弓形蟲蟲體、風疹、巨細胞、皰疹Ⅰ、Ⅱ病毒抗原純化工藝的製作方法
2023-09-21 18:39:20 1
專利名稱：弓形蟲蟲體、風疹、巨細胞、皰疹Ⅰ、Ⅱ病毒抗原純化工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種TORCH檢測診斷試劑盒中抗原物質的純化方法。
新生兒出生缺陷已成為影響人口素質的重要因素，在引起出生缺陷的諸多因素中，宮內感染是一個重要因素。國內外研究指出，妊娠期間發生弓形體Toxoplasma(Toxo)，風疹病毒Rubella Virus(RV)、巨細胞病毒Cytomegalovirus(CMV)和單純皰疹病毒Herpes Simplex Virus(HSV)，簡稱TORCH感染，可通過胎盤傳給胎兒，發展成為先天性或圍產期新生兒感染。是導致流產、死胎、先天畸形、智力障礙等不良妊娠結局的重要原因之一。
弓形蟲妊娠期初次感染者，弓形蟲通過胎盤感染胎兒；孕早期感染者可發生流產或畸胎妊娠中晚期感染者，可發生宮內胎兒生長遲緩，神經系統損害等。
風疹病毒病毒能使胎兒致畸，主要為先天性白內障，先天性心臟和神經性能耳聾。20周後感染者幾乎無影響。
巨細胞病毒病毒能通過胎盤感染胎兒，引起宮胎兒生長遲緩，小頭畸形、腦炎、視網膜脈絡膜炎、黃疸、肝脾腫大、溶血性盆血等，新生兒死亡率甚高。
單純皰疹病毒孕早期感染者能破壞胚芽而導致流產，孕中晚期感染者雖少發畸胎，但可引起胎兒和新生兒發病。
近年來，許多經濟發達國家已將TORCH檢測作為孕期常規篩查項目，在預防畸胎、流產等方面發揮重要的作用。在國內，隨著科學技術的發展和人民生活水平的提高，人們對「優生優育」的認識逐步提高，TORCH檢測越來越受到重視。
成人TORCH感染的臨床症狀不明顯，無法自我感覺到是否受到感染，因此孕前及早期診斷對優生優育十分重要。
目前，國際上公認的最方便、最先進的早期診斷方法是檢測人體血清中的特異IgM、IgG抗體，以判斷受到感染的情況。TORCH檢測有許多種，其中ELISA法因其特異性強，靈敏度高、操作簡便，成本低廉等優點而成為各實驗室首選。目前國內外均以IgM、IgG抗體的檢測作為早期診斷或進行流行病學、免疫學調查的實驗方法。檢出特異性IgM說明患者近期感染，檢出特異IgG說明患者既往感染。對孕期檢測抗體陽性者建議定期複查，結合其他檢測對抗體水平進行動態觀察，了解胎兒發育情況，並給予相應治療。
國內開展TORCH檢測起步較晚，由於TORCH抗原純化的技術難度影響TORCH試劑盒的開發生產，所用試劑盒多為國外進口或由國外購入包被抗原組裝而成。這些進口試劑不但價格昂貴，而且未經國家檢定部門檢定，產品質量無法保障和規範。許多產品使用效果很不理想，市場情況混亂。
本發明的目的是為了提供一種工藝過程簡便、所用試劑低廉、抗原純度和收率高、可批量生產、批間差異小的TORCH抗原純化工藝。
本發明的目的可通過如下措施來實現一種TORCH抗原純化工藝含有下述步驟(1)將風疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒I型、II型的培養液，經離心去除細胞碎渣後，沉澱離心分離得病毒沉澱物；(2)將弓形蟲腹水離心去除細胞，然後加入的0.01mol、PH＝7的磷酸鹽(PBS)緩衝液稀釋，離心後弓形蟲腹水與緩衝液的體積比為1∶(0.8-1.3)，再沉澱後離心分離得弓形蟲病毒沉澱物；(3)將上述(1)、(2)兩步沉澱所取得的病毒深沉物分別溶於0.01mol、PH＝8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA的緩衝液中；然後再將溶解液採用透析得病毒濃縮液；(4)將病毒濃縮液用離子交換柱進行分離並用0.01mol、PH＝8的Tris-HCl-0.001molEDTA緩衝液含0.2-0.5mol的NaCl作梯度洗脫，收集各蛋白峰，包被酶標板，並用已知陽性血清，做間接ELISA試驗檢測抗原活性高峰液收集，即為純化Torch抗原。
本發明相比現有技術具有如下優點1、本發明的工藝過程簡便，無需特殊貴重設備，採用中性鹽、有機溶劑和非離子多聚物沉澱濃縮病毒、步驟簡單，所用試劑低廉、收率高可達80％以上。
2、本發明利用病毒體和弓形蟲體的特定結構，選用DEAE陰離子交換柱，做NaCl梯度洗脫工藝純化抗原，抗原純度高，用於包被酶標試劑盒、包被抗原板、本底低，可批量生產，批間差異小，一個批次可生產100萬人份以上的抗原用於酶標試劑盒。
本發明還將結合實施例作進一步詳述實施例一一種TORCH抗原純化工藝含有下述工藝(1)取風疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒I型、II型細胞病毒培養液100ml、經3000轉/分離心30分鐘，取上清液調PH7.0，加100ml飽和硫酸銨邊滴加邊攪拌，混勻，在4℃下靜置30分鐘，經7000轉/分離心15分鐘分離得沉澱物，再將沉澱物溶於100ml、0.01mol、PH7.0的PBS緩衝液中。
(2)將上述液體加入50ml飽和硫酸銨邊滴加邊攪拌，混勻，在4℃下靜置30分鐘，經7000轉/分離心15分鐘，分離得沉澱物，再將沉澱物溶於100ml、0.01mol、PH7.0的PBS緩衝液中。
(3)重複第(2)步兩次，最後將沉澱物溶於10ml、0.01mol、PH8.00的Tris-HCl-0.001molEDTA緩衝液中。
(4)將此液在0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA緩衝液中，在4℃下透析直至無硫酸根離子和銨離子檢出，再濃縮至10ml，此液為病毒濃縮提取液。
(5)將病毒濃縮提取液過DEAE纖維素交換柱，用0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA緩衝液含0.2-0.5mol的NaCl液作梯度洗脫，流速0.6ml/分，收集各蛋白峰包被酶標板用風疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒陽性血清做間接ELISA試驗，檢測相應抗原活性，收集抗原活性高的峰液，加0.02％疊氮鈉和50％甘油混勻，低溫保存。
弓形蟲純化(1)取弓形蟲腹水100ml加100ml、0.01mol、PH7.0的PBS液混勻，經3000轉/分離心30分鐘，取上清液調PH7.0加入200ml飽和硫酸銨，混勻，在4℃下靜置30分鐘，經7000轉/分離心15分鐘，分離得沉澱物，將沉澱物溶於100ml、0.01mol、PH7.0的PBS液中。
(2)將上述液體加入50ml飽和硫酸銨邊滴加邊攪拌，混勻後，在4℃下靜置30分鐘，經7000轉/分離心15分鐘，分離得沉澱物，將沉澱物溶於100ml、0.01mol、PH7.0的PBS液中。
(3)重複上述第(2)步兩次，最後將沉澱溶於10ml、0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA緩衝液中。
(4)將此液在0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA緩衝液中，在4℃下透析直至無硫酸根離子和銨離子檢出，再濃縮至10ml，此液為弓形蟲濃縮提取液。
(5)弓形蟲濃縮提取液過DEAE纖維素交換柱，用0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA緩衝液含0.2-0.5molNaCl液作梯度洗脫，流速0.6ml/分，收集各蛋白峰液，包被酶標板，用弓形蟲陽性血清做間接ELISA試驗，檢測弓形蟲抗原活性，收集抗原活性高的峰液，加0.02％疊氮鈉和50％甘油低溫保存。
實施例二在實施例一中將硫酸銨用硫酸鈉代替，最後濃縮提取液過於離離子交換柱可採用Qsepharose Fast Flow柱，其餘工藝和參數與例一同。
實施例三一種TORCH抗原純化工藝含有下述步驟(1)將風疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒I型、II型細胞培養液，經3000轉/分離心30分鐘，取上清液；(2)取弓形蟲腹水100ml加100ml、0.01mol、PH7.0的PBS液混勻，經3000轉/分離心30分鐘，取上清液；(3)將上述(1)(2)兩步的上清液分別加入預冷的95％的乙醇至濃度達到60％，在-5℃下靜置過液，次日經3000r/m離心30分鐘得沉澱物；(4)再將沉澱物溶於10ml、0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA緩衝液中；(5)將上述(4)的溶液分別在0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA液中透析平衡過DEAESepharose Fast Flow柱，並用0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA液含0.2-0.5molNaCl液作梯度洗脫，流速0.6ml/分，收集各蛋白峰，包被酶標板，用風疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒I型、II型和弓形蟲陽性血清分別做間接ELISA試驗，檢測相應抗原活性，收集抗原活性高峰液，加0.02％疊氮鈉和50％甘油低溫保存。
實施例四一種TORCH抗原純化工藝含有下述步驟(1)將風疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒I型、II型細胞培養液，經3000轉/分離心30分鐘，取上清液；(2)取弓形蟲腹水100ml加100ml、0.01mol、PH7.0的PBS液混勻，經3000轉/分離心30分鐘，取上清液；(3)將上述(1)(2)兩步的上清液分別加入葡聚糖至濃度達到12％，調PH7.4，在4℃下靜置過液，次日經7000r/m離心20分鐘得沉澱物；(4)再將沉澱物溶於10ml、0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA緩衝液中；(5)將上述(4)的溶液分別在0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA液中透析平衡過DEAESepharose Fast Flow柱，並用0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA液含0.2-0.5molNaCl液作梯度洗脫，流速0.6ml/分，收集各蛋白峰，包被酶標板，用風疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒I型、II型和弓形蟲陽性血清分別做間接ELISA試驗，檢測相應抗原活性，收集抗原活性高峰液，加0.02％疊氮鈉和50％甘油低溫保存。
權利要求
1.一種TORCH抗原純化工藝，其特徵在於含有下述步驟(1)將風疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒I型、II型的培養液，經離心去除細胞碎渣後，沉澱離心分離得病毒沉澱物；(2)將弓形蟲腹水離心去除細胞，然後加入的0.01mol、PH＝7的磷酸鹽(PBS)緩衝液稀釋，離心後弓形蟲腹水與緩衝液的體積比為1∶(0.8-1.3)，再沉澱後離心分離得弓形蟲病毒沉澱物；(3)將上述(1)、(2)兩步沉澱所取得的病毒深沉物分別溶於0.01mol、PH＝8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA的緩衝液中；然後再將溶解液採用透析得病毒濃縮液；(4)將病毒濃縮液用離子交換柱進行分離並用0.01mol、PH＝8的Tris-HCl-0.001molEDTA緩衝液含0.2-0.5mol的NaCl作梯度洗脫，收集各蛋白峰，包被酶標板，並用已知陽性血清，做間接ELISA試驗檢測抗原活性高峰液收集，即為純化TORCH抗原。
2.如權利要求1所述的TORCH抗原純化工藝，其特徵在於所述的細胞沉澱工藝可採用鹽析沉澱、有機溶劑沉澱和非離子多聚物沉澱工藝。
3.如權利要求1或2所述的TORCH抗原純化工藝，其特徵在於所述的鹽析沉澱工藝含有下述步驟(1)將風疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒I型、II型的培養液經離心後的病毒液和弓形蟲腹水經離心後的蟲體稀釋液分別加入飽和硫酸銨至飽和度達20-60％，混勻，在4℃下靜置再離心分離得病毒沉澱物；(2)將病毒沉澱物溶於體積比為1∶(5-10)的0.01mol、PH＝7.0的PBS緩衝液中；(3)將上述溶解液再加入飽和硫酸銨至飽和度達20-60％進行二次沉澱，經離心分離得沉澱物，並將沉澱物按(2)步的溶解工藝溶解；(4)重複(3)步工藝至少一次，並將最後的沉澱物溶於體積比為1∶(0.5-1.5)的0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA緩衝液中。
4.如權利要求3所述的TORCH抗原純化工藝，其特徵在於所述的硫酸銨還可用硫酸鈉代替，但其濃度為10-20％，其餘工藝步驟和參數不變。
5.如權利要求1或2所述的TORCH抗原純化工藝，其特徵在於所述的有機溶劑沉澱工藝是將風疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒I型、II型的培養液經離心後的病毒液和弓形蟲腹水經離心後的蟲體稀釋液分別加入乙醇和/或丙酮至濃度達50-80％進行沉澱，離心分離得病毒沉澱物，再將沉澱物溶於體積比為1∶(0.5-1.5)的0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA緩衝液中。
6.如權利要求1或2所述的TORCH抗原純化工藝，其特徵在於所述的非離子多聚物沉澱工藝是將採風疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒I型、II型的培養液經離心後的病毒液和弓形蟲腹水經離心後的蟲體稀釋液分別加入葡聚糖/右旋糖酐硫酸鈉至濃度達5-15％進行沉澱，離心分離得病毒沉澱物，再將深沉物溶於體積比為1∶(0.5-1.5)的0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDPA緩衝液中。
7.如權利要求1所述的TORCH純化抗原工藝，其特徵在於所述的離子交換柱可選自DEAE纖維素柱、DEAE Sepharose Fast Flow柱、Qsepharose FastFlow柱中的任一種。
全文摘要
本發明涉及一種TORCH抗原純化工藝,該工藝是將風疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒培養液離心分離後和弓形蟲腹水經離心分離再稀釋的蟲體液進行沉澱分離得沉澱物,再將沉澱物溶解,然後經透析得濃縮病毒液和弓形蟲提取濃縮液,將濃縮液過DEAE類陰離子交換柱,收集各蛋白峰,包被酶標板,並用已知陽性血清做間接ELISA試驗檢測抗原活性高峰液收集,即為純化TORCH;本發明的工藝收率高可達80%以上、生產的抗原純度高、工藝簡便,可批量生產、批間差異小、一個批次可生產100萬人份以上的抗原。
文檔編號G01N33/531GK1389731SQ0111528
公開日2003年1月8日 申請日期2001年6月1日 優先權日2001年6月1日
發明者李克生, 杜惠芬 申請人:李克生