電壓門控的金屬增強螢光、化學發光或生物發光方法及系統的製作方法

2023-09-21 06:01:30

專利名稱：電壓門控的金屬增強螢光、化學發光或生物發光方法及系統的製作方法
技術領域：
總的來說，本發明涉及金屬增強螢光(MEF)，更具體來說涉及通過使直流電通 過低電阻金屬互連粒子來「打開和關閉」發射，以操縱MEF發射的能力。相關技術多年來，已經從發展對金屬增強螢光(MEF)1—3現象的基本理解以及其次將熒 光團的增強的光物理性質應用於生物學應用4的觀點上，對螢光團接近等離子體激元 (plasmon)共振粒子的效應進行了報導。在所有這些報導中，通過緊鄰螢光團偶極子在近 場誘導了表面等離子體激元，表面等離子體激元又輻射耦合量子，導致螢光放大，正如 圖4上部的圖所示。耦合螢光在很大程度上與不存在金屬情況下觀察到的自由空間螢光 非常類似，例外之處在於輻射壽命明顯較短，這據認為是由等離子體激元衰變η和耦合 發射的角度依賴性發射5造成的。因為目前正在對金屬-螢光團相互作用及其在生物學和臨床診斷學中的應用正 在進行深入研究，因此發現MEF的其他可應用的用途、例如能夠(根據需要)打開或關 閉MEF將是有利的，並可用於諸如晶片實驗室(lab-on-a-chip)和光子檢測器的技術。發明概述本發明涉及通過將直流電導入並使其通過具有低電阻的「恰好連續」的金屬薄 膜來「打開和關閉」發射，以操縱MEF發射的能力。一方面，本發明涉及用於操縱來自金屬增強螢光系統的發射的方法，所述方法 包括a)在基材上提供導電金屬表面，其中所述導電金屬表面包含在所述基材上恰好 連續的薄膜，並且其中所述基材包括玻璃、石英、銅或聚合材料；b)將分子定位於所述導電金屬表面附近，其中所述分子能夠發射可檢測的電磁 能量，並且其中所述分子在距所述導電金屬表面以增強發射的可檢測電磁能量的強度的 距離處定位；c)施加電磁能量，所述電磁能量的波長足以激發所述分子並引起可檢測的電磁 能量發射；以及d)將所述導電金屬表面與電壓源例如蓄電池、太陽能板、氫燃料電池或風源以 及可致動開關相連，其中所述開關打開允許直流電通過所述導電金屬表面輸送，這減小 或停止可檢測的電磁能量發射，並且所述開關關閉為可檢測的電磁能量發射提供可檢測 的電磁能量發射。
上面描述的方法可用於多種螢光檢測系統中，包括但不限於微波加速的金屬增 強螢光(MAMEF)、微波觸發的金屬增強化學發光(MTMEC)或微波加速的表面增強拉 曼散射(MASERS)。上面描述的方法可用於多種螢光檢測系統中，包括但不限於微波加 速的金屬增強螢光(MAMEF)和微波加速的表面增強拉曼散射(MASERS)。此外，所述 系統可以用於許多不同的分析中，包括但不限於免疫分析、雜交分析、共振能量轉移分 析、基於偏振/各向異性的分析、基於生物發光的分析、基於化學發光的分析、基於發 光的分析或酶聯免疫吸附分析。在一個實施方案中，分子包含當與從UV或IR範圍內的輻射接觸時有能力發射 螢光的螢光組分。優選，螢光組分是不幹擾分析系統中任何化學反應的分子。優選，導電金屬表面採取「恰好連續」表面的形式，鑑於下述事實，它與連續 導電錶面和不連續表面不同即「恰好連續」表面存在相連的金屬材料或粒子網，所述 金屬材料或粒子包括但不限於納米結構、島、多孔金屬基質、膠體或金屬薄膜，所述薄 膜厚度從約12到17nm並已被退火以提供具有粒子特性的破裂薄膜。金屬材料可以包括 任何形式的導電金屬，包括銀、金、鉬、鋁、銠和銅，並更優選金屬材料是銀或銅。能夠發射可檢測的電磁能量的分子包括但不限於螢光團、發色團或發光團。能 夠發射螢光的化合物可以是固有螢光團或與外來螢光團結合的化合物。另一方面，本發明涉及用於分析中的裝置系統，所述系統包含a)基材上的導電金屬表面，其中所述導電金屬表面在所述基材上是幾乎連續的 並表現出低電阻，並且其中所述基材包括玻璃、石英或聚合材料；b)位於導電金屬表面上或其附近的分子，其中所述分子能夠在激發時發射電磁 能量；c)用於激發所述分子並引起電磁能量發射的電磁能量源；d)與所述導電金屬表面相連、具有打開和關閉能力的直流電源，其中直流電由 蓄電池、太陽能板、氫燃料電池或風源產生；以及e)用於測量發射電磁能量的檢測器和/或用於測量通過所述導電金屬表面的直 流電的檢測器。另一方面，本發明涉及為螢光信號在打開或關閉模式之間提供切換的、可用於 檢測裝置中的方法和系統，其中強度的變化是定量的，並與發射分子的量相關。從隨後的公開內容和權利要求書中，本發明的其他方面和優點將更充分地顯示。


圖1顯示了在半連續的SiF上隨著施加的「開」和「關」電壓(2.1V，0.3A)， FITC的時間依賴性螢光發射(在544nm測量)(上圖)。上圖的插入圖顯示了半連續SiF 薄膜的SEM圖像。下圖-SiF上的FITC隨著2.1V，0.3A門控的開和關的螢光光譜。下 圖的插入圖顯示了實驗設置的示意圖和通過473nm陷波濾波器獲得的照片。圖2顯示了在幾乎連續的SiF上隨著施加的電壓/電流門控的「開」和 「關」(上圖)，以及在不連續的SiF上隨著施加的電壓/電流門控的「開」和「關」(下 圖)，FITC的時間依賴性螢光發射(在544nm測量)。插入圖顯示了相應SiF的SEM圖像。圖3顯示了 FITC隨著施加的電壓/電流門控的「開」和「關」的發射，其中 當電流關閉時可檢測到發射的強度。圖4顯示了目前對金屬增強螢光(上圖)、用施加的電壓/電流擾動的金屬增強 螢光(下圖)進行說明的圖示。F-螢光團，MEF-金屬增強螢光，Ag-銀納粒。圖5顯示了平均SiF電阻對不同SiF製備時間的圖(上圖)。對於幾乎連續的、 -7Q的薄膜來說，隨著電壓/電流門控的「開」和「關」，來自SiF的時間依賴性背景 發射(在544nm測量)(下圖)。圖6顯示了 SiF隨著施加的電壓/電流而變的吸收光譜(上圖)。加熱到不同溫 度的SiF的吸收光譜(下圖)。圖7顯示了施加電壓/電流門控的「開」時，在幾乎連續的SiF(7⑴上FITC 的螢光光譜(上圖)。比色杯中的FITC隨著溫度而變的螢光光譜(下圖)。圖8顯示了隨著施加的電壓/電流門控的「開」和「關」，摻入到旋塗在半連 續SiF上的0.25% PVA中的FITC的時間依賴性螢光發射(在524nm測量)(上圖)。隨 著施加的電壓/電流門控的「開」和「關」，SiF上的FITC的螢光光譜(下圖)。發明詳述在本發明中，第一次證明了電流對表面等離子體激元放大螢光信號的能力的影 響，即對金屬增強螢光(MEF)的影響。跨過低電阻的銀島薄膜(SiF)施加的直流電擾亂 了緊鄰螢光團的螢光增強。對於給定的施加電流來說，「恰好連續」的低電阻薄膜中的 表面等離子體激元可用於螢光團偶極子耦合的很少，因此增強的螢光隨著所施加電流的 變化被門控。對於較厚的低電阻薄膜來說，這時在MEF被較低程度擾亂的金屬中存在足 夠的載荷子，容易地在表面上形成由緊鄰偶極子誘導的表面等離子體激元。本文中使用的術語「恰好連續的薄膜」的意義是指具有從約2到200歐姆、更 優選從約5到約60歐姆、最優選從約7到25歐姆的電阻的導電金屬薄膜，其中與導電金 屬薄膜交通連接的直流電與沒有接通直流電的薄膜相比，導致由鄰近的螢光團、發色團 或發光團發出的電磁發射強度的降低。本發明的方法和系統可以用於眾多的系統和方法中，包括在下列專利申 請中描述的系統和方法題為「使用金屬增強螢光用於病原體檢測的高靈敏度分 析」(HIGH-SENSITIVITY ASSAYS FORPATHOGEN DETECTION USING METAL ENHANCEDFLUORESCENCE)的美國專利申請 No.US 10/536,502 ；題為「基於金 屬增強螢光的傳感方法 」(METAL-ENHANCEDFLUORESCENCE-BASED SENSING METHODS)的美國專利申請No.ll/917,804;題為「來自塑料基材的金屬增強熒 光」(METAL-ENHANCED FLUORESCENCE FROM PLASTICSUBSTRATES)的美國 專利申請No. 11/718,560 ；題為「微波加速的分析」(MICROWAVE ACCELERATED ASSAYS)的美國專利申請No.ll/719,731 ；題為「微波加速的等離子體光子 學」(MICROWAVEACCELERATED PLASMONICS)的美國專利申請 No. 11/695,397 ； 題為「螢光微波顯微術」(FLUORESCENCE MICROWAVEMICROSCOPY)的國際專利 申請NO.PCT/US08/65801 ；題為「微波聚焦的化學發光」(MICROWAVE FOCUSED CHEMILUMINESCENCE)的美國專利申請No. 12/036,402 ；題為「角度依賴性金屬增強螢光」(ANGULAR DEPENDENT METAL-ENHANCED FLUORESCENCE)的美 國專利申請11/750,119 ；題為「金屬增強的單線態氧產生」(METAL-ENHANCED SINGLET OXYGEN GENERATION)的美國專禾丨J 申請 No. 12/020,571 ；題為「使 用來自貴重金屬納米結構的等離子體散射的生物分析」(BIOASSAYS USING PLASMONIC SCATTERINGFROM NOBLE METAL NANOSTRUCTURES)的美國 專利申請No.11/917,075;和題為「用於極化成像和受體/配體量子化的納米結 構」 (NANOSTRUCTURES FOR POLARIZED IMAGING ANDRECEPTOR/LIGAND QUANTIZATION)的美國專利申請No.11/997,778，這些申請的內容在此出於所有目的引 為參考。已知導電金屬表面能夠對振蕩偶極子的螢光團做出響應，並改變作為固有輻射 衰變速率的發射速率和所發出的輻射的空間分布。理論家將這種效應描述為是由於靠近 螢光團的光子模式密度的變化所致。在大多數分光測定中，溶液或介質對發射的和取樣 的輻射來說都是透明的。但是，對於自由空間條件來說存在幾種重要的例外。一個眾 所周知的例子是表面增強的拉曼散射(SERS)。已知金屬表面的存在能夠將拉曼信號增 加103到108倍，有報導甚至出現過1014-1016倍的更高增強。鄰近的金屬薄膜、島或粒 子的存在也能改變螢光團的發射性質。最熟知的效應是螢光被鄰近金屬淬滅。在金屬表 面50 A範圍內的螢光團的發射幾乎被完全淬滅。這種效應使用在用漸逝波激發的螢光顯 微術中。來自石英-水界面附近的細胞膜區域的發射被淬滅，允許選擇性觀察來自距固 體_液體界面更遠的細胞質區域的發射。除了淬滅之外，已知金屬表面或粒子能夠引起 螢光的顯著增加。引人注目的是，取決於距離和幾何形狀，金屬表面或粒子對於螢光團 的螢光發射來說能夠產生幾千倍的增強倍數。在本文中可以互換使用的「螢光團」和「螢光標記物」，是指當被某種波長 (激發波長)的輻射照射時能夠發出具有不同波長(發射波長)的電磁能量例如光的任何 物質，並打算包含能夠與樣品中的目標被分析物特異性相互作用或反應以提供一種或多 種光信號的化學或生物化學分子或其片段。此外，螢光團包括外來和固有螢光團。外來 螢光團是指與另一種物質結合的螢光團。固有螢光團是指其自身是螢光團的物質。示例 性螢光團包括但不限於在《分子探針目錄》(Molecular Probes Catalogue)中列出的螢光 團，該文獻在此引為參考。代表性的螢光團包括但不限於Alexa Fluor 350、丹磺醯氯(DNS-C1)、5-(碘 代乙醯胺)螢光素(5-IAF)、螢光素5-異硫氰酸酯(FITC)、四甲基羅丹明5-(和6_)異 硫氰酸酯(TRITC)、6-丙烯醯基-2-二甲基氨基萘(丙烯醯丹)、7-硝基苯並-2-噁-1， 3，-二唑-4-基氯化物(NBD-C1)、溴化乙錠、螢光黃、5-羧基羅丹明6G鹽酸鹽、麗絲 胺羅丹明B磺醯氯、德克薩斯紅 、磺醯氯、BODIPY 、萘胺磺酸包括但不限於1-苯 胺基萘-8-磺酸(ANS)和6-(對甲苯胺基)萘-2-磺酸(TNS)、蒽醯脂肪酸、DPH、 十八碳四烯酸、TMA-DPH、芴基脂肪酸、螢光素-磷脂醯乙醇胺、德克薩斯紅-磷 脂醯乙醇胺、芘基-磷脂醯膽鹼、芴基-磷脂醯膽鹼、部花青540、1-(3_磺酸根合丙 基)-4-[- 3 -[2[ ( 二正丁基氨基)-6-萘基]乙烯基]吡啶鐺甜菜鹼(Naphtyl Styryl)、3， 3』 _ 二丙基硫雜二羰花青(diS-C3_(5))、4-(對二戊基氨基苯乙烯基)-1_甲基吡啶鐺 (di-5-ASP)、Cy-3碘代乙醯胺、Cy-5-N-羥基琥珀醯亞胺、Cy_7_異硫氰酸酯、羅丹明800、IR-125、噻唑橙、天青B、尼羅藍、A1酞花青、噁嗪1，4'，6-二脒基-2-苯基 吲哚(DAPI)、Hoechst 33342、TOTO、吖啶橙、乙錠同二聚體、N(乙氧基羰甲基)_6_甲 氧基喹啉鐺(MQAE)、Fura-2、鈣綠、羧基 SNARF-6、BAPTA、香豆素、phytofluors、
暈苯和金屬-配體複合物。代表性的固有螢光團包括但不限於具有芳環結構的有機化合物，包括但不限於 NADH、FAD、酪氨酸、色氨酸、嘌呤、嘧啶、脂類、脂肪酸、核酸、核苷酸、核苷、 胺基酸、蛋白、肽、DNA、RNA、糖類和維生素。其他適合的螢光團包括酶-輔因子、 鑭系元素、綠色螢光蛋白、黃色螢光蛋白、紅色螢光蛋白或其突變體和衍生物。適合的化學發光標記物的實例包括但不限於過氧化物酶、細菌螢光素酶、螢火 蟲螢光素酶、官能化的鐵-卟啉衍生物、魯米那、異魯米諾、吖啶酯、磺醯胺等。最 近的化學發光標記物包括以次黃嘌呤作為底物的黃嘌呤氧化酶。觸發劑包括過硼酸鹽、 Fe-EDTA複合物和魯米諾。具體的化學發光標記物的選擇取決於幾種因素，包括製備標 記成員的成本、用於與檢測分子共價偶聯的方法以及檢測分子和/或化學發光標記物的 大小。因此，化學發光觸發劑的選擇將取決於所使用的具體化學發光標記物。優選，生物發光產生系統的組分是螢光素酶和螢光素。生物發光產生系統可以 選自從櫛水母、腔腸動物、軟體動物、魚、介形動物、昆蟲、細菌、甲殼綱、環節動物 和蚯蚓分離的系統。螢光素酶可以選自發光水母、海螢(vargula)、海腎、螅蛋白、珍蟾 魚、齒裂蟲、奇巨口魚、厚巨口魚、螢火蟲和細菌的系統。金屬增強螢光提供了增加的強度，同時縮短了發射壽命。發射增強可以根據待 檢測螢光團的類型和金屬材料的類型、形狀，在一定距離處觀察到，注意到了薄膜與金 屬島或膠體之間的區別。例如，當螢光團位於距金屬表面約7nm到約40nm的距離時， 可以觀察到發射增強。優選的距離是距金屬表面約7nm到約30nm，更優選為lOnm到約 20nm。螢光可以使用裝置進行檢測，裝置包括但不限於帶有光源和檢測器的螢光分光 光度計。其他檢測器可以包括GaAs-陰極PMT。還有的檢測器可以包括光電倍增管。 此外，對於裝置來說具有單色器是有利的，以便可以使用特定波長的光來激發分子或在 特定波長處檢測發射。激發光源可以包括弧燈和雷射、雷射二極體和發光二極體光源、以及單個和多 個光子激發源。在另一個實施方案中，Ti-藍寶石雷射、雷射二極體(LD)或發光二極體 光源(LEDs)的使用可以與本發明的RNA分析一起使用。例如，使用700-1000nm處的 2-光子激發，並且也使用短脈衝寬度(<50pi)、高重複頻率(l-SOMHz)的雷射二極體和 LED (Ins, 1-lOMHz)光源)。可以通過使用連續稀釋的RNA，開始用Ti_藍寶石系統， 然後使用LED和LD，來顯示使用2-光子激發與1-光子相比的分析靈敏度的增加。如 果螢光團同時吸收兩個光子，它將吸收足夠的能量升高到激發態。然後螢光團發出單個 光子，其波長依賴於所使用的螢光團，典型在可見光譜內。使用具有紅外光的TI-藍寶 石雷射具有附加的益處，即較長的波長散射較少，這有利於高解析度成像。重要的是， 通過利用靠近金屬粒子的局部激發，使用2-光子激發與1-光子激發相比獲得的背景信號 水平降低了。當含有螢光團、發色團或發光團的樣品被暴露於一定量激發輻射或參與發光化學反應時，螢光團、發色團或發光團發出可檢測的輻射。當金屬粒子與螢光團、發色團 或發光團之間的距離為約5nm到約200nm時，發射強度可以對激發輻射的量做出響應而 增加。發射強度的增強部分是由於螢光團在與金屬表面緊鄰時的局部激發，並導致發射 分子的光穩定性增加。此外，與金屬材料表面上的等離子體激元的相互作用和偶聯提供 了額外的增強。在一個實施方案中，可以通過使用各種還原劑還原金屬離子來製備金屬粒子。 例如，可以將氫氧化鈉添加到快速攪拌的硝酸銀溶液中，形成棕色沉澱。然後加入氫氧 化銨重新溶解沉澱。將溶液冷卻，向燒杯中加入乾燥的石英玻片，然後加入葡萄糖。在 攪拌2分鐘後，將混合物加溫到30°C。10-15分鐘後，混合物轉為黃綠色並變渾濁。銀 粒子的薄膜形成在玻片上，可以從它們的棕綠色看出。值得注意的是，玻片在混合物中 保留的時間長度提供了不同的薄膜厚度。例如，如果沉積過程進行約5到10分鐘，沉積 的薄膜將被認為是「恰好連續的」。優選的金屬是銀和金。同樣地，因為金在較短波長 處的吸收，可以使用金。銀島薄膜也可以通過在石英表面上對銀鹽進行化學還原來形成，其製作相對簡通過在玻璃或聚合物基材上放置官能性化學基團例如氰化物(CN)、胺(NH2)或 硫醇(SH)，可以將能夠形成恰好連續薄膜的量的金屬材料結合到表面上。可以通過使用薄膜來實現將生物分子或金屬粒子定位在所需距離上。薄膜可以 是聚合物薄膜、Langmuir-Blodgett薄膜或氧化物薄膜。此外，金屬薄膜可以通過真空氣相沉積來製備。在沉積金屬薄膜之前，可以 將基材在lXl(T4mbar下用空氣等離子體預處理3分鐘。銀線可以在燈絲上熔化，在 < lXlcTmbar的壓力下蒸發，並沉積在玻璃載片上。沉積速度可以通過燈絲電流進行 調整(1埃/秒)，薄膜的厚度可以使用沉積室中位置與玻璃基材接近的石英晶體微天平 來測量。優選，薄膜厚度在約12到17nm之間，然後薄膜可以在約200°C下退火約1小 時。退火過程在不存在氧氣的情況下進行，在退火過程開始之前，可以通過輪流地用超 高純度氮氣(Airgas，MD)吹掃系統和泵抽真空來消除氧氣。方法和材料具有不同電阻的銀島薄膜(SiF)的製備SiF按照以前發表的4進行製備。在典型的SiF製備中，在乾淨的lOOmL玻璃燒 杯中製備硝酸銀溶液(0.5g在60ml去離子水中)。在室溫下向連續攪拌的硝酸銀溶液中 加入200 u L新鮮製備的5% (w/v)氫氧化鈉溶液和2ml氫氧化銨。隨後通過將燒杯放置 在冰浴中，將溶液冷卻到5°C，然後將矽烷-prepTM玻璃載片浸泡在溶液中，並加入新鮮 的D-葡萄糖溶液(0.72g在15ml水中)。然後將混合物的溫度加溫到30°C。當混合物 的顏色從黃綠色轉變成黃棕色時，將燒杯移除加熱，根據所需的電阻將玻片在溶液中保 持5-30分鐘。然後將玻片從混合物中取出，用水洗滌，在風下乾燥，使用GDT-11伏 特計(GBInstruments )測量玻片電阻。在表面上製備幹樣品將300 ii L FITC(2.5mM)乙醇溶液滴在具有不同電阻的SiF表面上。將溶劑蒸
發並研究樣品。對於氧化和偶極子重新定向研究(對照樣品)來說，將100 u L FITC滴在lmL 0.25% (w/v)PVA水溶液中，並旋塗在SiF上歐姆)。該步驟產生了 &37nm 厚的薄膜(使用AFM測量)，其阻止了氧氣的擴散和電流流動過程中螢光團偶極子重新 定向。吸收和螢光測量在VarianCary50UV-Vis分光光度計上記錄吸收光譜。使用來自Ocean Optics， Inc.的Fiber Optic光譜儀(HD2000)，使用與玻璃/鍍銀表面成45度入射的473nm激發 光，在與表面成90度的角度上收集螢光測量值。電壓門控實驗將直流電(Extech Instruments 382213)施加到具有不同電阻的SiF上，如圖1下 圖插入圖，並在螢光測量期間門控「開」和「關」。SEM 測量在日立SU-70儀器上進行掃描電子顯微術(SEM)。切取樣品並固定在鋁支持物 上。使用20kV的高電壓，以14994x放大倍數研究樣品。結果和討論有趣的是，具有高電阻的不連續薄膜使用直流電時沒有顯示出效應，具有低電 阻的厚連續薄膜如以前所述6根本不適合於等離子體激元耦合。隨後，本文提出的發現 表明，具有低電阻的恰好連續的薄膜能夠用於門控MEF 「開和關」，並事實上具有「居 間的」發射強度。由於最近對MEF用途的興趣，這些發現對於基於晶片實驗室的技術以 及開發新的直接測量耦合量子/螢光的螢光檢測器7，將是非常重要的。以前被用於MEF的SiF4』8，沉積在胺塗層的玻璃載片上(Sigma)，該步驟被修 改以允許SiF沉積更長的時間，以改變表面的電阻，如圖5上圖中所示。具體來說，沉 積> 15分鐘的薄膜被發現是完全導電的(電阻< 1 Q)，而沉積106Q)。在約5-13分鐘之間沉積的薄膜是「恰好」導電的，薄膜具有最高 幾百歐姆的電阻。表面的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像顯示了薄膜的顆粒(高電阻)到連 續(低電阻)性質，參見圖1和2的插入圖。圖1顯示了施加的電壓對塗層在半連續(恰好連續)薄膜(7Q)上的螢光素 (FITC)的影響，實驗設置顯示在圖1下圖的插入圖中。顯然，當電壓被門控時，可以看 到FITC螢光分別上升和下降。除了強度波動的幅度之外，門控過程中螢光發射光譜在光 譜上原本是一致的。圖1下圖插入圖中的照片顯示了門控過程中真實的螢光。在一系列詳細的對照實驗中，作為效應的可能原因，消除了銀背景發射(圖5下 圖)和如圖6中所示的等離子體激元吸收隨著所施加的電流/電壓的變化。有趣的是， 隨著電壓和電流被逐漸改變，FITC發射隨後被相應地門控(圖7上圖)，強烈地表明觀 察到的現象是所施加的直流電的結果。如圖8中所示，表面氧化和偶極子重新定向也被考慮作為效應的可能原因。但 是，在氮氣吹掃的厚的0.25% w/vPVA薄膜k37nm)中，仍然容易觀察到螢光門控效 應。有趣的是考慮觀察到的螢光信號變化的幅度。從圖1上圖中看到了電流門控過程 中信號的的變化，但是據認為幾種因素造成了螢光信號沒有以甚至更大的程度變 化(l)FITC分子塗層在銀島之上和之間，因此一大部分可能沒有受到所施加電流的影響；(2)在門控過程中存在輕微的升溫，這增加了 FITC發射，抵消了觀察到的效應 的幅度。圖7下圖顯示了 FITC發射隨著溫度而增加，因此不能造成門控現象。就此而 言，SiF的等離子體激元吸收也顯示出不被溫度升高所擾亂，如圖6下圖中所示；以及(3)門控和未門控情況下螢光信號隨時間的總體降低，被認為是由於用恆定的 CW 473nm雷射激發的FITC的光穩定性。因此，取決於可激發分子，電流門控過程中信號的變化可以高於在FITC中發現 的 50%。圖2研究了直流電對非常厚和薄的、即分別為低和高電阻的薄膜的效應。有趣 的是，對於較厚的薄膜來說，MEF效應的幅度與圖1中顯示的低電阻薄膜、即190a.u相 比明顯較低(在t = 0時55a.u)。該觀察結果與目前對MEF的理解和解釋8完全相 符，其中在本文使用的條件下，連續薄膜不能支持表面等離子體激元的產生，因此不能 支持MEF的產生。具有非常高電阻(即低電流)的不連續薄膜，顯示出較高的起始MEF 效應，即= 260a.u.，如圖2下圖所示，與來自SiF的MEF的其他報導H』 8相符。有趣 的是，作為圖1中顯示的銀薄膜，兩種表面都顯示出不太顯著的螢光門控效應，表明對 於「恰好連續的」薄膜來說效應更加顯著。 理論上認為，導致如圖1和2所示的觀察到的結果的可能機制，包括當施加電流 時，圖1中顯示的具有低電阻的恰好連續薄膜中的等離子體激元不可用於偶極子耦合和 MEF,因此MEF效應被門控。對於圖2上圖中的厚薄膜來說，薄膜厚度足以允許電流流 動，等離子體激元可自由用於MEF，觀察到的螢光的淨變化小得多。對於不連續薄膜來 說，它是MEF的理想基材，對電流流動的電阻非常高，因此不能觀察到門控效應，圖2 下圖。圖4下圖繪出了對電壓/電流門控的MEF效應提出的機制。最後，將在本實驗中發現的結果放在最近出版物的環境中，在所述最近出版物 中，使用了掃描隧道顯微鏡在金屬納粒中激發了由於尖端的局部場引起的局部等離子體 激元共振9』1(1。隨後，Iwasaki等顯示了與納粒緊鄰的發光團被隨後激發，產生了分子發 光1(1。本發明的系統在本質上是宏觀的，事實上幾乎是相反的機制。在光激發和誘導 表面等離子體激元後，另外施加跨過納粒薄膜的電流降低了螢光團偶極子耦合的程度， 減小了總體MEF效應(圖4下圖)。有趣的是，儘管這些其他的報告是基於單個納粒和 無納粒的薄膜1(1，但我們還未能在不需要附加的光激發的情況下同樣地觀察到螢光。與 Iwasaki等的相似，本文提出的發現不依賴於極性，通過簡單地在電導線各處進行切換獲 得了同樣的結果(數據未顯示)。從圖1中，可以看到當電壓被門控時螢光發射幾乎以雙指數喪失，最終在幾百 秒、即<3分鐘內達到平臺。有趣的是，在開始施加電流時，螢光強度事實上在幾秒內 非常快速地下降。後來，發射的喪失速度就慢得多。螢光的這種快速然後慢速的衰減據 認為由兩個競爭性的過程造成。開始時，由於如同前面討論的，表面等離子體激元不能 偶極子耦合因而不能增強螢光，因此螢光由電流通過而被關門控。在後來的時間中，觀 察到了銀島薄膜已輕微升溫，如圖7下圖中所示，這導致了螢光素(FITC)螢光的增加。 隨後，快速的關門控效應、然後是由於薄膜對電流的電阻導致的緩慢表面加熱，被認為 造成了圖1上圖中觀察到的螢光的雙指數喪失。
儘管最初認為表面加熱似乎使螢光門控觀察結果複雜化，但據認為表面樣品的 輕微加熱能夠很好地促進快速分析的開發，正如最近通過使用聚焦低功率微波和金屬納 粒所報導的"_13。總之，在本發明中顯示了通過跨過恰好連續的銀薄膜添加施加的電流，第一次 觀察到了門控MEF。結果表明，對於具有施加的電流的恰好連續的薄膜來說，表面等離 子體激元不是那樣容易地可用於近場偶極子耦合，當使用較厚金屬時效應消失，從根本 上增加了可用於電流的載荷子的數量，並釋放出表面等離子體激元用於偶極子耦合。參考文獻 本文引用的參考文獻的內容在此出於所有目的引為參考。(l)Geddes, C.D. ； Lakowicz, J.R.，Journal of Fluorescence, 2002，121-129.(2) Asian, K. ； Gryczynski, I. ； Malicka, J. ； Matveeva, Ε. ； Lakowicz, J.R.； Geddes, C.D., Current Opinion in Biotechnology 2005, 16，55-62.(3)Zhang, Y. ； Asian, K. ； Previte, M.J. ; Geddes，C.O., J Fluoresc2007, 17， 627-631.(4) Asian, K. ； Geddes, C.D., Analytical Chemistry 2005，77，8057-8067.(5) Asian, K. ； Malyn, S.N. ; Geddes，C.D., Analyst 2007，132，1112-1121.(6) Chowdhury, M.H. ； Asian, K. ； Malyn, S.N ； Lakowicz, J.R. ； Geddes, C.D., Applied Physics Letters, 2006，88，173104.(7) Boehm, D.A. ； Gottlieb, P.A. ； Hua, S.Z., Sensors and ActuatorsB-Chemical 2007， 126， 508-514.(8) Asian, K. ； Zhang, Y. ； Hibbs, S. ； Baillie, L. ； Previte, M.J. ； Geddes, CD., Analyst 2007，132，1130-8.(9)Makinen, A.J. ; Foos，Ε.Ε. ； Wilkinson, J. ； Long, J.R, JoumalofPhysical Chemistry C, 2007，111，8188—8194.(lO)Liu.H.W. ； Ie, Y. ; Nishitani R. ; Aso，Y. ； Iwasaki, H., PhysicalReview B, 2007， 75.(11) Asian，K.; Geddes, C.D., Analytical Chemistry, 2005，77，8057-8067.(12) Asian, K. ； Geddes, C.D., Plasmonic, s 2006, 1，53-59.(13) Asian, K. ； Geddes, C.D., Anal Chem，2007，79，2131—6.
權利要求
1.一種用於分析中的裝置系統，所述系統包含a)基材上的導電金屬表面，其中所述導電金屬表面是沉積在所述基材上的恰好連續 的薄膜並表現出低電阻，並且其中所述基材包括玻璃、石英或聚合材料；b)位於導電金屬表面上或其附近的分子，其中所述分子能夠在激發時發射電磁能量；c)用於激發所述分子並引起電磁能量發射的電磁能量源；d)與所述導電金屬表面相連、具有打開和關閉能力的直流電源；以及e)用於測量發射電磁能量的檢測器和/或用於測量通過所述導電金屬表面的直流電 的檢測器。
2.權利要求1的系統，其中所述分子是螢光團、發色團或發光團。
3.權利要求1的系統，其中所述導電金屬表面由選自金、銀、鋁和銅的金屬製成。
4.權利要求1的系統，其中所述恰好連續的薄膜是電阻在約2到200歐姆範圍內的導電金屬薄膜。
5.權利要求1的系統，其中所述恰好連續的薄膜是電阻在約5到25歐姆範圍內的導電金屬薄膜。
6.權利要求1的系統，其中與所述導電金屬薄膜交通連接的直流電的通過，導致與其 中沒有連接直流電的薄膜相比，由鄰近的螢光團、發色團或發光團發射的電磁發射強度 降低。
7.權利要求1的系統，其中電壓源是蓄電池、太陽能電池或氫燃料電池。
8.權利要求1的系統，其中螢光團、發色團或發光團位於距所述金屬表面約10到 20nm 處。
9.
10.權利要求8的系統，其中所述系統用於免疫分析、雜交分析、共振能量轉移分 析、和基於偏振/各向異性的分析、基於生物發光的分析、基於化學發光的分析、基於 發光的分析或酶聯免疫吸附分析。
11.權利要求1的系統，其中所述激發電磁能量在從UV或IRE的範圍內。
12.一種用於操縱來自金屬增強螢光系統的發射的方法，所述方法包括a)在基材上提供導電金屬表面，其中所述導電金屬表面包含在所述基材上恰好連續 的薄膜，並且其中所述基材包括玻璃、石英、銅或聚合材料；b)將分子定位於所述導電金屬表面附近，其中所述分子能夠發射可檢測的電磁能 量，並且其中所述分子在距所述導電金屬表面以增強發射的可檢測電磁能量的強度的距 離處定位；c)施加電磁能量，所述電磁能量的波長足以激發所述分子並引起可檢測的電磁能量 發射；以及d)將所述導電金屬表面與電壓源和可致動開關相連，其中所述開關打開允許直流電 通過所述導電金屬表面輸送，這減小或停止可檢測的電磁能量發射，且所述開關關閉為 可檢測的電磁能量發射提供可檢測的電磁能量發射。
13.權利要求12的系統，其中所述分子是螢光團、發色團或發光團。
14.權利要求12的系統，其中所述導電金屬表面由選自金、銀、鋁和銅的金屬製成。
15.權利要求12的系統，其中所述恰好連續的薄膜是電阻在約2到200歐姆範圍內的導電金屬薄膜。
16.權利要求12的系統，其中所述恰好連續的薄膜是電阻在約5到25歐姆範圍內的導電金屬薄膜。
17.權利要求12的系統，其中與所述導電金屬薄膜交通連接的直流電的通過，導致與 其中沒有連接直流電的薄膜相比，由鄰近的螢光團、發色團或發光團發射的電磁發射強 度降低。
18.權利要求12的系統，其中電壓源是蓄電池、太陽能電池或氫燃料電池。
19.權利要求12的系統，其中所述螢光團、發色團或發光團位於距所述金屬表面約 10 到 20nm 處。
20.權利要求19的系統，其中所述系統用於免疫分析、雜交分析、共振能量轉移分 析、和基於偏振/各向異性的分析、基於生物發光的分析、基於化學發光的分析、基於 發光的分析或酶聯免疫吸附分析。
21.權利要求12的系統，其中所述激發電磁能量在從UV或IR的範圍內。
全文摘要
在本發明中，第一次證明了電流對表面等離子體激元放大螢光信號的能力的影響。跨過低電阻銀島薄膜(SiF)施加的直流電擾亂了緊鄰螢光團的螢光增強。對於給定的施加電流來說，「恰好連續」的低電阻薄膜中的表面等離子體激元很少可用於螢光團偶極子耦合，因此隨著所施加電流的變化對增強的螢光進行了門控。
文檔編號G01N21/64GK102016553SQ200980113902
公開日2011年4月13日 申請日期2009年3月1日 優先權日2008年3月3日
發明者克裡斯·D·格迪斯 申請人:馬裡蘭大學,巴爾的摩縣