Fgfr單鏈抗體融合蛋白及其在製備靶向腫瘤細胞藥物中的應用的製作方法

2023-09-22 00:19:45

專利名稱：Fgfr單鏈抗體融合蛋白及其在製備靶向腫瘤細胞藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程和生物製藥領域，具體地說，涉及FGFR單鏈抗體融合蛋白及其在製備靶向腫瘤細胞藥物中的應用。
背景技術：
成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)是一類由FGF基因家族成員編碼的結構相關的蛋白質，目前已經發現23個成員，其中心區域都含有同源性為30%-70%的一段胺基酸序列。龐大的FGF家族成員作為細胞間的多功能信號分子調節著生物體的多種生理功能。FGFs主要通過細胞膜上的FGFR受體發揮調控功能，FGFR屬於酪氨酸激酶受體，是一種單跨膜蛋白，包括與FGFs結合的細胞外部分、跨膜部分和細胞內酪氨酸激酶結構域3個部分。其中細胞外部分包含著3個免疫球蛋白樣結構域(Ig-like domain, I -III)，第I個免疫球蛋白區域被認為與受體的自身抑制有關，第2和第3個免疫球蛋白結構域是FGF配體的結合位點；細胞內的酪氨酸激酶結構域則類似於VEGF受體和TOGF受體激酶。FGF共有4種受體，分別是FGFR1-4，由於存在選擇性剪切，最終可形成7種受體類型。在很多腫瘤中發現FGFs及FGF受體呈異常高表達，其中以FGFR3突變或過表達最為頻繁，已經在多發性骨髓瘤(Plowright EE等，1995)、尿路上皮腫瘤(Al-Ahmadie HA等，2011、膀胱癌(PandithAA 等，2010)、口腔癌(Henson BJ 等，2010、睪丸癌(Goriely A等，2009)和大腸癌(Sonvilla G等，2010等多種腫瘤中發現FGFR3激活突變或過表達。FGFR3的異常表達參與了腫瘤細胞的增殖、生存、遷移和耐藥等多種生理功能。針對FGFR的抑制治療也得到了科學家們的廣泛重視。目前，阻斷FGFR的方法主要有酪氨酸激酶抑制齊U、反義基因方法和抗FGFR單克隆抗體。如Henson等(2010)發現降低FGFR3表達能明顯抑制細胞增殖和增強口腔癌細胞對電離輻射的敏感性。FGFR3在放療耐受的人鱗狀細胞癌(squamous cancer)中高表達，用FGFR3抑制劑TO173074靶向FGFR3能夠增強人鱗狀細胞癌細胞的放療敏感度，並且HH73074與放療聯用的抗腫瘤效果明顯高於單獨放療或單獨使用抑制劑(Uzawa K等，2011)。FGFR3也被發現在原發性巨球蛋白血症(Waldenstrommacroglobulinemia, WM)細胞中過表達，FGFR3抑制劑Dovitinib處理能誘導WM細胞凋亡和抑制細胞增殖，同時也發現Dovitinib與其它藥物聯用能產生更好的治療效果(AzabAK, 2011)。FGFR抑制劑不能直接抑制過量表達的FGFR基因，更不能徹底阻斷FGFR的表達。而且FGFR抑制劑往往具有廣譜性，對其它酪氨酸激酶也具有一定的抑制作用，因此往往對正常細胞的信號傳導也具有一定的幹擾，產生一定的毒性，大大限制了它的臨床應用。抗FGF受體單克隆抗體是一種更為特異性的阻斷FGF信號通路的途徑，很多研究都表明，它是一種更為有效的方法。FGFR3的下調也被發現能明顯抑制膀胱癌細胞的細胞周期和削弱其在異種移植小鼠內的腫瘤發生進程，小鼠體內實驗結果顯示針對FGFR3的特異性抗體處理對膀胱癌和t (4; 14)陽性的多發性骨髓瘤都具有明顯的抗腫瘤效果(Qing J等，2009)。通過Anti-FGFR3中和抗體PRO-OOl抑制FGFR3自身磷酸化和下遊的信號傳導，能特異性的抑制FGFR3轉化的多發性骨髓瘤細胞生長(Trudel S等，2006)。儘管靶向抑制FGFR3介導的信號傳導能抑制腫瘤細胞的增殖和腫瘤組織生長，但仍然不能從根本上根除腫瘤，因為FGF受體僅僅是腫瘤惡性生長的一個因素，其他的信號傳導途徑仍然可以激活促進腫瘤細胞增殖和生存。

發明內容
本發明的目的是提供一種FGFR單鏈抗體(ScFV)融合蛋白。本發明的另一目的是提供所述FGFR單鏈抗體融合蛋白在製備靶向腫瘤細胞，特別是靶向腫瘤幹細胞的藥物中的應用。為了實現本發明目的，本發明的一種FGFR單鏈抗體融合蛋白，其為FGFR單鏈抗 體-鹼性多肽融合蛋白；其中，所述FGFR單鏈抗體為人成纖維細胞生長因子受體1、2、3或4的單鏈抗體，所述鹼性多肽為由9-30個鹼性胺基酸組成的多肽。其中，人成纖維細胞生長因子受體1-4的單鏈抗體的胺基酸序列分別如Seq ID No. 7_10所示(參照美國專利US8101721)。優選的，所述鹼性多肽為魚精蛋白(protamine)、多聚精氨酸(如多聚精氨酸9R)
坐寸οFGFR3單鏈抗體-魚精蛋白融合蛋白，其胺基酸序列如Seq IDNo. I所示。FGFR3單鏈抗體-多聚精氨酸9R融合蛋白，其胺基酸序列如SeqID No. 2所示。本發明還提供編碼所述FGFR單鏈抗體融合蛋白的基因。本發明還提供含有編碼所述FGFR單鏈抗體融合蛋白的基因的載體。其出發載體優選為原核表達載體，更優選為pET-20b。本發明還提供含有編碼所述FGFR單鏈抗體融合蛋白的基因的轉化細胞系。本發明還提供含有編碼所述FGFR單鏈抗體融合蛋白的基因的工程菌。工程菌的出發菌株優選為大腸桿菌BL21 (DE3)。本發明還提供所述FGFR單鏈抗體融合蛋白的製備方法，通過在編碼所述FGFR單鏈抗體融合蛋白的基因的5』端添加編碼分子伴侶Sumo蛋白的基因序列，從而形成融合基因，將該融合基因克隆至原核細胞中進行誘導表達，並分離純化融合蛋白，切除Sumo蛋白部分，純化後即得。具體地說，可採用以下方法製備融合蛋白首先，合成編碼FGFR ScFV-鹼性多肽的核苷酸序列根據ScFV和鹼性多肽的核甘酸序列，設計長引物，通過PCR引物延伸的方法獲得ScFV和鹼性多肽的融合基因。其次，合成編碼Sum0-ScFV-鹼性多肽的融合基因將編碼FGFRScFV-鹼性多肽的核苷酸序列通過PCR引物延伸的方法連接到編碼分子伴侶Sumo蛋白的核苷酸序列上。迄今為止，主要是使用細菌特別是大腸桿菌作為以重組技術工業規模生產蛋白質的宿主細胞，大腸桿菌的主要優點是易於遺傳操作並能保持轉化株的穩定性；經大體積培養可獲得高產率的表達產物；細胞易於培養，從而可降低生產成本。然而，使用大腸桿菌生產生物學活性蛋白質特別是真核細胞蛋白的一個重要缺點是，表達產物在宿主胞漿內形成所謂的包涵體，即無生物學活性的不溶性聚合體。必須對包涵體進行變性一溶解一復性處理。這一過程獲得的產物回收率很低，也影響了蛋白質活性。為了克服原核表達容易形成包涵體的缺點，本發明採用Sumo分子伴侶與ScFV-鹼性多肽基因融合，以提高ScFV-鹼性多肽的可溶性表達。應當理解，本領域技術人員可以根據密碼子的兼併性以及在不同物種中的表達偏好，合成相應的核苷酸序列，並將其克隆到適當的表達載體中，並轉化相應的宿主。例如，以pET_20b為表達載體，BL21 (DE3)作為宿主，製備FGFR單鏈抗體融合蛋白的步驟如下 I)培養轉化後的宿主細胞，誘導表達Sum0-ScFV-鹼性多肽將轉化後的大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，氨苄青黴素抗性平板篩選陽性轉化子，將篩選的陽性重組菌BL21 (DE3)/pET-20b-Sumo-ScFV-鹼性多肽單菌落，接種到LB培養基中，37°C振蕩培養16h。然後按5%比例轉接到新鮮LB培養基中，進行溫度、IPTG濃度和誘導時間等表達條件的優化，經研究證實，OD值為O. 6時，ImM IPTG在37°C誘導3h，超聲波(100w，超聲2s，間隔2s)破菌，適於蛋白ScFV-鹼性多肽的可溶性表達。其中可溶性表達的目的蛋白可佔菌體總目的蛋白的90%以上。2)分離純化Sum0-ScFV-鹼性多肽收集菌體，破碎後離心，取上清液進行純化、鹼性洗脫，收集洗脫液，進行樹脂親和層析，再經洗滌、洗脫，即得含Sum0-ScFV-鹼性多肽的可溶性融合蛋白。3)切除Sumo部分利用Sumo蛋白酶切除分子伴侶部分取分離純化後的可溶性融合蛋白，加入Sumo蛋白酶，在適當的條件下進行酶切反應，反應終止後，進行SDS-PAGE檢測。4)純化ScFV-鹼性多肽重組蛋白酶切後的融合蛋白進行樹脂親和層析，經洗滌、洗脫、脫鹽，即得純化後的ScFV-鹼性多肽重組蛋白，再經SDS-PAGE、考馬氏亮藍染色，驗證蛋白純度。本發明中所述載體、宿主菌等均可由商業途徑獲得，如pET_20b和BL21 (DE3)購自Novagen公司。本發明中涉及的基因的設計、合成和克隆，表達載體的構建，DNA序列分析及鑑定，以及表達產物的分離和純化等操作，可按照本領域已知的技術進行(參見SambiOOk等,Molecular Cloning:ALaboratory Mannual, Cold Spring Harbor laboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY,1989)。本發明還提供所述FGFR單鏈抗體融合蛋白在製備靶向腫瘤細胞，特別是靶向腫瘤幹細胞的藥物中的應用，其是將融合蛋白作為小分子幹擾RNA的腫瘤靶向藥物遞送載體。所述小分子幹擾RNA為具有抑制腫瘤細胞功能的siRNA、mi RNA、sh RNA、ds RNA等中的一種或多種。本發明進一步提供靶向腫瘤幹細胞的藥物，其含有所述FGFR單鏈抗體融合蛋白和具有抑制腫瘤幹細胞功能的小分子幹擾RNA，任選含有藥用賦形劑。 前述靶向腫瘤幹細胞的藥物中，優選所述FGFR單鏈抗體融合蛋白為FGFR3單鏈抗體-鹼性多肽融合蛋白。FGFR3的單鏈抗體ScFV可以靶向腫瘤細胞表面高表達的FGFR3，鹼性多肽可以攜帶帶負電荷的siRNA，siRNA進入腫瘤細胞後，通過抑制特定基因的mRNA，以達到抑制腫瘤細胞增殖或生存或誘導腫瘤幹細胞分化等功能。
前述靶向腫瘤幹細胞的藥物中，更優選所述FGFR單鏈抗體融合蛋白為FGFR3單鏈抗體-魚精蛋白融合蛋白或FGFR3單鏈抗體-多聚精氨酸9R融合蛋白。利用這兩種融合蛋白作為核酸運載工具，攜帶siRNA去攻擊FGFR3高表達的各類腫瘤細胞和組織(如白血病幹細胞、膀胱癌細胞、乳腺癌細胞等)，通過誘導腫瘤細胞凋亡、生長抑制和分化等，最終起到抑制腫瘤生長、侵襲和轉移的作用。前述靶向腫瘤幹細胞的藥物中，最優選所述FGFR單鏈抗體融合蛋白為FGFR3單鏈抗體-魚精蛋白融合蛋白。在本發明中，發明人設計的FGFR3單鏈抗體融合蛋白，既可以靶向抑制腫瘤細胞表面的FGFR3信號途徑，還可以用來攜帶小分子RNA去抑制與腫瘤細胞增殖、生存相關的基因表達，起到徹底殺死腫瘤細胞的目的。研究發現，很多腫瘤幹細胞中高表達FGFR3，如已知的急性粒細胞白血病幹細胞、慢性粒細胞白血病幹細胞等。通過單鏈抗體-多肽融合蛋白，可以攜帶一些與腫瘤幹細胞自我更新相關基因(如c-myc、Bmil和Dotl等)的siRNA，可以在靶向腫瘤幹細胞的同時，通過單鏈抗體抑制腫瘤幹細胞增殖，通過siRNA誘導腫瘤幹細 胞分化，進而徹底根除腫瘤幹細胞，有助於解決目前臨床中腫瘤幹細胞耐藥的難題。本發明中，ScFV-鹼性多肽融合蛋白與Sumo融合後，蛋白表達量明顯提高，可溶性蛋白含量大大增加，通過DEAE-S印harose FF陰離子交換、Ni-NTA親和層析以及S印hadexG-25脫鹽，最終獲得蛋白純度超過95%的具有較高生物學活性的ScFV-鹼性多肽重組蛋白，為大規模產業化生產奠定了基礎。


圖I為本發明實施例3中重組Sumo-FGFR3 ScFV-鹼性多肽的SDS-PAGE圖，其中I為誘導後3h ；2為誘導前；M為蛋白Marker。圖2為本發明實施例3中目的蛋白FGFR3 ScFV-鹼性多肽的Western Blot檢測圖，其中1為FGFR3 ScFV-protamine融合蛋白；2為FGFR3 ScFV_9R融合蛋白。圖3顯示了本發明實施例4中FGFR3 ScFV-鹼性多肽融合蛋白與siRNA的結合能力。圖4顯示了本發明實施例5中FGFR3 ScFV-鹼性多肽融合蛋白可以攜帶c_mycsiRNA誘導K562細胞分化，其中A為FGFR3 ScFV-鹼性多肽融合蛋白(對照組);B為FGFR3ScFV-鹼性多肽融合蛋白+ c-myc siRNA (箭頭標記為較為典型的分化細胞)。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。 實施例I FGFR3 ScFV-鹼性多肽融合基因的PCR合成根據文獻(Martinez-Torrecuadrada J等，2005)中報導的編碼FGFR3單鏈抗體的基因序列，委託上海捷瑞生物工程有限公司合成了 FGFR3ScFV與鹼性多肽的融合基因，其中，FGFR3單鏈抗體-魚精蛋白融合基因和FGFR3單鏈抗體-多聚精氨酸9R融合基因的核苷酸序列分別為Seq ID No4和6。實施例2 pET-20b-Sumo-FGFR3 ScFV-鹼性多肽表達載體的構建
參照ZL200810102542. 4中描述的載體構建方法。為了將合成的FGFR3 ScFV-鹼性多肽融合基因同編碼Sumo分子伴侶的核苷酸序列融合，根據Sumo序列N端設計合成引物P1，根據Sumo C端和ScFV N端設計引物P2，P2包含20bp與ScFV-鹼性多肽基因互補的序列。以Pl和P2為引物(引物序列見表I )，通過PCR方法合成Sumo-S序列。PCR反應體系一

權利要求
1.FGFR單鏈抗體融合蛋白，其特徵在於，其為FGFR單鏈抗體-鹼性多肽融合蛋白；其中，所述FGFR單鏈抗體為人成纖維細胞生長因子受體1、2、3或4的單鏈抗體，所述鹼性多肽為由9-30個鹼性胺基酸組成的多肽。
2.根據權利要求I所述的融合蛋白，其特徵在於，其為FGFR3單鏈抗體-鹼性多肽融合蛋白。
3.根據權利要求2所述的融合蛋白，其特徵在於，其為FGFR3單鏈抗體-魚精蛋白融合蛋白，其胺基酸序列如Seq ID No. I所示。
4.根據權利要求2所述的融合蛋白，其特徵在於，其為FGFR3單鏈抗體-多聚精氨酸9R融合蛋白，其胺基酸序列如Seq ID No. 2所示。
5.編碼權利要求1-4任一項所述融合蛋白的基因。
6.含有權利要求5所述基因的載體。
7.含有權利要求5所述基因的工程菌。
8.權利要求1-4任一項所述融合蛋白的製備方法，其特徵在於，在權利要求5所述基因的5』端添加編碼分子伴侶Sumo蛋白的基因序列形成融合基因，將該融合基因克隆至原核細胞中進行誘導表達，並分離純化融合蛋白，切除Sumo蛋白部分，純化後即得。
9.權利要求1-4任一項所述FGFR單鏈抗體融合蛋白在製備靶向腫瘤細胞藥物中的應用，其是將融合蛋白作為小分子幹擾RNA的腫瘤靶向藥物遞送載體。
10.根據權利要求9所述的應用，其特徵在於，所述小分子幹擾RNA為具有抑制腫瘤細胞功能的siRNA、mi RNA、sh RNA、ds RNA中的一種或多種。
全文摘要
本發明提供了一種人成纖維細胞生長因子受體(FGFR)單鏈抗體融合蛋白，其為FGFR單鏈抗體-鹼性多肽融合蛋白。其中，FGFR單鏈抗體為FGFR1、2、3或4的單鏈抗體，鹼性多肽為由9-30個鹼性胺基酸組成的多肽。本發明還提供所述FGFR單鏈抗體-鹼性多肽融合蛋白在製備靶向腫瘤細胞藥物中的應用。利用該融合蛋白作為核酸運載工具，攜帶小分子幹擾RNA(如siRNA)去攻擊相應的FGFR高表達的各類腫瘤細胞和組織(如白血病幹細胞、膀胱癌細胞、乳腺癌細胞等)，通過誘導腫瘤細胞凋亡、生長抑制和分化等，最終起到抑制腫瘤生長、侵襲和轉移的作用。
文檔編號A61K47/42GK102875684SQ201210323399
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月4日 優先權日2012年9月4日
發明者肖業臣, 李校堃 申請人:吉林大學