實施方案中，本發明的CMV gB多肽包含位於多肽的C端的聚組氨酸標記。在某些實施方案中，本發明的CMV gB多肽具有選自下列的胺基酸序列:SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ IDN0:16和SEQ ID NO: 18或其亞序列(例如，缺乏胺基酸的信號序列或具有不同信號序列的取代的亞序列)。可替代地，在特定實施方案中，本發明的CMV gB多肽具有選自SEQ IDNO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21 的胺基酸序列。本公開的另一個方面涉及編碼本發明的CMV gB多肽的核酸。將這樣的核酸或載體導入的細胞(即宿主細胞)也是本發明的一部分。宿主細胞可以是細菌細胞，但是更通常是真核細胞，如酵母細胞(例如畢赤酵母(Picchia))、植物細胞、昆蟲細胞、或哺乳動物細胞(例如CHO細胞)。根據一個實施方案，本發明的CMV gB多肽在CHO細胞中重組表達。術語「多核苷酸」和「核酸序列」是指核苷酸長度至少為10個鹼基的聚合形式。核苷酸可以是核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或任一種核苷酸的修飾形式。該術語包括DNA的單鏈和雙鏈形式。「分離的多核苷酸」是指不與從中得到該多核苷酸的生物的天然存在的基因組中兩個與之直接鄰接的編碼序列(一個位於5'端，一個位於3'端)直接鄰接的多核苷酸。在一個實施方案中，多核苷酸編碼多肽。通過參考各個核苷酸單位的連接性定義核酸的5'和3'方向，並根據脫氧核糖(或核糖)糖環的碳位置命名。以5' -3'方向讀取多核苷酸序列的信息(編碼)內容。「重組」核酸是具有不是天然存在的序列或具有由兩個本來分開的序列區段的人工組合構成的序列。可通過化學合成，或者更通常通過人工操作核酸的分離區段，例如通過遺傳工程技術，來實現這種人工組合。「重組」蛋白是指由異源性(例如，重組)核酸編碼的蛋白質，其已被導入宿主細胞，例如細菌或真核細胞。可以將核酸引入具有能夠表達由引入的核酸編碼的蛋白的信號的表達載體上，或者可以將核酸整合到宿主細胞染色體中。在某些實施方案中，重組核酸進行密碼子優化用於在選定的原核或真核宿主細胞中進行表達，諸如哺乳動物、植物或昆蟲細胞。為了促進複製和表達，可將核酸引入原核或真核表達載體等載體中。雖然本文公開的核酸可包含在多種載體(包括例如細菌質粒；噬菌體DNA ;杆狀病毒；酵 母質粒；得自質粒和噬菌體DNA的組合的載體，病毒DNA，例如牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病病毒、腺病毒、腺相關病毒、反轉錄病毒等等)的任一種中，但是最常見的載體為適於產生多肽表達產物的表達載體。在表達載體中，編碼嵌合CMVgB多肽的核酸通常排列在相對於指導mRNA合成的合適轉錄控制序列(啟動子和任選一個或多個增強子)的附近和方向上。即目標多核苷酸序列與合適的轉錄控制序列可操作地連接。這類啟動子的實例包括:CMV的即時早期啟動子、LTR或SV40啟動子、杆狀病毒的多角體蛋白啟動子、大腸桿菌Iac或trp啟動子、噬菌體T7和λ Pl啟動子以及已知在原核或真核細胞或其病毒中控制基因表達的其他啟動子。表達載體通常還含有用於翻譯起始的核糖體結合位點和轉錄終止子。載體任選包括用於擴增表達的合適序列。另外，表達載體任選包含一個或多個選擇標記基因以提供用於選擇轉化宿主細胞的表型性狀，例如二氫葉酸還原酶、真核細胞培養的新黴素抗性或卡那黴素抗性，或例如大腸桿菌中的四環素或氨苄西林抗性。表達載體還可包括例如改進翻譯的效率的其他表達元件。這些信號可包括ATG起始密碼子和鄰接序列。在某些情況下，例如，將翻譯起始密碼子和相關序列元件與目標多核苷酸序列一起同時插入合適的表達載體中(例如天然起始密碼子)。在這類情況下，不需要其他翻譯控制信號。然而，在僅插入多肽編碼序列或其部分的情況下，提供包括ATG起始密碼子在內的外源翻譯控制信號用於表達CMV gB序列。將起始密碼子置於正確的讀框中以確保目標多核苷酸序列的翻譯。外源轉錄元件和起始密碼子可以是各種來源的，既可以是天然的也可以是合成的。如果需要，可通過包含對使用中的細胞系統合適的增強子，來進一步提高表達效率(Scharf 等人(1994) Results Probl Cell Differ 20:125-62; Bitter等人(1987) Methods in Enzymol 153:516-544)。足以指導本領域普通技術人員產生重組CMV gB核酸的示例性方法可參見Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第 2 版，Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989; Sambrook ^Molecular Cloning: A LaboratoryManual,第 3 片反，Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel 等人，Current Pro toco Isin Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (和 2003 的增刊)；以及 Ausubel 等)\，Short Pro toco Is in Molecular Biology: A Compendium of Methodsfrom Current Pro toco Is in Molecular Biology,第 4 IK, Wiley & Sons, 1999。編碼本發明的CMV gB多肽的示例性核酸是由SEQ ID NOs: 6、7、8、9、11、13、15和17表達的。與示例性變體共有序列同一性的其他序列變體可由本領域技術人員產生。核酸變體通常編碼不同的多肽，這種不同不多於核苷酸或胺基酸的1%、或2%、或5%、或10%、或15%、或20%。即編碼的多肽共有至少80%、或85%、更通常至少約90%或更多(例如95%或甚至98%或99%)的序列同一性。本領域技術人員可立即理解到，編碼CMV gB多肽的多核苷酸序列由於遺傳密碼的豐餘性而自身可共有較少的序列同一性。本領域技術人員將理解的是，關於多肽序列和核苷酸序列，CMV gB多肽和多核苷酸序列之間的相似性一般可以在序列之間的相似性、或者被稱為序列同一性方面來表示。經常在百分比同一性(或相似性)方面來測量序列同一性；百分比越高，兩個序列的一級結構越相似。通常，兩個胺基酸(或多核苷酸)序列的一級結構越相似，由摺疊和裝配產生的更高階結構越相似。CMV gB多肽和多核苷酸序列的變體可以具有一個或少量的胺基酸缺失、添加或取代，但是儘管如此它們的胺基酸和通常它們的多核苷酸序列將共有非常高的百分比。確定序列同一性的方法是本領域眾所周知的。各種程序和比對算法描述如下:Smith和Waterman, Adv.App1.Math.2:482，1981; Needleman和Wunsch, J.Mol.Biol.48:443，1970; Higgins 和 Sharp, Gene 73:237，1988; Higgins 和 Sharp, CABIOS5:151, 1989; Corpet 等人，Nucleic Acids Research 16:10881，1988;和 Pearson 和Lipman, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:2444，1988。Altschul 等人，NatureGenet.1994提供了序列比對方法和同源性計算的詳細考慮。NCBI基本局部比對搜索工具(BLAST) ( Altschul等人，J Mol.BioL 215:403, 1990)可以從幾個來源包括國家生物技術信息中心(NCBI，Bethesda, MD)和網際網路上獲得，其與序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx聯繫使用。如何使用該程序確定序列同一'I"生的描述可以在網際網路上的NCBI網站獲得。兩個核酸間的序列相似性的另一個標識是雜交的能力。兩個核酸的序列越相似，它們雜交的條件越嚴格。雜交條件的嚴格性是序列依賴性的，並且在不同的環境參數下不同。因此，導致特定嚴格性程度的雜交條件將根據所選擇的雜交方法的性質和雜交核酸序列的組成和長度而變化。通常，雜交的溫度和雜交緩衝液的離子強度(尤其Na+和/或Mg++濃度)決定雜交的嚴格性，儘管洗滌次數也影響嚴格性。一般選擇在規定的離子強度和PH下比特定序列的熱解鏈溫度(Tm)低約5°C-20°C的嚴格條件。Tm是50%的靶序列與完全匹配的探針雜交的溫度(在規定的離子強度和PH下)。核酸雜交的條件和嚴格性的計算可參見例如Sambrookifo/ecw/ar Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Tijssen, Hybridization WithNucleic Acid Probes, Part 1: Theory and Nucleic Acid Preparation, LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Ltd., NY,NY, 1993.以及 Ausubel 等X Short Pro toco Is in Molecular Biology,第 4 版，JohnWiley & Sons, Inc.，1999。對於本說明書的目的，「嚴格條件」包括只有雜交分子和靶序列之間的錯配小於25%時才可發生雜交的條件。可將「嚴格條件」分成特定的嚴格性水平用於更精確的定義。因此，本文使用的「適度嚴格性(moderate stringency) 」條件是錯配超過25%序列的分子將不會雜交的條件；「中等嚴格性(medium stringency) 」條件是錯配超過15%的分子將不會雜交的條件，而「高嚴格性」條件是錯配超過10%的序列將不會雜交的條件。「非常高嚴格性」條件是錯配超過6%的序列將不會雜交的條件。相比之下，在「低嚴格性」條件下雜交的核酸包括具有少得多的序列同一性或只在核酸短的亞序列內具有序列同一性的核酸。因此，將理解的是，由本公開包括的各種核酸變體能夠與SEQ ID N0:6、7、8、9、ll、13、15和17中至少一個在基本上其整個長度進行雜交。可採用用於表達和純化重組蛋白的已充分完善的方法來產生本文公開的CMV gB多肽。足以指導本領域技術人員的方法可參見,例如，上面引用的Sambrook和Ausubel參考文獻。下文提供其他和具體細節。通過多種眾所周知的方法中的任一種，將編碼CMV gB多肽的重組核酸，如(但不限於)由SEQ ID NOs:6、7、8、9、11、13、15和17所示的示例性的核酸導入宿主細胞，所述方法諸如電穿孔、脂質體介導的轉染、磷酸鈣沉澱、感染、轉染等，這取決於載體和宿主細胞的選擇。因此，包含重組CMV gB多肽編碼核酸的宿主細胞也是本說明書的特徵。有利的宿主細胞包括原核(即細菌)宿主細胞，例如大腸桿菌，以及許多真核宿主細胞，包括真菌(例如酵母，例如釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母iPicchia pastor is))細胞、昆蟲細胞、植物細胞和哺乳動物細胞(如CHO細胞)。將重組CMV gB核酸通過例如載體(例如表達載體)導入(例如轉導、轉化或轉染)宿主細胞。如上所述，載體最典型是質粒，但這種載體也可以是，例如，病毒顆粒、噬菌體等。合適表達宿主的實例包括:細菌細胞，例如大腸桿菌、鏈黴菌屬i^treptomyces)和鼠傷寒沙門氏菌iSedmorwllei typhimurium)；真菌細胞，例如釀酒酵母，巴斯德畢赤酵母(Pichia pastor is)和粗糙脈胞菌{Neurosporacrassa);昆蟲細胞,例如果蜆屬WrosophiIa)和草地貪夜蛾{Spodoptera frugiperda)；哺乳動物細胞，例如3T3、C0S、CH0、BHK、HEK 293或鮑斯黑色素瘤(Bowes melanoma);植物細胞，包括藻類細胞等。可將宿主細胞培 養在為激活啟動子、選擇轉化體或擴增插入多核苷酸序列而酌情改良的常規營養培養基中。例如溫度、PH等培養條件，通常為之前與選擇以進行表達的宿主細胞一起使用的條件，對本領域技術人員而言是顯而易見的並存在於本文所引用的參考文獻中，包括例如 Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of BasicTechnique,第3版，Wiley-Liss, New York及其中引用的參考文獻。與本發明的核酸對應的表達產物還可在非動物細胞中產生，例如植物、酵母、真菌、細菌等。除Samtoook、Berger和Ausubel以外，關於細胞培養的詳情可參見Payne等人(1992) Plant Cell andTissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc.New York, NY; Gamborg和 Phillips (主編)(1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; FundamentalMethods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)以及 Atlas 和 Parks (主編)The Handbook of Microbiological Media (1993) CRCPress, Boca Raton, FL。在細菌系統中，可根據所表達產物的預期用途選擇多種表達載體。例如，當需要大量的多肽或其片段以產生抗體時，最好使用指導高水平表達易於純化蛋白的載體。這類載體包括但不限於多功能大腸桿菌克隆和表達載體，例如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中可將目標編碼序列(例如上述本發明的多核苷酸)與氨基端翻譯起始甲硫氨酸和隨後7個產生催化活性的β半乳糖苷酶融合蛋白的半乳糖苷酶的殘基的序列符合讀框地連接到載體中；ρΙΝ載體(Van Heeke & Schuster (1989) T Biol Chem264:5503-5509) ;pET載體(Novagen, Madison WI),其中氨基端甲硫氨酸與組氨酸標記符合讀框地連接；等等。同樣，在酵母(例如釀酒酵母)中，可以使用含有組成型或誘導型啟動子(例如α因子、醇氧化酶和PGH)的多個載體以產生所需要的表達產物。對於綜述，參見Berger, Ausubel,和例如 Grant 等人.(1987; Methods in Enzymology 153:516-544)。在哺乳動物宿主細胞中，可使用多個表達系統，包括基於質粒和病毒兩者的系統。任選針對所需方式調節插入序列表達或加工所表達的蛋白質的能力選擇宿主細胞。蛋白質的這類修飾包括但不限於糖基化(以及例如乙醯化、羧化、磷酸化、脂化和醯化)。翻譯後加工，例如將蛋白的前體形式裂解為成熟形式(例如，由弗林蛋白酶)任選地在宿主細胞的背景中進行。不同的宿主細胞(例如3T3、COS、CH0、HeLa, BHK、MDCK、293、WI38等)具有用於這類翻譯後活性的特殊細胞機器和特有機制，可選擇以確保導入的外源蛋白的正確修飾和加工。對於本文公開的由核酸編碼的重組CMV gB多肽的長期高產率生產，通常使用穩定的表達系統。例如，通過將含有病毒複製起點或內源表達元件和選擇標記基因的表達載體導入宿主細胞，而獲得穩定表達本發明的CMV gB多肽的細胞系。在導入載體後，使細胞在富集培養基中生長1-2天後，將其轉移到選擇培養基中。選擇標記的目的是賦予選擇抗性，並且選擇標記的存在允許成功表達導入序列的細胞生長和回收。例如，可採用適於所述細胞類型的組織培養技術，使穩定轉化細胞的抗性群或集落增殖。任選將用編碼CMV gB多肽的核酸轉化的宿主細胞培養在適於表達和從細胞培養物中回收編碼蛋白質的條件下。在合適的宿主細胞系轉導和宿主細胞生長到適當細胞密度後，通過合適的方法(例如溫度變化或化學誘導)誘導選定的啟動子，並再將細胞培養一段時間。然後，從培養基中回收和純化分泌的多肽產物。或者，可通過離心收穫細胞，通過物理或化學方法破壞細胞，並保留所得到的粗製提取物用於進一步純化。用於蛋白質表達的真核或微生物細胞可通過任何合宜的方法破壞，包 括凍融循環、超聲處理、機械破壞、或使用可通過本領域眾所周知的多種方法中的任一種從重組細胞培養物中回收和純化細胞CMV gB多肽，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉澱、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析(例如使用本文所述任何標記系統)、羥磷灰石層析和凝集素層析。在完成成熟蛋白質的構型時，可根據需要使用蛋白質再摺疊步驟。最後，在最終的純化步驟中可採用高效液相層析(HPLC)。除了上述參考文獻以外，多種純化方法是本領域眾所周知的，包括例如以下文獻提供的方法:Sandana (1997) Bioseparation of Proteins,Academic Press, Inc.;和Bollag等X (1996) Protein Methods,第2版,Wiley-Liss,NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris和 Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRLPress at Oxford, Oxford, U.K.; Scopes (1993) Protein Purification: Principlesand Practice 第 3 版， Springer Verlag, NY; Janson 和 Ryden (1998) ProteinPurification: Principles, High Resolution Methods and Applications,第 2 版,ffiley-VCH, NY;以及Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ。在一個實例中，將編碼CMV gB多肽的多核苷酸克隆到適合用於引入哺乳動物細胞(例如，CHO細胞)的載體中。在該示例性實施方案中，將編碼CMV gB多肽的多核苷酸序列引入Amaxa開發的pMax載體中。多肽在組成型啟動子立即早期CMV啟動子下表達。基於轉染的細胞在卡那黴素存在的情況下生長的能力選擇穩定轉染的表達chimer的細胞。已經成功整合pMax的細胞能夠在卡那黴素存在的情況下生長，因為pMax載體表達卡那黴素抗性基因。選擇的細胞可以克隆擴增且表徵CMV gB多肽的表達。可替代地，可以將編碼本發明的CMV gB多肽的多核苷酸序列引入NRC開發的pTT5載體中，所述ρΤΤ5載體表達氨苄青黴素抗性基因。轉染和誘導表達(根據選擇的啟動子和/或增強子或其他調控元件)之後，回收(例如，純化或富集)表達的多肽。下面是用於純化CMV gB多肽的示例性程序。為了促進純化，CMV gB多肽包括C末端的多聚組氨酸標記。簡而言之，轉染後6天收集細胞培養上清液。澄清後，將上清液上樣至鎳柱。術語「純化」是指從組合物中除去不需要存在的組分的過程。純化是相對術語，並不需要從組合物中除去所有痕量的不需要的組分。在疫苗產生的情況下，純化包括例如離心、透析、離子交換層析和大小排阻層析、親和純化或沉澱等方法。因此，術語「純化的」不要求絕對純度；而是意指相對術語。可以純化基本純的核酸或蛋白質的製備物，使得所需要的核酸或蛋白質佔製備物總核酸含量的至少50%。在某些實施方案中，基本純的核酸或蛋白質佔製備物總核酸或蛋白含量的至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%或更多。在本發明的意義上，「分離的」生物組分(如核酸分子，或蛋白)已經基本上遠離該組分天然存在的生物體的細胞中的其他生物組分進行分離或純化，所述其他生物組分如染色體和染色體外的DNA和RNA、蛋白和細胞器。已經「分離」的核酸和蛋白包括通過標準純化方法純化的核酸和蛋白。該術語也包括通過在宿主細胞中重組表達而製備的核酸和蛋白，以及化學合成的核酸和蛋白。本發明的CMV gB多肽和核酸可用於製備用於治療CMV感染的藥物。本發明的CMVgB多肽特別適合作為用於免疫原性組合物如疫苗中包含的抗原。相應地，本發明還包括用於引發針對CMV的免疫應答的方法，其通過將免疫有效量的組合物施用於受試者而實現，所述組合物含有本發明的任何CMV gB多肽。受試者可以是HCMV血清陽性或HCMV血清陰性的受試者。在一些實施方案中，受試者是少女，通常是12至16歲的少女。可替代地，受試者是生育年齡的婦女。通常，生育年齡的婦女的組代表16至45歲之間的年齡且可以懷孕的婦女。在一個特定的實施方案中，本發明考慮了用於引發針對CMV的免疫應答的方法，所述方法包括將免疫有效量的組合物施用於HCMV血清陰性的生育年齡的婦女的步驟，所述組合物包含本發明的gB多肽。在一個可替代的實施方案中，本發明的CMV gB多肽可用於製備用於預防和/或治療CMV感染的藥物。合適地，組合物或藥物，引發保護性免疫應答，所述保護性免疫應答降低或防止CMV感染和/或降低或防止CMV感染後的病理應答。具體而言，本發明的方法，其中將免疫有效量的組合物施用於生育年齡的婦女(所述組合物含有本發明的任何CMV gB多肽)，防止C MV從母親傳播到胎兒，即防止CMV先天性感染。術語「防止新生兒中的HCMV先天性感染」意味著新生兒在出生時沒有CMV感染。可替代地，接受本發明的免疫原性組合物的合適受試者是免疫功能低下的受試者，如例如，移植的患者。相應地，在一些實施方案中，本發明考慮了本發明的CMV gB多肽用於在免疫功能低下的受試者中降低和/或預防CMV感染的用途。在進一步的實施方案中，本發明考慮了用於引發針對CMV的免疫應答的方法，其包括將本發明的CMV gB多肽施用於免疫功能低下的受試者的步驟。「受試者」是活的多細胞脊椎動物生物體。在本公開的範圍內，受試者可以是實驗受試者，如非人動物，例如，小鼠、棉鼠、或非人靈長類。可替代地，受試者可以是如上文所述的人受試者。「抗原」指能通過在動物中產生抗體和/或T細胞應答而刺激免疫應答的化合物、組合物或物質，包括注射、吸收或以其他方式導入動物中的組合物。術語「抗原」包括所有相關的抗原表位。術語「表位」或「抗原決定簇」是指B細胞和/或T細胞對之產生應答的抗原上的位點。「顯性抗原表位」是對其產生功能上重要的宿主免疫應答(例如抗體應答或T細胞應答)的表位。因此，對於針對病原體的保護性免疫應答，顯性抗原表位是當被宿主免疫系統識別時產生免於由該病原體引起的疾病的保護的抗原部分。術語「T細胞表位」是指當與合適的MHC分子結合時被T細胞(通過T細胞受體)特異性結合的表位。「B細胞表位」是被抗體(或B細胞受體分子)特異性結合的表位。「免疫應答」是免疫系統的細胞(例如B細胞、T細胞或單核細胞)對刺激的應答。免疫應答可以是B細胞應答，其導致特異性抗體(例如抗原特異性中和抗體)的產生。免疫應答也可以是T細胞應答，例如CD4+應答或CD8+應答。在某些情況下，應答對特定抗原有特異性(即「抗原特異性應答」)，特別是，CMV。如果抗原來源於病原體，則抗原特異性應答是「病原體特異性應答」。「保護性免疫應答」是抑制病原體的有害功能或活性、降低病原體的感染或減少因病原體感染產 生的症狀(包括死亡)的免疫應答。可通過例如在噬斑減少測定或ELISA中和測定中抑制病毒複製或噬斑形成，或者體內測定抗病原體攻擊的抗性，來測定保護性免疫應答。通常，免疫應答弓I發免疫應答，其特徵在於產生Thl型細胞因子，例如Thl-型免疫應答。「Thl」型免疫應答的特徵在於產生IL-2和IFN-Y的⑶4+ T輔助細胞。相比之下，「Th2」型免疫應答的特徵在於產生IL-4、IL-5、和IL-13的CD4+輔助細胞。「免疫有效量」是用於在受試者中引發免疫應答的組合物(通常，免疫原性組合物)的量。通常，所需結果是產生能夠或有助於保護受試者免於病原體如CMV的抗原(如病原體)特異性的免疫應答。然而，獲得針對病原體的保護性免疫應答可以需要多次施用免疫原性組合物。因此，在本公開的上下文中，術語免疫有效量包括有助於組合以前或隨後的施用以實現保護性免疫應答的部分劑量。還提供了免疫原性組合物，如疫苗，其包括CMV gB多肽和藥學上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。「免疫原性組合物」是適於施用於人或動物受試者的能夠誘導例如引發病原體(例如CMV)的特異性免疫應答的物質的組合物。因此，免疫原性組合物包含一種或多種抗原(例如多肽抗原)或抗原表位，如，例如，本發明的CMV gB多肽。免疫原性組合物還可包含一種或多種能夠引發或提高免疫應答的其他組分，例如賦形劑、載體和/或佐劑。在某些情況下，施用免疫原性組合物以引發防止受試者免於由病原體引起的症狀或病況的免疫應答。在某些情況下，在受試者暴露於病原體後，通過抑制病原體(例如CMV)的複製來預防(或減輕或改善)由病原體引起的症狀或疾病。在本說明書的情況下，術語免疫原性組合物將被理解為包括旨在施用於受試者或受試者群以引發針對CMV的保護性或治標性免疫應答的組合物(即，疫苗組合物或疫苗)。本發明的免疫原性組合物不限於包含CMV gB多肽的組合物。本發明還考慮了免疫原性組合物，如疫苗，其包含本發明的CMV gB多肽和至少一種或多種選自PP65、IEl、pUL131、gL、gH、pUL128、pUL130、或其任何組合的CMV抗原。本發明還考慮了免疫原性組合物，如疫苗，其包含本發明的CMV gB多肽和至少一種或多種選自HPV、衣原體、RSV、剛地弓形蟲、帶狀皰疹和麴黴菌的抗原。多種藥學上可接受的稀釋劑和載體和/或藥學上可接受的賦形劑是本領域已知的，且描述於，例如，E.ff.Martin 的，5.Pharmaceutical Sciences, MackPublishing C0., Easton, PA,第15版(1975)。形容詞「藥學上可接受的」表明稀釋劑、或載體、或賦形劑適合用於施用於受試者(例如，人或動物受試者)。通常，稀釋劑、載體和/或賦形劑的性質將取決於所採用的具體施用方式。例如，腸胃外製劑通常包括可注射的液體，其包括藥學上和生理上可接受的液體，如水、生理鹽水、平衡鹽溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作為媒介物。在某些製劑(例如，固體組合物，如粉末形式)中，不採用液體稀釋劑。在這種製劑中，可以使用無毒固體載體，包括，例如，藥物級海藻糖、甘露糖醇、乳糖、澱粉或硬脂酸鎂。相應地，本領域技術人員可以選擇合適的賦形劑和載體以產生適合用於通過選擇的施用途徑遞送給受試者的製劑。賦形劑包括，但不限於:甘油、聚乙二醇(PEG)、玻璃形成多元醇(諸如山梨糖醇、海藻糖)、N-月桂醯肌氨酸(例如鈉鹽)、L-脯氨酸、非去汙劑磺基甜菜鹼、鹽酸胍、尿素、三甲胺氧化物、KC1、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+(和其他二價陽離子相關鹽)、二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(dithioerytrol)、β-巰基乙醇、去汙劑(包括例如 Tween80、Tween20、Triton X-100、NP-40、Empigen BB、辛基葡糖苷、月桂醯麥芽糖苷、兩性去汙劑3-08、兩性去汙劑3-10、兩性去汙劑3-12、兩性去汙劑3_14、兩性去汙劑3_16、CHAPS、去氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉、和溴化十六烷基三甲銨)。

在某些實例中，免疫原性組合物還包含佐劑。適合於在含有本發明的CMV gB多肽的免疫原性組合物中使用的佐劑是與本文中所公開的所述多肽組合在對受試者施用時是安全且反應原性最小的佐劑。「佐劑」是以非特異性方式增強免疫應答產生的物質。常見佐劑包括抗原吸附在其上的無機物(明礬、氫氧化鋁、磷酸鋁)的懸浮液；乳劑，包括油包水和水包油乳劑(及其變化，包括雙乳劑和可逆乳劑)、脂糖(Iiposaccharide)、脂多糖、免疫刺激性核酸(例如CpG寡核苷酸)、脂質體、Toll樣受體激動劑(特別是TLR2、TLR4、TLR7/8和TLR9激動劑)和這類組分的各種組合。與本發明的CMV gB多肽組合使用的合適的佐劑是皂苷。相應地，本發明的免疫原性組合物可以包含皂苷QS21 (W08809336A1; US5057540A)。QS-21在本領域眾所周知作為源自Quillaja saponaria Molina的樹皮的天然皂苷，其誘導CD8+細胞毒性T細胞(CTL)、Thl細胞和主要的IgG2a抗體應答。為了避免疑問，提到QS21包括0PT-821。在本發明的合適形式中，本發明的免疫原性組合物包含基本上純形式的QS21，也就是說，QS21是至少80 %，至少85%，至少90%純，例如至少95%純，或至少98%純。本發明的組合物可以包含QS21的量為約至約100μδ,例如約至約6(^g之間或10μδ和約5(^g之間，例如，約lOKg、約12.5Pg、約15Pg、約20μ8、約25μ8、約30μ8、約40μ8或者尤其約50μ8。具體而言，QS21存在的量為約40μδ和60μδ之間或45和55 μδ之間或47和53μδ之間或48和52Kg之間或49和51之間或約5(^g。可替代地，QS21存在的量為約2lPg和29 μδ之間或約22Pg和約28Pg之間或約23Pg和約27Pg之間或約24gg和約26Pg之間，或約25 Pg。在一些實施方案中，包含本發明的CMV gB多肽的免疫原性組合物包含QS21的量為約10 Pg，例如約5μ〖至約Ι5μ〖之間，約6μ〖和約Ι4μ〖之間，約7μ〖和約Ι3μ〖之間，約8μ〖和約l2gg之間或約9Pg和約IlPg之間，或約lOPg。在一個進一步的實施方案中，本發明的免疫原性組合物包含QS21的量為約5Pg，例如約IPg至9Pg之間，約2Pg和約8Pg之間，約3Pg和約7Pg之間，約4Pg和約6Pg之間，或約5Pg。本發明的組合物的人用劑量中合適量的QS21為例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或 50 Pg 中的任一種。包含本發明的CMV gB多肽的免疫原性組合物可以包含QS21和甾醇，特別是膽固醇。這種組合物顯示當 與其中缺乏留醇的組合物相比的反應原性降低，同時保持佐劑作用。反應原性研究可以根據WO 96/33739中公開的方法進行評價。採用本發明的甾醇意味著可以採用外源性留醇，即對於由其製備β澱粉樣蛋白抗原製劑的生物體不是內源的留醇。合適地，外源性留醇與WO 96/33739中描述的皂苷佐劑相關。在特定的實施方案中，膽固醇相對於QS21過量存在，例如，QS21:甾醇的比例將通常是大約1:100至1:1 (w/w)，合適地在1:10至1:1 (w/w)之間,和優選地1:5至1:1 (w/w)。具體而言，QS21:甾醇的比例為至少1:2 (w/w) 0在一個特定的實施方案中，QS21:甾醇的比例為1:5 (w/w) 0合適的甾醇包括β_谷留醇、豆留醇、麥角固醇、麥角鈣化醇和膽固醇。在一個特定的實施方案中，本發明的組合物包含膽固醇作為留醇。這些留醇是本領域眾所周知的，例如膽固醇作為在動物脂肪中發現的天然存在的甾醇公開於Merck Index，第11版，第341頁中。因此，在一個特定實施方案中，包含本發明的CMV gB多肽的免疫原性組合物在其反應原性較低的組合物中包含QS21，其中它被外源留醇例如膽固醇猝滅。存在幾個具體形式的反應原性較低的組合物，其中QS21被外源膽固醇猝滅。在一個特定的實施方案中，皂苷/留醇是脂質體結構的形式(W0 96/337391)。因此，例如，本發明的CMV gB多肽可以合適地與包含QS21和膽固醇的組合的佐劑用於免疫原性組合物中。術語「一種或多種脂質體」一般指封裝水性內部的單或多層(取決於形成的脂質膜數目，特別是2、3、4、5、6、7、8、9或10層)脂質結構。脂質體和脂質體製劑是本領域眾所周知的。能夠形成脂質體的脂質包括具有脂肪或脂肪樣性質的所有物質。可以構成脂質體中的脂質的脂質可以選自甘油酯、甘油磷脂、甘油膦醯脂(glycerophosphinolipids)、甘油磷酸酯、硫脂、鞘脂、磷脂、異戊二烯、類固醇、硬脂、留醇、archeolipids、合成陽離子脂質和含碳水化合物的脂質。脂質體可適當地包含磷脂。合適的磷脂包括(但不限於):其為磷脂醯膽鹼合成中的中間產物的磷酸膽鹼(PC);天然磷脂衍生物:蛋磷酸膽鹼、蛋磷酸膽鹼、大豆磷酸膽鹼、氫化大豆磷酸膽鹼、作為天然磷脂的鞘磷脂；和合成磷脂衍生物:磷酸膽鹼(二癸醯-L-C1-磷脂醯膽鹼[DDPC]、二月桂醯磷脂醯膽鹼[DLPC]、二肉豆蘧磷脂醯膽鹼[DMPC]、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼[DPPC]、二硬脂醯磷脂醯膽鹼[DSPC]、二油醯磷脂醯膽鹼[D0PC]、1-棕櫚醯、2-油醯磷脂醯膽鹼[P0PC]、二反油醯磷脂醯膽鹼[DEPC])、磷酸甘油(1，2-二肉豆蘧醯-Sn-甘油-3-磷酸甘油[DMPG]、1,2-二棕櫚醯-Sn-甘油-3-磷酸甘油[DPPG]、1，2- 二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸甘油[DSPG]、1_棕櫚醯-2-油醯-sn_甘油-3-磷酸甘油[POPG])、磷脂酸(1,2-二肉豆蘧醯-sn-甘油-3-磷脂酸[DMPA]、二棕櫚醯磷脂酸[DPPA]、二硬脂醯-磷脂酸[DSPA])、磷酸乙醇胺(1，2-二肉豆蘧醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DMPE]、I, 2- 二棕櫚醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DPPE]、I, 2- 二硬脂醯-sn_甘油-3-磷酸乙醇胺DSPE、I, 2- 二油醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DOPE])、磷酸絲氨酸、聚乙二醇[PEG]磷脂(mPEG-磷脂、聚甘油-磷脂、官能化的磷脂、末端激活的磷脂)。在一個實施方案中，脂質體包含1-棕櫚醯-2-油醯-甘油-3-磷酸乙醇胺。在一個實施方案中，使用高度純化的磷脂醯膽鹼，並且可以選自磷脂醯膽鹼(蛋)、氫化磷脂醯膽鹼(蛋)、磷脂醯膽鹼(大豆)、氫化磷脂醯膽鹼(大豆)。在進一步的實施方案中，脂質體包含磷脂醯乙醇胺[POPE]或其衍生物。取決於磷脂組成和用於其製備的方法，脂質體大小可以從30 nm到數Mm變化。在本發明的特定實施方案中，脂質體大小將在50 nm - 500 nm的範圍中，並且在進一步實施方案中，50 nm - 200 nm。動態雷射散射是本領域技術人員眾所周知的用於測量脂質體的大小的方法。本發明的脂質體可以包含二油醯基磷脂醯膽鹼[D0PC]和甾醇，特別是膽固醇。因此，在一個特定的實施方案中，包含本發明的CMV gB多肽、如具有非功能性跨膜結構域和至少一個融合環FLl和FL2突變(可能兩者都突變)的免疫原性組合物包含本文描述的脂質體形式的任何量的QS21，其中所述脂質體包含二油醯基磷脂醯膽鹼[D0PC]和留醇，特別是膽固醇。本發明的免疫原性組合物可以包含一種或多種進一步的免疫刺激劑。在一個實施方案中，如本文所述的包含本發明的CMV gB多肽的免疫原性組合物進一步包含脂多糖，適當地脂質A的無毒衍生物，特別是單磷醯脂質A或更具體而言3-脫醯單磷醯脂質A (3D -MPL)。3D-MPL 在名稱 MPL 下由 GlaxoSmithKline Biologicals N.A.銷售，並且說明書自始至終稱為MPL或3D-MPL。參見例如，美國專利號4，436，727; 4,877,611; 4，866，034和4，912，094。3D-MPL主要促進具有IFN-Y (Thl)表型的CD4+ T細胞應答。3D-MPL可以根據GB2220211 A中公開的方法產生。在化學上，它是具有3、4、5或6條醯化鏈的3-脫醯單磷醯脂質A的混合物。在本發明的組合物中，可以使用小顆粒3D-MPL。小顆粒3D-MPL具有這樣的顆粒大小，從而使得它可以通過0.22 μ m濾器無菌過濾。此類製劑在WO 94/21292中描述。本發明的組合物可以包含3D-MPL的量為約IPg至約IOOPg之間，例如約Mg至約6(^g之間或10μδ和約5(^g之間，例如，約軸、約12.5Pg、約馳、約2(^g、約25Pg、約3(^g、約4(^g或者尤其約5(^g。具體而言，3D-MPL存在的量為約40Pg和6(^g之間或45和55 Pg之間或47和53Pg之間或48和52 Pg之間或49和51之間或約5(^g。可替代地，3D-MPL存在的量為2lPg和29 μδ之間或約22Pg和約28Pg之間或約23Pg和約27Pg之間或約24μδ和約26μδ之間，或約25 μδο在另一個實施方案中，人劑量的免疫原性組合物包含在約10μ8，例如5和15Pg之間，合適地6和14μδ之間，例如7和13μδ之間或8和12μδ之間或9和IlPg之間，或10μδ的水平的3D-MPL。在進一步實施方案中，人劑量的免疫原性組合物包含在約5Pg，例如I和9Pg之間，或2和8Pg之間或者合適地3和7Pg之間或4和6Pg之間，或5Pg的水平的3D-MPL。在本發明的 組合物中3D-MPL的合適的量是，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50 Pg的任何一種。在其他實施方案中，脂多糖可以是J_l_6)葡糖胺二糖，如描述於美國專利號6，005，099和歐洲專利號O 729 473 BI。基於這些參考文獻的教導，本領域技術人員會容易地能夠生成各種脂多糖，諸如3D-MPL。在前述免疫刺激劑(其在結構上與LPS或MPL或3D-MPL類似)外，作為上述MPL結構的亞部分的醯化單糖和二糖衍生物也是合適的佐劑。在其他實施方案中，佐劑是脂質A的合成衍生物，其中一些被描述為TLR-4激動劑，並且包括但不限於:
OMl74 (2-脫氧-6-0-[2-脫氧-2-[(R)-3-十二醯氧基四-癸醯氨基]-4_o-膦醯基-β -D-吡喃葡萄糖基]-2-[(R)_3-羥基十四醯氨基]_α -D-吡喃葡萄糖基磷酸二氫鹽)，(W0 95/14026)。OM 294 DP (3S, 9 R) _ 3—[ (R)-十二醯氧基十四醯氨基]_4_氧代_5_氮雜-9 (R)-[(R)-3-羥基十四醯氨基]癸-1，10-二醇，I, 10-雙(磷酸二氫鹽(或酯))(W099/64301和 WO 00/0462)。OM 197 MP-Ac DP ( 3S-, 9R) -3-[(R)-十二醯氧基十四醯氨基]_4_氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四醯氨基]癸-1，10-二醇，1-磷酸二氫鹽(或酯)10-(6-氨基己酸鹽)(W0 01/46127)
也可以在具有CMV gB多肽的組合物中使用不同佐劑如上文所提及的佐劑的組合。例如，如已經指出的，可以將QS21與3D-MPL配製在一起。QS21:3D_MPL的比例通常會是大約1:10至10:1，如1: 5至5: 1，和經常基本上為1:1。典型地，比例在2.5:1至1:13D-MPL:QS21的範圍中。因此，在一些實施方案中，包含本發明的CMV gB多肽的免疫原性組合物包含至少QS21和3D-MPL。包含本發明的CMV gB多肽的免疫原性組合物也可以合適地與水包油乳劑配製。水包油乳劑包含可代謝的油(即，可生物降解的油)。油可以是任何植物油、魚油、動物油或合成油，其對於受體沒有毒性，且能夠通過代謝轉化。堅果、種子、和穀物是植物油的常見來源。合成油也是合適的。相應地，與本發明的CMV gB多肽組合使用的水包油乳劑包含可代謝的油。在一個特定的實施方案中，水包油乳劑包含鯊烯(例如，約4%和6% [v/v]之間)。水包油乳劑可以進一步包含表面活性劑。本發明的水包油乳劑包含一種或多種表面活性劑。合適的表面活性劑是技術人員眾所周知的且包括但不限於聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(Tween 80、聚山梨醇酯80)、脫水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)、磷脂醯膽鹼(卵磷脂)、聚氧乙烯(12)十六基十八基醚和辛笨聚醇-9 (Triton X-100)。在本發明的一個特定實施方案中，水包油乳劑包含聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(Tween 80、聚山梨醇酯80)。在一個進一步實施方案中，本發明的水包油乳劑包含聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(Tween 80)和進一步表面活性劑,具體而言脫水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)。本發明的水包油乳劑還可以包含母育酚。母育酚是本領域眾所周知的並描述於EP0382271。具體而言，母育酚是α-生育酚或其衍生物如α-生育酚琥珀酸酯(也稱為維生素E琥珀酸酯)。在本發明的一個特定實施方案中，提供包含本發明的CMV gB多肽的免疫原性組合物與包含S烯(例如約5% [v/v])和α -生育酹(例如約5% [ν/ν])的水包油乳劑的組合。在一個特定實施方案中，水 包油乳劑包含可代謝油(例如鯊烯)、母育酚(例如α-生育酚)和表面活性劑(例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯[聚山梨醇酯80])。在本發明的進一步實施方案中，本發明的水包油乳劑包含可代謝油(例如鯊烯)、表面活性劑(例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯[聚山梨醇酯80])和任選的第二表面活性劑(例如脫水山梨糖醇三油酸酯[Span 85])。在本發明的進一步實施方案中，本發明的水包油乳劑包含可代謝油(例如鯊烯)、聚氧乙烯烷基醚親水性非離子性表面活性劑(例如聚氧乙烯(12)十六基十八基醚)和疏水性非離子型表面活性劑(例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯[聚山梨醇酯80]或脫水山梨糖醇三油酸酯[Span 85])。在一些實施方案中，包含本發明的CMV gB多肽、如具有非功能性跨膜結構域和融合環FLl和FL2中至少一個突變(可能兩者都突變)的免疫原性組合物包含含有鯊烯、α -生育酚和聚山梨醇酯80的水包油乳劑。合適地，水包油包含每劑量疫苗的11 mg或11 mg以下(例如0.5-11 mg、0.5-10mg 或0.5-9 mg 1-10 mg、l_ll mg、2_10 mg>4-8 mg、或4.5-5.5 mg)可代謝油(諸如S烯)，和 5 mg 或 5 mg 以下(例如 0.1-5 mg、0.2-5 mg、0.3-5 mg、0.4-5 mg、0.5-4 mg、1-2 mg或2-3 mg)乳化劑(諸如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯)。合適地，母育酚(例如α-生育酹)每人疫苗劑量存在12 mg或12 mg以下,例如0.5-12 mg、10_ll mg、l_ll mg、2_10mg>4-9 mg、或 5-7 mg。術語「疫苗人劑量」意味著適於人使用的體積的劑量。通常在0.25和1.5 ml之間。在一個實施方案中，人劑量是0.5 ml。在進一步實施方案中，人劑量高於0.5 ml，例如
0.6、0.7、0.8、0.9或I ml。在進一步實施方案中，人劑量在I ml和1.5 ml之間。在另一個實施方案中，特別當免疫原性組合物用於兒科群體時，人劑量可以小於0.5 ml如在0.25和0.5 ml之間。免疫原性組合物通常含有免疫保護量(或其分數劑量)的抗原，並且可以通過常規技術來製備。免疫原性組合物(如疫苗，包括用於對人受試者施用的免疫原性組合物)的製備一般描述於 Pharmaceutical Biotechnology,第 61 卷 Vaccine Design-the subunitand adjuvant approach, Powell 和 Newman 編輯，Plenum Press, 1995。New Trends andDevelopments in Vaccin es, Voller 等人編輯，University Park Press, Baltimore,Maryland, U.S.A.1978。例如，Fullerton的美國專利4，235，877描述了封裝在脂質體內。例如，Likhite，美國專利4，372，945和Armor等人，美國專利4，474，757公開了蛋白質與大分子的綴合。典型地，每劑免疫原性組合物中的蛋白量選擇為在典型的受試者中誘導免疫保護性應答而沒有顯著的、不利的副作用的量。在此上下文中的免疫保護性的並不必然意味著針對感染的完全保護的；它意味著保護免於症狀或疾病，尤其是與病毒有關的嚴重疾病。抗原量可以採用何種特定的免疫原被而變化。一般而言，預期每個人劑量會包含1-1000 μ g的蛋白質,如約I μ g至約100 μ g,例如約I μ g至約50 μ g,如約I UgJS 2P g、約 5 μ g、約 10 μ g、約 15 μ g、約 20 μ g、約 25 μ g、約 30 μ g、約 40 μ g、或約50 Ug0基於受試者群體(例如嬰兒或老年人)來選擇免疫原性組合物中利用的量。可以通過牽涉在受試者中觀察抗體滴度和其他應答的標準研究來確定特定組合物的最佳量。初始疫苗接種後，受試者可以在約4周中接受加強免疫。除非另有解釋，否則本文使用的所有技術和科學術語具有本說明書所屬領域普通技術人員通常理解的相同含義。分子生物學的常見術語的定義可參見Benjamin Lewin,Genes V, Oxford University Press 出版，1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew 攀yl (主編)，The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd 出版；1994 (ISBN 0-632-02182-9);以及 Robert A.Meyers (主編)，MolecularBiology andBiotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。單數術語「一(a)」、「一(an)」和「該(the) 」包括複數的對象，除非上下文另有明確規定。應當進一步理解的是，對於核酸或多肽給出的所有鹼基大小或胺基酸大小和所有分子量或分子質量值是近似的，且提供用於說明。術語「多種(個)」是指兩種(個)或更多種(個)。還要進一步理解的是，對於核酸或多肽給出的所有鹼基大小或胺基酸大小和所有分子量或分子質量值是近似的，且提供用於說明。另外，給出的有關物質(例如抗原)的濃度或水平的數值限制意指是近似的。因此，如果指明濃度為至少(例如)200 pg，則是指此濃度應理解為至少近似(或「約」或「、)200 pg。雖然類似於或等同於本文所述方法和材料的方法和材料可用於實施或檢驗本說明書，但下面描述了合適的方法和材料。術語「包含(comprises)」是指「包括(includes)」。因此，除非上下文另有要求，否則詞語「包含(comprises) 」和各種變化如「包含(comprise) 」和「包含(comprising) 」應理解為表示含有規定的化合物或組合物(例如核酸、多肽、抗原)或步驟，或一組化合物或一組步驟，而非排除任何其他的化合物、組合物、步驟或其組。縮寫詞「e.g.」源於拉丁文exempli gratia,本文用來表示非限制性實例。因此，縮寫詞「e.g.」是術語「例如」的同義詞。在本發明中考慮下列實施方案:
a)巨細胞病毒(CMV) gB多肽，在N末端至C末端方向，其包含:包含融合環I(FLl)結構域和融合環2(FL2)結構域的至少一部分的細胞外結構域，任選地至少一部分跨膜(TM)結構域，和至少一部分細胞質結構域，其中FLl結構域的至少一個胺基酸被取代或缺失，並且其中TM結構域或其部分，如果存在，是非功能性的。b)實施方案 a)的CMV gB多肽，其中通過缺失相對於SEQ ID NO:1中所示的序列的701-775位或在其他CMV gB多肽的對應位置處的胺基酸而使得TM結構域沒有功能。c)實施方案a)或b)的CMV gB多肽，進一步包含在融合環FL2結構域中至少一個胺基酸取代或缺失。d)實施方案a)至c)中任一項的CMV gB多肽，進一步包含在多肽的細胞質結構域中至少一個疏水性胺基酸區的缺失。e)實施方案a)至d)中任一項的CMV gB多肽，其中融合環FLl結構域中所述一個胺基酸取代在於位於相對於SEQ ID NO:1中所示序列的155-157位或在其他CMV gB多肽的對應位置處的在Y.1.Y中至少一個胺基酸被非芳族的極性胺基酸的取代。f)實施方案e)的CMV gB多肽，其中取代在於位於相對於SEQ ID NO:1中所示序列的155-157位或在其他CMV gB多肽的對應位置處的在Y.1.Y中至少兩個胺基酸被非芳族的極性胺基酸的取代。g)實施方案e)或f)的CMV gB多肽，其中極性胺基酸選自帶正電荷的胺基酸賴氨酸(K)、組氨酸(H)和精氨酸(R)。h)實施方案g)的CMV gB多肽，其中位於相對於SEQ ID NO:1中所示的序列的156位或在其他CMV gB多肽的對應位置處的異亮氨酸(I)被組氨酸(H)取代。i)實施方案g)或權利要求h)的CMV gB多肽，其中位於相對於SEQ ID NO:1中所示的序列的157位或在其他CMV gB多肽的對應位置處的酪氨酸(Y)被精氨酸(R)取代。j)實施方案e)至i)中任一項的CMV gB多肽，其中位於相對於SEQ ID NO:1中所示的序列的155位或在其他CMV gB多肽的對應位置處的酪氨酸(Y)被甘氨酸(G)取代。k)實施方案a)至d)中任一項的CMV gB多肽，其中位於相對於SEQ ID NO:1中所示序列的融合環FLl結構域中的155-157位或在其他CMV gB多肽的對應位置處的胺基酸Y.1.Y分別被胺基酸G.H.R取代。I)實施方案a)至d)中任一項的CMV gB多肽，其中位於相對於SEQ ID NO:1中所示序列的融合環FLl結構域中的155-157位或在其他CMV gB多肽的對應位置處的一段胺基酸序列Y.1.Y (所述胺基酸序列Y.1.Y具有通過Kyte和Doolittle指數所測量的+ 1.9的疏水性評分)被下列一段三個胺基酸序列取代，所述胺基酸序列具有通過Kyte和Doolittle指數所測量的小於_3，小於-7，小於-8的疏水性評分。m)實施方案a)至I)中任一項的CMV gB多肽，其中融合環FL2結構域中胺基酸取代在於位於相對於SEQ ID NO:1中所示序列的240-242位或在其他CMV gB多肽的對應位置處的在W.L.Y中至少一個胺基酸被帶正電荷的胺基酸的取代，所述帶正電荷的胺基酸選自賴氨酸(K)、組氨酸(H)和精氨酸(R)。η)實施方案m)的CMV gB多肽，其中位於相對於SEQ ID N0:1中所示的序列的240-242位或在其他CMV gB多肽的對應位置處的W.L.Y中的胺基酸被組氨酸(H)取代。O)實施方案m)或η)的CMV gB多肽，其中至少位於相對於SEQ ID NO:1中所示序列的242位或在其他CMV gB多肽的對應位置處的酪氨酸(Y)被組氨酸(H)取代。P)實施方案c)至η)中任一項的CMV gB多肽，其中位於相對於SEQ ID NO:1中所示序列的融合環FL2結構域中的240-242位或在其他CMV gB多肽的對應位置處的胺基酸W.L.Y分別被胺基酸A.F.H取代。`q)實施方案d)至P)中任一項的CMV gB多肽，其中相對於SEQ ID NO:1中所示的序列，細胞質結構域中的缺失對應於825至877胺基酸區。r)實施方案a)至q)中任一項的CMV gB多肽，其中所述多肽在蛋白內切水解位點處突變。s)實施方案r)的CMV gB多肽，其中進行至少一個胺基酸取代，所述取代選自下列:相對於SEQ ID NO:1中所示序列或在其他CMV gB多肽的對應位置處，R456被T456取代、R458被Q458取代以及R459被T459取代。t)實施方案s)的CMV gB多肽，其中相對於SEQ ID NO:1中所示的序列或在其他CMV gB多肽的對應位置處的R456、R458和R459分別被T456、Q458和T459取代。u)實施方案a)至t)中任一項的CMV gB多肽，其中相對於SEQ ID NO:1中所示的序列的精氨酸(R357)被絲氨酸(S357)取代。V)實施方案a)至u)中任一項的CMV gB多肽，其中相對於SEQ ID NO:1中所示的序列的精氨酸(r5°)被絲氨酸(s5°)取代。w)實施方案a)至V)中任一項的CMV gB多肽，其中相對於SEQ ID NO:1中所示的序列的半胱氨酸(C778)被丙氨酸(A778)取代。X) SEQ ID NO:3中所示的序列的CMV多肽。y) SEQ ID NO:4中所示的序列的CMV多肽。
Z ) SEQ ID NO: 5中所示的序列的CMV多肽。aa)包含CMV gB多肽的製劑，其中如通過AUC(分析超速離心)測定的，所述多肽的超過50%是三聚體形式。bb)免疫原性組合物，其包含實施方案a)至z)中任一項的CMV gB多肽與合適的藥物載體的混合物。cc)實施方案bb)的免疫原性組合物,進一步包含佐劑。dd)多核苷酸，其編碼實施方案a)至z)中任一項的CMV gB多肽。ee)重組載體，其包含實施方案dd)的多核苷酸。ff)用實施方案ee)的重組載體轉化的宿主細胞。gg)實施方案a)至z)中任一項的CMV gB多肽，其用於預防和/或治療CMV感染。hh)實施方案a)至z)中任一項的CMV gB多肽在製備用於預防和/或治療CMV感染的藥物中的用途。 ii)用於引發針對CMV的免疫應答的方法，所述方法包括將免疫有效量的組合物施用於受試者的步驟，所述組合物包含實施方案a)至z)中任一項的CMV gB多肽。本發明將通過參考下列非限制性實施例進行進一步描述。實施例1: CMVgB多肽
以下指定的所有gB多肽變體(對於圖示參見圖1和圖2)的源自CMV毒株AD169的gB的胺基酸序列。相應地，當指定突變位置時，胺基酸的編號是相對於SEQ ID NO:1中所述的AD169 CMV gB的序列。此外，除如下所述它們各自含有的特定突變以外，下列構建體(i)所有缺失跨膜結構域(缺失胺基酸701至775)和(ii)所有包含下列點突變:用胺基酸S取代胺基酸R50和R3570儘管下列變體在用於瞬時轉染的多肽的C末端包含組氨酸標記，但是所述標記的序列不包括在其中公開的SEQ ID中。1.1 gB~SLP12
gB-SLP12變體包含2個系列的點突變，其分別針對靶向gB的推定的融合環，FLl和FL2。FLl通過用胺基酸155G.H.R157取代胺基酸155Y.1.Y157進行突變，而FL2通過用胺基酸240A.F.H242取代胺基酸24°W.L.Y242進行突變。該構建體編碼830胺基酸長的蛋白。gB_SLP12的完整胺基酸序列以SEQ ID NO:3給出。1.1.1 表汰載體 DMax-AD169-gB_SLP12 的構律
gB-SLP12基因序列(SEQ ID NO:6)由GeneArt公司合成。將編碼序列進行密碼子優化而用於在CHO細胞中表達。分xMj^HindIII M BamHI限制性位點引入5』末端(在起始密碼子之前)和3』末端(剛好在終止密碼子之後)。密碼子優化的基因序列在第一個推定的融合環(用155G.H.R157替換155Y.1.Y157)和第二個推定的融合環(用24°A.F.H242替換240W.L.Y242)中攜帶突變。使用KpnI和SacI克隆位點接受合成的DNA片段作為2558 bp長的DNA插入物以克隆進pMA載體(GeneArt專有質粒)，生成AD169-gB-SLP12-pMA質粒。用HindIIlMBamHI 限制性處理 AD169-gB_SLP12_pMA 質粒。將含有 gB_SLP12 基因的 2530 bpDNA片段進行凝膠純化,並且連接到哺乳動物表達載體pMax (Amaxa的pMaxCloning載體的修飾版本)中。pMaxCloning載體骨架已經修飾，以消除Amaxa商業載體的多克隆位點中存在的ATG起始密碼子Q(pnl和HindIII之M )。在通過自動DNA測序驗證序列後，使用pMax-AD169-gB-SLP12重組質粒以瞬時轉染CHO-S細胞。1.2 gB-SLP12~Del2
將包括胺基酸Pro825至Lys 877的一個疏水區缺失引入gB_SLP12變體，產生gB-SLP12-Del2變體。該構建體編碼777胺基酸長的蛋白。gB-SLP12_Del2變體的完整胺基酸序列以SEQ ID N0:4給出。編碼gB-SLP12-Del2的核苷酸序列以SEQ ID N0:8給出。1.2.1 表汰載體 pMax-AD169-gB-SLP12-Del2 的構律
使用作為模板的 AD169-gB-SLP12-pMA 質粒和引物 SLP-Fw (SEQ ID NO:22)(5』-GAAAGCGGGCAGTGAGCGGAAGGC-3』)和 SLP-Rv (SEQ ID NO:23) (5』-TGTCCTCCACGTACTTCACGCGCTGC-3，)，通過PCR擴增存在於AD169_gB_SLP12編碼序列中的包括HindIII和ClaI獨特限制性位點的2159 bp DNA片段。使用作為模板的Del2-pMA質粒和引物Del-Fw (SEQID NO:24) ( 5』-CCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCA-3』)和Del-Rv (SEQ ID NO:25) (5，-CCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGC-3』)，也 PCR 擴增 AD169_gB_SLP12Del2 基因的 C 末端部分作為包括CZaJ和fee/限制性位點的745 bp片段。由GeneArt公司構建攜帶編碼gB_SLP12_Del2基因的C末端部分的合成DNA片段的Del2-pMA載體。用適當的酶限制性處理後，將PCR片段克隆到用HindIII和SacI限制性處理的pMax載體中。在通過自動DNA測序驗證序列後，使用pMax-AD169-gB-SLP12重組質粒以瞬時轉染CHO-S細胞。1.3 gB-SLPl-Del2
將包括胺基酸Pro825至Lys 877的一個疏水區缺失引入gB_SLPl變體，產生gB-SLPl-Del2變體。該變體編碼777胺基酸長的蛋白。gB-SLPl_Del2變體的完整胺基酸序列以SEQ ID NO:5給出。

1.3.1 表汰載體 pMax-AD169-gB-SLPl-Del2 的構律
gB-SLPl基因首先由GeneArt合成。密碼子優化的基因序列在第一個推定的融合環中攜帶突變(用155G.H.R157替換155Y.1.Y157)。使用KpnI和SacI克隆位點接受該合成的基因作為2558 bp DNA片段以克隆進pMA載體，生成AD169-gB-SLPl-pMA質粒。從AD169-gB-SLPl-pMA 和載體質粒 Del2_pM 構建表達載體 pMax-AD169-gB-SLPl_Del2。用HindIII和ClaI限制性處理pMA_gB_SLPl載體，且通過凝膠純化分離編碼SLP1-De1-2蛋白的N末端部分的1964 bp DNA片段。用CZa/和5^/消化載體質粒Del2_pMA，且通過凝膠純化分離編碼gB-SLPl-Del2蛋白的C末端部分的420 bp DNA片段。將這兩個片段一起連接至用HindIII和SacI限制性處理的pMax表達載體中，生成最終表達載體pMax-AD169-gB-SLPl-Del2。在通過自動DNA測序驗證序列後，使用pMax-AD169-gB-SLP1-De12重組質粒以瞬時轉染CHO-S細胞。編碼gB_SLPl_Del2的核苷酸序列以SEQ ID NO:7顯示。1.4 gB-SLP12-Deltall3
在gB-SLP12-Deltall3變體中進行在胺基酸793開始的胞質結構域的C末端部分的缺失，以及跨膜結構域的胺基酸701-775的缺失。該變體編碼717胺基酸長的蛋白。gB-SLP12-Deltall3變體的完整胺基酸序列以SEQ ID N0:12給出。1.4.1 載體 pTT5-gB-SLP12-Deltall3 的構律
用於構建pTT5-gB-SLP12-Deltall3表達載體的策略如下。首先，用HindIII和ClaI限制性處理pMax-AD 169-gB-SLP 12載體(參見部分1.1.1)。通過凝膠純化分離獲得的對應於gB-SLP12-Deltall3構建體的N末端部分的1970-bp gB片段。由Geneart合成包括ClaI取BernHI位點(剛好在終止密碼子之後)的gB-SLP12_Deltall3構建體的C末端，並且接受作為230-bp長的DNA插入物(命名為new-2)，用於克隆到pMA載體(Geneart專有質粒)。用ClaI和BamHI限制性處理New-2-pMA載體且凝膠純化230_bp插入物。將兩個凝膠純化的DNA片段一起連接至以前用HindIII和BamHI限制性處理的pMax表達載體中，生成 pMax-AD169-gB-SLP12-Deltall3 質粒。然後使用來自 Stratagene (N0.200513)的「QuickChange多位點定向誘變」試劑盒將AD169-gB-SLP12_Deltall3構建體的50和357位的絲氨酸回復為天然的精氨酸。序列驗證後，用限制性酶"ifli////取BamHI消化獲得的質粒。凝膠純化2200-bp gB片段且連接至以前用HindIII和BernHI限制性處理的pTT5載體(NRC，Canada)中，生成最終的pTT5-gB-SLP12_Deltall3表達質粒。該載體用於瞬時轉染CHO-S細胞。編碼gB-SLP12-Deltall3的核苷酸序列以SEQ ID NO: 11顯示。1.5 gB-SLP12-Delta725
在gB-SLP12-Delta725中進行在胺基酸725開始的跨膜結構域部分的缺失，和整個胞質結構域的缺失。該變體編碼724胺基酸長的蛋白。gB-SLP12-Delta725變體的完整胺基酸序列以SEQ ID NO: 10給出。1.5.1 表汰載體 pTT5-gB-SLP12-Delta725 的構律
首先，使用來自Stratagene (N0.200513)的「QuickChange多位點定向誘變」試劑盒將gB-SLP12-Del2構建體(參見部分1.2)的50和357位的絲氨酸回復為天然的精氨酸。序列驗證後，用限制性酶和ClaI消化獲得的質粒，且通過凝膠純化分離獲得的1970-bp gB片段。還生成包括CZaJ和及麗奴限制性位點(SEQ ID NO: 26)且包含下列序列的PCR片段:
47CG^TCCCCTGGAGAACACCGACTTCAGGGTGCTGGAGCTGTACTCCCAGAAGGAACTGAGGT CCAGCAACGTGTTCGACCTGGAGGAAATCATGAGAGAGTTCAACAGCTACAAGCAGCGCGTGAA GTACGTGGAGGACAAGGTGGTGGACCCCCTGC CCCCCTACCT GAAGGGCCTGGACGACCTGA
TGAGCGGACTCGGGGCTGCTGGAAAGGCCTGAGG^reC。將 1970-bp HindII1-ClaI片段和用ClaI和BamHI限制性處理的PCR DNA 一起連接至pTT5載體(NRC, Canada)的HindIII取BamHI克隆位點之間，以生成最終的pTT5-gB-SLP12_Delta725表達載體。在通過自動DNA測序檢查序列後，使用PTT5-gB-SLP12-Delta725重組質粒以瞬時轉染CHO-S細胞。編碼gB-SLPl-Delta72的核苷酸序列以SEQ ID N0:9顯示。1.6 gB-SLP12-Delta725-LVL759
該變體編碼683胺基酸長的蛋白。gB-SLP12-Delta725-LVL759的完整胺基酸序列以SEQ ID NO: 14 給出。1.6.1 表汰載體 pTT5-AD169-Delta725-LVL759 的構律
使用來自 Stratagene (N0.200522)的 QuickChange II XL 位點定向誘變試劑盒和引物 CANl498 S』-gtgcatctfgtgeel_gatocgaggec#gagecae8gg-T 和CANl499 5-cctgt9gclcacggcctcggalccGaggcacacgatpcac-3'突變 pTTS-gB-SLPU-DeltaTSS-RR-1eaderf 質粒, 產生中間質粒 pTT5_694_13。 使用相同的QuickCha nge II XL位點定向誘變試劑盒和引物 CAN1650 S'- gtgaacciglQcalcgl9tgcc{g§ccclggcx:agccaccgggcc3acgagaca3-3'和CAN1651 5'- ttgtetcg _eccgglggctggeeagig agieacacgaigcaeag_cae-y 突變該中間質粒，產生
最終的表達載體 pTT5-gB-SLP12-725-LVL75。編碼 gB-SLP12-Delta725_LVL759 的核苷酸序列以SEQ ID NO: 13顯示。1.7 gB-SLP12-Delta725-LVL776
該變體編碼683胺基酸長的蛋白。gB-SLP12-Delta725-LVL776變體的完整胺基酸序列以 SEQ ID NO: 16 給出。1.7.1 表汰載體 pTT5-AD169-Delta725-LVL776 的構律
使用相同的QuickChange II XL位點定向誘變試劑盒和引
物 C A N I 6 4 8 S'-cctgtgcatcgtgtgcclgggagccci§gccagccaccgggccaacgagacaatc-3'和 C A N I 6 4 9 S-gattgtctcgttggcccggtggclggccagQgcttJCcaagcacaciatgcacafg-S'突變上述中間質粒PTT5-694-13，產生進一步的中間質粒pTT5_LVL758-1。使用相同的QuickChange II XL位點定向誘變試劑盒和引物C A N I 6 9 7 5'*tggtgtgcgtgaac:clgtgeatc#gclcclgggage :lggc ccggg(xaacgagaMalctao3'
和 C A N I 6 9 8 8.gtaga^lgιctogIl9gcccigtgigccagggclcccaggag€acg^^9C8cagg!^cacgGacacca-3,突變該中間質粒，產生最終的表達載體pTT5-gB-SLP12-Delta725-LVL776。編碼gB-SLP12-Delta725-LVL759 的核苷酸序列以 SEQ ID NO: 15 顯示。1.8 gB-SLP12-Delta725_CD33
gB-SLP12-Delta725-CD33變體編碼677胺基酸序列長的蛋白。該構建體與gB-SLP12-Delta725構建體·幾乎相同，除了包括核苷酸I至192的gB基因的N末端部分(成熟gB蛋白的信號序列和前64個胺基酸)被CD33的信號序列所替換(Taylor等人.1999，第274卷，第17期:第11505-11512頁)。gB-SLP12Delta725_CD33變體的完整胺基酸序列以SEQ ID NO: 18給出。1.8.1 表汰載體 pTT5-gB-SLP12-Delta725-CD33 的構律
使用作為模板的 pTT5-gB-SLP12-Delta725 質粒和引物 CD33 (SEQ ID NO:27)
(5'- AATCAAAAGCTTACTAGTGCCGCCACCATGGCCCCCCTGCTGCTTCTGCTGCCCCTGCTTTGGG
CAGGGGCCCTGGCXCACCGGGGCAACG.^1》和 CM0578 (SEQ ID NO:28)
(S'- GTAATAGGATCCGGTACCTCATCAGGCCTTTCCAGCAG-3!),通過 PCR 擴增構建gB-SLP12-Delta725-CD33基因。正向引物含有歷位點和CD33信號序列。反向引物包含終止密碼子和BamHI位點。用適當的酶限制性處理後，將PCR片段克隆到用HindIIIMBglII限制性處理的pEE14載體中。序列驗證後，選擇pEE14-gB-SLP12-Delta725-CD33重組質粒。最後，如下將gB-SLP12-Delta725-CD33基因亞克隆到pTT5載體中。使用作為模板的 ΡΕΕ14- gB-SLP12-Delta725-CD33 載體和引物 CD33F (SEQ IDNO:29) (5,-AATCAAAAGGTTOC:TAGTGCCGCGMXATGGGCCCCXTGCTG-3』》和 Ecto-Rv (SEQID NO:30)
《S'-GACTTATAGGATCCTCATCAGTGGTGGTGATGATGGTGGCCGCCGGCCTTTCCAGCAGC-S.)
PCR擴增編碼序列。正向和反向引物分別含有和克隆位點。用HindII和BernHI限制性處理擴增的DNA和pTT5載體，然後連接。序列驗證後，獲得的pTT5-gB-SLP12-Delta725-CD33表達載體用於瞬時轉染CHO-S細胞。編碼gB-SLP12-Delta725-CD33 的核苷酸序列以 SEQ ID NO: 17 顯示。實施例2:CMV gB多肽的表達
使用來自Invitrogen的Freestyle MAX CHO表達系統將上述不同的DNA構建體瞬時轉染至CHO(中國倉鼠卵巢)細胞中。編碼多肽gB-DeltaTM的構建體用作對照。gB_DeltaTM的胺基酸序列以SEQ ID NO: 2給出。用於表達gB-DeltaTM的表達載體是pMax_AD169。Freestyle MAX CHO使用CHO-S細胞系(常用CHO-Kl細胞系適應於懸浮的分開的亞克隆)和作為轉染試劑的基於合成的陽離子性脂質的聚合物。使用Qiagen Maxiprep試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)根據製備商的方案分離用於轉染的質粒DNA。如Invitrogen所推薦地製備轉染複合物。簡而言之，將37.5 μ g質粒和37.5 μ I FreeStyle MAX轉染試劑分別稀釋在0.6 ml Opt1-Pro SFM培養基中。之後立即將稀釋的FreeStyle MAX轉染試劑添加至稀釋的DNA溶液。DNA-FreeStyle MAX混合物在室溫下孵育10分鐘，然後添加至細胞培養物。轉染的培養物在37°C培養3天。然後，培養物在29°C維持另外3天期間。在轉染後第6天，收集包含懸浮的轉染細胞以及細胞培養基的各自I ml的細胞培養物。通過以12，000 g離心將細胞培養上清液與懸浮的細胞分開。收集上清液，且用Iml裂解緩衝液(補充1% Triton X-100的PBS)溶解細胞沉澱。通過在4°C以12，000 g離心5 min而從細胞裂解物中除去不溶性物質。使用MOPS緩衝液將培養物上清液和溶解的細胞級分的等分試樣(15 μ )在Criterion XT 4-12% Bis Tris凝膠(Biorad)上運行。將蛋白轉移至硝酸纖維素膜且用抗gB抗體MAb 27-156 (Spaete等人，1990)探測膜。可替代地,使用抗gB抗體通過Elisa測定檢測表達和分泌水平。在96孔板中進行測定。用多克隆抗gB抗體包被板(通過在兔中注射多肽gB** - EP0759995中所述-而產生抗體)。在37°C下在脫脂奶3%中飽和步驟Ih後，抗體在4°C下孵育過夜。然後洗滌孔4次。在生物素綴合的單克隆抗gB抗體(通過用完整CMV病毒注射小鼠而產生抗體)存在的情況下，將待測試的每份樣品(用給定的gB構建體轉染的上清液和細胞級分)的10份2倍稀釋液的系列添加至包被的板，在37°C持續2h 。用PBS/Tween 20 0.1% 4次洗滌後，添加100 μ 鏈黴親和素-辣根過氧化物酶，且在37°C下孵育30 min。用PBS/Tween 20 0.1%將板洗滌4次，且用水洗滌一次。然後，在37°C下在0.1M檸檬酸鹽緩衝液pH 5.8 (25%)中用100 μ 四甲基-聯苯胺75% (TMB)將板孵育10 min。用100 μ H2SO4 0.4Ν停止該反應，且在分光光度計中在450/620 nm閱讀比色度。其濃度已知的以前批次的純化的gB-DeltaTM用作在該實驗中的標準品。使用軟體SoftMax Pro，定量待測試的每份樣品的濃度。2.1 gB_SLP12、gB-SLPl~Del2 和 gB-SLP12_Del2 的表汰和分泌-Western 印跡分析
圖3中顯示的是獨立進行的三次實驗的代表性Western印跡-泳道A、B、C和D分別代表用 gB-DeltaTM、gB_SLP12、gB-SLPl-De12 和 gB_SLP12_Del2 轉染的培養物的細胞級分。所述細胞級分中存在的gB的水平表明細胞內的gB水平。泳道E、F、G和H分別代表用 gB-DeltaTM、gB_SLP12、gB-SLPl-De12 和 gB_SLP12_Del2 轉染的培養物的上清液。所述上清液中存在的gB的水平表明分泌的gB水平。如果將泳道B、C和D中存在的gB水平與泳道A中存在的gB水平進行比較，注意到，與具有完整融合環的gB-DeltaTM(即，現有技術的多肽)相比，當突變融合環時(即，本發明的多肽)的細胞內gB水平保持不變，提示融合環中的突變不影響分泌。事實上，如果將泳道F、G和H中存在的gB水平與泳道E中存在的gB水平進行比較，觀察到，本發明的gB多肽(具有突變的融合環)的表達和它們的分泌至少與現有技術的gB多肽(具有完整融合環的gB-DeltaTM)的表達和分泌一樣有效。2.2 gB_SLP12、gB-SLP12_Deltall3 和 gB-SLP12_Delta725 的表達和分泌二Elisa測定
圖4中顯示了通過Elisa測定獲得且以圖的形式表示的結果的定量-黑色條分別代表用 gB-DeltaTM、gB_SLP12、gB_SLP12_Deltall3 和 gB_Delta725 轉染的培養物的細胞級分，而灰色條代表相同培養物的上清液。相應地，每種表達的變體的灰色條和黑色條的總和代表在CHO細胞中轉染後獲得的總表達水平。關於gB-DeltaTM，觀察到在表達的多肽群體內，約一半的多肽保留在細胞內(灰色條)且約一半的多肽分泌(黑色條)，令人驚訝的是，當表達gB-SLP12時，觀察到總表達水平比gB-DeltaTM的顯著高約2倍。此外，如果比較分別的胞內形式和分泌形式的水平，觀察到，超過80 %的多肽分泌，而僅10-20%保持在細胞內，提示gB-SLP12也比gB-DeltaTM更有效地分泌。該結果表明，融合環的突變對表達和分泌具有積極影響。用多肽gB-SLP12-Deltall3和gB-SLP12_Delta725類似地觀察到比gB-DeltaTM更高的表達和分泌水平。然而，令人驚訝的是，那兩種多肽甚至比gB_SLP12更顯著表達，分別為超過2倍和約1.6倍，這提示至少部分細胞質結構域的缺失與融合環突變的組合進一步改善了多肽的表達和因此獲得的分泌多肽的最終產率。2.3 gB-SLP12、gB-SLP12_Deltall3、gB-SLP12_Delta725、gB~SLP12 的表汰和分泌-融合環的作用
Western印跡顯示於圖5中-圖5A顯示gB_SLP12的分泌至少與gB_SLP12_Delta725一樣地有效，其二者顯示了比gB-DeltaTM更高的分泌水平(比較泳道F和J與泳道B)，驗證了通過Elisa測定觀察到的結果。泳道M和N代表用具有完整融合環FLl和FL2的gB-SLP12-Delta725轉染的培養物的細胞級分和上清液。在培養上清液中沒有檢測到gB的情況(參見泳道N)表明，gB的良好表達/分泌水平需要融合環被突變-在圖5中得到了類似的觀察結果，其中與用gB-SLP12-Delta725轉染的培養物的上清液相比，具有完整融合環FLl和FL2的gB-Delta725轉染的 培養物的上清液中沒有檢測到gB蛋白(分別比較泳道6和2)。對於多肽gB-SLP12-Deltall3類似地觀察到對於實現比gB-DeltaTM更好的分泌需要突變融合環FLl和FL2。與用gB-SLP12-Deltall3轉染的培養物的上清液相比，具有完整融合環FLl和FL2的gB-SLP12-Deltall3轉染的培養物的上清液中幾乎檢測不到gB(分別比較泳道6』和4』)。2.4 gB-SLP12~Delta7 25.gB - S L P I 2-D e 11 a 7 2 5 - L V L 7 5 9、矛口gB-SLP12-Delta725-LVL776 的表汰和分泌
Western印跡顯示於圖5C中-用gB_SLP12-Delta725_LVL759轉染的培養物的上清液中存在的gB水平至少與用gB-SLP12-Delta725轉染的培養物的上清液中存在的gB水平一樣好(分別比較泳道f和h與泳道b和d)。用gB-SLP12-Delta725-LVL776轉染的培養物的上清液中存在的gB水平僅稍微低於用gB-SLP12-Delta725轉染的培養物的上清液中存在的gB水平(分別比較泳道j和I與泳道b和d)。這些結果表明，在本發明的多肽(參見圖2)中N末端部分中的突變沒有顯著影響所述多肽的分泌水平。實施例3:CMV gB多肽的產物概況如實施例2中描述，在CHO細胞中瞬時表達gB-DeItaTM,gB-SLP12和gB_SLP1-De12，且在轉染後第6天收集培養上清液。澄清後，用350 mM NaCl和0.4% Empigen補充上清液，然後0.22 Mm過濾。鎳柱用於從細胞對應的培養物上清液純化轉染和分泌的多肽。用包含10 mM TRIS-HCl, 350 mM NaCl, 10 禮咪唑和0.4% Empigen pH 8.0 的緩衝液平衡 XK 16柱(Qiagen)。以4 ml/min的流速將以前澄清、補充且過濾的細胞培養上清液上樣，且用平衡緩衝液洗滌保留的蛋白。用包含10 mM TRIS HCl, 350 mM NaCl, 350 mM咪唑和0.4%Empigen pH 8.0的緩衝液以4 ml/min的流速進行洗脫。然後以2 ml/min的流速在用包含10 mM磷酸鹽(K)緩衝液和0.4% Empigen pH 7.2的緩衝液平衡的XK 26柱(GE)中注射洗脫的級分。收穫第一蛋白峰，用於進一步分析。然後將對應於該峰的洗脫級分上樣至用包含10 mM磷酸鹽(K)和0.4% Empigen pH 7.2的緩衝液平衡的cellufine硫酸鹽柱(ChissoCorporation)上。用包含 5 mM 磷酸鹽(K), IM NaCl 和 0.1% Pluronic F68 pH 7.2 的緩衝液以3 ml/min的流速進行洗脫。然後從上述純化過程產生的純化多肽進行下列實驗。3.1戊二醛交聯實驗
將戊二醛直接添加至15 μ 每種純化的多肽(對應於約7 Pg總蛋白)，以便獲得0.5%和1%的最終戊二醛濃度。作為對照，留下沒有戊二醛的每種純化多肽的樣品。將混合物孵育150 min,且然後通過添加NaBH4 (Aldrich)而停止戊二醒反應,且樣品在冰上孵育20min。使用MOPS緩衝液將樣品在Criterion XT 4-12% Bis Tris凝膠(Biorad)上運行。凝膠用考馬斯藍R-250染色，且顯示於圖9中。結果
如果多肽的多聚體在用戊二醛處 理之前存在於樣品中，那麼任何給定大小的多聚體，無論是二聚體、三聚體、或任何其他高分子量的多聚體，進行交聯，且因此，當在變性條件下在凝膠上遷移時，保持相同。相應地，所述多聚體根據其分子量進行遷移。相反，對於沒有用戊二醛處理的對照樣品，所述樣品中存在的任何多聚體當在變性條件中在凝膠上遷移時被變性為單體，使得對照樣品中的多肽根據等同於多肽的單體的分子量進行遷移(參見泳道A、D和G中稍低於150 kDa的單一條帶)。如果考慮gB-DeltaTM的多聚體概況(泳道A、B和C)，觀察到用戊二醛處理的樣品中非常高分子量的2條條帶(由箭頭指出)。還注意到，這兩條條帶具有相同強度，這提示gB-DeltaTM樣品主要包含兩種類型的多聚體且樣品內的每種多聚體的比例應該是大致相同的。相反，當考慮gB-SLP12的概況時，尤其在泳道E和F中，其中用戊二醛處理樣品，同時也觀察到兩條高分子量條帶，每條條帶的強度顯著不同。事實上，較低分子量條帶的強度至少比最高的條帶強3-5倍，這表明在gB-SLP12樣品內的較低分子量多聚體群體遠大於較高分子量多聚體的群體。當考慮gB-SLPl-Del2樣品(泳道G、H和I)時得到了類似的觀察結果，其中較低條帶的強度比較高條帶的強度強約2-3倍。這表明，gB-SLP12和gB-SLPl-Del2具有較低分子量多聚體的比例富集的類似多聚體概況，這不同於現有技術的多肽gB-DeltaTM。應當注意的是，該實驗中使用的凝膠沒有提供好到足以確定條帶中觀察到的關於gB-DeltaTM的較低分子量條帶與條帶中觀察到的關於gB-SLP12和gB-SLPl-Del2的條帶大小是否相同的解析度。出於同樣的原因，不可能精確地確定每條條帶的實際大小，使得從該實驗中鑑定觀察的多聚體是二聚體或三聚體等...是困難的。為了獲得該信息，用純化多肽進行下列兩個實驗。3.2 分析軺諫離心-gB-DeltaTM、gB_SLP12、gB-SLPl_Del2使用分析超速離心(AUC)通過測量分子對離心力響應的移動速率來確定純化的多肽樣品內不同種類(例如，聚集的純化多肽的不同大小的多聚體)的溶液總共的同質性和大小分布。這是基於通過沉降速率實驗獲得的不同種類的沉降係數的計算，其取決於它們的分子形狀和質量。純化後，在AN-60Ti轉子已經平衡至15°C之後，在IOmM磷酸鈉，IMNaCl 和 0.1% Pluronic, pH 7.2 中重懸浮的 gB-DeltaTM, gB-SLP 12 和 gB-SLP 1-De 12 在Beckman-Coulter ProteomeLab XL-1分析超速離心機中以28 000 rpm離心。為了收集數據，每隔5 min在280nm和230nm記錄160次掃描。使用程序SEDFIT進行數據分析，用於測定C(S)分布。用SEDNTERP軟體從它們的胺基酸序列和它們的預期聚糖組合物的組合進行蛋白的微分比容的測定。SEDNTERP還用來通過忽略Pluronic F68的貢獻(這沒有表示在該軟體的資料庫中)確定緩衝液的粘度和密度。結果以圖的形式提供，其代表針對分子量繪製的每個種類的濃度。已經通過考慮總分布的曲線下的總面積作為100%的樣品且通過計算每個種類的貢獻代表的該總面積的百分比來進行所有種類的相對豐度的測定。
圖10相繼顯示了通過分析超速離心分析的純化的gB-DeltaTM、gB-SLP 12和gB-SLP 1-De 12的概況。對應於gB-DeltaTM樣品的圖表明通過多個峰代表的不均勻分布。具體而言，在所述樣品中觀察到的主要群體是417 kDa (35%)和723 kDa (30%)種類，其可能分別代表三聚體和六聚體。更高分子量多聚體也存在於所述樣品中。相比之下，當融合環FLl和FL2突變時，對應的純化的gB-SLP12多肽的概況表明更均勻的群體，因為主要群體是327 kDa (63%)的種類，其可能代表三聚體。更高分子量多聚體的存在是幾乎察覺不到的。在gB-SLPl-Del2樣品中觀察到類似的概況，其中主要群體是311 kDa (67%)的種類，其也可能代表三聚體 ，而更高分子量的多聚體的存在僅僅是微小的。總之，本發明的gB多肽(gB_SLP12和gB_SLPl_Del2)呈現改進的產物概況，因為與現有技術的gB多肽(gB-DeltaTM)的三聚體群體相比，三聚體群體增加了約2倍係數。3.3 分析軺諫離心-gB-SLP12_Delta725、gB-SLP12_Deltall3
如上述部分3.2中所述進行分析超速離心，以確定在純化多肽gB-SLP12-Delta725和gB-SLP12-Deltall3內不同種類的溶液中的同質性和大小分布。如實施例2中描述重組表達多肽，且如本實施例3中的第一段描述進行純化。純化後，將gB-SLP12-Delta725和gB-SLP12-Deltal 13各自再懸浮在包含0.1% Pluronic的緩衝液中或沒有Pluronic的緩衝液中。結果
-圖1lA相繼顯示了在0.1% Pluronic存在或不存在的情況下通過分析超速離心分析的純化的gB-SLP12-Deltall3多肽的概況。在Pluronic不存在的情況下，觀察到的概況與圖10中對於gB-SLP12和gB-SLP12-Del2觀察到的概況相類似，類似的72%群體代表在純化的多肽群體內的三聚體，即與現有技術的gB多肽(gB-DeltaTM)相比改進的產物概況。然而，在Pluronic存在的情況下，三聚體的百分比降低，伴隨單體的百分比增加(25% )和大小約230 kDa的多聚體的存在。這種gB-SLP12-Deltall3多肽在Pluronic存在的情況下單體化的傾向表明對去汙劑的敏感性。-圖1lB相繼顯示了在0.1% Pluronic存在或不存在的情況下通過分析超速離心分析的純化的gB-SLP12-Delta725多肽的概況。用這種純化的多肽觀察到的概況是類似的，無論Pluronic存在與否。事實上，在兩種情況下三聚體的百分比為約70%，即與用上述gB-SLP 12和gB-SLP 12_De 12多肽觀察到的三聚體百分比一樣高，且因此，gB-SLP12-Delta725也顯示與現有技術的gB多肽(gB-DeltaTM)相比改進的產物概況。結論
儘管gB-SLP12-Deltall3和gB_SLP12_Delta725兩者都顯示出具有三聚體的富集比例的改進的產物概況，但是獲得的結果表明，gB-SLP12-Delta725提出了在溶液中具有增加的結構穩定性的額外優勢，因為在Pluronic存在或不存在的情況下保持了其三聚體概況。事實上，去汙劑處理對於該多肽的沉降特性沒有可觀察到的影響。3.4大小排阻層析
還使用在280 nm的UV-檢測器和TSK G5000PWXL柱(Tosoh Bioscience)通過大小排阻層析確定純化的gB-DeltaTM和gB_SLP12的蛋白大小。在室溫下以0.5ml/min的流速將樣品上樣。在室溫下以相同的流速用PBS + 0.1% Pluronic進行洗脫。甲狀腺球蛋白(669kDa)、鐵蛋白(440 kDa)、過氧化氫酶(232 kDa)、醛縮酶(158 kDa)、白蛋白(68 kDa)、伴清蛋白(75k Da)、卵清蛋白(43 kDa)、碳酸酐酶(29 kDa)、和核糖核酸酶(13.7kDa)用於校準。益果
如圖13上所示，如通過大小排阻層析法所測量的，gB-SLP12具有357 kDa的大小，這可能代表三聚體形式。現有技術的兩種多肽gB-DeltaTM和gB-S50_DeltaTM，即具有完整融合環的多肽，具有類似的代表較高分子量多聚體的710 kDa的大小。這些結果驗證了上述用分析超速離心獲得的結果，因為本發 明的多肽(gB-SLP12)具有不同於現有技術的多肽(gB-DeltaTM)的產物概況。實施例4: gB-SLP 12多肽的C末端剪切
4.1表汰和鈍化
如實施例2中描述，瞬時轉染和表達gB-DeltaTM、gB_SLP12、gB_SLP12_Deltall3和gB-SLP12-Delta725 多肽。如實施例 3 的第一段中描述，純化 gB-SLP12、gB-SLP12_Deltall3和gB-SLP12-Delta725多肽。在轉染後第6天收集後，用Bis-Tris和Empigen BB補充gB-DeltaTM上清液以分別達到20 mM和0.4%的最終濃度。然後將其上樣至在包含20mM Bis-Tris - 0.4% Empigen BB, pH 6.0 的緩衝液中平衡的 Q-Sepharose XL 柱(GEHealthcare)上。用 75% 的包含 20 mM Bis-Tris - 0.4% Empigen BB, pH 6.0 的緩衝液和 25% 的包含 20 mM Bis-Tris - 0.4% Empigen BB -1 M NaCl, pH 6.0 的緩衝液的混合物從柱上洗脫結合的多肽。然後用磷酸鈉補充洗脫物以達到10 mM的最終濃度，且調整至pH 6.8。然後將其上樣至在包含10 mM磷酸鈉-0.4% Empigen BB - 0.25M NaCl, pH
6.8的緩衝液中平衡的羥基磷灰石II型柱(Bio-Rad)上。回收含有多肽的流出物，且上樣至在包含10 mM磷酸鈉-0.4% Empigen BB - 0.25M NaCl, pH 6.8的緩衝液中平衡的Cellufine硫酸鹽柱(JNC Corporation)上。回收含有多肽的流出物,使用IOOkD PelliconXL膜(Millipore)通過超濾濃縮,且上樣至在包含10 mM磷酸鈉-0.4% Empigen BB, pH
7.2的緩衝液中平衡的Superdex 200柱(GE Healthcare)上。收集洗脫物,濃縮,且用IOmM磷酸鉀，PH 7.2進行滲濾。4.2 Western 印跡分析使用N-糖苷酶F去糖基化試劑盒(Roche，N0.11836552001)根據製備商的說明將上述純化的多肽去糖基化。使用MOPS緩衝液將等量的每種純化的去糖基化多肽在CriterionXT 4-12% Bis Tris凝膠(Biorad)上運行。將蛋白轉移至硝酸纖維素膜，且用抗gB抗體MAb 27-156 (Spaete 等人，Virology 167，207-225 (1988)(圖 14A,圖 14B,泳道 3，圖14C,泳道B,和圖14D,泳道D)和抗6X His標記抗體(Abeam, N0.ab9108)(圖14B,泳道2，圖14C，泳道A，和圖14D，泳道C)探測膜。結果
-圖14A顯示抗gB抗體識別純化的gB-DeltaTM多肽群體中兩種不同形式，表明在純化群體中多肽以至少兩種不同大小的形式存在，分別為92 kDa和80 kDa。基於胺基酸分子量的平均值(110 Da)，包含830個胺基酸的gB-DeltaTM的分子量應該是約91 kDa。因此，92 kDa條帶可能對應於全長gB-DeltaTM多肽,而80 kDa條帶可能對應於更短的多肽版本，表明在群體內，一些多肽被裂解且產生約80 kDa的剪切形式。-圖14B顯示，gB-SLP12多肽在細胞中重組表達後，抗gB抗體(泳道3)提供了識別類似大小的兩種形式( 分別為92 kDa和80 kDa)的相同概況，表明在這種多肽中發生類似的裂解。這裡應當注意的是，gB_SLP12的預期分子量也是約91 kDa，因為胺基酸的數目與對於gB-DeltaTM的是相同的。當用抗His標記抗體探測膜(泳道2)時，僅檢測到約92kDa的條帶。由於His標記位於多肽的C末端，這些數據表明，在多肽的C末端部分發生裂解，且因此生成缺失C末端的80 kDa的片段。-圖14C顯示，gB-SLP12-Deltall3多肽在細胞中重組表達後，抗gB抗體(泳道B)僅識別一條條帶(在約80 kDa)。因為gB-SLP12-Deltall3包含717個胺基酸，所以其預期平均分子量應當是約79 kDa。因此，在約80 kDa的僅一條條帶的觀察結果表明，該純化的多肽的群體僅由全長多肽構成，表明在該多肽群體中不再發生以前觀察到的在C末端部分的裂解。通過用抗His標記抗體探測膜且觀察到在約80 kDa的相同條帶驗證了這一點(泳道A)，表明存在多肽的C末端。-從關於多肽gB-SLP12_Delta725的圖14D中提供的Western印跡可以得出類似的結論。泳道D代表用僅識別一條條帶(在約80 kDa)的抗gB抗體探測的膜。包含824個胺基酸的該多肽的預期平均分子量應該是約79 kDa。泳道C代表用抗His標記抗體探測的膜且類似地僅識別在約80 kDa的一條條帶，表明存在多肽的C末端。-在去糖基化過程中多肽可能沉澱，這可能導致不完整的去糖基化。當去糖基化不完整時，一些多肽以它們的糖基化形式保留，該形式通常在凝膠中以彌散方式遷移，如在圖 14C和 14D 中提供的 Western 印跡中對於多肽gB_SLP12_Deltall3和 gB_SLP12_Delta725
所觀察到的。
圖14中提供的數據顯示，當缺失至少部分胞質結構域時，多肽的C末端部分中的多肽gB-DeltaTM和gB_SLP12發生的剪切沒有發生。 實施例5:多肽的gB-SLP12_Delta725的N末端異質性
如圖12A中所示，CMV gB-SLP12-Delta725多肽，當在細胞中重組表達時，產生成熟多肽的群體，該成熟多肽在N末端是異質的。事實上，如所示，信號肽酶碰巧在不同的胺基酸位置裂開信號序列。這種現象也被稱為信號肽酶「woobling」。
5.1表汰和鈍化
如實施例2中描述的，重組表達如實施例1中描述的含有His標記的gB-SLP12-Delta725、 gB_SLP12-Delta725_LVL759、 gB-SLPl2-Delta725-LVL776 和gB-SLP12-Delta725-CD33多肽。轉染後第6天，收集培養上清液。將不含EDTA的蛋白酶抑制劑混合物(Roche, N0.11873580001)添加至上清液中，且將NaCl濃度調節至500 mM,且最終pH調節至8.3。將IMAC瓊脂糖6 FF (GE Healthcare)填充至5 cm直徑玻璃柱(Waters)。用 5個柱體積的結合緩衝液(10 mM Tris, 500 mM NaCl, 10 mM咪唑，pH 8.3)平衡該柱。以10 ml/min的流速將上清液上樣至平衡柱上。用兩個柱體積的上述結合緩衝液洗滌未結合的物質。收穫50 ml的級分。用額外兩個柱體積的上述結合緩衝液進一步洗滌柱。收穫10 ml的級分。用6個柱體積的洗脫緩衝液(Tris，500 mM NaCl, 350 mM,咪唑，pH 8.30)洗脫與柱結合的蛋白。收穫10 ml的級分。將級分上樣至SDS-PAGE凝膠，且合併陽性級分，且用Centricon超濾裝置(Millipore)進行濃縮。通過RCDC修改的Lowry比色測定(Biorad)定量濃縮的蛋白。使用N-糖苷酶F去糖基化試劑盒(Roche, N0.11836552001)根據製備商的說明將5至10 Pg純化的蛋白去糖基化。通過RCDC沉澱反應物(BioRad)沉澱去糖基化的蛋白，重懸浮在SDS-PAGE還原上樣緩衝液中，且在SDS-PAGE上上樣。切割在對應於去糖基化蛋白的位置處遷移的蛋白條帶，用於胰蛋白酶消化和MS/MS肽圖譜分析。5.2胰蛋白酶消化
含有純化蛋白的凝膠片用乙腈(ACN)脫水。通過添加還原緩衝液(10 mM DTT, 100 mM碳酸氫銨)在40°C下還原蛋白30分鐘，且通過添加烷化緩衝液(55 mM碘乙醯胺，100 mM碳酸氫銨)在40°C下烷化20分鐘。然後凝膠片在40°C下通過添加CAN 5 min進一步脫水和洗滌，然後丟棄所有試劑。然後凝膠片在40°C下乾燥5 min，且然後在4°C下用胰蛋白酶溶液(來自Promega的6 ng/μ 的測序級胰蛋白酶,25mM碳酸氫銨)再水合40 min。蛋白消化在58°C下進行lh，且用15μ I的1%甲 酸和2% ACN的混合物停止。將上清液轉移至96孔板，且在室溫下使用提取緩衝液(I %甲酸和50% ACN)用兩個30分鐘提取步驟進行胰蛋白酶消化的肽的提取。將所有提取的肽合併到96孔板中，且然後在真空離心機中完全乾燥。將板密封，且保存在_20°C，直至進一步進行LC-MS/MS分析。5.3 JIlt
在LC-MS/MS分析之前，在12 μ 的0.2%甲酸中在攪拌的條件下將提取的肽重新溶解15 min,然後在2000rpm下離心I min。LC柱是用高壓包裝單元填充的C18反相柱。用C18Jupiter 5 lm300 A反相材料(Phenomenex)填充100 mm長的75 Im 1.d.溶融的二氧化娃毛細管。該柱安裝在 nano LC-2D 系統(Eksigent)上，且與 LTQ Orbitrap (ThermoFisherScientific)結合。用於層析的緩衝液是0.2%甲酸(緩衝液A)和100% ACN/0.2%甲酸(緩衝液B)。在前12 min期間，將5 μ 樣品以650nl/min的流速上樣至柱上，且隨後，梯度在20 min內從2%至80%緩衝液B，然後持續10 min回復至2%緩衝液B。使用4次掃描事件循環完成LC-MS/MS數據採集，所述4次掃描事件由在Orbitrap中獲得的掃描事件I的全掃描MS構成。益果
-圖12顯示在測試的不同多肽的信號序列的裂解位點發生的信號肽「woobling」的定量評價的結果。信號肽酶的Woobling導致在表示的多肽的每個群體內的在其N末端處以不同胺基酸開始的各種成熟多肽形式的生成。-圖12A顯示，在胰蛋白酶消化總蛋白提取物和隨後通過MS/MS對獲得的包含N末端的多肽相對定量之後，觀察到，在裂解信號序列之後，gB-SLP12-Delta725多肽的群體主要作為以相對等量比例(範圍為約10%至約30%)的五種不同多肽形式(如所示，每種以不同胺基酸開始)存在於溶液中。-圖 12B 和 12C 顯示分別在 gB_SLP12-Delta725_LVL759 和gB-SLP12-Delta725-LVL776的群體中存在的不同形式的多肽的MS/MS相對定量的類似分析。據觀察，在裂解信號序列之後，那兩種多肽的群體主要作為以高於99 %的百分比的一種主要多肽形式存在於溶液中，其分別以SEQ ID NO: 14中所述序列的23位的胺基酸和以SEQ ID NO: 16中所述序列的24位的胺基酸開始。由信號肽酶裂解且生成兩種額外的在N末端具有不同胺基酸的多肽形式的兩個可替代的裂解位點代表多肽的各自群體內僅僅少於I %。-圖12D顯示在gB-SLP12-Delta725_CD33多肽的群體中存在的不同形式的多肽的MS/MS相對定量的類似分析。據觀察，在裂解信號序列之後，該群體主要作為以高於99%的百分比的一種主要多肽形式存在於溶液中，其以SEQ ID NO: 18中所述序列的18位的胺基酸開始。由信號肽酶裂解且生成一種額外的在N末端具有不同胺基酸的多肽形式的其他可替代的裂解位點代表gB-SLP12-Delta725-CD33多肽群體內僅僅少於I %。結論
那些結果表明，gB-SLP12-Delta725-LVL759、gB-SLP12-Delta725-LVL776、和gB-SLP12-Delta725-CD33多肽中不再發生woobling，因為信號肽酶一致地僅識別一個主要裂解位點。這表明，對gB多肽的信號序列和前導序列進行的修飾對成熟多肽群體的異質性具有明顯積極影響，使得所述群體在大於99%的程度上具有同質性。實施例6:含有本發明的示例性CMV gB多肽的免疫原性組合物的免疫原性
如下測試免疫原性組合物的免疫原性,所述免疫原性組合物含有下列包含C末端His標記且如在部分中描述表達且純化的多肽:gB-DeltaTM、gB_SLP12、gB_SLP12_Deltall3、gB-SLP12-Delta725、LVL759、LVL776 和 CD33。6.1實駘設計
如表I中所示，10隻C57BL/6小鼠的組已經用兩個劑量的上述示例性免疫原性組合物接種疫苗，間隔為21天。已經進行肌內免疫(總體積為50 μ 的脂質體製劑中用包含2.5Pg D-MPL和2.5 μδ QS21的佐劑系統佐劑化的1.5 μδ每種gB多肽)。

表1-研究組
權利要求
1.巨細胞病毒(CMV)gB多肽，包含至少一部分gB蛋白細胞外結構域，所述至少一部分gB蛋白細胞外結構域包含融合環I (FLl)結構域和融合環2(FL2)結構域，其中所述FLl和FL2結構域中的至少一個包含至少一個胺基酸缺失或取代。
2.權利要求1的CMVgB多肽，包含至少50%、至少70%、至少80%、至少90%的所述細胞外結構域的胺基酸，或包含整個細胞外結構域。
3.權利要求1至2中任一項的CMVgB多肽，包含非功能性的跨膜(TM)結構域。
4.權利要求3的CMVgB多肽，包含至少一部分所述TM結構域的缺失。
5.權利要求4的CMVgB多肽，其中缺失至少50%、至少70%、至少80%、或至少90%的TM結構域的胺基酸。
6.權利要求4或權利要求5的CMVgB多肽，包含SEQ ID NO:1所示序列的725-775位或其他CMV gB多肽的對應位置處的胺基酸的缺失。
7.權利要求4至5中任一項的CMVgB多肽，包含SEQ ID NO:1所示序列的701-775位或其他CMV gB多肽的對應位置處的胺基酸的缺失。
8.權利要求1-7中任一項的CMVgB多肽，包含在所述FLl結構域中至少一個胺基酸的缺失或取代。
9.權利要求1-8中任一項的CMVgB多肽，包含在所述FL2結構域中至少一個胺基酸的缺失或取代。
10.權利要求1至7的CMVgB多肽，包含在所述FLl和FL2結構域兩者中至少一個胺基酸的缺失或取代。
11.權利要求1至10中任一項的CMVgB多肽，包含至少一部分所述細胞質結構域的缺失。
12.權利要求11的CMVgB多肽，包含至少一個細胞質結構域的疏水胺基酸區的缺失。
13.權利要求12的CMVgB多肽，包含SEQ ID NO:1所示序列的胺基酸825至877或其他CMV gB多肽的對應位置處的胺基酸的缺失。
14.權利要求11的CMVgB多肽，包含至少80%、至少90%、至少95%的所述細胞質結構域的胺基酸的缺失，或所述整個細胞質結構域的缺失。
15.權利要求1至14中任一項的CMVgB多肽，其中所述融合環FLl結構域中至少一個胺基酸取代包含選自位於SEQ ID NO:1所示序列的155-157位或其他CMV gB多肽的對應位置處的Y.1.Y的至少一個胺基酸被除芳族胺基酸以外的極性胺基酸取代。
16.權利要求15的CMVgB多肽，其中所述取代包含選自位於SEQ ID NO:1所示序列的155-157位或其他CMV gB多肽的對應位置處的Y.1.Y的至少兩個胺基酸被除芳族胺基酸以外的極性胺基酸取代。
17.權利要求15或權利要求16的CMVgB多肽，其中所述極性胺基酸選自帶正電荷的胺基酸賴氨酸(K)、組氨酸(H)和精氨酸(R)。
18.權利要求17的CMVgB多肽，其中位於SEQ ID NO:1所示序列的156位或其他CMVgB多肽的對應位置處的異亮氨酸(I)被組氨酸(H)取代。
19.權利要求17或權利要求18的CMVgB多肽，其中位於SEQ ID NO:1所示序列的157位或其他CMV gB多肽的對應位置處的酪氨酸(Y)被精氨酸(R)取代。
20.權利要求15至19中任一項的CMVgB多肽，其中位於SEQ ID NO:1所示序列的155位或其他CMV gB多肽的對應位置處的酪氨酸(Y)被甘氨酸(G)取代。
21.權利要求1至14中任一項的CMVgB多肽，其中位於SEQ ID NO:1所示序列的融合環FLl結構域中的155-157位或其他CMV gB多肽的對應位置處的胺基酸Y.1.Y分別被胺基酸G.H.R取代。
22.權利要求1至14中任一項的CMVgB多肽，其中位於SEQ ID NO:1所示序列的融合環FLl結構域中155-157位、或其他CMV gB多肽的對應位置處的胺基酸Y.1.Y被一段胺基酸取代，所述一段胺基酸如通過Kyte和Doolittle指數所測量的具有小於_3，小於-7,小於-8的疏水性評分。
23.權利要求1至22中任一項的CMVgB多肽，其中所述融合環FL2結構域中至少一個胺基酸取代包含選自位於SEQ ID NO:1所示序列的240-242位或其他CMV gB多肽的對應位置處的W.L.Y的至少一個胺基酸被選自賴氨酸(K)、組氨酸(H)和精氨酸(R)的帶正電荷的胺基酸取代。
24.權利要求23的CMVgB多肽，其中選自位於SEQ ID NO:1所示序列的240-242位或其他CMV gB多肽的對應位置處的W.L.Y的胺基酸被組氨酸(H)取代。
25.權利要求23或權利要求24的CMVgB多肽，其中位於SEQ ID NO:1所示序列的242位或其他CMV gB多肽的對應位置處的酪氨酸(Y)被組氨酸(H)取代。
26.權利要求1至22中任一項的CMVgB多肽，其中位於SEQ ID NO:1所示序列的融合環FL2結構域中的240-242位或其他CMV gB多肽的對應位置處的胺基酸W.L.Y分別被胺基酸A.F.H取代。
27.權利要求1至26中任一項的CMVgB多肽，包含至少一部分所述前導序列的缺失。
28.權利要求27的CMVgB多肽，包含至少40%、至少50%、至少70%、至少80%、至少90%的所述前導序列的胺基酸或整個前導序列的缺失。
29.CMV gB多肽，包含至少40%、至少50%、至少70%、至少80%、至少90%的所述前導序列的胺基酸或整個前導序列的缺失。
30.權利要求29的CMVgB多肽，進一步包含一個或多個權利要求1至26中任一項的特徵。
31.CMV gB多肽，具有選自以下所示序列的序列:SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20 和 SEQ ID NO:21。
32.製劑，包含CMVgB多肽群體，其中所述群體的至少50%、至少60%、或至少70%是三聚體形式。
33.免疫原性組合物，包含權利要求1至31中任一項的CMVgB多肽與合適的藥學載體的混合物。
34.權利要求33的免疫原性組合物，進一步包含至少一種或多種選自pUL131、gL、gH、pUL128、pUL130或其任何組合的CMV抗原。
35.權利要求3 3至34的免疫原性組合物，進一步包含佐劑。
36.權利要求35的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含脂質體製劑中的3D-MPL和QS21。
37.權利要求35的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含水包油乳劑。
38.多核苷酸，編碼權利要求1至31中任一項的CMVgB多肽。
39.多核苷酸，具有選自以下所示序列的序列:SEQID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ IDNO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15 和 SEQ ID NO:17。
40.重組載體，包含權利要求38或權利要求39的多核苷酸。
41.用權利要求40的重組載體轉化的宿主細胞。
42.權利要求1至31中任一項的CMVgB多肽或權利要求33至37中任一項的組合物，其用於預防和/或治療CMV感染。
43.權利要求1至31中任一項的CMVgB多肽或權利要求33至37中任一項的組合物在製備用於預防和/或治療CMV感染的藥物中的用途。
44.權利要求42或權利要求43的用途，其用於預防新生兒中先天性CMV感染。
45.用於引發針對CMV的免疫應答的方法，所述方法包括將免疫有效量的包含權利要求I至31中任一項的CMV gB多肽的組合物或權利要求33至37中任一項的組合物施用於受試者的步驟。
46.用於預防新生兒中免於CMV的先天性感染的方法，所述方法包括將免疫有效量的包含權利要求1至31任一項的CMV gB多肽的組合物和權利要求33至37中任一項的組合物施用於受試者的步驟。
47.權利要求42至44的用途或權利要求45或權利要求46的方法，其中所述受試者是CMV血清陰性受試者。
48.權利要求47的用途或方法，其中所述CMV血清陰性受試者是生育年齡的婦女。
49.權利要求47的 用途或方法，其中所述CMV血清陰性受試者是少女。
全文摘要
本發明涉及包含至少一部分gB蛋白細胞外結構域的巨細胞病毒(CMV)gB多肽，所述至少一部分gB蛋白細胞外結構域包含融合環1(FL1)結構域和融合環2(FL2)結構域，其中所述FL1和FL2結構域中的至少一個包含至少一個胺基酸缺失或取代。
文檔編號C07K14/045GK103237560SQ201180060437
公開日2013年8月7日 申請日期2011年10月14日 優先權日2010年10月15日
發明者G.J.M.F.P.鮑道克斯, N.布萊斯, M.馬漢德 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司