一種應用於紅黴素發酵的糖醇混合補料新方法
2023-09-10 05:39:15 2
專利名稱：一種應用於紅黴素發酵的糖醇混合補料新方法
一種應用於紅黴素發酵的糖醇混合補料新方法技術領域
本發明屬於生物工程領域；更具體地，本發明涉及一種應用於紅黴素發酵的糖醇混合補料新方法。
背景技術：
紅黴素是由紅色糖多孢菌經過次級代謝合成的十四元大環內酯類抗生素，主要應用於治療革蘭氏陽性細菌感染。其作用機理為通過與細菌核蛋白體50S亞基核糖體結合抑制轉肽作用和信使核糖核酸(mRNA)移位殺死致病細菌。紅黴素是全球銷量居前的抗感染藥物，全球銷售額達到上百億美元。隨著以紅黴素為原料的新型半合成紅黴素藥物如羅紅黴素、阿奇黴素和克拉黴素等銷售額的連年猛增，帶動了紅黴素需求的不斷增加，紅黴素原料藥的生產和銷售日趨活躍。
目前大多數生產廠家採用黃豆餅粉和澱粉作為主要的培養基成份。在此配方的基礎上添加少量的速效氮源能夠促進紅色糖多孢菌菌體的前期生長並有效地提高紅黴素的發酵水平。在發酵過程中隨著澱粉的消耗，菌體會被迫水解利用黃豆餅粉。黃豆餅粉的脫氨基作用引起PH的升高。為了控制發酵過程的pH值，可以採用補加酸鹼的方法控制發酵過程 pH。隨著工藝的逐漸完善，在紅黴素發酵工業中，普遍採用在發酵進入菌體生長穩定期後開始採用流加葡萄糖控制PH值的發酵工藝，結果顯示該方法不僅優於單純補加酸鹼控制pH 值的方法，而且比依據發酵液中殘糖的葡萄糖補加工藝更能提高最終紅黴素發酵水平。
除了在發酵過程中補加葡萄糖外，豆油和正丙醇作為紅黴素合成前體的重要來源，也是過程補料的重要內容。然而，一直以來尚未形成統一的豆油和正丙醇的補加方法。 一些廠家完全根據多年的生產經驗來進行豆油和正丙醇的補料工藝。這些方法缺少一定的理論依據，在實施中多依靠有經驗的技術人員的分析判斷。
因此，本領域迫切需要深入研究紅黴素的發酵機制，優化紅黴素的發酵工藝，有效提聞紅黴素的廣量。發明內容
本發明的目的在於提供一種應用於紅黴素發酵的糖醇混合補料新方法。
在本發明的第一方面，提供一種採用pH值反饋控制法進行紅黴素發酵的方法，所述方法包括設定PH預設值6. 95-7. 1(如6. 95,7.0,7. 05,7. I)，進行三階段發酵
第一階段培養紅色糖多胞菌至菌體生長穩定期，當發酵液pH值高於預設值時， 開始第二階段；
第二階段當發酵液pH值高於預設值時，通過補加葡萄糖產生有機酸來控制pH值在預設值；同時補加正丙醇，使加入的葡萄糖和正丙醇的總碳原子的量滿足菌體生產所需； 當正丙醇補加速率低於0.07-0. OSgL-1IT1 (如O. OTegL-1^1)時，開始第三階段；
第三階段維持正丙醇補加速率0.07-0. OSgL^r1 (如O. (^egL—V1);補加葡萄糖使發酵液pH值在預設值。
在本發明的一個優選例中，所述方法的第二階段中，加入的葡萄糖和正丙醇的總碳原子的量以每12小時補加碳原子絕對量來計算，在O. 25-0. 35mol/L。在本發明的另一優選例中，加入的葡萄糖和正丙醇的總碳原子的量以每12小時補加碳原子絕對量來計算，由第二階段起始時的O. 26mol/L增加到O. 31mol/L,之後下降(較佳地,下降至O. 24mol/L)。在本發明的另一優選例中，所述的pH預設值為7. 0-7. 05。在本發明的另一優選例中，所述方法的第二階段中，每一時間點加入的葡萄糖和正丙醇的總碳原子的量等於以下發酵方法a相應(或相同)時間點發酵液中葡萄糖和正丙醇的總碳原子的量
當發酵液pH值高於6. 9時補加葡萄糖，平均葡萄糖補加速率O. liOg-rV1 ;同時補加正丙醇，平均正丙醇補加速率O. 058g · T1IT1至發酵結束。在本發明的另一優選例中，所述的方法中，正丙醇補加速率=(發酵方法a葡萄糖補加速率X6+發酵方法a正丙醇補加速率X3)-葡萄糖補加速率X6]+3。在本發明的另一優選例中，發酵的溫度在34±1°C。在本發明的另一優選例中，發酵的溶氧30±5%。在本發明的另一優選例中，發酵的初始培養基包括澱粉35±5g/L，糊精5±lg/L，黃豆餅粉 33 ± 5g/L，玉米漿 18 ± 2g/L，NaCl2 ±O. 4g/L，CaC037 ± I. 5g/L，豆油 5 ± lmL/L。在本發明的另一優選例中，發酵的初始培養基還包括消泡劑。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
圖I、紅色糖多胞菌的接種-發酵流程。圖2、高低補糖下對紅黴素發酵的影響。▼線表示模式a補糖曲線(預設pH=6.9),▽線表示模式b (預設pH=7. 3)下的補糖曲線， 線表示模式a下紅黴素合成曲線，〇線表示預設PH=7. 3下的紅黴素合成曲線。圖3、在高低補糖下溶氧曲線比較。圖4、在圖2-3的基礎上設計的四種總碳原子相等原則的補料模式，顯示了補糖和補醇速率的變化，即在不同階段控制葡萄糖和正丙醇的比例。圖5、根據模式I-模式4工藝下獲得的過程發酵參數。圖6、不同補加模式下的攝氧速率OUR和呼吸商RQ。圖7、葡萄糖和正丙醇在代謝中的去向考察。
具體實施例方式為了解決現有技術中紅黴素發酵過程中補糖補醇以經驗為主、缺乏理論依據的問題，本發明從葡萄糖和正丙醇之間的相互利用間的關聯性為出發點，揭示了一種糖醇混合補料新方法。與傳統補加工藝相比，本發明的補料方法通過控制不同發酵階段的補糖速率來控制正丙醇的利用效率，同時依據葡萄糖補加速率對正丙醇補加速率進行調控，可以很好地控制菌體處於適於紅黴素合成的最佳生理狀態。
本發明的方法基於以下原理通過在一定範圍內調控發酵過程中的pH設定值，能夠有效地改變葡萄糖的補加速率，當葡萄糖補加速率降低時，正丙醇的利用速率會增加。正丙醇是紅黴素合成前體的重要來源，其利用率增加則使得紅黴素產量增加。基於此，研究了改變PH設定值調控補糖速率以及依據葡萄糖補加速率控制正丙醇補加速率的新型混合補料模式，實現了紅黴素發酵水平的提高。
葡萄糖和正丙醇在代謝中的去向如圖7所示，葡萄糖可以合成紅黴素前體，正丙醇也可以合成紅黴素前體。葡萄糖代謝要經過EMP、TCA等代謝途徑，在這些途徑中，使得大部分葡萄糖以二氧化碳的形式釋放掉，並沒有很好的合成紅黴素。而正丙醇代謝與紅黴素合成更直接相關，正丙醇可被菌株利用的利用率高。因此，本發明人本著提供足夠的總碳原子量且提高正丙醇的加料、葡萄糖的加入僅滿足控制PH的原則，開發了本發明的高效產紅黴素的方法。
如本文所用，所述的「菌體生長穩定期」是指微生物經過一段時間的生長，由於培養基中營養物質已不多，只能維持菌體基本新陳代謝和合成次級代謝產物的需要，因此菌體的比生長速度基本為零，菌體濃度基本上處於恆定。
作為本發明的優選方式，本發明人依據葡萄糖和正丙醇的碳原子總和不變原則提高正丙醇補加速率。在碳原子總和不變原則下，葡萄糖平均補加速率降低，正丙醇平均補加速率提高，紅黴素產量大幅增加。與傳統的單純依據PH補糖和恆速補醇策略相比，該方法充分考慮到葡萄糖和正丙醇的利用關係，保證了菌體持續快速的合成紅黴素產物。
本發明的方法採取三階段發酵法，首先培養紅色糖多孢基因工程菌，在發酵液中葡萄糖濃度降低到接近零時，發酵液的PH值會開始升高，當發酵液pH值高於預設值時，開始第二階段補加葡萄糖以控制PH值。
之後，進行第二階段，補加葡萄糖的同時啟動正丙醇補加程序，根據方程計算出正丙醇的補加速率。方程為，正丙醇補加速率=(原工藝葡萄糖補加速率X 6 +原工藝正丙醇補加速率X3)-葡萄糖補加速率X6]+3，補加速率單位為mmol L^Vl0
之後，進行第三階段，在較低的正丙醇補加速率下，補加葡萄糖控制pH值在預設值。
與傳統的糖醇補料工藝相比，本發明的新型糖醇混合補料方法具有在菌體代謝活躍期補糖速率低、補醇速率高和在菌體代謝衰亡期補糖速率高、補醇速率低的特點。該特點使菌體處於一個適合於合成紅黴素的生理狀態，即菌體代謝活躍期降低補糖速率刺激正丙醇的利用，從而提高來源於正丙醇的紅黴素前體的濃度，而在菌體代謝衰亡期提高補糖速率來減緩菌體的衰亡，同時降低補醇速率，從而降低了正丙醇對菌體的傷害作用。
在本發明的實施實例中，採用新型補加策略進行紅黴素發酵，結果表明新型補料方法可以實現不同發酵階段的葡萄糖補加速率和正丙醇補加速率的聯動效應。降低葡萄糖補加速率能夠顯著提高正丙醇的利用速率。採用新型糖醇混合補料方法，可以實現菌體持續快速的合成紅黴素，大幅度提高了最終紅黴素水平。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件， 或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
實施例I、葡萄糖-正丙醇(糖醇)混合補料新方法提高紅黴素發酵水平
I、培養方法和參數檢測方法
菌種紅色糖多胞基因工程菌ZL1004(Saccharopolyapora erythraea ZL1004) (基因型為 permK*-K-K-G+permE*-K+permA*-G)。
一級種子罐培養基澱粉 30g/L，糊精 40g/L，豆粉 20g/L，CaC035g/L, NaC13g/L, (NH4)2S042g/L。
二級種子罐培養基澱粉30g/L，糊精30g/L，豆粉30g/L，玉米漿10g/L，CaC035g/ L，消泡劑10mL/L。
發酵培養基澱粉35g/L，糊精5g/L，黃豆餅粉33g/L，玉米漿18g/L，NaC12g/L, CaC037g/L，豆油5mL/L，消泡劑(有機矽類消泡劑，購自宜興市高時化工有限公司)56mL/L。
培養方法
採用三級發酵方式，挖取新鮮斜面菌種(IcmXlcm)接種到裝有50mL培養基的 500mL種子搖瓶中，220r/min轉速下34°C培養40h，之後轉入15L種子罐，二級種子培養過程維持溶氧40%以上，34°C培養40h。將二級種子培養液移入50L發酵罐，34°C培養191h， 過程維持溶氧30%以上。主要流程如圖I。
不同pH值設定值的研究(模式a_模式b)
發酵起始第1-34小時，隨溶氧降低逐漸提高轉速和通氣維持溶氧在30%以上，菌體通過利用培養基提供的成分生長和繁殖。第35小時起至發酵結束，採取表I的方式設定 pH及補料。
表I
權利要求
1.一種採用pH值反饋控制法進行紅黴素發酵的方法，其特徵在於，所述設定pH預設值6.95-7. I，進行三階段發酵第一階段培養紅色糖多胞菌至菌體生長穩定期，當發酵液PH值高於預設值時，開始第二階段；第二階段當發酵液PH值高於預設值時，通過補加葡萄糖產生有機酸來控制pH值在預設值；同時補加正丙醇，使加入的葡萄糖和正丙醇的總碳原子的量滿足菌體生產所需；當正丙醇補加速率低於O. 07-0. OSgL-1IT1時，開始第三階段；第三階段維持正丙醇補加速率O. 07-0. OSgL^r1 ;補加葡萄糖使發酵液pH值在預設值。
2.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，第二階段中，加入的葡萄糖和正丙醇的總碳原子的量以每12小時補加碳原子絕對量來計算，在O. 25-0. 35mol/L。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，加入的葡萄糖和正丙醇的總碳原子的量以每12小時補加碳原子絕對量來計算，由第二階段起始時的O. 26mol/L增加到O. 31mol/L，之後下降。
4.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述的pH預設值為7.0-7. 05。
5.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，第二階段中，每一時間點加入的葡萄糖和正丙醇的總碳原子的量等於以下發酵方法a相應時間點發酵液中葡萄糖和正丙醇的總碳原子的量當發酵液PH值高於6.9時補加葡萄糖，平均葡萄糖補加速率O. liOg-rV1 ;同時補加正丙醇，平均正丙醇補加速率O. 058g · T1IT1至發酵結束。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，正丙醇補加速率=(發酵方法a葡萄糖補加速率X6+發酵方法a正丙醇補加速率X 3)-所述方法葡萄糖補加速率X6]+3。
7.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，發酵的溫度在34±1°C。
8.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，發酵的溶氧30±5%。
9.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，發酵的初始培養基包括澱粉35±5g/L，糊精 5±lg/L，黃豆餅粉 33±5g/L，玉米漿 18±2g/L，NaC12±0. 4g/L，CaC037± I. 5g/L，豆油 5±lmL/L。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，發酵的初始培養基還包括消泡劑。
全文摘要
本發明涉及一種應用於紅黴素發酵的糖醇混合補料新方法。本發明的補料方法通過控制不同發酵階段的補糖速率來控制正丙醇的利用效率，同時依據葡萄糖補加速率對正丙醇補加速率進行調控，可以很好地控制菌體處於適於紅黴素合成的最佳生理狀態。
文檔編號C12R1/645GK102978266SQ20121057173
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月25日 優先權日2012年12月25日
發明者儲炬, 陳勇, 莊英萍, 張嗣良, 譚俊, 於曉光 申請人:華東理工大學