新的α-新瓊脂二糖水解酶及使用其獲得單糖類的方法

2023-09-14 11:20:05

專利名稱：新的α-新瓊脂二糖水解酶及使用其獲得單糖類的方法
技術領域：
本發明涉及新的α -新瓊脂二糖水解酶(α -neoagarobiose hydrolase)及使用其獲得單糖類的方法。
背景技術：
近年來，由於排放至大氣中的二氧化碳量的增加所引起的地球變暖及在不久的將來可能發生的石油的枯竭和價格上升，因此迫切要求新的二氧化碳減少型替代能源的開發。多種替代能源中，使用可以再生且為豐富的地球資源之一的生物質來生產的生物能源作為滿足前述要求的主要的再生能源，目前備受關注。特別地，已經考慮將生物乙醇作為目前需求大大增加的運輸用燃料的代替方案，在以美國為代表的發達國家中已經用法律對生物乙醇的使用賦予了義務。目前，用於生產生物乙醇的原料物質局限於來自玉米或其他糧食資源的糖質、澱粉等(第1代生物燃料)，與人類的糧食資源競爭，從而存在引發國際糧食價格上升這樣的問題。作為可以克服這種缺點的對策，不與糧食資源競爭的新的陸地木質系生物質(第2代生物燃料)、海洋海藻類生物質(第3代生物燃料)作為下一代生物能源的原料也備受關注，有效利用生物質來生產生物能源的技術目前正在活躍研究中。海藻類生物質與木質系生物質相比，微生物可以利用的多糖類的含量多，且由於不含木質素，因此具有前處理較簡單、每年可以收穫多次等多個優點。特別是韓國三面被海包圍，海藻類的生物資源化容易，海藻類的年產量在2006年為137M噸，與中國、日本、北朝鮮一起屬於世界的海藻類生產國，但現狀是在其有效利用率方面，除了食用資源以外，是低迷的(漁業生產統計，2006，統計廳社會統計局農漁業生產統計科)。最近，由海藻類生產生物能源的研究在日本和韓國等進行了活躍的討論。日本的水產業振興財團以「Ocean Sunrise ject (海洋日出項目)」為主題，制定了在日本的專屬經濟水域和海洋帶的未使用海域4. 47百萬km2中大量養殖海藻類以生產50億升的燃料用乙醇的計劃(Aizawa M et al. , Seaweed bioethanol production in Japan-The Ocean Sunrise Proj ect (海藻生物乙醇生產在日本-海洋日出項目)，OCEANS Conference, Sep. 29-Oct. 04，2007, Vancouver, Canada)。另外，韓國在2009年1月最終發表的作為政府的17個新生推進事業領域之一的新再生能源領域中包括海洋生物燃料，對海藻類的興趣進一步提高。根據2009年的農林水產食品部的涉及海洋生物質的確保和有效利用技術的開發的研究規劃發表，在四邊71km 的正四邊形的海域中養殖海藻類來生產生物乙醇時，一年可以生產37. 74億升，這是相當於2030年韓國的汽油預期消耗量的31. 4%的量。目前已知的海藻類中，特別是使用紅藻類生物質(例如，Gelidiumamansii)作為原料物質的研究目前正在活躍進行。紅藻類的乾重總體的70%以上為多糖類，能夠轉換為微生物可以利用的發酵性糖。特別地，來自紅藻類生物質的多糖類的主要成分為瓊脂(agar)，含有乾重總體的60%左右，被認為作為用於生產生物能源的主要原料。瓊脂多糖體是以半乳糖(D-galactose)和3，6_脫水半乳糖(3，6-anhydro-L-galactose ；以下簡稱「AHG」)為單體單元，將它們分別通過α-1，3鍵(α-1, 3-linkage)或β_1，4鍵(β -1,4-linkage)連結而成的聚合物(Duckworth，Μ. and W. Yaphe (1971) Carbohydrate Research(《碳水化合物研究》)16，435-445)(參照圖1)。已知將瓊脂多糖體用作碳源的微生物的情況下，使用β瓊脂糖酶(β-agarase) 或α瓊脂糖酶(a-agarase)將瓊脂多糖體切成小尺寸的低聚糖後，最終在β瓊脂糖酶的情況下分解成α-新瓊脂二糖(α-neoagarobiose，α-1，3-D-半乳糖基_3，6_脫氫_L_半乳糖(a-l，3-D-galactosyl-3，6-anhydro-L-galactose))，在 α 瓊脂糖酶的情況下分解成 β-瓊脂二糖(β-agarobiose, β _1，4_ 脫氫-L-半乳糖基-D-半乳糖(β-1,4-anhydro -L-galactosyl-D-galactose))。已知作為β瓊脂糖酶的分解產物的新瓊脂二糖的情況下， 為了微生物進行代謝，需要轉換為半乳糖，因此需要切斷α-1，3鍵的酶(α-新瓊脂二糖水解酶)(Ekborg, N. A. et al (2005) Int. J. Syst. Evo 1. Microbiol. 55，1545-1549 ；Ekborg, N.A.et al.，(2006) Appl. Environ. Microbiol.(《應用與環境微生物學》)72，3396-3405)。 但是，迄今為止，切斷S.degradas中的新瓊脂二糖的α-1，3鍵的酶尚未發現(Elcborg， N. A. et al. (2006) Appl. Environ. Microbiol.(《應用與環境微生物學》)72，3396-3405)。據報導，在微生物中由瓊脂糖生產低聚瓊脂糖的β瓊脂糖酶可以通過許多微生物進行生產，例如假單胞菌(Pseudomonas)屬菌株(Ha, J. C. etal. (1997)Biotechnol. Appl. Biochem.(《生物技術與應用生化學》)沈1-6)、交替單胞菌(Alteromonas)屬菌株 (Potin，P.，et al. (1993) Eur. J. Biochem.(《歐洲生物化學期刊》)214 :599-607)、噬瓊膠菌 (Agarivorans)屬菌株(Ohta, Y. et al. (2005) Biotechnol. Appl. Biochem.(《生物技術與應用生化學》)41 :183-191)，交替假單胞菌(Pseudoalteromonas)屬菌株(Belas，R. (1989) J. Bacteriol.(《細菌學雜誌》)171 :602-605)，微顫菌(Microsilla)屬菌株(Zhong, Ζ. et al. (2001)Appl. Environ. Microbiol.(《應用與環境微生物學》)67 :5771-5779)和弧菌 (Vibrio)屬菌株(Aoki, T. et al. (1990)Eur. J. Biochem.(《歐洲生物化學期刊》)187 461-465)等。將來自紅藻類的瓊脂多糖體用作生產生物能源的原料時，必須經過多個階段的前處理過程而轉換為微生物可以實際利用的發酵性糖。瓊脂多糖體向發酵性單糖類的轉換可以大致通過化學前處理和生物學前處理2種工序來實現。首先是利用酸水解等的化學方法，是較簡單的工序，但存在如下缺點將由多糖類構成的生物質在高溫下進行化學前處理，會大量生成糠醛(furfural)、HMF (羥甲基糠醛，hydroxymethylfurfural)等毒性副產物，得到隨機切斷而得到的單糖類和低聚物的混合物(Pickering et al. , 1993, Journal of Applied Phycology (《應用藻類學雜誌》)5 :85-91 ;Armis，en，1995)。與此相對，使用瓊脂糖酶這樣的酶的生物學前處理和糖化方法具有可以在常溫下通過環境友好的方法來得到作為發酵性糖的半乳糖的優點，但存在如下缺點目前商業上可買到的酶局限於β瓊脂糖酶，瓊脂糖酶的產物也將通常的微生物難以使用的二糖類(新瓊脂二糖、瓊脂二糖)作為最終產物。作為β瓊脂糖酶反應的結果而生成的新瓊脂二糖的情況下，為了用於生產生物能源，必須轉換為作為發酵性單糖類的半乳糖，此時需要α-新瓊脂二糖水解酶。因此， 在用來將紅藻類生物質用作生物乙醇這樣的生物能源的生產原料的有效的生物質生物學的(酶的)前處理和糖化工序的最終階段，α-新瓊脂二糖水解酶是不可缺少的。另外， 作為新瓊脂二糖的水解產物而與半乳糖一起獲得的AHG，即使在商業上也沒有銷售，是只能購入D型的AHG的狀況，而且價格賣得很高(2009年，200磅(英國)/100mg，Dextra Laboratories)。因此，可以使用本酶，由瓊脂糖大量生產作為高價的寶貴性單糖類的AHG。

發明內容
技術問題為解決上述問題，根據上述必要性而想出本發明，其目的在於提供一種在向用於生物能源的生產等的作為發酵性單糖類的半乳糖的轉換中所必須的酶。本發明的其他目的在於提供一種使用新瓊脂二糖作為基質，轉換成作為單糖類糖的半乳糖和AHG的方法。技術的解決方法為了達成前述目的，本發明提供選自由序列號1 序列號11構成的組中的α -新瓊脂二糖水解酶(α -neoagarobiose hydrolase ；以下稱為 「 α -ΝΑΒΗ」 )。本發明的優選實施例中，就前述具有α-新瓊脂二糖水解活性的酶而言，不僅包含序列號1 序列號11所公開的胺基酸序列，而且作為前述酶的1個以上進行了取代、缺失、易位、添加等的突變蛋白質而具有α-新瓊脂二糖水解活性的蛋白質也包含在本發明的酶的權利要求範圍中，優選包含與序列號1 序列號11所公開的胺基酸序列的序列一致性為80%以上、85%以上、90%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、 98%以上和99%以上的胺基酸序列。本發明中，多肽相對於其他序列具有特定比率(例如，80%、85%、90%、95%或 99% )的序列一致性是指，使前述2個序列比對時，比較前述序列時前述比率的胺基酸殘基相同。前述比對以及百分率相同性或一致性可以使用本技術領域公知的任意的適當軟體程序，例如文獻⑶RRENT PROTOCOLS INMOLE⑶LAR BIOLOGY (《最新分子生物學實驗方法彙編》)(F.M.Ausubel 等(eds) 1987Supplement 30section 7.7.18)中所記載的軟體程序來決定。作為優選的程序，有 GCG Pileup 程序、FASTA(Pearson 等，1988Proc. Natl. Acad. Sci. USA(《美國科學院院刊》)85 J444-2448)、和 BLAST (BLAST Manual (BLAST 手冊)， Altschul 等，Natl. Cent. Biotechnol. Inf.，Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH)，Bethesda, MD 和 Altschul 等，1997NAR25 :3389-3402)。其他優選的比對程序是 ALIGN Plus (Scientific and Educational Software，PA)，優選使用基本媒介變量的程序。可以使用的其他的序列軟體禾呈序是可以在 Sequence Software Package Version 6. 0 (Genetics Computer Group (遺傳學計算機小組)，University of Wisconsin (威斯康辛大學)，Madison，WI)中利用的 TFASTA Data Searching Program。本發明的一個實施例中，前述酶優選從交替單胞菌saccharophagus degradans等獲得，但並不限定於此。^^ BJlii saccharophagus degradans ffl^nT L^i,Jl^A (saccharophagus degradans ATCC 43961)，但可以通過不受此限定的多種方法獲得。另外，本發明提供一種編碼前述本發明的酶的基因。在本發明的一個實施例中，前述基因優選是在序列號12中記載的基因，但並不限定於此。另外，在本發明的一個實施例中，前述基因優選從交替單胞菌saccharophagus
5degradans獲得，但並不限定於此。另夕卜，本發明提供一種製造本發明的酶的方法，包括培養交替單胞菌 saccharophagus degradans > iAJ^Ifif Φ￠1 ^^ _ 。另外，本發明提供一種製造半乳糖和脫水半乳糖的方法，包括用本發明的酶分解 α -新瓊脂二糖，從前述分解物中提取半乳糖和脫水半乳糖。另外，本發明提供一種α -新瓊脂二糖水解酶，其包含含有在選自由圖8所示的模序(motif) 1 50 (共50個模序)所構成的組中的模序中的1、2、3、4、5、6、7、14、16、17、 20,34,40的13個模序，更加優選提供必須包含圖8所示的50個模序中的模序7和34的
α-新瓊脂二糖水解酶。蛋白質模序如果可以用規則表示的模式表示，則通常模式的表達方式用正則表達式表不；http //www, expasy. ch/prosite/prosuser. html ；例如PA [AC] -x-V-x (4) - {ED}。本模式角軍析如下[Ala or Cys] -any-Val-any-any-any-any- {any but Glu orAsp}PA < A-x-[ST] (2)-χ (0,1)-V.該模式必須在序列的N-末端(「<」)，解析如下Ala-any- [Ser or Thr] - [Ser or Thr] - (any or none) -Val ； Si grist C. J. A. , Cerutti L. , Hulo N. , Gattiker A. , Falquet L. , Pagni Μ. , Bairoch A., Bucher P. PR0SITE :adocumented database using patterns and profiles as motif descriptors. BriefBioinform.(《生物信息簡報》)3 :265-274 Q002) ；Sigrist C. J.A.，De Castro Ε. ,Langendijk-Genevaux P. S. ,Le Saux V. ,Bairoch Α. ,Hulo N. ProRule :a new database containing functional and structural information on PR0SITE profiles. Bioinformatics (《生物信息學》)· 2005Nov 1 ；21 (21) :4060-6. Epub 2005Aug 9 ；Timothy L. Bailey, Nadya Williams, Chris Misleh, and Wilfred W. Li, MEME-discovering and analyzing DNA and protein sequence motifs,Nucleic Acids Research (《核酸石if究》)， Vol. 34，pp.W369-W373,2006)。本發明中，與細胞、核酸、蛋白質或載體關聯而使用時，用語「重組」是指前述細胞、 核酸、蛋白質或載體由於異種核酸或蛋白質的導入或者原來的核酸或蛋白質的變更而變形、或者前述細胞來自這樣變形後的細胞。即，例如，重組細胞表達在前述細胞原來的(非重組)形態內未表達的基因、或者表達由於不同而在表達時異常地表達、或者完全未表達的原來的基因。用語「蛋白質」和「多肽」在本發明中可以互換使用。本發明中對於胺基酸殘基， 使用通常的1個字或3個字的編碼。本發明中，「基因」不僅指本發明的酶的編碼區域之前或之後的區域，也指包含各自的編碼片段間的插入序列的、與生產多肽有關的DNA片段。本發明中，用語「核酸」包括單鏈或雙鏈的DNA、RNA及它們的化學變異體。用語 「核酸」和「多核苷酸」在本發明中可以能夠互換地使用。由於遺傳密碼簡併，因此為了編碼特定胺基酸，可以使用1個以上的密碼子，本發明包括編碼特定的胺基酸序列的多核苷酸。本發明中，「載體」是指為了在1個以上細胞類型內導入核酸而設計的多核苷酸序列。就載體而言，有克隆載體、表達載體、穿梭載體、質粒、噬菌體粒子、盒子(cassette)等。本發明中使用的「表達載體」是指具有可工作地與可以使目標DNA在適當的宿主內表達的適當的控制序列連結的DNA序列的DNA結構物。這種控制序列可以包含引起轉錄的啟動子、調節轉錄的任意的操縱子(operator)序列、編碼mRNA上的適當的核糖體結合部位的序列、增強子以及調節轉錄和翻譯終止的序列。本發明中，「啟動子」是涉及為了開始基因的轉錄而使RNA聚合酶結合的調節序列。 前述啟動子可以是誘導性啟動子或構成型(constitutive)啟動子。本發明中的用語「來自」包括用語「源自」、「可得到」或「可以從...得到」、以及 「可從...離析出」，在本發明中使用時，它是指被前述核苷酸序列編碼的多肽由原本存在前述核苷酸、或者插入有前述核苷酸序列的細胞產生。用語「培養」是指在適當的條件下，使微生物細胞群體在液體或固體培養基中生長。在優選的實施例中，培養是指(典型地在容器或反應器內)將含有瓊脂糖的基質生物轉換為最終生成物。發酵是指通過使用微生物將有機物質以酶方式和厭氧方式進行分解而產生更單純的有機化合物。發酵在厭氧條件下發生，但由於發酵還可以在氧的存在下發生， 因此不用將前述用語僅限定於嚴格的厭氧條件。本發明中使用的用語「回收」、「離析」和「分離」是指從自髮結合的1個以上的成分中除去的化合物、蛋白質、細胞、核酸或胺基酸。與本發明中使用的細胞關聯使用的用語「轉化」、「穩定的轉化」和「基因導入 (transgenic)」是指具有作為細胞通過數代維持的附加體質粒的、或整合到其基因組內的非原來(例如，異種)的核酸序列。本發明中使用的用語「表達」是指基於基因的核酸序列而生產多肽的方法。前述方法包括轉錄和翻譯。將核酸序列插入細胞內的用語「導入」是指「轉染(transfection) 」、或者「轉化」 或「轉導(transduction) 」，包括言及涉及核酸序列整合到真核或原核細胞內，此時，前述核酸序列被整合到細胞的基因組(例如，染色體、質粒、色素體或線粒體DNA)內，轉換成自主複製子、或者暫時表達。以下，關於本發明進行說明。1.含有紅藻類的海^羊勿質的前處理工序過稈中，由 為了從瓊脂多糖體生成發酵性糖，作為分解為單糖類的前處理過程，可以利用大致化學方法和酶方法2種方法。首先，化學方法由於隨機地分解複合多糖類，因此不僅非常難以選擇性地生產所希望的發酵性單糖類，而且還有時生成阻礙所生成的糖的發酵的副產物。另外，在鹼處理或酸處理的情況下，排放相當數量的汙染物質，為了淨化這些汙染物質要花費高額費用，作為微生物可以利用的發酵性糖的生產方法是不適合的。作為酶方法，可以使用微生物生成的瓊脂糖酶來使瓊脂多糖體分解。作為可以用於這種方法的酶，可舉出 α瓊脂糖酶或β瓊脂糖酶。作為分解瓊脂多糖體的酶，α瓊脂糖酶將瓊脂多糖體中存在的α-1，3和β_1，4鍵中的α鍵水解，從而最終生成β -瓊脂二糖二糖體，β瓊脂糖酶切斷β鍵而生成α-新瓊脂二糖二糖體。在這種酶的前處理的過程中使用β瓊脂糖酶的情況下，最終產物是α-新瓊脂二糖，這是通常的微生物無法使用的非發酵性糖。為了將其最終轉換為作為發酵性糖的半乳糖的前處理工序，α -新瓊脂二糖水解酶是不可缺少的。2.圳飾剖旨錯側■■一_目前，由新瓊脂二糖的水解得到的3，6_脫水-L-半乳糖(3， 6-Anhydro-L-galactose)即使在商業上也沒有銷售，是只能購入D型的AHG的狀況，而且價格賣得很高(2009年，200磅(英國)/100mg, DextraLaboratories)。因此，可以使用本酶、由瓊脂糖大量生產高價的AHG。本發明的發明人等確認了海洋細菌saccharophagus degradans中的α -新瓊脂二糖水解酶的活性，並首次確認了該基因。另外，轉化到大腸桿菌來大量生產蛋白質，從而確認了 α-新瓊脂二糖水解酶的活性。使用新的α-新瓊脂二糖水解酶基因的酶活性來適用於含有瓊脂多糖體的海洋生物質的前處理工序中，並用於由前處理工序所得的α-新瓊脂二糖獲得包含半乳糖的發酵性糖。近年來，發現可以使用瓊脂多糖體作為碳源來進行生長的作為海洋細菌的 saccharophagus degradans, ^^^ΙΦWii^1J 1^ °為了發掘α -新瓊脂二糖水解酶的基因，首先確認交替單胞菌saccharophagus degradans中的α -新瓊脂二糖水解酶的活性。其次，通過染色體序列信息的分析，預測將交替單胞菌saccharophagus degradans的基因中屬於糖基水解酶家族32的基因(蛋白質資料庫Uniprot database ID :Q21HB2)作為α -新瓊脂二糖水解酶。實際上，為了確認蛋白質是否具有α-新瓊脂二糖水解酶的活性，在表達用載體中進行複製，在大腸桿菌中進行過表達，並分離精製蛋白質後，最終確認酶的活性。發明效果本發明中，報導了新的α -新瓊脂二糖水解酶的鹼基序列和蛋白質序列。特別地， 如上所述，近年來，在使用海藻類生物質的生物能源的生產中生物質向發酵性糖的酶轉化工序中，為了由瓊脂多糖體生產脫水半乳糖和半乳糖，必須使用α-新瓊脂二糖水解酶，因此會起到可以期待生物質前處理的成本削減和產量提高效果這樣的效果。另外，在生產生物燃料的酵母或細菌等中導入α-NABH基因，從而還可以期待由瓊脂(agar)或新瓊脂二糖直接生產生物燃料。進一步地，在由海洋生物質生產作為高附加價值的單糖類的半乳糖和 AHG的工序中也使用α -新瓊脂二糖水解酶，也可以進行有用物質的生產。


圖1為表示瓊脂多糖體的結構的圖。圖2為表示由S. degradans 2-40得到的細胞內助酶得到的反應生成物的薄膜色譜(Thin layer chromatography)的照片。條帶A 半乳糖的標樣；條帶B 與細胞內酶一起培養0. 25% (w/v)瓊脂糖而得的培養液；條帶C 與細胞內酶一起培養0. 3% (w/v)石花菜(紅藻類)而得的培養液。酶反應在30°C、20mM Tris-HCl (pH6. 8)中進行12小時。圖3表示本發明所發掘的基因的鹼基序列和蛋白質序列。圖4表示在大腸桿菌中表達並進行了精製的瓊脂糖酶；12% SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳；A 分子尺寸標識物、B α -新瓊脂二糖水解酶(α -neoagarobiose hydrolase)。圖5表示α -新瓊脂二糖水解酶(α -neoagarobiose hydrolase)和β瓊脂糖酶引起的瓊脂糖水解的產物的薄膜色譜照片。在30°C、20mM Tris-HCl (pH6. 8)中進行酶反應， 其基質濃度為0. 25 (w/v)。(a)半乳糖(b-c)反應混合物。A 半乳糖標準物質；B α -新瓊脂二糖水解酶反應產物(反應2小時)；C 新瓊脂二糖。圖6表示α -新瓊脂二糖水解酶和β瓊脂糖酶引起的瓊脂糖水解的產物通過液相色譜-質譜分析(Mass Spectrometry)來確認反應產物。使用質量分析儀的反應產物的質量分析結果(陰離子化而形成甲酸鹽(HC00-，分子量45))，如圖6所示，確認到半乳糖的質量為225. 1 (180+45)，脫水半乳糖為207. 1 (162+45)。因此，確認到水解酶的產物是半乳糖和脫水半乳糖。即，依靠來自基礎科學支援中心首爾分所的質量分析所得的結果是圖 6所示的質量分析圖譜，解析其結果，結果確認了酶的水解產物。圖7表示含有α-新瓊脂二糖水解酶的同源(homolog)蛋白質的模序(motif)分析結果。圖8表示α -新瓊脂二糖水解酶的特異的模序。圖9和圖10表示包含所有由圖8確認的α-新瓊脂二糖水解酶的特異的模序的蛋白質的序列。圖11表示使用由圖9和圖10所得的10個序列和α -新瓊脂二糖水解酶的胺基酸序列的多重序列比對。圖12表示在大腸桿菌中表達並進行了精製的來自大西洋假交替單胞菌的瓊脂糖酶；12% SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳；條帶A 分子尺寸標識物；條帶B : α -新瓊脂二糖水解酶。圖13表示在大腸桿菌中表達並進行了精製的天藍色鏈黴菌；12% SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳；條帶A α -新瓊脂二糖水解酶；條帶B 分子尺寸標識物。圖14是α-新瓊脂二糖水解酶(α-neoagarobiose hydrolase)和β瓊脂糖酶引起的瓊脂糖水解的產物的薄膜色譜照片。使酶反應在30°C、20mMTris-HCl (pH6. 8) 中進行2小時，其基質濃度為0.25(w/v)。㈧半乳糖(B-D)反應混合物。條帶A:半 ？LHfe^iItlM ；B glii saccharophagus degradans (saccharophagus degradans 2-40)的α -新瓊脂二糖水解酶反應產物；條帶C 來自大西洋假交替單胞菌 (Pseudoalteromonas atlantica T6c)的α -新瓊脂二糖水解酶反應產物；條帶D 來自天藍色鏈黴菌(Sti^ptomyces coelicolorA3)的α -新瓊脂二糖水解酶反應產物。
具體實施例方式以下，通過非限定的實施例來進一步詳細說明本發明。但下述實施例以說明本發明的目的而記載，本發明的範圍不受下述實施例限制。實施例1 來自saccharophagus degradan粗提取液的α -新瓊脂二糖水解酶的酶活性的確認為了確認saccharophagus degradan是否具有通過α -新瓊脂二糖水解生成作為單糖類的半乳糖和AHG的酶活性，按以下方法得到粗提取液並確認活性。使 saccharophagus degradan在含有海水鹽的培養基中培養直至對數增殖期的中期後，對 40ml的培養液進行離心分離，然後利用超聲波將細胞粉碎，得到粗提取液後，將利用β瓊脂糖酶分解瓊脂多糖體而得到的瓊脂糖作為基質，通過TLC觀察反應分解產物。A條帶是半
9乳糖標準物、B條帶是使0.25% (w/v)的瓊脂糖與saccharophagus degradan的細胞內助酶液反應而成的產物、C條帶是使0. 3% (w/v)作為紅藻類的乾燥的瓊脂粉與saccharophagus degradan的細胞內助酶液反應後，通過TLC分析產物的結果。通過與saccharophagus degradan的細胞內助酶液的反應，從瓊脂糖和瓊脂獲得的均是作為單糖類的AHG和半乳糖，而且確認到生成兩種糖類。因此得知，saccharophagus degradan具有在細胞內通過 α -新瓊脂二糖水解而生成作為單糖類的半乳糖和AHG的酶。本發明中發掘的基因的鹼基序列和蛋白質的胺基酸序列如圖3所示。_仿丨丨2:α-旨二 ■崖賄經精製的α-新瓊脂二糖水解酶的活性如下所述進行確認。首先，用β瓊脂糖酶處理瓊脂多糖體而生成作為酶處理的最終產物的新瓊脂二糖後，將其作為基質，通過TLC 確認α -新瓊脂二糖水解酶的反應產物(圖5的TLC結果)。確認到用α -新瓊脂二糖水解酶在TLC溶劑條件(正丁醇乙醇水=3 2 2)下處理過的基質被分解為推斷是半乳糖和脫水半乳糖的物質。在TLC上確認到半乳糖Rf值約為0. 46、α -新瓊脂二糖的Rf 值約為0. 58。為了測定通過α -新瓊脂二糖水解酶生成的產物的分子量，通過液相色譜-質譜分析儀(liquid chromatography-mass spectrometry)石角認了分子量。由 LC—MS 分析結果顯示脫水半乳糖(AHG)的分子量為162、半乳糖分子量為180。207. lm/z是甲酸(formic acid)與脫水半乳糖結合的狀態的分子量，可知脫水半乳糖被檢測出，179. lm/z和225. Im/ ζ是半乳糖以及與半乳糖結合的甲酸的分子量，可以確認半乳糖被檢測出。因此，如LC-MS 所示，可以確認作為新瓊脂二糖水解酶的反應產物的2種單糖類、即半乳糖和脫水半乳糖為反應產物(參照圖6)。^MM 3:α-新 SH 旨二解寺異的 jfelt序序歹 U通常，蛋白質模序是指在具有相同的分子功能的蛋白質中以一種模式表達的短的肽序列。這種蛋白質模序被大致進化地、正常地保存在蛋白質的全體序列中，並以模式化的胺基酸序列表示，所述模式化的胺基酸序列以包含活性部位的、代表分子功能的區域表不(Sigrist C. J. A. , Cerutti L. , Hulo N. , Gattiker A. , Falquet L. , Pagni Μ. , Bairoch A.,Bucher P. PROSITE :a documented database using patterns and profiles as motif descriptors. Brief Bioinform(《生物信息簡報》).3 :265-274 Q002) ；Sigrist C. J.A.，De Castro Ε. , Langendijk-Genevaux P. S. , LeSaux V. , Bairoch Α. , Hulo N. ProRule :a new database containing functional and structural information on PR0SITE profiles. Bioinformatics (《生物信息學》)· 2005Nov 1 ；21 (21) :4060-6. Epub 2005Aug 9 ；Timothy L. Bailey, Nadya Williams, Chris Misleh, and Wilfred W. Li, MEME-discovering and analyzing DNA and protein sequence motifs,Nucleic Acids Research (《核酸石if究》)， Vol. 34，pp.W369-W373,2006)。為了確認可以規定α -新瓊脂二糖水解酶的蛋白質模序的序列，首先，使用α -新瓊脂二糖水解酶的胺基酸序列作為模板，使用NCBI鹼基局部對準檢索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)來檢索公共資料庫，收集具有統計顯著性(Ε-value <0. 001)的60個(包含α-新瓊脂二糖水解酶的)蛋白質的胺基酸序列。使用這些序列，使用作為蛋白質模序檢索程序的 MEME(http//meme. sdsc. edu/meme4_l/intro. html ；使用參數mode = zero or one occurrence&nsites = 50, mwin = 8,除此以夕卜的條件使用default parameters ；Timothy L. Bailey,Nadya Williams,Chris Misleh,and Wilfred W. Li, MEME :discovering and analyzing DNA and protein sequence motifs, Nucleic Acids Research, Vol. 34，pp. W369-W373, 2006)來檢索針對α -新瓊脂二糖水解酶的特異的模序。其結果如圖7所示，確認到saccharophagus degradan的α -新瓊脂二糖水解酶具有在從具有相同性的蛋白質的分析所得的共50個模序中的13個特異的模序(1、2、 3、4、5、6、7、14、16、17、20、34、40)。因此，可以確認該13個特異的模序是代表α -新瓊脂二糖水解酶的活性的模序。其中模序7和34是一定出現在代表α-新瓊脂二糖水解酶的活性的蛋白質中的必須的2個模序，分別示於圖8和圖9 (通常，蛋白質模序使用正則表達式(regular expression)來表示，因此附圖上也以相同的方式來表現；Sigrist C. J. A.， Cerutti L. , Hulo N. , Gattiker A. , Falquet L. , Pagni M. , Bairoch A. , Bucher P. PR0SITE :a documented database using patterns and profiles as motif descriptors. Brief Bioinform (《生物信息簡報》).3 =265-274 (2002)) 0因此可以說，包含13個特異模序中的一部分、其中一定含有模序7和34的蛋白質具有α-新瓊脂二糖水解活性(參照圖 8)。確認了 在與α-新瓊脂二糖水解酶顯示出序列相同性的蛋白質中，含有這13個特異模序的一部分且一定含有模序7和34的蛋白質是10個(參照圖9和10)。前述含有在α -新瓊脂二糖水解酶中發現的13個特異模序的一部分且一定含有模序7和34的蛋白質在現有公共資料庫上發現了 10個。這些起源分別是大西洋假交替單胞菌(Pseudoalteromonas atlantica T6c)，微顫菌(Microscilla sp.PREl)，擬桿菌 (Bacteroides plebeius DSM17130，革蘭菌(Gramella forsetii)(菌株 KT080;3)，黃桿菌 (Flavobacteriales bacterium HTCC2170),類芽抱桿菌(Paenibacillus sp. oral taxon 786str. D14)，瘤胃球菌(Rum inococcus sp. 5139BFAA)，天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor A3)。各自的胺基酸序列示於圖10。圖11所示的序列是如上所述地在與α -新瓊脂二糖水解酶具有序列相同性的蛋白質中，選擇含有13個特異模序的一部分且一定含有模序7和34的10個蛋白質進行多重比對而成的序列，這些10個蛋白質的序列示於圖9和圖10。^MM 4;α-新SH旨二因的蛋白J1!序歹I丨的相同+牛的石角i人通過檢索來自saccharophagus degradan的水解酶的蛋白質序列的相同性來確認預計具有類似功能的候選基因。雖然候選基因的具體功能未知，但根據作為碳水化合物關聯的酶/蛋白質資料庫的CAZy (http //www. cazy. org)，可以確認它們均屬於糖苷水解酶(glycoside hydrolase family 32，GH32)。屬於GH32家族的蛋白質所具有的已知功能是轉化酶(irwertase) (EC 3.2.1.26)；內切菊粉酶 (endo-inulinase) (EC 3.2.1.7) ； β _2，6-果聚糖 6-左聚糖生物水解酶(β-2,6-fructan 6-levanbiohydrolase) (EC 3. 2. 1. 64)；內切左聚糖酶(endo-levanase) (EC 3. 2. 1. 65)； 外切菊粉酶(exo-inulinase) (EC 3.2.1.80)；果聚糖β _(2，1)-果糖苷酶/1-外水解酶(fructan β -(2，1)-fructosidase/l-exohydrolase) (EC 3. 2. 1. 153)；果聚糖 β -(2, 6)-果糖苷酶 /6-夕卜水解酶(frctan β -(2,6) -fructosidase/6-exohydrolase) (EC 3. 2. 1. 154)；蔗糖蔗糖 1-果糖基轉移酶(sucrose sucrose 1-fructosyltransferase) (EC 2. 4. 1. 99)；果聚糖果聚糖I-果糖基轉移酶(fructan fructan1-fructosyltransferase) (EC2. 4. 1. 100)；蔗糖果聚糖 6-果糖基轉移酶(sucrose fructan 6-fructosyltransferase) (EC 2. 4. 1. 10)；果聚糖果聚糖 6G-果糖基轉移酶 (fructan fructan 6G_fructosyltransferase) (EC2. 4. 1. 243)；左聚糖果糖基轉移酶 (levan ffrctosyltransferase) (EC 2.4.1.-)。因此，屬於 GH32 家族的一部分蛋白質具有與α -新瓊脂二糖水解酶相同的分子功能，這在本發明開始已報導。JA^: § saccharophagus degradan (saccharophagus degradan 2-40)白勺 α ~ 0 脂二糖水解酶(以下稱為α-ΝΑΒΗ)的胺基酸序列的相同性的檢索(BLAST檢索-參照附件)獲得的序列中，如果通過BLAST的E-value羅列具有50%以上的相同性的蛋白質序列， 則如下所示(以下使用Uniprot資料庫序號，括弧內是來源微生物和％相同性)。1. Q15UF2(大西洋假交替單胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)(菌株 T6c/ BAA-1087) ,70% )，2.Q93PB3(微顫菌(Microscilla sp. PRE 1. ) ,59% ),3. B4CY74(擬桿菌(Bacteroidesplebeius DSM17135. ) ,60% )，4·Α0Μ245(革蘭菌(Gramella forsetii)(菌株 KT0803) · ,56% ),5. A4AR39(黃桿菌(Flavobacteriales bacterium HTCC2170.) ,57% ),6. C6J3P3(類芽孢桿菌(Paenibacillus sp. oral taxon 786str. D14. ) ,58% ),7. C6JDD4(瘤胃球菌(Ruminococcus sp. 5_1_39BFAA.) ,58% ),8. C6J313(類芽孢桿菌(Paenibacillus sp. oral taxon 786str. D14. ) ,57% ),9. Q15XP8(大西洋假交替單胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)(菌株 T6c/ BAA-1087) ,55% )，10. Q9RKF6 (天藍色鏈黴菌(Str印tomyces coelicolor), 56% )實施例5 大腸桿菌中的表達和大小的確認分別複製前述獲得的具有50%相同性以上的序列相同性的蛋白質中具有最高序列相同性的來自大西洋假交替單胞菌O^seudoalteromonas atlantica T6c)的蛋白質 (Q15UF2)和最低的來自天藍色鏈黴菌Gtr印tomyces coelicolorA3)的蛋白質019RKF6)， 確認是否具有α-NABH活性。首先，將使它們密碼化的基因的鹼基序列分別插入作為大腸桿菌表達載體的pET21a(N0Vagen，美國)中(以下，將含有來自大西洋假交替單胞菌的 α -ΝΑΒΗ基因的表達載體稱為「pI^sAGAJ」、將含有來自天藍色鏈黴菌的α -ΝΑΒΗ基因的表達載體稱為pScAGAJ)。為了確認重組α -ΝΑΒΗ在大腸桿菌中成功表達，使pPsAGAJ和pScAGAJ 轉化為作為表達用大腸桿菌的Ε. coli BL21(DE3)後，塗抹在含有50mg/L濃度的安匹西林抗生素的固體培養基上。將通過前述轉化所得的菌落接種在添加有50mg/L濃度的安匹西林抗生素的Luria-Bertani (LB)培養基上後，在37°C振蕩培養一天，確保菌體。之後，為了確認表達，將轉化體接種在添加有50mg/L濃度的安匹西林抗生素的Luria-Bertani (LB) 培養基上後，在37°C振蕩培養直至0D600 = 0. 5 1. 0，以0. 5mM/L的濃度添加IPTG，在 180rpm下誘導表達4小時。培養液經離心分離(12000rpm、4°C、10分鐘)回收菌體，回收的菌體在20mM的Tris緩衝液(Tris_HCl，pH 7. 4)中進行懸浮，利用超聲波粉碎機進行粉碎後，通過12%的SDS-PAGE來確認大小。將確認了大小的已粉碎的懸浮液進行15分鐘離心分離，使用上清液作為助酶液。
_3] ^MM 6;α-新SH旨二解舌件的石角i人
經精製的α-NABH的活性如下所述進行確認。首先，用β瓊脂糖酶處理瓊脂多糖體，生成作為酶處理的最終產物的新瓊脂二糖後，將其作為基質，通過TLC確認α -ΝΑΒΗ的反應產物。通過TLC的確認是在矽膠60TLC平板上滴下1 μ 1反應液，並在TLC溶劑條件 (正丁醇乙醇水=3 2 2)下展開。展開的TLC平板用作為處理溶液的硫酸(乙醇中有10% (ν/ν)硫酸)處理1次後，進行乾燥，經1次處理的平板再用作為2次處理溶液的間萘二酚(乙醇中有0.2% (w/v)間萘二酚)處理。這樣處理的TLC平板乾燥後，進行加熱。前述實施例4 6的結果如下所述。來自使用作為表達用菌株的E.coli BL21(DE3)進行了轉化的大西洋假交替單胞菌和天藍色鏈黴菌的α -ΝΑΒΗ的表達和大小的確認是通過12%的SDS-PAGE進行確認的。來自大西洋假交替單胞菌和天藍色鏈黴菌的α-NABH的預期分子量分別為40. 7kDa和 41. IkDa左右，確認與預期分子量相同(圖12、圖13)。另外，為了確認分解產物，使用作為標準物質的D-半乳糖來確認預期分解產物。 確認到作為用α-NABH處理過的二糖類的新瓊脂二糖被分解為推斷是已確認具有與D-半乳糖相同的Rf值的半乳糖和脫水半乳糖的物質(圖14)。
權利要求
1.一種α -新瓊脂二糖水解酶，其選自由序列號1 序列號11構成的組。
2.如權利要求1所述的α-新瓊脂二糖水解酶，其特徵在於，所述α-新瓊脂二糖水解酶包含序列號4的胺基酸序列。
3.如權利要求2所述的酶，其特徵在於，所述酶從saccharophagusdegradans獲得。
4.一種編碼權利要求2所述的α-新瓊脂二糖水解酶的基因。
5.如權利要求4所述的基因，其特徵在於，所述基因記載在序列號12中。
6.如權利要求4或5所述的基因，其特徵在於，所述基因從saccharophagusdegradans 獲得。
7.—種製造權利要求2所述的α-新瓊脂二糖水解酶的方法，包括培養微生物 saccharophagus degradans，從培養液中提取權利要求2的α -新瓊脂二糖水解酶。
8.—種製造半乳糖或脫水半乳糖的方法，包括用權利要求1或2所述的α-新瓊脂二糖水解酶分解α -新瓊脂二糖，並從所述分解物中提取半乳糖或脫水半乳糖。
9.如權利要求8所述的製造半乳糖或脫水半乳糖的方法，所述α-新瓊脂二糖水解酶 hX sacharophagus degradans
10.一種α-新瓊脂二糖水解酶，其必須包含圖8所示的模序7和34。
全文摘要
本發明涉及新的α-新瓊脂二糖水解酶(α-neoagarobiose hydrolase)及使用其獲得單糖類的方法。
文檔編號C12P19/12GK102405282SQ201080014617
公開日2012年4月4日 申請日期2010年3月24日 優先權日2009年3月27日
發明者崔仁傑, 李世榮, 金京憲 申請人:高麗大學校產學協力團