高密度嗜熱側孢黴及其發酵培養方法
2023-09-12 16:57:05 3
高密度嗜熱側孢黴及其發酵培養方法
【專利摘要】本發明提供一種高密度嗜熱側孢黴及其發酵培養方法，其採用固體發酵培養工藝，包括：1）以米糠、麩皮、玉米粉、豆粕中任意一種或幾種原料，和保水性樹膠作為固態培養基料；2）於固態培養基料中加入營養液培養基作為固態發酵培養基；3）將固態發酵培養基滅菌後,接種嗜熱側孢黴種子液,經培養,乾燥，粉碎製得高密度嗜熱側孢黴產品； 所述的營養液培養基為PDA培養基；所述的嗜熱側孢黴種子液為用PDA液體培養基接種嗜熱側孢黴培養製得。用高密度固體發酵培養工藝，具有投資少、節能減排、清潔環保、產品保存性強，活性好,產品含活菌量高等特點。
【專利說明】高密度嗜熱側孢黴及其發酵培養方法
[0001]【技術領域】:
本發明涉及農用微生物固態培養領域，一種嗜熱側孢黴菌的固態發酵培養工藝，特別是一種高密度嗜熱側孢黴及其發酵培養方法。
[0002]【背景技術】:
嗜熱側孢黴菌主要用於農業種植業，用於堆肥的快速發酵腐熟；嗜熱側孢黴屬於真菌，能在惡劣環境中生長繁殖；生存酸度、溫度範圍寬廣，PH5?pH10、5°C?70°C都可生存。
[0003]嗜熱側孢黴菌在種植業土壤改良方面的作用:能分泌大量的胞外纖維素酶，木聚糖酶，所以，具有極強的分解能力，並能協同自然界其他土壤微生物，將土壤中的有機質快速和徹底分解為植物易於吸收的小分子養分供植物生長；嗜熱側孢黴菌由於繁殖優勢明顯，可以顯著抑制多種植物病源微生物的生長活性，從而預防多種土傳病害。
[0004]嗜熱側孢黴菌可改良土壤物理結構和性狀，它能通過繁殖產生大量的白色菌絲體，在土壤中形成良好的團粒結構，從而有效改良土壤保水保肥性能。
嗜熱側孢黴菌在發酵秸杆或在有機物料腐熟方面的巨大作用:嗜熱側孢黴菌可以作為發酵堆肥，畜禽糞便快速發酵腐熟，秸杆循環腐熟利用方面起到巨大的作用；
在發酵秸杆方面:嗜熱側孢黴是典型的嗜熱纖維素分解真菌，可在較高的溫度如40?50°C下能大量分泌纖維素酶、木聚糖酶，從而可將秸杆、腐草、草炭等田間有機物快速分解和腐熟成為植物可以利用的有機質，降解秸杆可在20天內完成；從而在農業領域有巨大的應用空間。
[0005]在發酵腐熟畜禽糞便方面:結合秸杆作為發酵腐熟畜禽糞便的填料，秸杆起到疏鬆的作用，有利於空氣供給，有利於好氧發酵，則分解腐熟畜禽糞便只需20天以內，在堆肥(加秸杆輔助)發酵中，堆溫可達50?70°C，並可維持高溫期在10天以上，不僅可能糞便秸杆充分起到腐熟作用，還可以徹底消除糞便臭味，更重要的是高溫能殺死堆肥中的病菌、蟲卵、草籽，還可以降解秸杆中的農藥殘留，絡合重金屬，從而達到優質堆肥的生產目的，並對環境起到淨化作用，消解養殖場非常頭痛的糞便汙染問題。
[0006]嗜熱側孢黴菌在改善植物根系方面的作用:嗜熱側孢黴在土壤中能快速繁殖，既能附生在根表，又能在根系周圍形成良好的微生態環境，收集施用嗜熱側孢黴菌腐熟的堆肥植物根系土壤，肉眼能看到灰白色的菌絲，顯微鏡檢查為典型嗜熱側孢黴菌菌絲團，可與植物根系周圍土壤形成良性土壤微生態環境，防止植物微生物病害，增加土壤有益微生物的種群和數量，降低作物根部病害的發生頻率，起到以菌治菌的效果。
[0007]由嗜熱側孢黴菌形成的植物根系微生態系統，能將根系不能到達位置的養分送到根部，又將根系不能直接吸收的養分轉化後供給作物利用；同時微生物在生命活動中或死亡後所排出的東西，不僅含有有機養分和N、P、K等無機肥分，還包括多種胺基酸、維生素、細胞分裂素和植物生長素，使作物獲得高額產量。
[0008]嗜熱側孢黴(Thermophilic sporotrichum),也是我國農業部允許使用的農用微生物品種之一，在種植業土壤改良方面、發酵秸杆或在有機物料腐熟方面和改善植物根系方面都有重要的作用。該嗜熱側孢黴菌在國內則尚處於研究初級階段，市售產品含菌量低，市售產品中，其含活菌量少，活菌量僅為5億/克。目前現有的嗜熱側孢黴生產普遍採用初級的固態發酵培養工藝，其存在發酵工藝生產設備簡陋，其發酵工藝生產設備投資大，原料及能源消耗量大，且生產出的嗜熱側孢黴產品質量參差不齊，保存性差，雜菌眾多，菌活性不聞。
[0009]目前還沒有採用固態發酵培養工藝生產高密度嗜熱側孢黴及其發酵培養方法的報導。
[0010]
【發明內容】
:
本發明提供一種高密度嗜熱側孢黴及其發酵培養方法，用高密度固體發酵培養工藝，具有投資少、節能減排、清潔環保、產品保存性強，活性好，產品含活菌量高等特點。
[0011]本發明一種高密度嗜熱側孢黴發酵培養方法，其採用固體發酵培養工藝，包括:
1)以米糠、麩皮、玉米粉、豆柏中任意一種或幾種原料，和保水性樹膠作為固態培養基料；
2)於固態培養基料中加入營養液培養基作為固態發酵培養基；3)將固態發酵培養基滅菌後，接種嗜熱側孢黴種子液，經培養，乾燥，粉碎製得高密度嗜熱側孢黴產品；所述的營養液培養基為PDA培養基；
所述的嗜熱側孢黴種子液為用PDA液體培養基接種嗜熱側孢黴培養製得。
[0012]本發明所述的高密度嗜熱側孢黴發酵培養方法，其所述固體發酵培養工藝，優選為包括:
O固態培養基料各組分組成按質量比為米糠:麩皮:玉米粉:豆柏:保水性樹膠=1: (1.5-3.5): ( 1.0-1.5): (1.5-2.5): (0.05-0.1)的比例混合；
2)於上步固態培養基料中按質量比固態培養基料:營養液培養基為1:(1-1.5)的比例加入營養液培養基，並加入飼料用稀土添加劑，製成固態發酵培養基；
3)將2)步製得的固態發酵培養基，溼熱滅菌，冷卻後接種嗜熱側孢黴種子液，經培養，乾燥，粉碎製得高密度嗜熱側孢黴產品；所述的嗜熱側孢黴種子液是用PDA液體培養基，經滅菌冷卻後，接種嗜熱側孢黴斜面種子，在30°C _40°C溫度，ISOrpm轉速下，於搖床上培養18-20小時製得。
[0013]本發明所述的高密度嗜熱側孢黴發酵培養方法，所述3)步接種嗜熱側孢黴種子液，嗜熱側孢黴種子液接入量為固態發酵培養基質量的1_20%，培養過程中控制培養溫度30-40°C，時間 20-72 小時。
所述的高密度嗜熱側孢黴發酵培養方法，其所述3)步的培養過程中至少進行一次以上營養液培養基的流加操作。
[0014]本發明所述的高密度嗜熱側孢黴發酵培養方法，其3)步所述的乾燥粉碎是發酵培養後，物料於35-50°C下通風乾燥至含水量10Wt%以下，再粉碎至60-80目即為高密度嗜熱側抱黴成品。
[0015]本發明所述的高密度嗜熱側孢黴發酵培養方法，其所述2)步飼料用稀土添加劑為含有鑭、鈰有效元素的飼料用稀土添加劑；添加劑加入量按質量比是固態培養基料:營養液培養基:飼料用稀土添加劑為1:(1.0-1.3):(0.00005-0.00015)。
本發明所述的高密度嗜熱側孢黴發酵培養方法，其所述的嗜熱側孢黴種子液的製備是:稱取200g馬鈴薯，洗淨去皮切成小塊，加水100ml高壓蒸煮20分鐘，過濾，再加10_20g葡萄糖，充分溶解後趁熱過濾。滅菌條件為溫度110-121°C，時間20-30分鐘，冷卻後接種嗜熱側孢黴斜面種子，放置於搖床上培養18-48小時，即得到嗜熱側孢黴種子液。
本發明所述的高密度嗜熱側孢黴發酵培養方法，優選是分二次進行流加操作，是兩次將滅菌後的營養液培養基按營養液:固態發酵培養基=(0.1-0.3):1的質量比例加入營養液於固態發酵培養基培養料中，於無菌環境條件下翻料攪拌數分鐘，繼續培養到結束。
[0016]本發明一種高密度嗜熱側孢黴依據上面所述的嗜熱側孢黴發酵培養方法製備獲得。本發明所述製備高密度嗜熱側孢黴即是指高密度嗜熱側孢黴培養物。
[0017]本發明高密度嗜熱側孢黴依據上面所述的嗜熱側孢黴發酵培養工藝方法製備獲得，具有如下特點:具有投資少、節能減排、清潔環保、產品保存性好，活性高等，其成品中有效活菌數可以達到100-200億/g。
採用清潔、節能的固態發酵培養技術，可獲得最多的生物活性代謝物質；用保水性樹膠載體為基質的營養物流加培養技術，最終連同載體一起粉碎處理並作為產品，載體同時起到吸附包埋作用；運用培養液流加培養技術；還添加特殊稀土促培養技術；氣流烘乾技術，以保證最大的活菌數量。
[0018]【專利附圖】
【附圖說明】:
圖1為本發明高密度嗜熱側孢黴產品稀釋2億倍後檢測的平板圖；
圖中:圖中小點均是嗜熱側孢黴菌落，菌落開始白色，後變成灶土色，最後變成咖啡色；每一個小點菌落代表有2億/克的含量，若是20個菌落代表樣品含嗜熱側孢黴量為40億/克。
[0019]【具體實施方式】:下面結合具體實例對本發明作進一步說明；質量或質量比。
[0020]本發明具體實施內容各原料製備如下:(I)製備嗜熱側孢黴種子液PDA培養基:其做法是稱取200g馬鈴薯，洗淨去皮切成小塊,加水100ml高壓蒸煮20分鐘，過濾，再加10-20g葡萄糖，充分溶解後熱過濾，冷卻後貯存備用。滅菌條件為:控制滅菌溫度為121 °C，時間20-30min ;每50毫升滅菌後的液體培養基裝於250毫升三角瓶中，接種斜面嗜熱側孢黴種子一接種環，放置於搖床上培養18?24小時，即得到嗜熱側孢黴種子液。
[0021](2)營養液培養基製備:製備固態發酵過程中需要流加的營養液培養基,製備方法同(I)所述PDA培養液，滅菌冷卻後貯存備用。
[0022](3)固態發酵培養基配製和滅菌:固態發酵培養基包括麩皮、玉米粉、豆柏、米糠、保水性樹膠等，在固態培養基料中再加入上述營養液培養基作為固態發酵培養基營養液，再加入採自江西市場某地的含有鑭、鈰有效元素用於飼料稀土添加劑的稀土 (市售獲得)作為促培養劑，固態培養基:液體培養基:稀土比例為1:(1.0-1.3):0.0001，拌勻後滅菌，滅菌條件為 121°C，20-30min。
[0023](4)固態發酵培養:對滅菌冷卻後的固態發酵培養基接種培養:按接種量5-20%,在滅好菌的固態發酵培養基中接入嗜熱側孢黴種子液，在30?37°C無菌環境下培養24?72h ;培養過程中營養液培養基和固態發酵培養基的流加操作:培養20小時後，將上述滅菌冷卻後的營養液培養基pH值為6.5,即成為流加營養液,按流加營養液:固態發酵培養基為
0.2:1的比例加入流加營養液，於無菌環境中簡單翻料攪拌幾分鐘，繼續培養，培養到40小時時，重複上述的補充流加營養液的操作，再繼續培養到72小時時即培養完畢。
[0024](5)乾燥粉碎:出料後，於35?50°C下通風乾燥至含水量10%以下時結束。粉碎至60目即為嗜熱側孢黴高密度固態發酵成品，也即是高密度嗜熱孢黴培養物產品，用平板培養檢測法檢測嗜熱側孢黴其含活菌量達到100?200億/g。
固態培養基料的各組分的加入量，嗜熱側孢黴種子液接入固態發酵培養基的量均可按現有技術的配比或接入量計加入，而飼料用稀土添加劑可由市售獲得，並按說明添加。
[0025]實施例1:除下述說明外其餘和上述高密度嗜熱側孢黴固態發酵工藝相同，步驟及操作如下:
1、用滅菌PDA液體培養基作為種子培養基，在250毫升三角瓶中裝入滅菌冷卻後的PDA液體培養基50毫升，接種嗜熱側孢黴斜面種子一環，在35°C搖床上培養18?24h，成為接種用嗜熱側孢黴種子液。2、營養液培養基製備:製備固態發酵過程中需要流加的PDA營養液培養基，滅菌冷卻後貯存備用。
[0026]3、配製固態發酵基料:將米糠、麩皮、玉米粉、豆柏、保水性樹膠按質量比1:2:1:2:0.1的比例混合均勻，即成為固態培養基料，在固態培養基料中再加入上述營養液培養基作為固態發酵培養基營養液，再加入市售的含有鑭、鈰有效元素用於飼料稀土添加劑的稀土 (市售獲得)作為促培養劑，固態培養基:營養液培養基:飼料用稀土添加劑比例為1:
1.0?1.3:0.0001，拌勻後滅菌，滅菌條件為121。。，20?30min。
4、接種:待滅菌物料冷卻至室溫後，接入嗜熱側孢黴種子液，接種量按固態基料質量的10%計算。
5、將接好種的物料置於培養室35°C無菌環境中進行培養，培養20小時後，將前述滅菌後的營養液調節PH值到6.5，即成為流加營養液，按流加營養液:固態發酵培養基為0.2:1的比例加入營養液，於無菌環境中簡單翻料攪拌幾分鐘，繼續培養，培養到40小時時，重複上述的補充流加營養液的操作，再繼續培養到72小時時即培養完畢。
6、出料後的物料於35?50°C通風乾燥，乾燥至含水量10%以下時結束。
7、粉碎乾燥好的物料，即為本發明產品100?200億/g的嗜熱側孢黴高密度固態發酵成品高密度嗜熱側孢黴培養物。
8、檢測培養基為:PDA瓊脂培養基，於PDA液體培養基中加入瓊脂1.5?2%，pH自然，37°C培養72h。檢測操作方法簡述:將樣品採用逐級稀釋方法，用無菌生理鹽水稀釋I億倍，製成10_8的菌懸液，將事先滅好菌的90mm平板培養皿放於無菌操作室內，將上述檢測培養基用三角瓶裝好滅菌並冷卻到45°C左右，置於45°C恆溫水浴鍋內保溫備用；在平板培養皿中注入I毫升稀釋後的菌懸液，然後注入上述45°C的溶解狀態的瓊脂培養基，在接種臺上轉動平板培養皿幾圈，使培養基與菌懸液混合均勻，待凝固後，置於37°C恆溫培養箱中培養72小時；檢測計數方法:培養結束後，菌落計數，即為嗜熱側孢黴的菌落，計數結果乘以I億，即得到樣品的嗜熱側孢黴菌數含量，依據上述檢測方法本發明產品培養得到100?200億cfu/g的嗜熱側孢黴菌含量。
[0027]說明:cfu/g單位是指:每克樣品含有的有效菌落形成單位。
【權利要求】
1.一種高密度嗜熱側孢黴發酵培養方法，其特徵是採用固體發酵培養工藝，包括:I)以米糠、麩皮、玉米粉、豆柏中任意一種或幾種原料和保水性樹膠作為固態培養基料； 2)於固態培養基料中加入營養液培養基作為固態發酵培養基； 3)將固態發酵培養基滅菌後，接種嗜熱側孢黴種子液，經培養，乾燥，粉碎製得高密度嗜熱側孢黴產品； 所述的營養液培養基為PDA培養基； 所述的嗜熱側孢黴種子液為用PDA液體培養基接種嗜熱側孢黴培養製得。
2.依據權利要求1所述的高密度嗜熱側孢黴發酵培養方法，其特徵是所述固體發酵培養工藝，包括:I)固態培養基料各組分組成按質量比為米糠:麩皮:玉米粉:豆柏:保水性樹膠=I: (1.5-3.5): (1.0-1.5): (1.5-2.5): (0.05-0.1)的比例混合； 2)於上步固態培養基料中按質量比固態培養基料:營養液培養基為1:(1-1.5)的比例加入營養液培養基，並加入飼料用稀土添加劑，製成固態發酵培養基； 3)將2)步製得的固態發酵培養基，溼熱滅菌，冷卻後接種嗜熱側孢黴種子液，經培養，乾燥，粉碎製得高密度嗜熱側孢黴產品；所述的嗜熱側孢黴種子液是用PDA液體培養基，經滅菌冷卻後，接種嗜熱側孢黴斜面種子，在30°C _40°C溫度，ISOrpm轉速下，於搖床上培養18-20小時製得。
3.依據權利要求1或2所述的高密度嗜熱側孢黴發酵培養方法，其特徵是所述3)步接種嗜熱側孢黴種子液，嗜熱側孢黴種子液接入量為固態發酵培養基質量的1_20%，培養過程中控制培養溫度30-40°C，時間20-72小時。
4.依據權利要求1或2所述的高密度嗜熱側孢黴發酵培養方法，其特徵是所述3)步的培養過程中至少進行一次以上營養液培養基的流加操作。
5.依據權利要求1或2所述的高密度嗜熱側孢黴發酵培養方法，其特徵是3)步所述的乾燥粉碎是發酵培養後，物料於35?50°C下通風乾燥至含水量10Wt%以下，再粉碎至60-80目即為高密度嗜熱側孢黴成品。
6.依據權利要求2所述的高密度嗜熱側孢黴發酵培養方法，其特徵是所述2)步飼料用稀土添加劑為含有鑭、鈰有效元素的飼料用稀土添加劑；添加劑加入量按質量比是固態培養基料:營養液培養基:飼料用稀土添加劑為1:(1.0-1.3):(0.00005-0.00015)。
7.依據權利要求1或2所述的高密度嗜熱側孢黴發酵培養方法，其特徵是所述的嗜熱側孢黴種子液的製備是:稱取200g馬鈴薯，洗淨去皮切成小塊，加水100ml高壓蒸煮20分鐘，過濾，再加10-20g葡萄糖，充分溶解後趁熱過濾；滅菌條件為溫度110-121?，時間20-30分鐘，冷卻後接種嗜熱側孢黴斜面種子，放置於搖床上培養18-48小時，即得到嗜熱側孢黴種子液。
8.依據權利要求4所述的高密度嗜熱側孢黴發酵培養方法，其特徵是分二次進行流加操作，是兩次將滅菌後的營養液培養基按營養液:固態發酵培養基=(0.1-0.3):1的質量比例加入營養液於固態發酵培養基培養料中，於無菌環境條件下翻料攪拌數分鐘，繼續培養到結束。
9.一種高密度嗜熱側孢黴依據權利要求1所述的嗜熱側孢黴發酵培養方法製備獲得。
【文檔編號】C12N1/14GK104450540SQ201410784240
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月16日 優先權日:2014年12月16日
【發明者】鍾啟平, 楊林海 申請人:宜春強微生物科技有限公司