穀氨酸脫羧酶熱穩定變體g311p基因及其用途的製作方法
2023-09-09 14:54:25 1
專利名稱：穀氨酸脫羧酶熱穩定變體g311p基因及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學技術領域，尤其涉及一種穀氨酸脫羧酶變體G311P基因及其用途。
背景技術：
定點突變(site-directed mutagenesis 或 site-specific mutagenesis)是指在目的DNA片段的指定位點上引入特定的鹼基對變化的技術。它是研究蛋白質結構與功能之間的複雜關係的有力工具，也是在實驗室中改造基因的常用手段。對某個已知基因的特定鹼基進行定點改變、缺失或者插入，可以改變對應的胺基酸序列和蛋白質的結構和功能特徵，有助於了解蛋白質結構和功能的關係。特別是在酶的理性設計中，或利用隨機突變等定向進化技術篩選得到具有潛力的重要胺基酸位點後，進行定點突變分析，將有利於進一步了解該位點在蛋白質結構和功能的關係中所發揮的作用。
穀氨酸脫羧酶(glutamatedecarboxylase,簡稱 GAD ；EC4.1.1. 15)是一種廣泛地存在於植物、動物和微生物中的胺基酸脫羧酶，它可以專一地催化L-穀氨酸的α -羧基脫羧反應生成Y-氨基丁酸(Y-aminobutyric acid,簡稱GABA)。GABA是哺乳動物神經系統的一種關鍵的神經遞質抑制劑，具有抑制中樞神經系統過度興奮、解除神經緊張等生理功能。由於身心緊張會導致人體血壓升高、免疫功能失調、代謝紊亂，因此GABA對人體具有鎮靜安神、促進睡眠、健腦益智、降低血壓，改善免疫功能，延緩衰老等作用，是一種在食品和醫藥領域具有廣泛應用的天然胺基酸，已被國家衛生部批准為「新資源食品」。目前，利用穀氨酸脫羧酶或具有該酶活力的細胞進行GABA的生物製備正得到越來越多的重視。
作為生物技術富集生產GABA的關鍵酶，細菌GAD的熱穩定性一直是限制其在大規模生物反應器中應用的因素之一。細菌GAD的最適溫度一般在30 50°C之間，然而在60°C 以上酶的活力下降較快。而在工業生產過程中，往往希望採用更高的操作溫度，以提高反應速率、增加底物溶解度、降低體系粘度，從而提高生物催化與轉化的效率。
中國專利申請200510049189. 4和中國專利申請200510049187. 5公開了一種生產 Y-氛基丁酸的短乳桿菌(Lactobacillus brevis) CGMCC NO. 1306,對該菌株的GAD基因進行克隆，構建重組質粒，轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，可實現可溶表達。但是，該基因表達的GAD在60°C及以上的環境中很快失活，不利於該酶在GABA生物製備中的應用。發明內容
本發明所解決的技術 問題首先是提供一種穀氨酸脫羧酶的變體基因，其編碼對應的變體酶在60°C和70°C下的熱穩定性有明顯提高，從而在工業生產過程中可以採用更高的操作溫度，以提高反應速率、增加底物溶解度，有利於利用該酶通過生物轉化生產GABA。
本發明進一步的目的是提供上述變體基因編碼的穀氨酸脫羧酶或包含上述變體基因的表達單元、重組質粒、或轉化子。
為了達到上述目的，本發明採用的技術方案是
一種穀氨酸脫羧酶熱穩定變體G31IP基因，其核苷酸序列在第311位有定點突變。 研究發現，此位點突變後得到的變體基因編碼的穀氨酸脫羧酶的熱穩定性有所增強。本發明研究的基礎是來自短乳桿菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO. 1306中的GAD基因。其中短乳桿菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO. 1306 已在中國專利申請 200510049189. 4 和中國專利申請200510049187. 5中公開，由浙江大學保藏在中國普通微生物保藏管理中心(地址北京市朝陽區北辰西路I號院)。本申請使用的是浙江大學饋贈的。
經研究發現，短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)CGMCC NO. 1306 中的 GAD 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，本申請將該基因第311位甘氨酸(Gly)的密碼子GGT突變為脯氨酸(Pro)的密碼子CCC，序列長度沒有變化。得到的穀氨酸脫羧酶熱穩定變體G311P 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一種由上述穀氨酸脫羧酶熱穩定變體G311P基因編碼的穀氨酸脫羧酶。其胺基酸序列優選如SEQ ID NO. 2所示。
一種包含上述穀氨酸脫羧酶熱穩定變體G311P基因的穀氨酸脫羧酶表達單元、重組質粒或轉化子。表達單元的啟動子可以為常用的T7啟動子、Iac啟動子或araBAD啟動子。在這些啟動子的作用下，突變酶可以直接在大腸桿菌宿主細胞(如BL21(DE3))中實現胞內可溶表達。
本發明通過在編碼野生GAD酶基因基礎上進行定點突變，提高了其對應變體酶在 60°C和70°C下的熱穩定性。本發明特異性選擇對編碼GAD第311位胺基酸殘基位點的密碼子進行替換，且採用編碼脯氨酸的密碼子替換編碼穀氨酸的密碼子、使GAD的第311位胺基酸殘基由野生型的穀氨酸突變為脯氨酸，是因為採用分子設計方法對GAD上各胺基酸殘基對GAD熱穩定性的影響進行了分析，發現第311位胺基酸殘基位點是一個對GAD的熱穩定性有重要影響的胺基酸。基於胺基酸性質與蛋白質結構和性質間的關係，研究發現在該位點採用脯氨酸替換甘氨酸可以增加GAD蛋白質結構的剛性、提高GAD對熱的穩定性。因此， 設計了引物，並通過定點突變方法構建了穀氨酸脫羧酶的熱穩定突變體G311P。隨著穀氨酸脫羧酶熱穩定性的提高，在工業生產過程中可以採用更高的操作溫度，以提高反應速率、增加底物溶解度，有利於利用該酶通過生物轉化生產GABA。
圖1為質粒pET28a(+)_gad的基因圖譜；
圖2為突變位點Gly311在GAD三級結構中的位置圖(以球表示)；
圖3為定點 突變原理示意圖4為野生型GAD酶基因PCR擴增產物凝膠電泳圖譜；
圖5為突變酶和野生型GAD在60°C的熱穩定性；
圖6為突變酶和野生型GAD在70°C的熱穩定性。
具體實施方式
為進一步說明本發明，結合以下實施例具體說明
一、構建重組質粒
將短乳桿菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO. 1306培養至對數生長中期，取4. 5mL菌液10000rpm離心一分鐘後棄去上清，利用試劑盒(上海生工)按說明書提取基因組 DNA。
設計如下簡併引物上遊簡併引物5'-cgggatccatggcffatgttRtaYggffaaac-31 (如 SEQ ID NO. 5 所示)；
下遊簡併引物5'-gggaattcttagtgHgtgaaYccgtattt-3;(如 SEQ ID NO. 6 所示)；
其中，上遊引物中的「ggatcc」為BamH I酶切位點，下遊引物中的「gaattc」為EcoR I酶切位點。
分別用上遊引物和下遊引物配對，選擇和優化不同的模板/Pfu/引物比例，退火溫度，循環次數，以所得基因組DNA為模板進行PCR，以得到擴展片段大小合適、豐度合適和非特異條帶少的PCR結果，最終通過條件的優化，得到了一個長度約為1400bp的DNA條帶。
所確定的PCR 體系組成為ddH20,38. 5 μ L ； 10 X Pfu buffer，5 μ L ;上遊引物 O. 5 μ L ;下遊引物，O. 5 μ L ；dNTP,4y L ;模板 DNA, I μ L ；Pfu,0. 5 μ L ;反應總體積為 50 μ L。
所用的PCR條件為94°C變性5min後進入擴增循環，即94°C變性1. 5min, 57°C退火lmin，72°C延伸3. 5min，共循環32次，最後再72°C延伸8min。擴增產物經凝膠電泳檢驗， 結果如圖4所示，產物條帶單一、清晰、明亮，大小在1400bp左右。將克隆產物測序，發現穀氨酸脫羧酶基因的保守序列。
用BamH I和EcoR I對擴增得到的目的基因和pET28a(+)進行雙酶切，酶切條件如下DNA 20 μ L、10X K buffer 4 μ L、BamH I 4 μ L、EcoR I 4 μ L、ddH20 8 μ L，酶切溫度為 35。。。
質粒酶切lh，PCR產物酶切4h。分別對酶切產物進行電泳純化和切膠回收，電泳驗證回收產物，然後進行連接，連接條件為=IOXbuffer 2 μ L、gad 10 μ L、質粒I μ L、 PEG30006 μ L、Τ4連接酶I μ L，連接溫度為16°C，連接16小時。
連接反應結束後60°C保溫5min滅活連接酶，再分別取連接產物轉化E. coli DH5 α感受態細胞(氯化鈣法)。轉化產物塗布於含有終濃度為30 μ g/mL卡那黴素的LB固定培養基，37°C培養18小時後挑出陽性克隆，分別在含有30 μ g/mL卡那黴素的LB液體培養基中過夜培養陽性克隆，提取質粒後進行BamH I和EcoR I雙酶切、PCR驗證，轉化子含重組質粒 pET28a(+)_gad(如圖1 所示)。經測序，短乳桿菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO. 1306中GAD基因如SEQ ID NO. 3所示，編碼的GAD胺基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
二、野生型GAD的表達和純化
取構建的表達穀氨酸脫羧酶的質粒pET28a(+)_gad轉化E. coli BL21 (DE3)感受態細胞，得到表達短乳桿菌穀氨酸脫羧酶的重組工程菌。挑取菌體在含有終濃度為30 μ g/ mL卡那黴素的LB固體培養基平板上於37°C活化10小時，然後挑取單菌落接種20mL含有 30 μ g/mL卡那黴素的LB液體培養基中，在37°C、200rpm搖床培養過夜後，按2%的接種量接種於IOOmL含有30 μ g/mL卡那黴素的LB液體培養基中在37°C、200rpm搖床培養2 3 小時。當發酵液中菌體濃度(0D_)達到O. 6 O. 8時，向培養液中加入終濃度為1. Ommol/ L的異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)，改變培養溫度到30°C，繼續培養6 8小時。培養結束後,在4°C、8000Xg的條件下離心IOmin收集菌體。
然後採用破胞緩衝液重懸細胞，然後用N1-NTA(QIAGEN)進行金屬螯合層析，得到野生型GAD純酶，其操作步驟和所用試劑如「突變酶的表達與純化」。
三、定點突變PCR產物的獲得
向200 μ L的Eppendorf管中加入200 μ mo I的dNTPs,上、下遊引物各I μ mo I,約 10ngpET28a(+)-gad 重組質粒作為模板 DNA，5yL 的 IOXPfu Buffer，2. 5U 的 Pfu DNA 聚合酶，然後加無菌蒸餾水至總體積為50 μ L。反應參數是在95°C預變性5min後，95°C變性 lmin,53°C退火2min,72°C延伸14min,經過18個循環,最後72°C延伸lOmin。
上遊引物5』-CTTGGGTCCCGAACTACCTACGATGGCC-3> (如 SEQ ID NO. 7 所示);
下遊引物5』-GTAGTTCGGGACCCAAGTAGCTGACCT-3，(如 SEQ ID NO. 8 所示);
其中，下劃線標記的核酸序列組合為編碼GAD第311位胺基酸殘基的密碼子。野生型GAD基因在該位置處的密碼子為編碼甘氨酸的密碼子GGT ;在所設計的引物中，該位置的密碼子替換為編碼脯氨酸的密碼子CCC。採用這對引物，根據定點突變原理，可以特異地在所擴增獲得的GAD基因中引入密碼子替換、使所得基因編碼的GAD的第311位胺基酸殘基變為脯氨酸，而不再是野生型的甘氨酸。定點突變的原理如圖3所示。
四、定點突變PCR產物的轉化與驗證
將上述獲得的定點突變PCR產物用Dpn I酶進行消化，以降解野生型質粒，消除轉化子中野生型個體出現的可能。消化的體系為PCR產物10 μ L，IOXbuffer 2 μ L，Dpn I I μ L，加ddH20至總體積為20 μ L。
將消化以後的產物用CaCl2法轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，具體操作如下
(I)從_70°C冰箱中取100 μ L的感受態細胞懸液，冰上融化；
(2)加入定點突變PCR消化產物5 μ L，輕輕混勻，冰上放置30min ；
(3)於42°C水浴熱激110s，然後立即冰上放置2min ；
(4)向管中加入900 μ LSOC培養基，混勻，37°C振蕩培養lh，使細胞復甦；
(5)將上述菌液搖勻，取適量塗布在含有30 μ g/mL卡那黴素的LB平板上，正面向上放置半小時，待菌液被培養基吸收後倒置平板，37°C培養過夜。
待轉化子長出後，隨機挑選若干個克隆，提取質粒，進行全自動DNA測序，證實突變位點為Gly311 — Pro (如圖2所示)。
五、突變酶的表達與純化
將轉化子接種到20mL含有30 μ g/mL卡那黴素的LB液體培養基中，37 °C，180rpm 振蕩過夜培養，然後以I %的接種量接種到含有30 μ g/mL卡那黴素的IOOmL LB液體培養基中，37°C，180rpm 培養至 OD600 為 O. 6 O. 8 時，加入 IPTG (終濃度為 O. 5mM), 30°C, 150rpm 繼續誘導8h。誘導結束後,4<€下5000\8離心10111；[11,收集菌體沉澱。用pH 8. O磷酸緩衝液洗滌兩次，除盡培養基後再用原發酵液體積1/10的破胞緩衝液(50mM磷酸鉀緩衝液， ImMPMSF, 300mM NaCl，IOmM咪唑，pH 8.0)重懸細胞，在冰浴中超聲破胞90次(300W，工作 3s，間隙6s)，15000Xg離心IOmin收集上清，即得到含有GAD的粗酶液。
採用N1-NTA親和層析對上步所得的粗酶液進行分離純化。經上樣(loading)、清洗(washing)和洗脫(eluting)，收集洗脫液，透析除去小分子即得到純酶。適當稀釋後，以考馬斯亮藍法測定純酶的濃度。
所用緩衝液配製如下
裂解緩衝液(disruption buffer) :50mM磷酸二氫鈉，ImM苯甲基磺醯氟(PMSF), 300mMNaCl, IOmM 咪唑，pH 8. O。
洗柱緩衝液(wash buffer) 50mM磷酸二氫鈉，ImM苯甲基磺醯氟(PMSF), 300mMNaCl,20mM 咪唑，pH 8. O。
洗脫緩衝液(elution buffer) :50mM磷酸二氫鈉，ImM苯甲基磺醯氟(PMSF), 300mMNaCl,250mM 咪唑，pH 8. O。
六、突變酶的熱穩定性考察
將得到的G311P純酶分別在60°C和70°C的情況下保溫0，10，30，60，90min後，冰浴lOmin。取10 μ L純酶，加入於48°C預熱的200 μ L底物溶液(pH 4. 8，O.1M檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝液，含O. OlmM PLP，50mM底物L-MSG)，迅速混勻後在48°C反應lOmin，反應結束後迅速放入沸水浴中IOmin以終止反應,離心,收集上清液,採用高效液相色譜法測定反應生成的GABA的量，以測定突變酶G311P的殘餘酶活力。在同樣條件下，以野生型GAD的反應作為對照。HPLC操作條件如下色譜分離柱為Hypersil 0DS2C18 (250mmX4. 6mm)(大連依利特公司)，紫外檢測波長為254nm，進樣量為10 μ L，控制柱溫25°C，流動相A為甲醇， 流動相B為四氫呋喃甲醇0.05M醋酸鈉(pH 6.2)(5 75 420，V/V)。梯度洗脫程序見下表
權利要求
1.一種穀氨酸脫羧酶熱穩定變體G311P基因，其特徵在於所述基因的核苷酸序列在第311位有定點突變。
2.根據權利要求1所述的穀氨酸脫羧酶熱穩定變體G311P基因，其特徵在於所述基因的核苷酸序列第311位的密碼子GGT突變為CCC。
3.根據權利要求2所述的穀氨酸脫羧酶熱穩定變體G311P基因，其特徵在於所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.權利要求1-3任一項所述的穀氨酸脫羧酶熱穩定變體G311P基因編碼的穀氨酸脫羧酶。
5.根據權利要求4所述的穀氨酸脫羧酶，其特徵在於所述穀氨酸脫羧酶的胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
6.ー種包含權利要求1-3任一項所述的穀氨酸脫羧酶熱穩定變體G311P基因的穀氨酸脫羧酶表達單元。
7.ー種包含權利要求1-3任一項所述的穀氨酸脫羧酶熱穩定變體G311P基因的重組質粒。
8.ー種包含權利要求1-3任一項所述的穀氨酸脫羧酶熱穩定變體G311P基因的轉化子。
9.權利要求1-3任一項所述的穀氨酸脫羧酶熱穩定變體G311P基因在60°C以上條件下、催化L-穀氨酸或其鹽生成Y -氨基丁酸的方法中的應用。
10.權利要求4或5所述的穀氨酸脫羧酶在60°C以上條件下、催化L-穀氨酸或其鹽生成Y-氨基丁酸的方法中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種穀氨酸脫羧酶熱穩定變體G311P基因，其核苷酸序列在第311位有定點突變。研究發現，此位點突變後得到的變體基因編碼的穀氨酸脫羧酶的熱穩定性有所增強。本發明通過在編碼野生GAD酶基因基礎上進行定點突變，提高了其對應變體酶在在60℃和70℃下的熱穩定性。隨著酶熱穩定性的提高，在工業生產過程中可以採用更高的操作溫度，以提高反應速率、增加底物溶解度，有利於利用該酶通過生物轉化生產GABA。
文檔編號C12N9/88GK103031322SQ20111029715
公開日2013年4月10日 申請日期2011年9月30日 優先權日2011年9月30日
發明者梅樂和, 鬱凱, 胡升, 黃 俊 申請人:浙江大學寧波理工學院