嵌合型豬圓環病毒pcv1－2及其構建方法、用途的製作方法

2023-09-14 04:40:40 2

專利名稱：嵌合型豬圓環病毒pcv1－2及其構建方法、用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及畜牧獸醫技術領域。
背景技術：
斷奶仔豬多系統衰竭綜合症(Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)，它是一種新的傳染病。目前世界上許多國家和地區都有該病的報導，給養豬業造成嚴重的經濟損失。該病多發於5～12周齡的仔豬。臨床症狀以進行性消瘦，行動遲緩，呼吸困難，黃疸，皮膚蒼白為特症，有的豬有腹瀉症狀。致死率和死亡率隨飼養條件、爆發的階段不同而不同，總體上來說，致死率可達10-30％。斷奶仔豬多系統衰竭綜合症(PMWS)在我國多數省市已成蔓延之勢。目前，該病的控制主要依靠生物安全措施，尚無疫苗可供使用。
豬圓環病毒(Porcine circovirus，PCV)具有PCV1和PCV2兩種基因型。已經研究表明，豬圓環病毒PCV1對豬無致病性，但能產生血清抗體，並且在調查的豬群中普遍存在。而豬圓環病毒PCV2對豬只具有較強的易感性，可經口腔、呼吸道途徑感染不同年齡的豬。現有證據表明，懷孕母豬感染豬圓環病毒PCV2後，可經胎盤垂直傳播感染仔豬。豬圓環病毒PCV2是引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合症(PMWS)的主要病原。PCV有7個開放閱讀框(ORF)，其中ORF2編碼病毒的Cap蛋白，構成病毒的核衣殼。PCV兩種血清型的Cap蛋白上存在共同的抗原決定簇，但兩者沒有抗原交叉性。

發明內容
本發明目的是構建一種既無致病性，又能表達保護性抗原的嵌合型豬圓環病毒PCV1-2。
本發明的嵌合豬圓環病毒PCV1-2由一段缺失PCV1-ORF2的基因組(pSK-PCV1△ORF2)及一段PCV2-ORF2基因組連接構成，其長度為1767bp，DNA序列為accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcgtca gtgaaaatgc caagcaagaa 60aagcggcccg caaccccata agaggtgggt gttcaccctt aataatcctt ccgaggagga 120gaaaaacaaa atacgggagc ttccaatctc cctttttgat tattttgttt gcggagagga 180aggtttggaa gagggtagaa ctcctcacct ccaggggttt gcgaattttg ctaagaagca 240gacttttaac aaggtgaagt ggtattttgg tgcccgctgc cacatcgaga aagcgaaagg 300aaccgaccac cggaataaag aatactgcag taaagaaggc cacatactta tcgagtgtgg 360agctccgcgg aaccagggga agcgcagcga cctgtctact gctgtgagta cccttttgga 420gacggggtct ttggtgactg tagccgagca gttccctgta acgtatgtga gaaatttccg 480
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本發明還為上述嵌合型豬圓環病毒PCV1-2提供了一種構建方法以豬圓環病毒PCV2的PCV2-ORF2替代豬圓環病毒PCV1的PCV1-ORF2，構建嵌合型豬圓環病毒PCV1-2。
通過以下步驟實現1)以PCR方法分別擴增豬圓環病毒PCV2的PCV2-ORF2基因組、豬圓環病毒PCV1全基因組；2)用分子生物學方法將豬圓環病毒PCV2的PCV2-ORF2克隆入缺失PCV1-ORF2的基因組pSK-PCV1△ORF2中，將所得基因串聯入pSK載體。
其中，擴增豬圓環病毒PCV2的PCV2-ORF2基因組的引物為5』-AGGTTATAAGTGGTGGGGGGTCTTTAAGATTAA-3』5』-GGAAACGTTACCGCAGAAGAAGACACC-3』。
擴增豬圓環病毒PCV1全基因組的引物為5』-TTTGGTACCCGAAGGCCGATT-3』5』-ATTGGTACCTCCGTGGATTGTTCT-3』。
擴增缺失PCV1ORF2的基因組(pSK-PCV1△ORF2)的引物為5』-GAAGTTAACCCTAAATGAATAAAAATAAAAACCATTACG-3』5』-GGTGGCGCCTCCTTGGATACGTCATCCTATAAAAGTG-3』。
將PCV1全基因組克隆入pSK載體，即pSK-PCV1；以pSK-PCV1質粒為模板，採用PCR方法，擴增缺失PCV1-ORF2的基因組(pSK-PCV1△ORF2)；將豬圓環病毒PCV2的PCV2-ORF2基因組和豬圓環病毒PCV1全基因組的PCR產物分別克隆入轉移載體，用特定的限制性內切酶(Hpa I和Nar I、Psi I和Acl I)進行酶切後，用T4DNA連接酶連接兩段基因組，得到pSK-sPCV1-2DNA克隆；最後從pSK-sPCV1-2DNA克隆中用Kpn I限制性內切酶切下整個PCV1△ORF2-PCV2-ORF2基因組，經T4DNA連接酶連接形成串聯二聚體，得到pSK-dPCV1-2。
本發明還為嵌合型豬圓環病毒PCV1-2提供一種用途將嵌合型豬圓環病毒PCV1-2感染性DNA克隆免疫剖腹產並剝奪初乳仔豬，用於防治斷奶仔豬多系統衰竭綜合症。
本發明以致病性PCV2的ORF2替代PCV1的ORF2，構建PCV1-2感染性DNA克隆。分別轉染Dulac細胞，驗證其在細胞中的複製能力。PCV1-2感染性DNA克隆免疫剖腹產並剝奪初乳仔豬，測定其針對PCV2的體液免疫應答。


圖1為pSK-dPCV1-2的圖譜；圖2為嵌合型豬圓環病毒PCV1-2的技術構建路線圖譜；圖3為pSK-sPCV1-2、pSK-dPCV1-2DNA克隆酶切鑑定圖譜；圖4為Dulac細胞的螢光圖；圖5為接種PCV2的Dulac細胞螢光圖；圖6為轉染PCV1-2的Dulac細胞螢光圖。
具體實施例主要材料病毒豬圓環病毒1型(PCV1)，PK15細胞中分離鑑定，由揚州大學農業部畜禽傳染病學重點開放實驗室保存。
載體和菌株pBluescript SK質粒載體(簡稱pSK載體)和宿主菌E.coli DH5α均由揚州大學農業部畜禽傳染病學重點開放實驗室保存。(pSK載體可由美國Stratagene公司購得)一、構建嵌合型豬圓環病毒PCV1-2質粒1、根據GeneBank中豬圓環病毒PCV2的基因序列，設計含特異酶切位點(Psi I、Acl I)的引物，採用PCR方法擴增長度為700bp的PCV2-ORF2基因組。
其中，擴增豬圓環病毒PCV2的PCV2-ORF2基因組的引物為
5』-AGGTTATAAGTGGTGGGGGGTCTTTAAGATTAA-3』5』-GGAAACGTTACCGCAGAAGAAGACACC-3』2、根據GeneBank中PCV1的基因序列，設計含特異酶切位點(Kpn I)的引物，採用PCR方法擴增長度為4700bp的PCV1全基因組。
擴增豬圓環病毒PCV1全基因組的引物為5』-TTTGGTACCCGAAGGCCGATT-3』5』-ATTGGTACCTCCGTGGATTGTTCT-3』3、將擴增的豬圓環病毒PCV1全基因組克隆入pSK載體，形成長度為4700bp的pSK-PCV1。
4、以pSK-PCV1質粒為模板，採用PCR方法，擴增缺失PCV1-ORF2的基因組(pSK-PCV1△ORF2)。擴增缺失PCV1-ORF2的基因組(pSK-PCV1△ORF2)的引物含特異酶切位點(Hpa I、Nar I)，為5』-GAAGTTAACCCTAAATGAATAAAAATAAAAACCATTACG-3』5』-GGTGGCGCCTCCTTGGATACGTCATCCTATAAAAGTG-3』5、將PCV2-ORF2基因組和PCV1全基因組的PCR產物分別克隆入轉移載體，分別用特定的限制性內切酶Psi I和Acl I、Hpa I和Nar I進行酶切後，連接兩段基因組，得到長度為4700bp的pSK-sPCV1-2DNA克隆。
6、從pSK-sPCV1-2DNA克隆中用Kpn I限制性內切酶切下整個PCV1△ORF2-PCV2-ORF2基因組，經T4DNA連接酶連接形成串聯二聚體，即pSK-dPCV1-2，PCV1-2感染性克隆構建完成，長度為6400bp。
由圖3表明通過以上步驟，已成功地完成整個構建過程。
在圖3中1為pSK-dPCV1-2Sac I酶切2為pSK-dPCV1-2Kpn I酶切3為Hind III+EcoR I Marker4為pSK-sPCV1-2Sac I酶切5為pSK-sPCV1-2Kpn I酶切二、PCV1-2感染性DNA克隆在Dulac細胞中的表達1、材料細胞Dulac細胞(無PCV1汙染)，由揚州大學農業部畜禽傳染病學重點開放實驗室保存。
實驗動物9周齡的剖腹產並剝奪初乳仔豬12頭豬抗PCV2陽性血清由浙江大學周繼勇教授惠贈。
轉染試劑Lipofectamine 2000，購自Life Technologies公司。
兔抗豬FITC標記的螢光二抗，購自Sigma公司。
2、方法2.1DNA在Dulac細胞中轉染2.2間接免疫螢光試驗DNA轉染後的Dulac細胞進行固定，做間接免疫螢光試驗。未轉染的Dulac細胞和接種PCV2的Dulac細胞分別作為陰性和陽性對照。
3、結果如圖4，在Dulac細胞的螢光圖片中無螢光。
如圖5，在接種PCV2的Dulac細胞螢光圖片中可見細胞內螢光。
如圖6，在轉染PCV1-2的Dulac細胞螢光圖片中同樣可見典型的細胞內螢光。
4、免疫效力試驗應用在剖腹產並剝奪初乳仔豬體內進行免疫效力試驗(見下表)，證明所研製的嵌合型PCV1-2感染性DNA克隆可以有效地刺激機體產生免疫應答並提供免疫保護。
剖腹產並剝奪初乳仔豬免疫嵌合型PCV1-2DNA克隆後血清中產生針對PCV2抗體的檢測結果

*dpv免疫後天數(days post-vaccination，dpv)
權利要求
1.嵌合型豬圓環病毒PCV1-2，其特症在於由一段缺失PCV1-ORF2的基因組(pSK-PCV1ΔORF2)及一段PCV2-ORF2基因組連接構成，其長度為1767bp，DNA序列為accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcgtca gtgaaaatgc caagcaagaa 60aagcggcccg caaccccata agaggtgggt gttcaccctt aataatcctt ccgaggagga 120gaaaaacaaa atacgggagc ttccaatctc cctttttgat tattttgttt gcggagagga 180aggtttggaa gagggtagaa ctcctcacct ccaggggttt gcgaattttg ctaagaagca 240gacttttaac aaggtgaagt ggtattttgg tgcccgctgc cacatcgaga aagcgaaagg 300aaccgaccac cggaataaag aatactgcag taaagaaggc cacatactta tcgagtgtgg 360agctccgcgg aaccagggga agcgcagcga cctgtctact gctgtgagta cccttttgga 420gacggggtct ttggtgactg tagccgagca gttccctgta acgtatgtga gaaatttccg 480cgggctggct gaactttaga aagtgagcgg gaagatgcag cagcgtgatt ggaagacagc 540tgtacacgtc atagtgggcc cgcccggttg tgggaagagc cagtgggccc gtaattttgc 600tgagcctagc gacacctact ggaagcctag tagaaataag tggtgggatg gatatcatgg 660agaagaagtt gttgttttgg atgattttta tggctggtta ccttgggatg atctactgag 720actgtgtgac cggtatccat tgactgtaga gactaaaggc ggtactgttc cttttttggc 780ccgcagtatt ttgattacca gcaatcaggc cccccaggaa tggtactcct caactgctgt 840cccagctgta gaagctctct atcggaggat tactactttg caattttgga agactgctgg 900agaacaatcc acggaggtac ccgaaggccg atttgaagca gtggacccac cctgtgccct 960tttcccatat aaaataaatt actgagtctt ttttgttatc acatcgtaat ggtttttatt 1020tttattcatt tagggtttaa gtggggggtc tttaagatta aattctctga attgtacata 1080catggttaca cggatattgt attcctggtc gtatatactg ttttcgaacg cagtgccgag 1140gcctacgtgg tctacatttc cagcagtttg tagtctcagc cacagctgat ttcttttgtt 1200gtttggttgg aagtaatcta tagtggaatc taggacaggt ttgggggtaa agtagcggga 1260gtggtaggag aagggctggg ttatggtatg gcgggaggag tagtttacat aggggtcata 1320ggtgagggct gtggcctttg ttacaaagtt atcatctaga ataacagcac tggagcccac 1380tcccctgtca ccctgggtaa tcggggagca gggccagaat tcaaccttaa cttttcttat 1440tctgtagtat tcaaagggca cagagcgggg gtttgagccc cctcctgggg gaagaaagtc 1500attaatattg aatcgcatca tgtccaccgc ccaggagggc gttttgactg tggttcgctt 1560gatagtatat ccgaaggtgc gggagaggcg ggtgttgaag atgccatttt tccttctcca 1620gcggtaacgg tggcgggggt ggacgagcca ggggcggcgg cggaggatct ggccaagatg 1680gctgcggggg cggtgtcttc ttctgcggta acgcctcctt ggatacgtca tcctataaaa 1740gtgaaagaag tgcgctgctg tagtatt。
2.嵌合型豬圓環病毒PCV1-2的構建方法，其特症在於以豬圓環病毒PCV2的PCV2-ORF2替代豬圓環病毒PCV1的PCV1-ORF2，構建嵌合型豬圓環病毒PCV1-2。
3.根據權利要求2所述嵌合型豬圓環病毒PCV1-2的構建方法，其特症在於通過以下步驟實現
1)以PCR方法分別擴增豬圓環病毒PCV2的PCV2-ORF2基因組、豬圓環病毒PCV1全基因組；
2)用分子生物學方法將豬圓環病毒PCV2的ORF2克隆入缺失PCV1-ORF2的基因組pSK-PCV1ΔORF2中，將所得基因串聯入pSK載體。
4.根據權利要求3所述嵌合型豬圓環病毒PCV1-2的構建方法，其特症在於擴增豬圓環病毒PCV2的ORF2基因組的引物為5，-AGGTTATAAGTGGTGGGGGGTCTTTAAGATTAA-3，5，-GGAAACGTTACCGCAGAAGAAGACACC-3，。
5.根據權利要求3所述嵌合型豬圓環病毒PCV1-2的構建方法，其特症在於擴增豬圓環病毒PCV1全基因組的引物為5，-TTTGGTACCCGAAGGCCGATT-3，5，-ATTGGTACCTCCGTGGATTGTTCT-3，。
6.根據權利要求3所述嵌合型豬圓環病毒PCV1-2的構建方法，其特症在於擴增缺失PCV1-ORF2的基因組(pSK-PCV1ΔORF2)的引物為5，-GAAGTTAACCCTAAATGAATAAAAATAAAAACCATTACG-3，5，-GGTGGCGCCTCCTTGGATACGTCATCCTATAAAAGTG-3，。
7.根據權利要求3所述嵌合型豬圓環病毒PCV1-2的構建方法，其特症在於先將PCV1全基因組克隆入pSK載體，得到pSK-PCV1；再將豬圓環病毒PCV2的PCV2-ORF2基因組和豬圓環病毒PCV1全基因組的PCR產物分別克隆入轉移載體，用特定的限制性內切酶進行酶切後，用T4DNA連接酶連接兩段基因組，得到pSK-sPCV1-2 DNA克隆；最後從pSK-sPCV1-2 DNA克隆中用Kpn I限制性內切酶切下整個PCV1ΔORF2-PCV2-ORF2基因組，經T4DNA連接酶連接形成串聯二聚體，得到pSK-dPCV1-2。
8.根據權利要求7所述嵌合型豬圓環病毒PCV1-2的構建方法，其特症在於所述特定的限制性內切酶為Hpa I和Nar I、Psi I和Acl I。
9.嵌合型豬圓環病毒PCV1-2的用途，其特症在於將嵌合型豬圓環病毒PCV1-2感染性免疫剖腹產並剝奪初乳仔豬，用於防治斷奶仔豬多系統衰竭綜合症。
全文摘要
嵌合型豬圓環病毒PCV1－2及其構建方法、用途，涉及畜牧獸醫技術領域。以豬圓環病毒PCV2的PCV2－ORF2替代豬圓環病毒PCV1的PCV1－ORF2，構建由一段缺失PCV1－ORF2的基因組(pSK－PCV1ΔORF2)及一段PCV2－ORF2基因組連接構成的長度為1767bp的嵌合型豬圓環病毒PCV1－2。將嵌合型豬圓環病毒PCV1－2感染性免疫剖腹產並剝奪初乳仔豬，用於防治斷奶仔豬多系統衰竭綜合症。
文檔編號C12N7/01GK1693455SQ20051003882
公開日2005年11月9日 申請日期2005年4月8日 優先權日2005年4月8日
發明者高崧, 劉秀梵, 宋益, 姚月琴 申請人:揚州大學