靶向egf受體的單克隆抗體175及其衍生物和用途的製作方法

2023-09-14 18:55:20

專利名稱：靶向egf受體的單克隆抗體175及其衍生物和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗體、尤其是抗體175及其片段，其與EGF受體、尤其是擴增或過表達 的表皮生長因子受體(EGFR)和EGFR的de2-7EGFR截短體結合。這些抗體可用於診斷和治 療癌症。本發明的抗體也可用於與化療劑或抗癌劑和/或與其他抗體或其片段聯合治療。
背景技術：
增生性疾病、尤其是癌症的化學治療通常依賴於利用人體或動物體內靶標增殖細 胞和其他正常細胞的差別。例如，許多化學製劑設計成被迅速複製的DNA吸收，由此破壞 DNA的複製和細胞分裂的過程。另一種方法是鑑定在已發育的人體組織中正常不表達的腫 瘤細胞或其他異常細胞表面的抗原，例如腫瘤抗原或胚胎抗原。此類抗原可用結合蛋白例 如抗體靶向，其可以阻斷或中和該抗原。此外，所述結合蛋白、包括抗體及其片段可遞送毒 性劑或可以在腫瘤位點直接或間接的激活毒性劑的其他物質。EGFR是腫瘤靶向抗體治療的很有吸引力的靶標，因為它在許多上皮腫瘤類型 中過表達(Voldborg, B. R.，等(1997) Ann 0ncol8 1197-206 ；den Eynde, B. and Scott, Α. Μ. (1998) Tumor Antigens. In :P. J. Delves and I. M. Roitt (eds. ), Encyclopedia of Immunology, SecondEdition edition, pp. 2424-31. London :Academic Press)。 此夕卜， EGFR的表達與許多腫瘤類型中的不良預後有關，包括胃瘤、結腸瘤、膀胱瘤、乳瘤、前列腺 瘤、子宮內膜瘤、腎瘤和腦瘤(例如神經膠質瘤)。因此，文獻報導了許多EGFR抗體，某些 正在進行臨床評價(Baselga, J.，等(2000) J Clin Oncol. 18 904 ；Faillot, T.，等(1996) Neurosurgery 39 478-83 ；Seymour, L. (1999)Cancer Treat Rev 25:301-12)。在頭頸 癌、鱗狀上皮細胞肺癌、腦神經膠質瘤和惡性星形細胞瘤患者中使用EGFR單抗研究的結 果是令人鼓舞的。大多數EGFR抗體的抗腫瘤活性通過其阻斷配體結合的能力得到提升 (Sturgis, E.M.，等(1994)Otolaryngol Head Neck Surg 111:633_43 ；Goldstein, N. I.， 等(1995)Clin Cancer Res 1 :1311_8)。此類抗體可通過調節細胞增殖和抗體依賴性的免 疫功能(例如補體激活)起作用。然而，這些抗體的使用可能受到具有高內源性EGFR水平 的器官例如肝和皮膚的吸收限制(Baselga, J.，等(2000) J Clin Oncol. 18 904 ；Faillot, T.，等(1996)Neurosurgery39 :478_83)。相當一部分含有EGFR基因擴增(即多個EGFR基因拷貝)的腫瘤同時共表達該 受體的截短形式(Wikstrand, C. J.，等(1998) J Neurovirol 4 148-58)，稱為 de2_7EGFR、 Δ EGFR 或△ 2-7 (本文中可交換使用的術語)(Olapade-Olaopa，Ε. 0.，等(2000) Br J Cancer 82 186-94)。de2_7EGFR中該可見的重排產生缺少801個核苷酸的框架內成熟 mRNA,其跨越外顯子 2-7 (Wong，A. J.，等(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89 :2965_9 ； Yamazaki, H.，等(1990) Jpn J Cancer Res 81 :773_9 ；Yamazaki, H.，等(1998)Mol Cell Biol 8 :1816-20 ;Sugawa，N.，等(1990)Proc Natl Acad Sci USA 87:8602-6)。相應的 EGFR蛋白具有包括胞外結構域殘基6-273的267個胺基酸的缺失，和在融合接頭處的新的 甘氨酸殘基(Sugawa, N.，等(1990)Proc Natl Acad Sci USA 87 :8602_6)。該缺失以及甘 氨酸殘基的插入在缺失接口處產生了獨特的接合肽。de2-7EGFR在多種腫瘤類型中報導，包括神經膠質瘤、乳瘤、肺瘤、卵巢瘤和前列腺瘤(Wikstrand，C. J.，等(1997)Cancer Res. 57 4130-40 ；Olapade-Olaopa, Ε.0.,等(2000)Br J Cancer 82 186-94 ；ffikstrand, C. J., 等(1995) Cancer Res 55 3140~8 ；Garcia de Palazzo, I.E.,等(1993) Cancer Res 53: 3217-20)。儘管該截短的受體不結合配體，其具有低組成性活性，為在裸小鼠中作為腫瘤 異種移植物生長的神經膠質瘤細胞提供了顯著的生長有利條件(Nishikawa，R.，等(1994) Proc Natl Acad Sci USA 91 :7727_31，1994.)，並且能夠轉化 NIH3T3 細胞和 MCF-7 細胞 (Batra, S. K.，等(1995)Cell Growth Differ 6:1251-9)。De2_7EGFR 在神經膠質瘤細胞 中利用的細胞機制未完全確定，但有報導包括減少的細胞凋亡和小幅增強的增殖(Nagane， Μ.，等(1996) Cancer Res 56 :5079_86)。由於該截短受體的表達局限於腫瘤細胞，其代表了抗體治療的高特異性靶點。 因此，許多實驗室報導了對該獨特的de2-7EGFR肽特異性的多克隆和單克隆抗體的製備 (ffikstrand, C. J.，等(1998) JNeurovirol 4 148-58 ；Humphrey, P. Α.，等(1990) Proc Natl Acad SciUSA 87 :4207_11 ；Okamoto, S.，等(1996)BrJ Cancer 73 1366-72 ；Hills, D.，等 (1995) Int J Cancer 63:537—43)。經用該獨特的de2_7肽免疫後分離的一系列小鼠單抗 均顯示對該截短受體的選擇性和特異性，以及靶向裸小鼠中生長的de2-7EGFR陽性異種移 植物(ffikstrand, C. J.，等(1995) Cancer Res 55 :3140_8 ；Reist, C. J.，等(1997) Cancer Res 57 1510-5；Reist, C. J.，等(1995)Cancer Res 55 :4375_82)。然而，de2-7EGFR抗體的一個潛在的缺點是僅部分顯示EGFR基因擴增的腫瘤同 時表達de2-7EGFR。因此，de2_7EGFR特異性抗體僅在一部分EGFR陽性腫瘤中有效。因此 儘管EGFR抗體活性的現有證據是令人鼓舞的，其仍然具有上述反映的應用範圍和效能的 觀察到的限制。因而需要開發具有廣泛腫瘤效能的抗體和類似製劑，這也是本發明所要實 現的目標。此外，不存在擴增、過表達或突變時不靶向正常組織和EGFR的抗體尤其有用。 W002092771和W005081854已描述了一個這樣的抗體——單克隆抗體mAb806。其他此類抗 體是需要和期望的。本文中參考文獻的引用不應被解釋為承認其構成本發明的現有技術。發明概述本發明的抗體抗體175及其片段或單體、重組體或來源於其的雜合抗體識別這樣 的EGFR表位，其發現於致瘤、過度增殖或異常細胞，在正常或野生型細胞中則檢測不到。本 發明的抗體進一步用本文所述抗體mAb 175加以說明。本發明描述了靶向與前文所述單克隆抗體(mAb) 806 (描述於W002092771和 W005081854中)同種EGF受體表位的抗體。mAb 175的互補決定區(⑶Rs)、抗原結合的最 重要胺基酸與806抗體高度同源，僅有幾個胺基酸的區別。抗體與其靶抗原的結合由其重鏈和輕鏈的互補決定區(CDRs)介導。有3個CDR 區⑶R1、⑶R2和⑶R3，因此，基於mAb 175重鏈或輕鏈、優選兩者的⑶R區的抗體是用於診 斷和治療(包括體內治療)的有效抗體。基於所鑑定的mAbl75抗體⑶R的抗體可有效用 於靶向含擴增的EGFR的腫瘤，而與其de2-7EGFR狀態無關。由於mAb 175不與正常、野生 型受體顯著結合，其在正常組織中將沒有顯著吸收，這就避免了現有研發的EGFR抗體的限 制。已測定了靶向EGF受體的單克隆抗體175序列，該抗體的⑶R區具有

圖1所示的胺基酸序列。這裡提供了各輕鏈和重鏈的⑶R。Abl75輕鏈⑶R相應於⑶Rl(SEQ ID NO: 1)、CDR2(SEQ ID NO 2)和 CDR3 (SEQ ID NO :3)。Abl75 重鏈 CDR 相應於 CDRl (SEQ ID NO: 4)、CDR2(SEQ ID NO 5)和 CDR3(SEQ ID NO :6)。類似於抗體806，本發明的175抗體同時識別擴增的野生型EGFR和de2_7EGFR， 還結合與de2-7EGFR突變的獨特接合肽不同的表位(接合肽LEEKKGNYVVTDH (SEQ ID NO 13))。Mabl75結合A431細胞表面，其具有EGFR基因的擴增但不表達de2-7EGFR。重要的 是，mAbl75像mAb 186—樣不顯著結合正常組織例如肝和皮膚，其表達高水平的內源性野 生型(wt)EGFR，但其中的EGFR無異常表達或擴增。雖然在表位結合，免疫組化染色等方面與mAb806具有非常類似的性質，mAbl75顯 示在治療表達de2-7EGF受體的人神經膠質瘤異種移植物中具有比mAb806更高的效力。一方面，本發明提供了能結合抗原的抗體，其中所述抗體包含多肽結合結構域，其 包含基本上如Abl75輕鏈的⑶R(包括⑶R1、⑶R2和/或⑶R3)所列出的，包括如SEQ ID NOs 1-3中所示的胺基酸序列。另一方面，本發明提供了能結合抗原的抗體，其中所述抗體 包含多肽結合結構域，其包含基本上如Abl75重鏈的⑶R(包括⑶R1、⑶R2和/或⑶R3)所 列出的，包括如SEQ ID NOs :4-6中所示的胺基酸序列。因此，本發明涉及重組、人源化、嵌 合、鑲蓋(veneered)或其他此類抗體或抗體肽，包括包含Abl75重鏈和/或輕鏈⑶R的結 構域肽。這些抗體的輕鏈可包括如SEQ ID NOS 1-3所示的序列，重鏈可包括如SEQ IDNOS 4-6所示的序列。在一個優選的實施方案中，結合結構域為人抗體框架攜帶。在其他方面，本發明提供了分離的核酸，其包含編碼上述定義抗體的序列，以及制 備本發明抗體的方法，其包括在一定條件下表達所述核酸以表達所述結合成員，以及回收 該結合成員。本發明的又一個方面是此類抗體與其他抗體，例如結合EGFR的抗體，優選與之結 合的抑制性配體，的組合物。這些組合物可為「一罐」雞尾酒、試劑盒等，優選配製成易於施 用的形式。根據本發明的抗體或其片段可用於治療或診斷人或動物體的方法中，例如治療人 類患者腫瘤的方法，其包括向所述患者施用有效量的本發明抗體。本發明還涉及重組DNA分子或克隆的基因，或其簡併變體，其編碼本發明的抗體。 優選核酸分子，尤其是編碼圖1所示抗體VH⑶Rl、2和/或3結構域(SEQ ID NOs :4_6)的 重組DNA分子或克隆的基因。在另一個實施方案中，本發明還涉及重組的DNA分子或克隆 的基因，或其簡併變體，優選核酸分子，尤其是編碼圖1所示抗體VL CDR1、2和/或3結構 域(SEQ ID NOs 1-3)的重組DNA分子或克隆的基因。在本發明的另一個實施方案中，編碼本文中提供序列的重組DNA分子或克隆基因 的全DNA序列可與表達控制序列可操作地連接，其可以被引入適當的宿主中。本發明因此 延伸至用所述克隆基因或重組DNA分子轉化的單細胞宿主，所述克隆基因或重組DNA分子 包含編碼本抗體VH和/或VL⑶R或其部分的DNA序列，更具體而言，包含編碼上示和圖1 所示和SEQ ID NOs :1、2、3、4、5和/或6的VH和/或VL CDR的DNA序列。本發明自然涉及若干製備抗體及其活性片段的方法，包括本文中說明的已知的重 組技術。本發明因此預期在其範圍內覆蓋這些合成或嵌合抗體製劑。本文中公開的核酸和 胺基酸序列的分離促進了通過此類重組技術對本發明抗體的複製，因此，本發明延伸至用於在宿主系統中通過重組DNA技術表達的製備的表達載體，以及生成的轉化的宿主。本發明提供了藥物或其他實體，包括抗體例如抗獨特型抗體，其能夠結合抗體由 此調節、抑制或加強抗體活性。這些抗獨特型抗體在開發特異性結合抗體例如mAbl75或其 表位或加強其活性的藥物中是有用的。本發明的診斷用途延伸至本發明抗體在鑑定腫瘤或細胞樣品或篩選腫瘤或癌症 的測定中的用途，包括體外和體內診斷測定。在免疫測定中，製備控制量的抗體或類似物， 用酶、特異性結合伴侶和/或放射性元素標記，隨後引入細胞樣品中。在所標記的物質或其 結合伴侶有機會與樣品中的位點反應後，通過已知技術(根據所用標記的性質而不同)檢 測所得物質。本發明的抗體可攜帶可檢測或功能性的標記。特異性結合成員可攜帶放射性標 記，例如同位素 3H、14C、32p、35S、36Cl、51Cr、57CO、58CO、59Fe、90Y、121I、124I、125I、131I、mIn、211At、 198Au、67Cu、225AC、213Bi、99TC和186Re。當使用放射性標記時，可使用已知的現有計數方法鑑別 和量化抗體。在所述標記為酶時，可通過本領域中已知的任何正在使用的比色法、分光光度 法、螢光分光光度法、電流測定法或氣體定量技術完成檢測。放射標記的抗體及其片段在體外診斷技術和體內放射顯影技術中是有用的。在本 發明的另一個方面，放射標記的抗體及其片段、尤其是放射免疫綴合物在放射免疫療法中 是有用的，尤其是作為癌症治療的放射標記抗體。在又一個方面，放射標記的抗體及其片段 在放射免疫引導手術技術中是有用的，其中它們能在手術前，手術期間或手術後鑑定和指 示癌細胞、癌前細胞、腫瘤細胞和過度增殖細胞的存在和/或位置，以除去這些細胞。本發明的免疫綴合物或抗體融合蛋白，還包括但不限於與化學燒蝕劑、毒素、免疫 調節物、細胞因子、細胞毒性劑、化療劑或藥物綴合的結合成員，其中本發明的抗體及其片 段綴合或連接於其他分子或試劑。本發明包括測定系統，其可製成檢測試劑盒的形式，用於諸如擴增的EGFR或 de2-7EGFR存在程度的定量分析。該系統或檢測試劑盒可包含由本文中討論的一种放射性 和/或酶技術製備的標記成分，偶聯標記與抗體，以及一種或更多種附加的免疫化學試劑， 至少其中一種是要測定的自由或固定的成分或其結合夥伴。在另一個實施方案中，本發明涉及某些治療方法，其基於抗體或其活性片段的活 性，或已確定具有同種活性試劑或其他藥物。第一治療方法與癌症的預防或治療有關，包括 但不限於頭頸癌、乳癌、前列腺癌和神經膠質瘤。具體而言，本發明的抗體(在一個具體實施方案中為175抗體或其活性片段和來 源於其的嵌合(雙特異性)或合成抗體，所述175抗體CDR結構域區序列如本文中的圖1 和SEQ ID NO :1-6所示)可製成包括適當賦形劑、載體或稀釋劑的藥物組合物，用於適於治 療，例如治療癌症時的施用。這些藥物組合物還可包括通過本領域已知的方法調節抗體或 片段半衰期的方法，例如PEG化。這些藥物組合物還可包括其他抗體或治療劑。因此，本發明的組合物可單獨或與其他治療、治療劑或試劑聯合，同時或連續施 用，其依賴於所治療的狀況。此外，本發明涉及並包括包含本文所述抗體或其片段，以及其 他試劑或治療劑例如抗癌劑或治療劑、抗EGFR劑或抗體，或免疫調節劑的組合物。更普遍 的，這些抗癌劑可以是酪氨酸激酶抑制劑或磷酸化級聯抑制劑、翻譯後調節劑、細胞生長或 分裂抑制劑(例如抗有絲分裂劑)、PDGFR抑制劑或信號轉導抑制劑。其他治療或治療劑可包括施用適當劑量的疼痛舒緩藥物，例如非甾體抗炎藥(例如阿司匹林、對乙醯氨基酚、布 洛芬或酮洛芬)或麻醉劑例如嗎啡，或抗催吐劑。因此，這些試劑可以是抗EGFR特異性的試 劑，諸如AG1478，或可以是更普遍的抗癌和抗腫瘤劑。非限制性的實例包括阿黴素、卡鉬和 順鉬。此外，所述組合物可與免疫調節劑一起施用，例如白介素、腫瘤壞死因子(TNF)或其 他生長因子、細胞因子或激素例如地塞米松，其刺激免疫應答和癌細胞或腫瘤減少或消失。 所述組合物還可與其他抗EGFR抗體一起施用，或可包括與其他抗EGFR抗體的組合，所述抗 EGFR抗體包括但不限於抗EGFR抗體mAb806、抗體528、225、SC-03、108 (ATCC HB9764)，美國 專利號 6，217，866、14E1 (美國專利號 5，942，602)、DH8. 3、L8A4、Y10、HuMAX-EGFr (Genmab/ Medarex)、ICR62 和 ABX-EGF(Abgenix)。本發明還包括抗體及其片段，其共價連接或與其他分子或試劑締合。這些其他分 子或試劑包括但不限於具有顯著識別特徵的分子(包括抗體或抗體片段)、毒素、配體和 化學治療劑。通過參照隨後的示範性附圖和所附的權利要求閱讀隨後的詳細說明後，其他目的 和優點對於本領域技術人員將是顯而易見的。附圖簡述圖1 :mAb806和mAbl75的⑶R胺基酸序列比對。兩種抗體間的序列差異用粗體表
7J\ ο圖2 使用mAbl75免疫組化染色細胞系和正常人肝。A 使用生物素化的mAbl75 染色從含A431細胞(過表達wtEGFR)、U87MG. Δ 2_7細胞(表達Δ 2-7EGFR)和U87MG細胞 (以中等水平表達wtEGFR)的塊製備的切片。B:使用mAbl75(左側)、同種型對照(中間) 和第二抗體對照(右側)染色正常人肝(400x)。未觀察到特別的竇狀或肝細胞染色。圖3 :mAb806和mAbl75與展示在酵母上的EGFR片段的反應性。A 代表性的流式 細胞計量柱狀圖，其描述了標記酵母展示的EGFR片段的mAb806和mAbl75的平均螢光信 號。通過酵母展示，一定百分比的細胞未在表面表達蛋白，產生2個柱狀峰。由於所有的 片段含線性C末端c-myc標記，使用9E10抗體作為陽性對照。B 與不同EGFR片段結合的 抗體概述。C:加熱酵母粒至80°C 30分鐘，變性EGFR片段。所有實例中C-myc標記依然被 9E10抗myc抗體識別，表明熱處理並不能損害酵母表面展示的蛋白。使用構象敏感性EGFR 抗體mAb225證實變性。圖4 :mAbl75對腦和前列腺癌異種移植物的抗腫瘤效應。A 給具有U87MG. Δ 2-7 異種移植物的小鼠(η = 5)腹腔注射PBS、Img mAbl75或mAb806 (陽性對照)，每周三次，兩 周，在第6、8、10、13、15和17天注射，起始腫瘤體積為100mm3。數據以平均腫瘤體積士SE 表示。B:細胞用兩種無關的抗體(藍色、實心和綠色、中空)、總EGFR的mAb528(粉色，實 心)、mAb806 (淺藍色，中空)和mAbl75 (橙色，中空)染色，隨後用FACS分析。C 裂解DU145 細胞，利用mAb528、mAb806、mAbl75或兩種獨立的不相關抗體進行IP，隨後對EGFR免疫印 跡。D 給具有DU 145異種移植物的小鼠(η = 5)腹腔注射PBS、lmg mAbl75或mAb806，在 第18-22、25-29和39-43天每天注射，起始腫瘤體積為85mm3。數據用平均腫瘤體積士SE 表不。圖5 結合Fab片段的EGFR肽287-302的晶體結構(A)Fab 806的草圖，輕鏈紅 色；重鏈藍色；結合肽黃色；EGFR的EGFR287_302重疊區紫色。(B)Fab 175的草圖，輕鏈
9黃色；重鏈綠色；結合肽淡紫色；EGFR(Dl-3)的EGFR287_3Q2 紫色。(C)⑶的詳細情況顯示 受體中的EGFR287_3(I2與結合Fabl75的肽類似。肽骨架以Ca帶表示，相互作用的側鏈以棒 表示。0原子染成紅色；N:藍色；S:橙色；C作為主鏈。(0作6 1 與？油175:肽複合物的疊合 圖，顯示空間重疊。按(C)中染色，EGFR187-286的表面染為藍綠色。(E) (D)的正交視圖， EGFR187-286為不透明藍色，輕鏈(橙色)和重鏈(綠色)表面為透明的。(F) 175Fab複合 物按抗原結合部位方向查看的詳細立體視圖，按(C)中染色，側鏈氫鍵以黑色虛線表示。復 合物形成時包埋的水分子以紅色球表示。圖6 271-283半胱氨酸鍵對mAb806和EGFR結合的影響。A 用wtEGFR、 EGFR-C271A、EGFR-C283A或C271A/C283A突變體轉染的細胞用mAb528 (實心粉色柱狀圖)、 mAb806 (藍線)或僅第二抗體(紫色)染色，隨後用FACS分析。使用類型匹配的無關抗體 獲得結果。B 在MTT測試中測定了表達EGFR-C271A或C271/283A EGFR的BaF3細胞對EGF 的響應，如方法中所述。使用數據點的Bolzman擬合獲得EC5tlt5數據表示三組重複測量的 平均值和標準差。C JL-3和血清飢餓培養表達wt或EGFR-C271A/C283A的BaF3細胞，隨 後暴露於EGF或賦形劑對照中。通過SDS-PAGE分離全細胞裂解物，用抗磷酸酪氨酸抗體 (上面)或抗EGFR抗體(下面)免疫印跡。D 用遞增濃度的EGF在無抗體(開口標記)、 mAb528(灰色圓圈)或mAb806(灰色三角)存在下刺激表達wt (左圖)或C271A/C283A (右 圖)EGFR的BaF3細胞，所述抗體濃度均為10 μ g/ml。數據用三組重複測量的平均值和標準 差表不。圖7 =A)聲帶轉移性鱗狀上皮細胞癌患者中111In-ChSOe生物分布的全身、成 像，顯示在右頸(箭頭)處腫瘤的定量高吸收。同時可見血池活性和自由mIn在肝中的 次要分解代謝。B)該患者頸部的單光子計算體層攝影(SPECT)圖像，顯示活體腫瘤中的 mIn-ch806吸收(箭頭)，表示壞死的中樞吸收下降。C)頸部相應的CT掃描顯示中心性壞 死的巨大右頸腫瘤塊(箭頭)。圖8 不受束縛的EGFR1-621結構的立體模型。受體骨架以藍色跟蹤，配體TGF- α 為紅色。mAb806/175表位畫成藍綠色，二硫鍵為黃色。將表位系回受體的二硫鍵的原子以 空間填充形式顯示。該模型通過將受束縛構象的EGFR-ECD CR2結構域(13)對接到其配體 存在情況下不受束縛的EGFR單體的結構上(14)構建。圖9 :mAb806與EGFR片段的反應性。將用表達可溶性1-501EGFR片段或GH/EGFR 片段融合蛋白(GH-274-501、GH-282-501、GH-290-501 和 GH-298-501)的載體轉染的 293T 細胞裂解物進行SDS-PAGE解析，轉移至膜上，用mAb806 (左圖)或抗myc抗體9B11 (右圖) 免疫印跡分析。發明詳述根據本發明，可使用本領域技術之內的常規分子生物學、微生物學和重組DNA技 術。這些技術在文獻中有詳盡的描述，參見例如Sambrook等，『『Molecular Cloning =A Laboratory Manual「 (1989) ； 「 Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III[Ausubel, R. Μ. ,ed. (1994)] ； 「 Cell Biology :A Laboratory Handbook" Volumes I-III[J· E. Celis, ed. (1994))] ； " Current Protocols in Immunology " Volumes I-III[Coligan, J.Ε., ed. (1994)] ； 「 Oligonucleotide Synthesis 「 (MJ. Gait ed. 1984) ； " Nucleic Acid Hybridization " [B. D. Hames&S. J. Higgins eds.(1985)] ； 「 Transcription And Translation 「 [B. D. Hames&S. J. Higgins, eds. (1984)] ；〃 Animal Cell Culture" [R. I. Freshney,ed. (1986)] ；〃 Immobilized Cells And Enzymes " [IRL Press, (1986)] ；B. Perbal, 「 APractical Guide To Molecular Cloning" (1984)。因此，如果在本文出現，本文中下列術語具有下文中所給出的定義。A.術語各種語法形式的術語「異常表達」表示和包括蛋白在組織中任何增強或改變的表 達或過表達，例如由包括增強表達或翻譯、蛋白啟動子或調節物的調節，蛋白基因的擴增或 增加的半衰期或穩定性的任何方法引起的蛋白量的增加，由此相對於非過表達狀態更多的 蛋白存在或可在任一時間檢測。異常表達包括並涉及任何方案或改變，其中細胞中的蛋白 表達或翻譯後修飾機制由於增強的蛋白表達或蛋白水平或量的增加而重度負荷或受損，包 括其中表達改變的蛋白，例如由於序列改變、缺失或插入或摺疊改變而突變的蛋白或變體。應當著重理解的是，本文中特別選擇的術語「異常表達」包括這樣的狀態其中存 在異常(通常是增加)量/水平的蛋白，而不考慮該異常量或水平的有效原因。因此，異常 量的蛋白可在無基因擴增情況下由蛋白的過表達產生，其例如在癌症受試者的頭和頸部獲 取的許多細胞/組織樣本中存在；而其他樣本則具有可歸因於基因擴增的異常蛋白水平。在後一種關係中，本文中給出了本發明人們的某些工作以說明本發明，其包括分 析其中某些具有由EreR擴增導致的異常蛋白水平的樣品。這因此解釋了本文中參考擴增 的實驗結果以及術語「擴增/擴增的」等在描述EreR的異常水平的使用。然而，由於蛋白 的異常數量或水平的觀察定義了預期憑藉本發明結合成員臨床幹預的環境或情況，本說明 書認為術語「異常表達」更寬泛的包括引起EreR水平相應異常的原因環境。因此，雖然各種語法形式的術語「過表達」和「擴增」理解為具有不同的技術含義， 但在本發明的背景下表示具有異常EreR蛋白水平的狀態時，它們被認為是等價的。因此， 選擇了術語「異常表達」，因為它被認為用於本文目的時在它的範圍內包含術語「過表達」和 「擴增」，因此所有的術語當用於本文中時均認為是等價的。術語「抗體」描述了天然或部分或全部合成的免疫球蛋白。該術語也包括任何具 有抗體結合結構域或與之同源的結合結構域的多肽或蛋白。CDR移植的抗體同樣包括在該 術語內。由於抗體可以多種方式修飾，術語「抗體」應當解釋為包括任何具有具有所需特異 性的結合結構域的特異性結合成員或物質。因此，該術語覆蓋了抗體片段、衍生物、功能等 價物和抗體的同系物，包括任何包含免疫球蛋白結合結構域的天然或全部或部分合成的多 肽。包含與另一多肽融合的免疫球蛋白結合結構域或等價物的嵌合分子也因此包括在內。 嵌合抗體的克隆和表達描述於EP-A-0120694和EP-A-0125023和美國專利號4，816，397和 4，816，567 中。已顯示全抗體的片段可行使結合抗原的功能。結合片段的實例有(i)由VL、 VH、CL和CHl結構域組成的Fab片段；(ii)由VH和CHl結構域組成的Fd片段；(iii)由 單個抗體的VL和VH結構域組成的Fv片段；(iv)dAb片段(Ward，Ε. S.等，Nature 341， 544-546 (1989))，其由VH結構域組成；(ν)分離的CDR區；(vi) F(ab' ) 2片段，包含兩個相 連的Fab片段的二價片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH結構域和VL結構域通過肽接頭連接，其使得這兩個結構域一起形成抗原結合位點(Bird等，Science, 242,423-426, 1988 ；Huston等，PNAS USA，85，5879-5883，1988) ； (viii)多價抗體片段(scFv二聚體、三聚 體和 / 或四聚體(Power andHudson, J Immunol. Methods 242 193-2049 (2000)) ； (ix)雙特 異性單鏈Fv 二聚體(PCT/US92/09965)和(χ) 「雙抗體(diabody) 」，由基因融合構建的多 價或多特異性片段(W094/13804 ；P. Holliger 等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448， (1993))。「抗體結合位點」是抗體分子的結構部分，其組成為特異性結合抗原的輕鏈或重和 輕鏈可變和高變區。本文中，各種語法形式的術語「抗體分子」包括完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋 白分子的免疫活性部分。示範性的抗體分子是完整的免疫球蛋白分子，基本完整的免疫球蛋白分子和含有 互補位的免疫球蛋白分子的那些部分，包括本領域已知的為例如Fab、Fab'、F(ab' )2和 F(ν)的那些部分，這些部分優選用於本文中所述的治療方法中。抗體也可以是雙特異性的，其中抗體的一個結合結構域是本發明的特異性結合成 員，另一個結合結構域具有不同的特異性，例如募集(recruit)效應器(effector)功能 等。本發明的雙特異性抗體包括這樣的抗體，其中所述抗體的一個結合結構域是本發明的 特異性結合成員，包括其片段，另一個結合結構域是不同的抗體或其片段，包括不同的抗 EGFR抗體、例如抗體528 (美國專利號4，943，533)，嵌合和人源化225抗體(美國專利號 4，943，533 和 W0/9640210)，抗 de2-7 抗體例如 DH8. 3(Hills，D.等(1995) Int. J. Cancer 63(4) :537-543)，抗體 L8A4 和 Y10(Reist，CJ 等(1995)Cancer Res. 55(19) :4375_4382 ； Foulon CF 等(2000)Cancer Res. 60(16) :4453_4460)，ICR62(Modjtahedi H 等(1993) Cell Biophys. Jan-Jun ;22 (1-3) 129-46 ；Modjtahedi 等(2002)P. A. A. C. R. 55 (14) 3140-3148，或 Wiksttrand 等的抗體(Wikstrand C.等(1995)Cancer Res. 55(14) 3140-3148)。另一個結合結構域可以是識別或靶向特定細胞類型的抗體，例如神經或神經 膠質細胞特異性抗體。在本發明的雙特異性抗體中，本發明抗體的一個結合結構域可與識 別特定細胞受體和/或調節特定類型細胞的其他結合結構域或分子組合，例如免疫調節物 (例如白介素、生長調節物或細胞因子(例如腫瘤壞死因子(TNF)，尤其是2002年2月13 日提交的U. S. S. N. 60/355，838中所述的TNF雙特異性形式，其整體引入本文)或毒素(例 如蓖麻毒素)或抗有絲分裂或細胞凋亡劑或因子。抗體分子的Fab和F(ab' )2部分可通過用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶分別水解基本 完整的抗體分子製備，其採用的方法是公知的，例如參見授予Theofilopolous等人的美國 專利號4，342，566。Fab'抗體分子部分也是公知的，其從F (ab 『 )2部分製備，首先用例如 巰基乙醇還原連接兩條重鏈部分的二硫鍵，隨後用諸如碘乙醯胺的試劑烷基化所得的蛋白 硫醇。本文中優選含有完整抗體分子的抗體。各種語法形式的術語「單克隆抗體」是指僅具有一種能與特定抗原免疫反應的抗 體結合位點的抗體。單克隆抗體因此通常具有對與之免疫反應的任何抗原的單結合親合 力。單克隆抗體還可以含有具有複數個抗體結合位點的抗體分子，每個位點對不同的抗原 免疫特異性。例如雙特異性(嵌合)單克隆抗體。術語「抗原結合結構域」描述了這樣的抗體部分，其包括特異性結合併與抗原的部分或全部互補的區域。當抗原巨大時，抗體可僅結合該抗原的特定部分，該部分被稱為表 位。抗原結合結構域可由一個或更多個抗體可變結構域提供。優選地，抗原結合結構域包 括抗體輕鏈可變區(VL)和抗體重鏈可變區(VH)。「翻譯後修飾」可包括任意修飾或其組合，包括共價修飾，蛋白在翻譯完成後和從 核糖體釋放後或共翻譯地在新生多肽上進行其。翻譯後修飾包括但不限於磷酸化、十四烷 基化、遍在蛋白化、糖基化、輔酶連接、甲基化和乙醯化。翻譯後修飾可調節或影響蛋白的活 性，其胞內或胞外的目標(destination)，其穩定性或半衰期和/或其被配體、受體或其他 蛋白的識別。細胞器內、核內或細胞質內或細胞外可能發生翻譯後修飾。術語「特異性」可用於指特異性結合對中的一個成員不顯著結合其特異性結合夥 伴外的任何分子。該術語也可用於例如抗原結合結構域對多種抗原具有的特定表位特異性 時，在該情形下，具有該抗原結合結構域的特異性結合成員能夠結合具有該表位的各種抗 原。術語「包含」通常用於包括的含義，即允許一個或更多個特徵或成分的存在。術語「基本上由......組成」是指一種產品，尤其是具有確定數目殘基的肽序列，
其不與更大的產品共價連接。在上文提及的本發明肽的情況下，然而本領域技術人員將會 理解，對所述肽N-或C-末端的微小修飾也包括在內，例如化學修飾末端添加保護基團等， 例如C末端的醯胺化。根據本發明，術語「分離的」是指本發明抗體、或編碼所述抗體或其CDR的核酸所 處的狀態。抗體與核酸不含或基本不含與其天然相關的物質，例如在其天然環境下或通過 體內或體外重組DNA技術製備的製備環境(例如細胞培養物)下發現的共存的其他多肽或 核酸。抗體與核酸可與稀釋劑或佐劑配製，進一步分離以供實踐——例如當免疫測定中用 於覆蓋微量滴定板時，所述成員通常與明膠或其他載體混合；或當用於診斷或治療時與可 藥用載體或稀釋劑混合。抗體可以是天然糖基化的或由異源真核細胞的系統糖基化，或者 其可以是未糖基化的(例如通過在原核細胞中表達產生時)。同樣，本文中術語「糖基化」和「糖基化的」包括通過添加寡糖的蛋白翻譯後修飾， 所述蛋白稱為糖蛋白。寡糖添加到糖蛋白的糖基化位點，尤其包括N-連接寡糖和0-連接 寡糖。N-連接寡糖加入到Asn殘基，尤其是當所述Asn殘基位於序列N-X-S/T中時，是糖蛋 白中發現的最常見形式，其中X不能是Pro或Asp。在N-連接糖蛋白的生物合成中，高甘露 糖型寡糖(通常包括多萜醇、N-乙醯葡萄糖胺、甘露糖和葡萄糖，首先在內質網(ER)中形 成)。所述高甘露糖型糖蛋白隨後從ER轉運至高爾基體，進行進一步的寡糖加工和修飾。 0-連接寡糖加入到Ser或Thr殘基的羥基基團。在0-連接的寡糖中，N-乙醯葡萄糖胺首 先通過ER中的N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶轉移到Ser或Thr殘基上。所述蛋白隨後轉移至 高爾基體，進一步修飾和鏈延伸。可在那些Ser或Thr位點簡單添加單獨OGlcNAc單糖進 行0-連接修飾，所述位點也可在不同的條件下磷酸化而非糖基化。本文中「pg」表示皮克，「ng」表示納克，「ug」或「 μ g」表示微克，「mg」表示毫克， 「ul 」或「 μ 1 」表示微升，"ml，，表示毫升，T表示升。術語「抗體175」、「175抗體」、「mAbl75」以及此處未特別列出的任何變體在本文中 可交換地使用，用於整個本申請和權利要求中時，指包括單個或多個蛋白的蛋白質性材料， 並且包括那些具有本文中所述胺基酸序列數據的蛋白，如圖1所示，具有或包括如SEQ IDNOs :1、2、3、4、5和/或6所示的胺基酸序列，以及具有本文中和權利要求中所述的活性特 徵。因此，具有基本等價或改變活性的蛋白也包括在內。這些修飾是故意的，例如通過定向 誘變獲得的修飾，或者是意外的，例如通過生產複合物或其指明的亞單位的宿主內突變獲 得的修飾。同樣，術語「抗體175」、「175抗體」和「mAbl75」意圖在其範圍內包括本文中特 別引用的蛋白及其所有的基本同源類似物和等位基因變異。 本文中描述的胺基酸殘基優選為「L」異構型。然而，「D」異構型的殘基可取代任 何L-胺基酸殘基，只要該多肽保留了需要的免疫球蛋白結合功能。NH2是指多肽氨基末端 存在的自由氨基基團。COOH是指多肽羧基末端存在的自由羧基基團。根據標準多肽命名
法，J.Biol. Chem.，243 3552-59(1969)
本文中，術語「限制性內切酶」和「限制性酶」是指細菌酶，其在特定的核苷酸序列 或其附近切割雙鏈DNA。當外源性或異源性DNA被引入細胞時，細胞被所述DNA 「轉化「。轉化DNA可以整 合(共價連接)/不整合至染色體DNA中，構成細胞的基因組。例如在原核生物、酵母和哺 乳動物細胞中，轉化DNA可維持於附加體元件例如質粒中。對於真核細胞，穩定轉化的細胞 是這樣的，其中轉化DNA被整合到染色體中，由此通過染色體複製被子細胞遺傳。穩定性通過真核細胞建立細胞系或克隆的能力證明，所述細胞系或克隆由含有轉 化DNA的子細胞群組成。「克隆」是通過有絲分裂來源自單細胞或共同祖先的細胞群。「細 胞系」是原代細胞的克隆，其在體外能穩定生長許多代。當在給定的DNA序列長度內，核苷酸匹配至少為約75% (優選至少約80%，最優 選至少為約90或95%)時，兩條DNA序列被稱為「基本同源的」。基本同源的序列可通過使 用序列資料庫中的標準軟體比較序列鑑定，或在Southern雜交實驗中，例如在該特定系統 中定義的嚴格條件下鑑定。本領域技術人員可以定義適當的雜交條件。例如參見Maniatis 等，上文；DNA Cloning, Vols. I&II，上文；Nucleic AcidHybridization，上文。應當理解，編碼本發明抗體的DNA序列也包括在本發明的範圍內，其編碼例如具 有包含或具有與SEQ ID N0:l、2、3、4、5或6相同但簡併的胺基酸序列的可變區結構域的抗 體。「簡併」指使用不同的三字母密碼子表示特定的胺基酸。以下密碼子可交換地用於編碼 每個特定的胺基酸，這在本領域是公知的
0110]苯丙氨酸(Phe或F)UUU 或 UUC0111]亮氨酸(Leu 或 L)UUA 或 UUG 或 CUU 或 CUC 或 CUA 或 CUG0112]異亮氨酸(lie或I)AUU 或 AUC 或 AUA0113]甲硫氨酸(Met或M)AUG0114]纈氨酸(Val 或 V)GUU 或 GUC 或 GUA 或 GUG0115]絲氨酸(Ser 或 S)UCU 或 UCC 或 UCA 或 UCG 或 AGU 或 AGC0116]脯氨酸(Pro 或 P)CCU 或 CCC 或 CCA 或 CCG0117]蘇氨酸(Thr 或 T)ACU 或 ACC 或 ACA 或 ACG0118]丙氨酸(Ala 或 A)GCU 或 GCG 或 GCA 或 GCG0119]酪氨酸(Tyr 或 Y)UAU 或 UAC0120]組氨酸(His 或 H)CAU 或 CAC0121]穀氨醯胺(Gln或Q)CAA 或 CAG0122]天冬醯胺(Asn或N)AAU 或 AAC0123]賴氨酸(Lys 或 K)AAA 或 AAG0124]天冬氨酸(Asp或D)GAU 或 GAC0125]穀氨酸(Glu 或 E)GAA 或 GAG0126]半胱氨酸(Cys或C)UGU 或 UGC0127]精氨酸(Arg 或 R)CGU 或 CGC 或 CGA 或 CGG 或 AGA 或 AGG0128]甘氨酸(Gly 或 G)GGU 或 GGC 或 GGA 或 GGG0129]色氨酸(Trp 或 W)UGG0130]終止密碼子UAA(赭石)或UAG(琥珀)或UGA(乳白)
應當理解，上述給出的密碼子適用於rna序列，dna的相應密碼子用t替換u。編碼本文中抗體結構域的核酸序列可進行突變，這樣一個特定的密碼子轉變為編 碼不同胺基酸的密碼子。所述突變通常通過改變最少可能的核苷酸進行。這一類替換突變 可以非保守的方式(即，通過使屬於一類具有特定大小或性質的胺基酸的密碼子改變為屬 於另一類胺基酸的密碼子)或以保守的方式(即，通過使屬於一類具有特定大小或性質的 胺基酸的密碼子改變為屬於同一類胺基酸的密碼子)改變所得蛋白質中的胺基酸。這樣的 保守性改變通常導致所得的蛋白結構和功能變化較少。非保守的改變更可能改變所得蛋白 的結構、活性或功能。本發明應當認為包括含保守性改變的序列，其未顯著改變所得蛋白的 活性或結合性質。以下是各種胺基酸分類的一個實例含非極件r基團的胺基酸丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸含不帶電極件r基團的胺基酸甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺含帶電極件r基團的胺基酸(dh6. 0時為負電)天冬氨酸、穀氨酸鹼件胺基酸(dh6. 0時為ih電)賴氨酸、精氨酸、組氨酸(ρη6· 0時)另一種分類是那些含苯基的胺基酸苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。另一種分類可根據分子量(即r基團的大小)
0144]甘氨酸750145]丙氨酸890146]絲氨酸1050147]脯氨酸1150148]纈氨酸1170149]蘇氨酸1190150]半胱氨酸1210151]亮氨酸1310152]異亮氨酸1310153]天冬醯胺1320154]天冬氨酸1330155]穀氨醯胺1460156]賴氨酸1460157]穀氨酸1470158]甲硫氨酸1490159]組氨酸(ρΗ 6. 0)1550160]苯丙氨酸1650161]精氨酸1740162]酪氨酸181
色氨酸204尤其優選的替換是-Lys替換Arg，反之亦然，以維持正電荷；-Glu替換Asp，反之亦然，以維持負電荷；-Ser替換Thr，以維持自由-OH ；以及-Gln替換Asn，以維持自由NH2。還可引入胺基酸替換以替換具有特別優選性質的胺基酸。例如，可將Cys弓丨入可 能與其他Cys生成二硫鍵的位點。可引入His作為特別的「催化」位點(即，His可作為酸 或鹼起作用，是生化催化中的最常用胺基酸)。Pro可由於其特殊的平面結構而引入，其誘 導蛋白結構中的轉角。當兩條胺基酸序列至少有約70%的胺基酸殘基(優選至少約80%、最優選至少約 90或95% )相同或代表保守性替換時，這兩條胺基酸序列是「基本同源的」。DNA構建體的「異源」區是較大DNA分子內的可識別DNA片段，其並非天然與該較 大的分子相關。因此，當該異源區編碼哺乳動物基因時，該基因側翼通常為在來源生物體 基因組中哺乳動物基因組DNA側翼不含的DNA。另一個異源編碼序列的例子是編碼序列本 身未天然發現的構建體(例如，cDNA，其中基因組編碼序列含有內含子，或具有不同於天然 基因密碼子的合成序列)。等位基因變異或天然發生的突變事件並不能產生本文所定義的 DNA異源區。術語「可藥用的」是指生理學上可耐受的分子實體和組合物，當施用於人體時通常 不產生過敏或類似的不良反應，例如心嘈、頭暈等。術語「治療有效量」在本文中表示足以預防、優選減少至少約30%、優選至少 50%、優選至少70%、優選至少80%、優選至少90%靶細胞物，癌細胞群或腫瘤的生長或進 展或有絲分裂活性，或其他病理學特徵的臨床顯著變化的量。例如，可減少EGFR活化程度 或EGFR陽性細胞尤其是抗體或結合成員反應性或陽性細胞的活性或量或數目。當表達調控序列控制和調節DNA序列的轉錄和翻譯時，該DNA序列「可操作地連 接」表達調控序列。術語「可操作地連接」包括在要表達的DNA序列前具有適當的起始信 號(例如ATG)，以及維持正確讀框允許所述DNA序列在表達調控序列的控制下表達，產生 該DNA序列編碼的所需產品。如果需要插入重組DNA分子的基因不包含適當的起始信號， 可在該基因前插入這樣的起始信號。術語「標準雜交條件」是指基本等同於5x SSC和65°C雜交和洗滌的鹽和溫度條 件。然而，本領域技術人員將會理解，這樣的「標準雜交條件」依賴於特定的條件，包括緩衝 液中鈉和鎂的濃度，核苷酸序列長度和濃度，錯配百分比、甲醯胺百分比等。在確定「標準雜 交條件」時同樣重要的是所雜交的兩條序列是RNA-RNA、DNA-DNA還是RNA-DNA。這樣的標 準雜交條件可由本領域技術人員根據公知的規則容易地確定，其中雜交通常低於預測或測 定的Tm10-20°C，如果需要的話，採用更高的嚴格度洗滌。B.發明詳述本發明提供了一種新型抗體175或其片段，包括免疫原性片段。其識別EGFR表位、 尤其是EGFR肽(287CGADSYEMEEDGVRKC3Q2 (SEQ ID NO 14))，其暴露於該表位增強、顯露或明 顯的腫瘤發生、過度增殖或異常細胞中，但在正常或野生型細胞中檢測不到。在特定的非限
18制性實施方案中，該抗體識別這樣的EGFR表位，所述表位在簡單糖修飾或早期糖基化時增 強或變明顯，在複合糖修飾或糖基化存在下減弱或不明顯。在不存在過表達、擴增或腫瘤發 生事件時，抗體或其片段不結合或識別含有正常或野生型EGFR表位的正常或野生型細胞。如前所述，在本發明的一個具體方面，本發明人們發現了新型單克隆抗體175，其 特異性識別擴增的野生型EGFR和de2-7EGFR，還結合不同於de2_7EGFR突變獨特接合肽的 表位。此外，儘管mAbl75不識別神經膠質瘤細胞表面表達的正常、野生型的EGFR，其結合固 定於ELISA板表面的EGFR胞外結構域，表明了具有多肽外觀的構象性表位。重要的是，mAb 175不顯著結合正常組織，諸如肝和皮膚，其內源性wtEGFR的表達水平要高於大多數其他 正常組織，但其中EGFR未過表達或擴增。因此，mAbl75表現出新的有用的特異性，其識別 de2-7EGFR和擴增的EGFR，而不識別正常的野生型EGFR或作為de2_7EGFR特徵的獨特接合 肽。在一個優選的方面，本發明的抗體175包括圖1和SEQID NOs :1、2、3、4、5和6所示的 VH和VL⑶R結構域胺基酸序列。另一方面，本發明提供了能在特定條件下競爭175抗體的抗體，其中至少10% 的具有175抗體的VH和VL序列的抗體在ELISA測試中通過與所述抗體競爭被阻斷與 de2-7EGFR的結合。如前所述，這裡也包括抗獨特型抗體。診斷和治療用塗本發明175抗體或其片段的獨特特異性提供了鑑定、表徵、靶向和治療、減少或消 除多種腫瘤發生細胞類型和腫瘤類型，例如頭頸、乳、肺、膀胱或前列腺腫瘤和神經膠質瘤 的診斷和治療用途，而沒有之前已知的EGFR抗體所見的與正常組織吸收相關的問題。因 此，可利用本發明的175抗體或其片段識別、分離、表徵、靶向和治療或消除過表達EGFR(例 如通過EGFR突變體或變體擴增或表達)的細胞，尤其是表現出異常的翻譯後修飾的細胞。本發明的抗體因此可通過染色或另外地識別存在EGFR過表達、尤其是擴增和/或 EGFR突變，尤其是de2-7EGFR的那些腫瘤或細胞對EGFR腫瘤或腫瘤發生細胞的性質進行 特異性歸類。此外，本發明的175抗體表現出針對含擴增的EGFR腫瘤和de2-7EGFR陽性異 種移植物顯著的體內抗腫瘤活性。在本發明的另一方面，提供了治療腫瘤、癌性狀況、癌前 狀況以及任何與過度增殖細胞生長相關或由其導致的狀況的方法，包括施用本發明的抗體 175。本發明的抗體被設計用於診斷和治療人或動物受試者腫瘤、尤其是上皮腫瘤的方 法。這些腫瘤可以是原發或續發的任何類型實體瘤，包括但不限於神經膠質瘤、乳、肺、前列 腺、頭頸腫瘤。抗體產生通過雜交瘤製備單克隆抗體的一般方法是公知的。永生的抗體產生細胞系也可 通過除融合外的技術，如直接用致癌DNA轉化B淋巴細胞或用EB病毒轉染建立。參見例 如 M. Schreier 等，「HybridomaTechniques 「 (1980) ；Hammerling 等，「Monoclonal Antibodies AndT-cell Hybridomas 「 (1981) ；Kennett 等， 「Monoclonal Antibodies" (1980)；還見 U. S.專利號 4，341，761 ;4，399，121 ;4，427，783 ;4，444，887 ； 4，451，570 ；4，466，917 ；4，472，500 ；4，491，632 ；4，493，890。產生的針對 EGFR 的單克隆抗 體組可對多種性質篩選即，同種型、表位、親和性等。特別感興趣的是模擬EGFR或其亞單 位活性的單克隆抗體。這些單克隆抗體可在特異性結合成員活性測試中方便地鑑定。高親和性抗體在免疫親和純化天然或重組特異性結合成員時也是有用地。用於實施本發明的單 克隆抗體可從包含含有分泌具有適當抗原特異性的抗體分子的雜交瘤的營養培養基的單 克隆雜交瘤培養物生產。該培養物維持在一定條件下一段時間，以供所述雜交瘤將抗體分 子充分分泌至培養基內。隨後收集含抗體的培養基。抗體分子可然後通過公知的技術進一 步分離。產生單克隆抗EGFR抗體的方法也是本領域公知的。參見Niman等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 =4949-4953 (1983)。在之前描述的產生抗EGFR單克隆抗體的方法中，通 常使用單獨或與免疫原性載體綴合的EGFR或肽類似物作為免疫原。篩選雜交瘤產生與腫 瘤發生、異常或過度增殖細胞中EGFR免疫反應的抗體的能力。其他抗EGFR抗體包括但不限 於 Genmab/Medarex 的 HuMAX-EGFr 抗體，108 抗體(ATCCHB9764)和美國專利號 6，217，866， 以及Schering AG的抗體14E1 (美國專利號5，942，602)。重組抗體、嵌合抗體、雙特異件抗體和片段通常，包括基本上如SEQ ID NOs :1、2、3、4、5和/或6的CDR區所示的胺基酸序列
的CDR區位於這樣的結構中，所述結構允許CDR區與腫瘤抗原的結合。「基本上如......所
示」表示本發明的⑶R區與給定的SEQ ID NOs :1、2、3、4、5和/或6的區域相同或高度同 源。「高度同源」表示⑶R中僅有少數替換，優選1-8、優選1-5、優選1-4或1-3或1或2個替換。含有本發明CDR的結構通常是抗體的重鏈或輕鏈序列或其基本部分，其中所述 CDR區位於相應於由重排的免疫球蛋白基因編碼的天然形成的VH和VL抗體可變結構域 的⑶R區的位置。免疫球蛋白可變結構域的結構和位置可參照下列確定Kabat，E.A.等， Sequences ofProteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Healthand Human Services. 1987及其更新版本，現可從英特網上獲得(http //immuno. bme. ηwu. edu))。優選地，基本上如SEQ ID NO :4、5和6所示的胺基酸序列作為人重鏈可變結構域 或其基本部分中的⑶Rl、2和3，基本上如SEQ IDNO :1、2和3所示的胺基酸序列分別作為 人輕鏈可變結構域或其基本部分中的CDR1-3。所述可變結構域可來源自任何種系或重排的人可變結構域，或可以是基於已知人 可變結構域一致序列合成的可變結構域。前文所定義的本發明的CDR-來源的序列可使用 重組DNA技術引入缺乏CDR區的可變結構域集中。例如，Marks等(Bio/Technology，1992， 10 =779-783)描述了產生抗體可變結構域集的方法，其中聯合使用定向至可變結構域5』端 或其鄰近的通用引物和人VH基因第三框架區的通用引物產生缺乏一個或更多個CDR的VH 可變結構域集。Marks等進一步描述了該集如何與特定抗體的CDR組合。使用類似的技術， 本發明的⑶R-來源的序列可與缺乏一個或更多個⑶R的VH或VL結構域集改組，改組的完 整VH或VL結構域與同源VL或VH結構域組合提供本發明的抗體。該集隨後在適當的宿主 系統例如W092/01047的噬菌體展示系統中展示，由此選擇適宜的特異性結合成員。集可由 任何IO4以上的單獨成員組成，例如IO6至IO8或IOltl個成員。類似的改組或組合技術也由 Stemmer所公開(Nature，1994，370 :389_391)，其描述了與β -內醯胺酶基因相關的技術， 但發現該方法可用於產生抗體。另一個選擇是使用隨機誘變例如編碼mAb 175VH或VL⑶R的核酸產生結構域內突變來產生含本發明⑶R-來源的序列的新型VH或VL區。Gram等描述了這樣的技術(1992， Proc. Natl. Acad. ScL, USA, 89 :3576_3580)，其使用了易錯PCR。可採用的另一種方法是定 點誘變VH或VL基因的CDR區。此類技術公開於Barbas等，(1994, Proc. Natl. Acad. Sci.， USA, 91 3809-3813)和 Schier 等(1996，J. Mol. Biol. 263 :551_567)。所有上述的技術在 現有技術中是已知的，其本身並不構成本發明的一部分。本領域技術人員能夠使用這些技 術以採用本領域的常規方法提供本發明的特異性結合成員。免疫球蛋白可變結構域的基本部分包括至少3個⑶R區。可變結構域基本部分N 末端或C末端的其他殘基可以是與天然形成的可變結構域區非正常相關的那些。例如，通 過重組DNA技術製備的本發明抗體結構可引入由為利於克隆或其他操作步驟引入的接頭 編碼的N-或C-末端殘基。其他操作步驟包括引入接頭以連接本發明的可變結構域和包括 免疫球蛋白重鏈、其他可變結構域(例如在製備雙抗體(diabody)中)或蛋白標記的其他 蛋白序列，其將在下文更詳細地討論。雖然在本發明一個優選的方面，優選包含一個或更多個基於基本上如SEQ ID NOs :1、2、3、4、5和/或6所示的序列的結合結構域的抗體，基於任一這些序列的單結合結 構域構成了本發明的其他方面。在基於基本如SEQ ID NO :6所示序列的結合結構域，或SEQ ID NO :4-6的結構域情況下，這些結合結構域可用作用於腫瘤抗原的靶向試劑，因為已知免 疫球蛋白VH結構域能以特定的方式結合靶抗原。在任一單鏈特異性結合結構域情況下，這 些結構域可用於篩選能形成雙結構域特異性結合成員的互補結構域，其體內性質與本文公 開的mAb 175抗體一樣好或與其等同。這可以使用美國專利5，969，108中公開的所謂分級雙重組合方法(hierarchical dual combinatorial approach)通過噬菌體展示篩選方法完成，其中使用單個含有H或L 鏈克隆的菌落感染編碼另一條鏈(L或H)的完整克隆庫，根據噬菌體展示技術選擇所得的 雙鏈特異性結合成員，例如該參考文獻中公開的那些。該技術同樣公開於Marks等的上文 中。本發明的抗體還可包括抗體恆定區或其部分。例如，基於SEQ IDNOs :1_3的抗體 可在其C末端連接抗體輕鏈恆定結構域，包括人C K或CX鏈。類似的，基於SEQ ID NOs 4-6的抗體可在其C末端連接全部或部分來源自任何抗體同種型的免疫球蛋白重鏈，例如 IgG, IgA、IgE, IgD和IgM以及任何同種型亞類，尤其是IgGl、IgG2b和IgG4。分子工程在將鼠mAb轉化為嵌合mAb (小鼠V區，人C區)和人源化物(其中僅mAb 互補決定區(CDR)是鼠源的)中的應用對單抗治療的臨床成功是關鍵的。工程化的mAb具 有顯著下降或缺乏的免疫原性，增加的血清半衰期，並且單抗的人Fc部分增加了募集補體 和細胞毒性細胞免疫效應器的潛能。為研究臨床施用mAb的生物分布、藥代動力學和任何 免疫應答誘導，需要開發鑑別藥用和內源性蛋白的分析方法。抗體或其任何片段也可綴合或重組性融合任何細胞毒素、細菌等，例如假單 胞菌外毒素、蓖麻毒素或白喉毒素。使用的毒素部分可以是全毒素或該毒素的任何特 定結構域。此類抗體-毒素分子已成功用於靶向和治療不同種類的癌症，參見例如 Pastan, Biochim Biophys Acta.19970ct 24 ； 1333 (2) :Cl-6 ；Kreitman φ, N Engl J Med. 2001Jul26 ；345 (4) :241_7 ；Schnell 等，Leukemia. 2000 Jan ；14(1) :129_35 ；Ghetie 等，Mol Biotechnol. 2001 Jul ； 18 (3) :251_68。
雙和三特異性多聚體可通過締合不同的scFv分子形成，已被設計為將T細胞募 集到腫瘤內(免疫治療)、病毒再靶向(基因治療)的交聯劑和紅細胞凝集劑(免疫診斷 學)，參見例如 Todorovska等，J ImmunolMethods. 2001Feb 1 ；248 (1-2) 47-66 ；Tomlinson 等，Methods Enzymo 1. 2000 ；326 461-79 ；McCall 等，J Immunol. 200IMay 15 ；166(10) 6112-7。全人抗體可通過免疫攜帶大部分人免疫球蛋白重和輕鏈的轉基因小鼠製備。這 些小鼠在本領域是公知的，這樣的小鼠的實例有Xen0m0UseTM(AbgeniX，Inc.)(美國專利號 6，075，181 和 6，150, 584), HuMAb-Mouse (Medarex, Inc. /GenPharm)(美國專利 5545806 和 5569825), TransChromo Mouse (Kirin)和 KM Mouse (Medarex/Kirin)。抗體可隨後通過 例如標準雜交瘤技術或噬菌體展示製備。這些抗體將僅含完全的人胺基酸序列。全人抗體 也可使用噬菌體展示從人庫中產生。噬菌體展示可使用本領域技術人員公知的方法進行， 例如Hoogenboom等和Marks 等(Hoogenboom HR and Winter G. (1992) J Mol Biol. 227(2) 381-8 ；Marks JD等(1991) J Mol Biol. 222(3) :581_97 ；以及美國專利 5885793和 5969108) 中所述。治療件抗體和用塗本發明抗體的體內性質，尤其是腫瘤血液比和清除速率至少與mAb 175相當。給 人或動物受試者施用後，所述特異性結合成員將顯示>1 1的腫瘤血液峰值比，優選在這 樣的比例下所述特異性結合成員同時具有超過1 1、優選超過2 1、更優選超過5 1 的腫瘤器官比。優選地，在該比例下，所述特異性結合成員在遠離腫瘤位點的器官內具有 < 1 1的器官血液比，這些比例不包括分解代謝和分泌所施用特異性結合成員的器官。本發明的抗體可用可檢測的或功能性的標記物標記。可檢測的標記物包括但不 限於放射性標記，例如同位素 3H, 14C，32P，35S，36C1，51Cr, 57Co, 5 8Co, 59Fe,9°Y，1211，1241，1251，1311， 111Inj211At,198Au,67Cu, 225Ac,213Bi,"Tc和186Re,其可以使用抗體成像領域已知的常規化學手 段連接到本發明的抗體上。所述標記物還可包括螢光標記物和本領域常規用於MRI-CT成 像的標記物。其還包括酶標記物例如辣根過氧化物酶。標記物還包括化學部分例如生物 素，其可通過結合特異性同源可檢測部分例如標記的抗生物素蛋白檢測。功能性標記物包 括經設計靶向至腫瘤位點引起腫瘤組織破壞的物質。此類功能性標記物包括細胞毒藥物例 如5-氟尿嘧啶或蓖麻毒素，以及酶類例如細菌羧肽酶或硝基還原酶，其能夠在腫瘤位點將 前藥轉化為活性藥物。175抗體和/或其亞單位可能具有某些診斷用途，例如，可用於檢測和/或測量 諸如癌症、癌前病變的狀況，與過度增殖細胞生長有關或其導致的狀況等等。放射性標記 的175抗體及其片段可用於體外診斷技術和體內放射成像技術以及放射免疫療法中。在 體內成像時，本發明的抗體可與顯像劑而非放射性同位素綴合，包括但不限於磁性共振成 像增強劑，其中例如用大量的順磁離子通過螯合基團加載抗體分子。螯合基團的實例包括 EDTA、嚇啉、多胺冠醚和多肟(polyoximes)。順磁離子的實例包括釓、鐵、錳、錸、銪、鑭、鈥和 ferbium。在本發明的另一方面，放射標記的175抗體及其片段、尤其是放射免疫綴合物可 用於放射免疫療法中，尤其是作為放射性標記的抗體治療癌症。在另一個方面，放射標記的 175抗體及其片段可用於放射免疫導向手術技術，其中它們能在手術前、手術期間或手術後 鑑別和指示癌細胞、癌前細胞、腫瘤細胞和過度增殖細胞的存在和/或位置，以便除去這些 細胞。本發明的免疫綴合物或抗體融合蛋白(其中本發明的175抗體及其片段與其他分子或試劑綴合或連接)還包括但不限於與化學燒蝕劑、毒素、免疫調節劑、細胞因子、細胞毒 性劑、化療劑或藥物綴合的175抗體.使用不同抗體免疫綴合物的放射免疫療法(RAIT)已進入臨床並證明了效果。131I 標記的人源化抗癌胚抗原(抗-CEA)抗體hMN-14已在結腸直腸癌中進行了評價(Behr TM 等(2002)Cancer 94(4Suppl) 1373-81)，用9°Y標記的同一抗體在甲狀腺髓樣癌中進行了 評價(Stein R等(2002)Cancer 94(1) :51_61)。使用單克隆抗體的放射免疫療法也針對非 霍奇金淋巴瘤和胰腺癌進行了評價和報導(Goldenberg DM(2001)Crit Rev Oncol Hematol 39(1-2) 195-201 ；Gold DV 等(2001) Crit RevOncol Hematol 39(1-2) 147-54)。使用特 定抗體的放射免疫療法也描述於美國專利6，306，393和6，331，175中。放射免疫導向手 術(RIGS)也已進入臨床並證明了效果和有用性，包括使用抗-CEA抗體和針對腫瘤相關抗 原的抗體(Kim JC 等(2002) Int J Cancer 97(4) 542-7 ；Schneebaum S 等(2001)fforld J Surg 25(12) 1495-8 ；Avital S等(2000)Cancer89(8) 1692-8 ；Mcintosh DG等(1997) Cancer Biother Radiopharm 12(4) :287_94)。本發明的抗體可通過任何適當的途徑施用給需要治療的患者，通常通過注射進入 血流或CSF，或直接進入腫瘤位點。精確的劑量依賴於多種因素，包括該抗體是用於診斷還 是治療，腫瘤的大小和位置，抗體的精確性質(是否為全抗體、片段、雙抗體等)，以及連接 所述抗體的可檢測或功能性標記物的性質。使用放射性核素治療時，適宜的最大單劑量為 約45mCi/m2至約250mCi/m2的最大值。優選的劑量範圍是15至40mCi，更優選的劑量範圍 是20至30mCi，或10至30mCi。該治療可能需要骨髓或幹細胞替換。用於腫瘤成像或腫瘤 治療的通常抗體劑量範圍是0.5至40mg、優選1至4mg F(ab' )2形式的抗體。裸抗體優 選施用劑量為20至IOOOmg蛋白/劑，或20至500mg蛋白/劑，或20至IOOmg蛋白/齊IJ。 這是成年患者單次治療的劑量，其可以針對兒童和嬰兒按比例調整，也可對其他抗體形式 按分子量比例調整。治療可按一日一次、一周兩次、一周一次或一月一次的間隔重複，由醫 師判定。這些製劑可包括第二結合蛋白，例如前文所描述的EGFR結合蛋白。在尤其優選的 形式下，該第二結合蛋白是諸如528或225的單克隆抗體，如下文所討論。藥用和治療組合物本發明的抗體通常以藥物組合物的形式施用，其可包括除所述特異性結合成員外 的至少一種成分。因此，根據本發明的藥物組合物和用於根據本發明用途的藥物組合物可 包括除活性成分外的可藥用賦形劑、載體、緩衝劑、穩定劑或其他本領域技術人員公知的材 料。這些材料應當是無毒的，並且不幹擾所述活性成分的效果。載體或其他材料的精確性 質依賴於施用的途徑，其可以口服或注射，例如靜脈注射。用於口服施用的藥物組合物可以是片劑、膠囊、粉末或液體的形式。片劑可以包含 諸如明膠或佐劑的固相載體，液態藥物組合物通常包含諸如水、石油、動物或植物油、礦物 油或合成油的液相載體。還可包括生理鹽水溶液、葡萄糖或其他糖溶液或二醇類例如乙二
醇、丙二醇或聚乙二醇。用於靜脈內注射或病變位點注射時，所述活性成分是腸胃外可接受的水溶液形 式，其無熱原並具有適宜的PH值、等滲性和穩定性。那些本領域相關的技術人員能使用例 如諸如氯化鈉注射液、林格注射液、乳酸林格注射液的等滲賦形劑製備合適的溶液。若需要 可包含防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑和/或其他添加劑。
依賴於治療的狀況，組合物可單獨或與其他療法、治療劑或試劑同時或順序組合 施用。此外，本發明涉及和包括包含本文中描述的結合成員、尤其是抗體或其片段，以及其 他試劑或治療劑，例如抗癌劑或治療劑、激素、抗EGFR劑或抗體或免疫調節劑的組合物。更 一般而言，這些抗癌劑可以是酪氨酸激酶抑制劑或磷酸化級聯抑制劑、翻譯後調節劑、細胞 生長或分裂抑制劑(例如抗有絲分裂劑)或信號轉導抑制劑。其他療法或治療劑可包括施 用適當劑量的疼痛舒緩藥物，例如非留體抗炎藥(例如阿司匹林、對乙醯氨基酚、布洛芬或 酮洛芬)或麻醉劑(例如嗎啡)，或止吐藥。所述組合物可與酪氨酸激酶抑制劑(包括但不 限於AG1478和ZD1839、STI571、0SI-774、SU-6668)、阿黴素、替莫唑胺、順鉬、卡鉬、亞硝基 脲、甲基苄胼、長春新鹼、羥基脲、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、環磷醯胺、表鬼白毒素、卡氮芥、環 己亞硝脲和/或其他化療劑組合(順序(即之前或之後)或同時)施用。因此，這些試劑 可以是抗-EGFR特異性試劑，或諸如AG1478、ZD1839、STI571、0SI-774或SU-6668的酪氨酸 激酶抑制劑，或可以是更一般的抗癌和抗腫瘤劑，例如阿黴素、順鉬、替莫唑胺、亞硝基脲、 甲基苄胼、長春新鹼、羥基脲、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、環磷醯胺、表鬼白毒素、卡氮芥或環己 亞硝脲。此外，所述組合物可與諸如地塞米松的激素、諸如白介素、腫瘤壞死因子(TNF)或 其他刺激免疫應答和癌細胞或腫瘤減少或消除的生長因子或細胞因子的免疫調節劑一起 施用。諸如TNF的免疫調節劑可與雙特異性抗體的形式的本發明的成員組合，識別806EGFR 表位的同時結合TNF受體。所述組合物也可與其他抗-EGFR抗體一起施用或包括與其他抗 EGFR抗體的組合，包括但不限於抗-EGFR抗體528、225、SC-03、DR8. 3、L8A4、Y10、ICR62和 ABX-EGF。先前諸如阿黴素和順鉬的試劑與抗-EGFR抗體聯合使用已產生了增強的抗腫瘤 活性(Fan等，1993 ；Baselga等，1993)。阿黴素和mAb528的組合導致已建立A431異種移 植物的總體根除，而其中任一種試劑單獨治療僅引起暫時的體內生長抑制(Baselga等， 1993)。類似的，順鉬和mAb528或225的組合也導致良好建立的A431異種移植物的根除， 其在使用任一試劑治療時並未觀察到(Fan等，1993)。常規放射療法此外，本發明涉及和包括用於抗體組合常規放療的治療組合物。已表明用靶向EGF 受體的抗體治療可提高常規放射療法的效果(Milas等，Clin Cancer Res. 2000Feb 6(2) 7018，Huang 等，Clin Cancer Res. 2000Jun 6(6) :216674)。175抗體或其片段與抗癌治療劑的組合也是預期的，尤其是抗-EGFR治療劑，包括 其他抗EGFR抗體，證實能有效治療異種移植瘤，尤其具有協同作用。AG 1478和mAb 175的 組合就是這樣的示範性組合。AG 1478 (4-(3-氯苯胺基)-6，7-二甲氧基喹唑啉)是EGF受 體激酶的有效選擇性抑制劑，其特別描述於美國專利號5，457，105中，其整體通過援引引 入本文(同樣參見 Liu, W.等(1999) J. Cell Sci. 112 2409 ；Eguchi, S.等(1998) J. Biol. Chem. 273 8890 ；Levitsky, A. and Gazit, Α. (1995) Science 267 1782)。175 抗體與其他 抗-EGFR抗體、尤其是528抗-EGFR抗體的治療協同作用被預期和考慮。本發明還涉及可用於實施本發明治療方法的治療組合物。治療組合物的主題包括 混合物中的可藥用賦形劑(載體)和一種或更多種本文所述作為活性成分的抗體175或其 片段。在一個優選的實施方案中，所述組合物包括能調節本結合成員/抗體與靶細胞特異 性結合的抗原。
製備含有多肽、類似物或活性片段作為活性成分的治療組合物的方法在本領域是 公知的。通常，此類組合物製成可注射的液相溶液或混懸液。然而，也可以製備在注射前適 於溶解或混懸於液體中的固體形式。製劑也可以被乳化。活性治療成分通常與可藥用並且 與活性成分相容的賦形劑混合。適宜的賦形劑有，例如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等或其 組合。此外，如果需要的話，該組合物可含有少量的輔助性物質例如提高活性成分效果的溼 潤或乳化劑、PH緩衝劑。多肽、類似物或活性片段可製成中性可藥用鹽形式的治療組合物。 可藥用的鹽包括酸加成鹽(通過多肽或抗體分子的自由氨基形成)，其使用例如諸如鹽酸 或磷酸的無機酸類，或諸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有機酸類形成。從自由羧基形成 的鹽還可來源自諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵的無機鹼，以及 諸如異丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的有機鹼。含治療性多肽、類似物或活性片段的組合物常規通過靜脈例如注射單位劑量施 用。術語「單位劑量」當用於涉及本發明的治療組合物時是指適於人類單次給藥的物理分 離單位。每個單位含有經計算產生所需治療效應的預定量的活性物質和需要的稀釋劑即 載體或賦形劑。所述組合物以與劑型相容的方式按治療有效量施用。施用的量取決於所治療的受 試者、所述受試者免疫系統利用該活性成分的能力以及所需的EGFR結合能力程度。需要施 用的活性成分的精確量取決於醫生的判斷，對每個個體都是獨特的。然而，適宜的劑量範圍 為約0. 1至20、優選約0. 5至約10、更優選1至數毫克活性成分/千克個體體重/天，依賴 於施用途徑。適宜的起始施用和加強注射方案也是可變的，但通常為起始施用後以1或更 多小時的間隔重複注射或以其他方式給藥。或者，可考慮連續靜脈輸液以維持血濃度在10 納摩爾至10微摩爾。用於口服施用的藥物組合物可以是片劑、膠囊、粉末或液體形式。片劑可包括諸如 明膠或佐劑的固相載體。液相藥物組合物通常包括諸如水、石油、動物或植物油、礦物油或 合成油的液相載體。還包括生理鹽水溶液、葡萄糖或其他糖溶液或二醇類例如乙二醇、丙二 醇或聚乙二醇。用於靜脈內注射或病變位點注射時，所述活性成分是腸胃外可接受的水溶 液形式，其無熱原並具有適宜的PH值、等滲性和穩定性。那些本領域相關的技術人員能使 用例如諸如氯化鈉注射液、林格注射液、乳酸林格注射液的等滲賦形劑製備合適的溶液。若 需要可包含防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑和/或其他添加劑。診斷性分析本發明還涉及多種診斷性應用，包括通過藉助其被本175抗體識別的能力檢測諸 如異常表達的EGFR的刺激物的存在的方法。本發明抗體的診斷性應用包括對於本領域技 術人員來說是熟知和標準化的和基於本說明書的體外和體內應用。可利用體外評價和判定 EGFR狀態、尤其是關於EGFR的異常表達的診斷性分析和試劑盒診斷、評價和監測包括已知 或疑似患有癌症、癌前狀況、與過度增殖的細胞生長有關的狀況或來自腫瘤樣本的那些的 患者樣本。EGFR狀態的評價和判定同樣可用於確定患者臨床藥物試驗或特定化學治療劑 或特異性結合成員、尤其是本發明抗體，包括其組合，相對於不同試劑或抗體的施用的適合 性。此類診斷監測和評價實踐中已使用針對乳癌中HER2蛋白的抗體(Here印Test, Dako Corporation)，其中該分析也使用Here印tin用於評價進行抗體治療的患者。體內應用包 括腫瘤成像或評價個體的癌症狀態，包括放射成像。
如早先所討論的，本發明的診斷方法包括通過分析手段檢測細胞樣品或培養基， 所述分析包括有效量的針對EreR/蛋白的拮抗劑，例如抗EGFR-抗體，優選本文提供的 mAb 175。此外，本文中使用的抗-EGFR抗體分子優選是Fab、Fab'、F(ab' )2或？(力部分或 全抗體分子的形式。如前面所討論的，能從該方法中獲益的患者包括患有癌症、癌前病變、 病毒感染、由過度增殖細胞生長導致或與之有關的病理學或其他類似的病理學紊亂的那些
^^ ο細胞內EGFR的存在可通過常規的用於此類檢測的體外或體內免疫學方法確定。 已知許多有效的方法。這些方法與其應用是本領域技術人員熟知的，因此可在本發明的範 圍內利用。在這些方法中，EGFR與一個或更多個抗體或結合夥伴形成複合物，該複合物的 一個成員用可檢測的標記物標記。複合物的形成及其數量(如果需要的話)可通過已知適 用於檢測標記的方法確定。大多數情況下用於這些研究的標記物是放射性元素、酶、暴露於 紫外光下發出螢光的化學物等等。已知許多螢光材料可用於標記物。其包括，例如螢光素、 玫瑰紅、金胺、德克薩斯紅、AMCA藍和螢光黃。EGFR或EGFR抗體175也可用放射性元素或 酶標記。放射性標記可通過任何現有的計數方法檢測。優選的同位素可選自3H, 14C，32P，35S, 36C1，51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 9°Y，121I，124I，125I，131I，mIn，211At，198AU，67CU，225AC，213Bi，99TC 和 186Re0 酶標記物也是有用的，可通過任何現有的比色法、分光光度法、螢光分光光度法、電流檢測 法或氣體定量技術檢測。酶與選定的顆粒通過與橋接分子諸如碳化二亞胺、二異氰酸鹽、戊 二醛等反應進行綴合。許多可用於這些方法中的酶是已知並可利用的。優選過氧化物酶、 β-葡糖苷酸酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加過氧化物酶 以及鹼性磷酸酶。例如參考美國專利號3，654，090,3, 850，752和4，016，043的備選標記材 料和方法。在本發明的另一個實施方案中，可製備適於內科醫師使用的商用檢測試劑盒以確 定疑似靶細胞中EGFR異常表達的存在與否，包括但不限於擴增的EGFR和/或EGFR突變。 根據上文討論的檢測技術，一類所述試劑盒將含有至少標記的EGFR或其結合夥伴，例如其 特異性抗體(抗體175)和說明書，當然其依賴於所選擇的方法，例如「競爭性」、「三明治」、 「DASP」等。所述試劑盒可還含有外周試劑，例如緩衝劑、穩定劑等。因此，可製備用於證實細胞的EGFR異常表達或異常形式存在或能力 (capability)的檢測試劑盒，包括(a)預定量的至少一種標記的免疫化學反應性組分，通過175抗體或其特異性結 合夥伴直接或間接連接可檢測標記物獲得；(b)其他試劑；以及(c)所述試劑盒的使用說明。根據上文，可製備用於篩選有效調節EGFR活性或EGFR異常表達，和/或所述抗體 (尤其是175抗體)活性或結合的潛在藥物的測試系統。受體或抗體可引入檢測系統，預期 的藥物也可引入所得的細胞培養物中，隨後檢測所述培養物，觀察細胞S期活性的任何變 化，其與單獨加入所述預期藥物或與已知試劑加入量的效果有關。本發明還提供了編碼本發明抗體175的分離的核酸。核酸包括DNA和RNA。在一 個優選的方面，本發明提供了編碼如前文所定義的本發明多肽的核酸，包括如SEQ ID NOs1、2、3、4、5和/或6所示的多肽。本發明還提供了質粒、載體、轉錄或表達盒形式的構建體， 其包括至少一種上述多核苷酸。本發明還提供了包含一種或更多種上述構建體的重組宿主 細胞。所提供的編碼任何抗體175的核酸其本身構成了本發明的一個方面，包括從其編碼 核酸的表達的產生該抗體的方法也是如此。表達可通過在合適的條件下培養含有該核酸的 重組宿主細胞方便地完成。通過表達產生後，可使用任何適宜的技術分離和/或純化特異 性結合成員，隨後適當時使用。根據本發明，抗體和編碼核酸分子和載體可分離和/或純化提供，例如從其天然 環境中以基本純或均質的形式提供，或在核酸的情況下，不含或基本不含除編碼所需功能 多肽的序列以外的核酸或基因來源。根據本發明，核酸可包括DNA或RNA，可以是全合成或 部分合成的。多種不同宿主細胞中的多肽克隆和表達系統是公知的。適當的宿主細胞包括 細菌、哺乳動物細胞、酵母和杆狀病毒系統。本領域中可獲得的用於表達異源多肽的哺乳動 物細胞系包括中國倉鼠卵巢細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞、NSO小鼠黑色素瘤細胞和許多 其他細胞。通常，優選的細菌宿主是大腸桿菌。抗體和抗體片段在原核細胞例如大腸桿菌 中的表達已在本領域確立。綜述可參見PlUckthun，A. Bio/Technology 9 :545_551 (1991)。 作為產生特異性結合成員的另一種選擇，真核細胞培養物中的表達也是本領域技術人員已 知的，近期綜述可參見例如，Raff, Μ. Ε. (1993)Curr. Opinion Biotech. 4 :573_576 ；Trill J.J.等(1995) Curr. Opinion Biotech 6 :553_560。可選擇或構建適當的載體，其含有合適 的調控序列，包括啟動子序列、終止子序列、多腺苷酸化序列、增強子序列、標記物基因和其 他合適的序列。載體適當時可以是質粒、病毒例如噬菌體或嗜菌粒。更多詳細情況參見例如 Molecular Cloning :a Laboratory Manual :2nd edition，Sambrook等，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press。許多操作核酸的已知技術和方法，例如製備核酸構建體、誘 變、測序、將DNA引入細胞和基因表達以及蛋白質分析等，詳細描述於Short Protocols in MolecularBiology,Second Edition，Ausubel 等 eds. ，John Wiley&Sons，1992。 Sambrook 等和Ausube 1等的公開的內容通過援弓I弓I入本文。因此，本發明的另一方面提供了含有編碼本文所公開抗體的核酸的宿主細胞。另 一個方面提供了包括將所述核酸引入宿主細胞的方法。該引入可使用任何現有技術。引入 後可引起或允許核酸的表達，例如通過在表達基因的條件下培養宿主細胞。在一個實施方 案中，本發明的核酸被整合到宿主細胞的基因組(例如染色體)內。根據標準技術，可加入 促進與基因組重組的序列促進整合。本發明還提供了包括在表達系統中使用上述構建體以 表達前述抗體或多肽的方法。如前所述，本發明還涉及重組DNA分子或克隆的基因，或其簡併的變體，其編碼具 有如SEQ ID N0s:l、2、3、4、5和/或6所示胺基酸序列的抗體175或其片段，優選是核酸分 子。如本領域公知的，DNA序列可通過與表達調控序列在適當的表達載體中可操作的連接 並使用所述表達載體轉化合適的單細胞宿主進行表達。在選擇表達調控序列時，通常考慮多種因素。它們包括例如系統的相對強度、其可 控性、與要表達的特定DNA序列或基因的相容性，尤其是可能的二級結構。適宜的單細胞 宿主將根據例如其與所選擇載體的相容性、其分泌特性、其正確摺疊蛋白的能力、其發酵需 求，以及要表達的DNA序列編碼產物對宿主的毒性和表達產物純化的難易程度進行選擇。 考慮到這些和其他因素，本領域技術人員將能夠構建多種載體/表達調控序列/宿主組合，
27以發酵或大規模動物培養物的形式表達本發明的DNA序列。諸如片段的類似物可通過例如胃蛋白酶消化抗體肽或材料產生。其他類似物， 例如突變蛋白質可通過特異性結合成員編碼序列的標準定點誘變產生。具有抗體175樣 活性的類似物，例如作為啟動子或抑制劑起作用的小分子，可通過已知的體內和/或體外 測試鑑定。編碼175抗體的DNA序列可合成而非克隆製備。全序列從使用標準方法製備 的重疊寡核苷酸裝配成全編碼序列，參見例如Edge，Nature, 292 =756(1981) ；Nambair等， Science, 223 1299 (1984) Jay 等，J. Biol. Chem.，259 :6311(1984)。合成的 DNA 序列可 方便地構建表達特異性結合成員類似物或「突變蛋白」的基因。或者，編碼突變蛋白的DNA 可通過定點誘變天然特異性結合成員基因或cDNA製備，突變蛋白可使用常規多肽合成直 接製備。關於非天然胺基酸位點特異性整合到蛋白質中的一般性方法描述於Christopher J. Noren, Spencer J. Anthony-Cahi11, Michael C. Griffith, Peter G. Schultz, Science, 244 =182-188 (Aprill989)。該方法可用於產生含非天然胺基酸的類似物。本發明可通過參考以下非限制性實施例更好地理解，其僅作為本發明的示例提 供。以下實施例用於更全面地說明本發明優選的實施方案，但不應以任何方式解釋為限制 本發明的寬範圍。
實施例本發明可通過參考以下非限制性實施例更好地理解，其僅作為本發明的示例提 供。以下實施例用於更全面地說明本發明優選的實施方案，但不應以任何方式解釋為限制 本發明的寬範圍。實施例1概述EGFR以兩種明確定義的構象異構體存在——受束縛(tethered)和不受束縛的 (imtethered)。受束縛的構象異構體僅在無配體的(和部分連接的)受體形式下觀察到， 其可由配體誘導形成不受束縛的背靠背二聚體。mAb806識別細胞表面上某些截短的、過表 達或活化形式的EGFR上的表位，但其不識別正常未刺激細胞上的EGFR。另一個相關的抗 體mAbl75同樣識別該非正常的表位。我們測定了與抗體mAb806和mAbl75的Fab結合的 EGFR287^02肽表位的3D結構。在所述抗體的存在下，肽表位採用了與兩種形式的受體非常類 似的構象。然而，mAb806或mAbl75抗體與wtEGFR結構的結合可通過Fab與受束縛或不受束 縛構象的CRl結構域顯著的立體衝突而抑制。CRl結構域的3D構象檢查表明就在表位之前 的二硫鍵的打斷使得CRl結構域充分打開以允許結合任一抗體。半胱氨酸突變體EGFRe27w C283a不僅結合mAb806和mAb 175，而且化學計量是1 1 (即，等價於識別EGFR L2配體結 合結構域的mAb528)。然而mAb806不能抑制表達野生型EGFR細胞的體外生長，mAb806完 全抑制了表達EGFRe271A/e283A的BaF/3細胞的配體相關刺激。我們的結果顯示抗體mAb806和 mAbl75的結合機制需要在受體活化或截短或過表達期間表位優先暴露的EGFR形式，因此， 與其他EGFR抗體相反，mAb806優先位於過表達EGFR癌症患者的腫瘤內，該作用機制揭示 了通過過表達的、截短的或活化形式的EGFR家族受體檢測腫瘤和改善抗體/抑制劑殺傷癌 細胞的新方法。重要性
EGFR參與刺激了許多人腫瘤的生長。儘管已使用抑制劑和拮抗劑作為治療劑，成 功依然受到限制。部分原因在於對正常組織EGFR的幹擾，部分緣於某些試劑有限的暫時效 果，即Ab具有更長作用。抗體mAb806和mAbl75識別受體的異常構象，其通常在腫瘤細胞 上存在，但在正常細胞上不存在。這些抗體與EGFR的三維結合位點鑑定了解釋其腫瘤特異 性的異常構象。這些抗體與其他抗-EGFR試劑協同作用誘導小鼠中複雜的腫瘤的殺傷。使 用放射性標記形式的抗體在癌症患者中的初步結果證實了腫瘤選擇性。引言其配體家族對EGFR活化的理解一直是挑戰性的，但精緻的遺傳學(1_3)、生物物 理學(4-8)，和最近的晶體學(9-17)研究揭示了活化EGFR細胞內酪氨酸激酶結構域需要的 眾多複雜的系列構象變化和聚集事件(18)。在這些複雜性中，很明顯溶液中EGFR胞外結構 域有至少兩種主要構象無活性的受束縛構象和活性的不受束縛或伸展的配體結合的「背 靠背」二聚體。EGFR是首個與癌症相關的生長因子受體(19-20)。EGFR通過自分泌配體活 化(19 ；21 ；22)，並且在大部分的晚期神經膠質瘤中，EGFR受體胞外結構域被截短(23 ；24) 並由此活化。通常需要EGFR的活化以維持惡性狀態。相反，除了少數毛囊和Brimner腺細 胞外，成年有機體中EGFR以低水平表達，並且在成體生命中是無活性的。已開發了靶向EGFR的兩類主要試劑酪氨酸激酶抑制劑(TKI' s)和單克隆抗體 (mAb's) ο TKI，s 例如 gefitinib(ZD1839)和 erlotinib (0SI-774)競爭性結合 EGFR 的 ATP 口袋以抑制其活化。相反，針對EGFR的抗體例如西妥昔單抗(cetuximab) (C225)和帕尼單 抗(panitumumab) (ABX-EGFR)競爭性地抑制配體結合，由此防止受體活化。抑制劑和抗體 兩類物質在EGFR依賴的小鼠異種移植物模型中具有顯著的抗腫瘤活性(25-29)，均已批准 用於包括NSCL、胰腺、頭頸和結腸癌的選擇性癌症中(30-32)。儘管對這些EGFR治療劑的 響應率為中等的，期望成功鑑定對EGFR阻斷應答的患者亞群體能改善患者的結果。例如在 神經膠質瘤中，對Tarceva的響應似乎很大程度上局限於對Δ 2_7EGFR(也稱為EGFRvIII， 通常在神經膠質瘤中表達的EGFR胞外截短體)和PTEN雙陽性的患者亞群(33)。這些治療 劑顯示希望的同時，其使用也受到劑量限制性毒性的限制，例如顯著表達EGFR的正常皮膚 中大量攝取這些試劑後導致的皮疹。許多神經膠質瘤過表達EGFR(23 ；34)，主要是因為EGFR基因的擴增。EGFR基因在 神經膠質瘤中的擴增也與突變事件有關，其導致外顯子2-7(34)切除，隨後表達上述提到 的截短的、部分活化的Δ 2-7EGFR形式的EGFR (35 ； 36)。Δ 2-7EGFR在N末端含有獨特的融 合肽，其由外顯子1和8的拼接和插入獨特的甘氨酸產生。已描述了某些靶向該接合肽的單 克隆抗體(34)，由此代表了對A2-7EGFR具有特異性的潛在的治療劑。我們使用過表達該 截短的EGFR的NR6細胞(無內源性EGFR家族成員的3Τ3變體)產生了一系列的Δ 2-7EGFR 特異性抗體。在強力結合A2-7EGFR的同時，某些抗體當過表達時還結合wtEGFR，但以生 理水平表達時不結合。這些抗體的最佳描述mAb806(35 ；37 ；38)似乎不結合表面表達低於 IxIO5EGFR的細胞，而僅僅更高的表達水平才產生mAb806反應性EGFR的獨特群體(受體總 數的 5-10% ) (35，37，38)。隨後的表位作圖研究表明mAb806與胞外結構域上胺基酸287-302之間的短半胱 氨酸環相結合，該胞外結構域上胺基酸287-302僅在EGFR從受束縛構象轉化為伸展構象時 短暫暴露(23，28)。因此，僅在具有受體解束縛有利條件的細胞內發現mAb806反應性，例如存在突變(例如A 2-7EGFR)、過表達或受體活化的細胞。在EGFR過表達的情況下，似乎非 配體依賴的EGFR活化和糖基化變化導致解束縛增加(39)。這些情況常見於腫瘤細胞中，但 在正常組織中較少。因此mAb806能夠優先靶向腫瘤細胞而非諸如肝的正常組織。實際上， 我們最近採用mAb806的嵌合體完成的I期臨床試驗結果表明該抗體靶向的表位未暴露於 正常組織中，但在EGFR陽性腫瘤範圍內是可及的(28 ；40)。在異種移植物中，mAb806已顯 示針對表達A 2-7EGFR的U87MG神經膠質瘤細胞，以及一系列其他在缺乏該突變情況下過 表達wtEGFR的模型的強抗腫瘤活性(28 ；40)。此外，mAb806在動物模型中與其他EGFR治 療劑組合使用時顯示協同抗腫瘤活性，所述其他EGFR治療劑包括EGFR激酶抑制劑(27)和 針對無關表位的抗體(47)。半胱氨酸殘基287和302之間的EGFR胺基酸序列足以結合mAb806，然而，儘管 A 2-7EGFR中發現的截短體清楚地暴露該半胱氨酸環以供mAb806結合，mAb806與wtEGFR 的結合機制僅部分被闡明。EGFR的全長胞外結構域和與配體結合的EGFR-ECDl片段的 晶體結構已被解析。這些結構的分析證明mAb806不能結合全長E⑶結構(13)中觀察到的 受束縛的EGFR或EGFR-E⑶^ (14)或EGFR-Era^ (42)構建體中所見的配體結合型不受 束縛的背靠背二聚體。因此我們假設mAb806結合存在於無活性和活性狀態之間的部分不 受束縛形式的wtEGFR。mAb806不能結合這些連接的不受束縛的EGFR進一步通過在防止 受體內化條件下用EGF預孵育表達BaF/3細胞的wtEGFR加以證實。在這些條件下更高百 分比的EGFR應當形成連接的背靠背二聚體，由此防止mAb806結合。清楚地證實了這一觀 察(43)。然而，穩定態下配體對mAb806結合的影響，例如在含強EGFR/配體自分泌環細胞 中可能發生，是未知的。有趣的是，雖然mAb806與細胞表面wtEGFR的結合依賴於受體的構 象，在免疫學的角度來說，該表位並非是構象性的，因為在Western印跡中mAb806是有效的 EGFR探針，S卩，其能識別變性的受體。顯而易見，EGFR構象決定的表位可及性是mAb806結 合的最關鍵因素，而非表位構象本身。mAb806還結合固定於塑料和表面等離子共振晶片上 的 EGFR (37)。在該報導中我們還以和mAb806同樣的方式描述了其他抗體的生物活性、特異性 和表位。為理解這些抗體的獨特的特異性我們測定了與mAb806和mAbl75的Fab片段和 游離Fab片段結合的mAb806肽表位(EGFR287_3C12)的3D結構。EGFR287_3(12在受體上的方位和 與抗體結合的所述肽的構象證明mAb806必須結合特定形式的EGFR，該形式的摺疊不同於 觀察到的受束縛或伸展構象的wtEGFR。我們使用點突變檢查了鄰近半胱氨酸環(胺基酸 271-283)對EGFR結構和mAb806/175反應性的影響，因為該環似乎嚴格限制了這些抗體的 結合。我們報導了 mAb806和175針對DU145異種移植物(一種具有強TGF- a /EGFR自分 泌刺激環的前列腺細胞系)的效果，以及放射性標記的mAb806與處於I期治療的頭頸癌患 者的結合(44)。結果mAbl75 特異性初步結合研究表明mAbl75具有類似於mAb806的EGFR特異性。在mAb806 (IgG2b) 和mAbl75(IgGl)的CDR區，胺基酸序列幾乎相同，每個只有一個胺基酸的差異(圖1)。所 有這些差異保留了側鏈的電荷和大小。顯然，這些抗體獨立出現。我們進行了一系列免疫組化實驗以分析mAbl75結合的特異性。mAbl75染色過表達EGFR的A431異種移植物切片(圖2A)和表達A 2-7EGFR的U87MG. A 2-7神經膠質瘤異 種移植物切片(圖2A)。相反，mAbl75不染色U87MG異種移植物切片。U87MG細胞系僅表 達中等水平的野生型EGFR(圖2A)，無可檢測的EGFR自分泌環。最重要的是，mAbl75不結 合正常人肝切片(圖2B)。因此，mAbl75似乎具有與mAb806同樣的特異性，即其檢測過表 達和截短的人EGFR，而非以中等水平表達的wtEGFR。mAbl75表位的鑑定由於mAbl75還結合A 2_7EGFR(其缺失胺基酸6-273)和EGFR:.，殘基274-501 內必須含有mAbl75表位。當確定mAb806表位時，我們表達了一系列與人GH羧基端融合的 c-myc-標記的EGFR片段，其均在胺基酸501處終止(45 ；46)。mAbl75還在Western印跡 中與274-501和282-501EGFR片段反應，但未檢測到開始於胺基酸290或298的片段(增 補圖9)。使用c-myc抗體、9E10驗證了所有GH-EGFR融合蛋白的存在(增補圖9)。因此， mAbl75表位的關鍵決定簇確定位於胺基酸290附近。最後，缺失mAb806表位(A 287-302) 的274-501EGFR片段不與mAbl75結合(圖9)，表明該區域類似地決定大部分mAbl75的結合。我們進一步使用第二種方法鑑定了 mAbl75的表位。在酵母的表面表達包括EGFR 胞外結構域的片段，使用流式細胞術，通過間接免疫螢光測定mAbl75的結合。mAbl75識 別酵母片段273-621，其相應於A2-7EGFR的胞外結構域，但不識別片段1-176、1-294、 294-543或475-621 (圖3A和3B)。因此，至少部分的mAbl75表位必須包含在胺基酸274-294 間的區域內，與我們使用EGFR片段的免疫印跡數據一致。由於mAbl75結合變性的273-621 片段(圖3C)，表位必須是天然線性的(增補圖9)。顯然mAb806和mAbl75識別EGFR的類 似區域和構象。使用表面等離子共振(BIAcore)，我們研究了 mAbl75與EGFR肽 (287CGADSYEMEEDGVRKC302 (SEQ ID NO: 14))的結合。使用胺、巰基二硫化物交換或 Pms-Ser 偶聯化學將EGFR287_3(I2固定於生物感應器表面。後一種方法通過N末端的半胱氨酸特異性 固定該肽(47)。mAbl75以所有方位與EGFR287_3(12結合(表1)。Pms-絲氨酸偶聯的mAb 175 和EGFR287_3(12親和度為35nM，胺偶聯為154nM。在所有情況下，mAb 175與EGFR287_3(12的結合 親和度低於mAb806 (表1)。我們還測定了 mAbl75與EGFR的兩種不同胞外片段的親和度。 mAb 175結合1-501片段的親和度與該肽類似(16nM對35nM)(表1)。正如預期，mAbl75針 對1-621全長胞外結構域(其可形成受束縛的構象)的親和度要低的多(188nM)。儘管 mAb806和mAbl75對於EGFR287_3(12具有類似的親和度，mAb 175似乎具有對EGFR胞外結構域 的更高親和度(表1)。顯然，mAb 175表位位於EGFR287_302內，並且類似於mAb806, EGFR胞 外結構域的結合親和度依賴於構象。表1 與EGFR表位結合的mAb806和mAbl75抗體親和度BIAcore測定 使用表達在酵母表面的273-621EGFR片段突變體群鑑定mAbl75表位的精細結構 (45 ；46)。mAbl75和mAb806具有近乎相同的對突變體的反應性模式(表2)。287-302 二硫 鍵的打斷對於表位反應性僅具有中等的影響，因為所有突變體與抗體均在C287處結合，某 些但非全部突變體在C302處結合(表2)。對mAbl75結合起關鍵作用的胺基酸包括E293、 G298、V299、R300 和 C302 (表 2)。mAbl75 似乎對突變 V299 和 D297 更為敏感，但 mAb806 同 樣顯示對這些位點某些突變的結合降低(表2)。同樣，mAbl75表位似乎與mAb806識別的 表位基本相同。表2 酵母上展示的EGFR表位287-302突變，以及mAb806和mAbl75的結合評分 mAbl75對由Δ 2-7EGFR或EGFR自分泌環刺激的腫瘤異種移植物的效果我們檢測了 mAb806和mAbl75對U87MG. Δ 2-7神經膠質瘤異種移植物的體內抗 腫瘤活性。抗體治療開始前建立異種移植6天(每周3次，兩周，標明日期)。此時平均 腫瘤體積為100mm3(圖4A)。當由於倫理道德原因處死對照組動物時，與賦形劑或mAb806 治療組相比，mAbl75治療導致總體腫瘤生長率下降，在接種後19天尤為顯著(相對對照P < 0. 0001，相對mAb806P < 0. 002)。此時的賦形劑、mAb806和mAbl75治療組平均腫瘤體 積分別為1530、300和IOOmm3 (圖4A)，證明mAbl75對於表達Δ 2-7EGFR的異種移植物具有 抗腫瘤活性。儘管U87MG細胞表達約1 X IO5EGFR/細胞，mAb806不能識別任何表面EGFR，由此 也不奇怪不能抑制U87MG的體內生長。此外，這些細胞不能共表達任何EGFR配體。為檢 測EGFR表位是否臨時暴露，從而能在含有EGFR自分泌環的細胞內被mAb806和mAbl75識 別，前列腺細胞系DU145與U87MG細胞表達wtEGFR的水平類似，然而與U87MG細胞不同的 是，0肌45細胞含有16 -(1基因的擴增，從而具有EGFR/TGF-α自分泌環。FACS分析表明， mAbl75和806均與DU145細胞結合(圖4B)，並且其均能免疫沉澱小部分從這些細胞中提 取的EGFR(圖4C)。兩種技術均顯示mAbl75具有更好的結合，然而，當與mAb528(結合L2 結構域)相比時，mAbl75和mAb806僅在這些細胞表面上結合EGFR亞組(圖4B和4C)。用 第二前列腺細胞系(LnCap)(數據未顯示)和結腸系(LIM1215)也觀察到類似的結果，其均 含有EGFR自分泌環(22 ；48)。顯然，在自分泌刺激環存在下，mAb806和mAbl75僅能識別少 量細胞上的EGFR。由於DU145細胞中表達的EGFR與mAbl75和mAb806的結合比U87MG細胞中表達 的EGFR更為有效，我們進行了一項研究以分析這些抗體在裸小鼠中生長的DU145異種移植 物中的抗腫瘤活性。治療開始前建立異種移植18天(每周3次，3周，標明日期)。此時平 均腫瘤體積為90mm3(圖4D)。mAbl75和mAb806均抑制了 DU145異種移植物的生長。對照 組在第67天處死，平均腫瘤體積為1145mm3，mAb806和mAbl75組分別為605和815mm3 (分 別地 ρ < 0. 007 和 0. 02)(圖 4D)。與 mAb806 和 mAbl75Fab 片段接觸的 EGFR287_302 的 3D-結 構為理解mAb806和mAbl75怎樣識別某些但非全部構象EGFR的分子細節，測定了兩 種抗體Fab片段單獨(解析度分別為2. 3和2. 8人)和與氧化的EGFR287_3(I2表位的複合物 的晶體結構(解析度分別為2. 0和1. 59人，圖5A和5B)。兩種情況中，自由和複合的Fab 結構基本相同，肽的構象和抗體CDR環能被很好的定義(圖5)。表位為β-帶結構，帶的一 端指向Fab，V299包埋在抗原結合位點的中心(圖5C-E)。表位的兩端均暴露於溶劑，與這 些抗體結合長得多的多肽相符。在與表位接觸的20個抗體殘基中，mAb806和mAbl75間僅存在兩個替換(圖1)。 mAbl75 接觸殘基有輕鏈 S30、S31、N32、Y49、H50、Y91、F94、W96 和重鏈 D32、Y33、A34、Y51、S53、Y54、S55、N57、R59、A99、G100、RlOl ；除輕鏈 N30、重鏈 F33 的序列差異外，mAb806 的 接觸殘基相同。EGFR287_3(12通過肽殘基293-302間的緊密接觸結合Fab，大部分接觸在殘基 297和302間。EGFR287_302主鏈原子和Fab間僅有的氫鍵為殘基300和302 (圖5F)。表位 序列的識別通過與殘基E293 (與Fab的H50和R101)、D297 (與Y51和N57)、R300 (與D32) 和K301 (通過水分子與Y51和W96)的側鏈氫鍵進行。疏水接觸在G298、V299和C302處產 生。293和302間表位骨架的構象基本與Fab806和Fabl75晶體相同(這些殘基中的 Ca原子的rms偏差=0.4人)。儘管受到二硫鍵的限制，肽的N末端(287-292)並不與任 一抗體結構發生顯著接觸，改變該區域的構象。然而，Fab806複合物中的該片段似乎更為 無序。更有趣的是，與抗體接觸的EGFR287_3(I2肽的構象非常緊密相關於受束縛或不受束縛的 EGFR結構骨架中觀察到的EGFR287_3Q2構象(Li等，2005 ；Garrett等，2002)。對於來自Fabl75 複合物的EGFR287_3Q2，C α位置的rms偏差分別為0. 66和0. 75人(圖5)。為進一步了解mAb806和mAbl75對EGFR的識別機制，在溶液中、自由態和806Fab 存在下，使用NMR光譜法研究了 15N標記的氧化肽EGFR287_3(I2的構象(詳見補充數據)。對 該自由肽進行共振分配，與那些比較無規捲曲。基本上，自由肽呈無規捲曲結構，而非天然 EGFR中看到的β-帶(14)。添加Fab後，觀察到共振位移。然而，由於加入Fab後顯著譜 線增寬產生的弱信號以及複合物的成功結晶，未進一步研究Fab806-表位複合物的溶液結 構。儘管如此，顯然當肽與mAb806(或mAbl75)的Fab片段結合時，似乎Fab選擇或誘導匹 配天然受體中肽的肽的構象。為什麼mAb806和mAb 175僅識別EGFR的某些構象？通過疊合EGFR287_3(12，我們 將mAbl75的Fab片段對接到EGFR的胞外結構域(受束縛的和不受束縛的單體)。對於 Δ 2-7-樣片段，沒有與受體顯著的立體衝突。在不受束縛的形式中，具有包埋的Fab的本 質上更可及的表面(920 A 2，受束縛形式為550人2)。因此，該抗原可與抗體的非⑶R區 具有額外的接觸，如酵母表達突變體所表明的那樣(45)。相反，將整個EGFR胞外結構域對 接到Fab上後，存在與表位前的CRl結構域部分(殘基187-286)實質上的空間重疊，並且 穿過Fab的中心(圖5D、Ε)。因此，由於CRl結構域在受束縛或不受束縛的構象中具有基 本相同的結構，mAb806或mAbl75不能結合任一形式的EGFR。顯然，允許表位結合的取向和 任一已知wtEGFR構象的CRl結構域的表位的取向之間必定存在差異。對CRl結構域的檢 查表明EGFR287-302前的二硫鍵(271-283)限制了多肽，其阻斷了對表位的可及；打斷二 硫鍵(即使其與指導結合抗體無關)預期能允許CRl結構域的部分展開，從而使mAb806或 mAb 175可及表位。EGFR 271-283 二硫鍵的打斷促進了 mAb806的結合蛋白質的二硫鍵提供了增強的結構剛性，但在某些細胞表面受體中，尤其是那些 細胞因子和生長因子受體中，臨時打斷二硫鍵和二硫化物交換可控制受體的功能(49)。由 於這是mAb806和mAbl75可及其結合位點的一種機制，我們試圖通過將271和283位之一 或兩者的半胱氨酸突變為丙氨酸殘基(C271A/C283A)以增加表位的可及性。將能表達全 長C271A-、C283A-或C271A/C283A-EGFR的載體轉染至IL-3依賴的Ba/F3細胞系中。選 擇以等價於wtEGFR水平表達C271A-和C271A/C283A-EGFR突變體的穩定Ba/F3克隆(圖 6A)。未觀察到表達高水平突變體C283A-EGFR的Ba/F3細胞。如前所述，wtEGFR幾乎不與 mAb806反應；然而，突變受體與mAb528、mAb806和抗-FLAG抗體同樣強烈地反應，表明該受體在細胞表面表達並且正確地摺疊，此時mAb806的表位完全可及。為確認mAb806相對 於wtEGFR更有效的識別C271A/C283A突變體，我們測定了 mAb806結合與mAb528結合的比 例。由於wt和C271A/C283A EGFR均是N末端FLAG標記的，我們還測定了與M2抗體結合 的mAb806和mAb528的比例。如之前所報導的，mAb806僅識別少量在Ba/F3細胞表面表達 的總wtEGFR(mAb806/528結合比為0. 08)(表3)。相反，mAb806事實上識別該細胞表面表 達的全部C271A/C283A突變EGFR(mAb806/528結合比為1. 01)(圖6A和表3)。表3 與表達wt或C271A/C283A EGFR的細胞的mAb806反應性 *四個獨立克隆的平均值。兩個半胱氨酸的突變沒有損害EGF結合或受體功能。表達C271A/C283A EGFR突 變體的BaF3細胞在EGF存在下增殖(圖6B)。我們重複觀察到EGF在表達C271A/C283A 突變的細胞中劑量效應曲線的左偏移，表明配體具有更高的親和性，或突變受體具有增強 的信號傳導潛能。Western印跡分析證實了 C271A/C283A突變體以類似於wtEGFR的水平 表達，並且是響應於EGF刺激的酪氨酸磷酸化(圖6C)。與其他細胞系中先前的研究一致， mAb806對體外EGF誘導的表達wtEGFR的Ba/F3細胞的增殖無任何效果，而阻斷mAb528的 配體完全抑制了 EGF誘導的所述細胞的增殖(圖6D，左)。相反，mAb806總體減少了 EGF誘 導的表達C271A/C283A突變體的BaF3細胞的增殖(圖6D，右)。當271-283半胱氨酸環破 裂時，不僅mAb806更有效的結合，而且一旦結合，mAb806防止了配體誘導的增殖。頭頸癌中的I期成像研究據報導，8名患者[1名女性和7名男性；平均年齡61歲(44_75)]完成了該I期 試驗(44)。所有的患者滿足了選擇標準，除8號患者外(其具有原發性腦瘤)，所有患者在 研究進入時均具有轉移性疾病。所有患者均觀察到腫瘤的抗體吸收，mIn-ch806 (嵌合的 mAb806)具有迅速和高水平的腫瘤吸收(圖7)。mIn-ch806從正常器官(肝、肺、腎和脾) 的清除顯示無劑量水平間的差異(44)。具體而言，肝清除顯示無劑量水平間的差異，表明肝 內無ch806的可飽和抗原室。剛輸液後總的肝吸收最大值為14. 45士2. 43% ID, 72小時後 下降到8·45±1·63% ID，輸液後一周下降到3. 18士0.87% ID。其顯著區別於wtEGFR抗體 的吸收(例如225)，其顯示在輸液後超過3天內在肝中超過30% ID(40mg劑量)(50)。測量的mIn-ch806峰值腫瘤吸收在輸液後5_7天到達。患者1和3的腫瘤吸收 不能精確地定量計算，因為靶病變接近心臟血池和患者走動。腫瘤中的峰值ch806吸收範 圍為5. 21至13. 73X 10_3% ID/gm腫瘤組織。腫瘤中的實際ch806濃度計算峰值為(平均 值 士 SD) 0. 85 士 0 μ g/gm(5mg/m2)、0· 92 士 0 μ g/gm(10mg/m2)、3. 80 士 1. 10 μ g/gm(20mg/m2) 以及 7. 05 士 1. 40 μ g/gm (40mg/m2)。
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討論當EGFR或相關的erbB2的水平或活性紊亂時，諸如西妥昔單抗和here印tin的靶 向EGFR家族成員的抗體是治療癌症的重要選擇。這些抗體結合位點、靶標受體以及最近抗 體受體複合物3D結構的確定加深了我們對於這些抗體如何幹擾受體激活的理解。這些研 究也暗示了靶向該受體家族上其他表位可能產生用於使用抗體組合以改善癌症的治療的 新的機會。不幸的是，所有當前可用的治療性抗-EGFR抗體均識別WtEGFR，其實際上在所有 的正常組織中表達。在正常組織中表達的EGFR不僅代表了所述抗體的大庫(large sink), 其在觀察到的劑量限制性毒性(例如皮疹)中可能是關鍵的，並且使得利用抗體/細胞毒 性綴合物不可能。雖然有這些問題，應當注意大多數正常組織缺乏活化的EGFR，因此中和 抗EGFR抗體似乎對生命內環境穩定信號傳導沒有深刻影響。相反，通過自分泌/旁分泌機 制、截短、突變、基因擴增和/或過表達，許多腫瘤含有活化的EGFR。重要的是，活化的EGFR 似乎通過增強細胞運動、增殖、侵襲、血管發生和腫瘤細胞存活促進腫瘤發生。因此，施用 抗EGFR抗體或EGFR激酶抑制劑能減少腫瘤細胞的生長和存活。針對Δ 2-7EGFR中獨特 接合肽的抗體能靶向某些腫瘤而沒有與正常組織吸收相關的困難(51)。在神經膠質瘤中， Δ 2-7EGFR的表達伴隨著wtEGFR的過表達，其不被其他Δ 2-7EGFR抗體抑制，但被mAb806 或mAbl75抑制。之前我們描述了抗體mAb806，其針對表達Δ 2-7EGFR的細胞。mAb806不僅結合該 截短的受體，還結合過表達的wtEGFR。mAb806識別半胱氨酸環內的表位(胺基酸287-302)， 當以低至中度水平在細胞上表達並且配體不存在時，其在A2-7EGFR中是可及的，但在 wtEGFR中是不可及的。類似的，純的EGFR全長胞外結構域(EGFIV621)。該抗體的表位被發 現位於EGFR胞外結構域的鉸鏈區附近，其在形成活性狀態時發生構象改變。此外，該表位 不僅包埋在非活性構象中，其在配體結合的背靠背不受束縛EGFR 二聚體中也是不可及的。 mAb806的該有趣的性質促使我們再次分析了表達分離自起始融合物(38)的單克隆抗體的 其他雜交瘤。在最初的篩選中，其中之一的mAbl75具有與mAb806類似的EGFR結合性質。 它們的CDR環內的胺基酸序列非常相似(90%的序列同一性)。這些區別保留了有關側鏈 的大小和電荷。象mAb806—樣，mAb 175染色過表達EGFR或表達Δ 2-7EGFR的腫瘤細胞，但 不染色具有中度水平wtEGFR的細胞，例如人肝。詳細的表位作圖顯示，mAbl75不僅結合與 mAb806相同的半胱氨酸環，其還具有與一系列含有環內點突變的突變體近乎相同的結合概 況。此外，兩種抗體的結合均不需要用於結合的表位二硫鍵是完整的。mAb806和mAbl75均具有針對表達Δ 2-7EGFR的人神經膠質瘤異種移植物的抗腫 瘤活性，兩者均誘導腫瘤生長顯著延遲，雖然mAbl75在該模型中略微更為有效。有趣的是， mAb806和mAbl75結合在DU145前列腺細胞上表達的EGFR，該細胞系表達中等水平的EGFR 但分泌顯著量的自分泌型TGF-α (52)。當用於過表達EGFR的細胞系時，兩種抗體僅結合 少量的DU145細胞表面EGFR。然而，兩種抗體均抑制了裸小鼠中DU145異種移植物的生 長。因此，在生理條件下配體的存在增加了 EGFR過渡形式的可用性，該形式可被這些抗體 識別，靶向該形式足以下調EGFR驅動的細胞生長。此類抗EGFR抗體可能具有比一開始預料的更寬的抗腫瘤作用。此外，mAb806與其 他EGFR治療劑組合使用時的協同活性(41)暗示此類抗體的直接(immediate)治療作用。mAb806還結合含有活化EGFR激酶的癌相關突變的腫瘤細胞。mAb806和mAbl75選擇性的 結合含有活化EGFR的細胞，可能是鑑別和/或監測可能響應現有批准的EGFR治療劑的患 者的有效試劑。我們對EGFR287_3(12表位的結構研究表明，mAb806和mAbl75均識別同樣的3D結構基 序。與mAb806和mAbl75接觸的肽殘基在兩種情形下具有幾乎相同的結構，表明這是這些 胺基酸在產生抗原A2-7EGFR中的構象。實際上，這些抗體/肽結構中發現的EGFR287_3(I2肽 骨架與兩種已知的EGFR結構構象緊密匹配。然而，這些結構中表位的取向防止了抗體與相 關胺基酸的可及其與抗體806不結合wtEGFR的實驗觀察一致。對EGFR結構的詳細檢查 導致了另一個有趣的可能性。EGFR287_3(12表位從第二個二硫鍵鍵合的環(胺基酸271-283) 上懸掛，打斷該二硫鍵將在不改變該表位骨架構象的情況下使EGFR287_3(I2環變得可及(見圖 8)。C271A/C283A EGFR突變體的結果顯示，CRl結構域必須開放，以使得mAb806和mAbl75 與突變受體化學計量地結合。該突變受體依然可採取對EGF刺激完全響應的天然構象，但 與wtEGFR不同，其被mAb806完全抑制。在過表達wtEGFR的細胞表面，清楚地存在受體的亞群，其中EGFR287_3(12表位是可被 mAb806或mAbl75結合的。由於結合最容易發生在受體活化的時候，還不清楚該受體亞群 是處於到不受束縛形式的構象過渡的那些，還是處於從不受束縛形式到連接的活化狀態的 過渡的那些，抑或271和283間的二硫鍵已被破壞(還原)的EGFR亞群是否存在不完全氧 化。若癌細胞表面存在還原形式的EGFR，我們的數據清楚地顯示其可能是活性的，並能夠 起始細胞信號傳導。儘管僅結合少數受體亞群和不抑制EGFR的下遊信號傳導，mAb806抑 制過度表達wtEGFR的異種移植物生長的能力依然是一個謎。由於這個原因，mAb806與獨 特的具有異常信號傳導性質的EGFR亞群的結合常常是人們感興趣的內容，尤其是當其與 其他EGFR治療劑具有巨大的協同作用時。如果存在於癌細胞的細胞表面，271-283 二硫鍵 還原的EGFR可代表EGFR的該獨特形式。最後，應當記住的是，儘管Δ 2-7EGFR中的缺失很 大，其終止於胺基酸273。A2-7EGra缺少該二硫鍵，已知具有與wtEGFR不同的信號傳導性 質。另一方面，活化EGFR的激酶突變、自分泌環和低糖基化(underglycosylation)也能通 過增加受體的活化增強mAb806的反應性，推測不需要打斷271-283 二硫鍵。這些觀察支持 了 CRl結構域可扭結以允許在EGFR活化期間某時間點可及EGFR287_3(12，但在受束縛和配體 結合狀態下被保護不扭結的觀點。我們當前正進行研究以確定mAb806識別的EGFR是否含 有還原的271-283 二硫鍵。嵌合806 (ch806)的I期試驗結果分析證明，mAb806靶向的表位是腫瘤特異性的。 定量生物分布分析清楚顯示了 ch806在腫瘤中的快速和特異性吸收。這些數據與癌細胞 上表達的抗原的抗體最高定量靶向一致，顯著高於相同劑量下wtEGFR抗體的值(44;50)。 Ch806在所有正常組織中的吸收(包括肝)很低，表明無結合正常組織中wtEGFR的證據，在 肝中僅代表血池活性和少量自由mIn-螯合物的分解代謝。雖然施用了大劑量的蛋白(高 達300mg) (50)，其顯著區別於靶向wtEGFR的抗體(例如225 ；西妥昔單抗)，後者顯示輸液 後在肝中保留了很高的吸收(20-30% ID)超過72小時。此外，在腫瘤明顯吸收前，wtEGFR 的抗體需要大負荷的劑量以飽和正常組織(50)，還具有來自結合皮膚和腸的wtEGFR的抗 體的劑量限制性毒性(55)。這些結果表明，mAb806不靶向人體正常組織，生物分布的定量 分析證明了體內mAb806靶向的EGFR表位的腫瘤特異性。
使用來源自mAb806或mAbl75的抗體靶向EGFR287_3(12表位是在最小化正常組織吸 收的情況下攻擊癌細胞中活化的EGFR的一種途徑。該受體的活化可由許多癌相關的機制 導致。同樣可能最重要的是，這些抗體可用於將細胞毒素、治療性納米顆粒、SiRNA和放射 性同位素直接靶向至腫瘤位點。最後，這些研究證明，mAb806和mAbl75是幫助將與細胞表 面EGFR活化相關事件作圖的有效工具。在分子水平上理解抗體如何識別異常和活化形式的生長因子受體而不識別非活 性的野生型受體，這一工作可用於產生針對癌症治療劑其他靶點(例如EGFR家族的其他成 員)的抗體。一種方法可使用與抗體mAb806和mAbl75化學計量地結合的二硫化物突變體 EGFR-C227A/C283A。當erbB2、erbB3或erbB4連續過表達或活化時，如果發現EGFR構象 幹擾作用，則這些受體對應的二硫化物突變體可作為免疫原建立對腫瘤選擇性的其他EGFR 家族成員靶向抗體。此外，當腫瘤細胞過表達其他受體時，尤其是那些富含二硫化物結構域 的，例如Trk，一部分這些受體可由於低糖基化或臨時二硫鍵打斷而部分錯誤地摺疊。可以 想像，二硫鍵突變體或截短的受體可類似用於可能產生識別其他異常表達受體的抗體的免 疫原。實驗操作細胞系A2-7EGFR轉染的U87MG. Δ 2-7 (54)和Α431細胞系(2)之前已描述。非依賴激素 的前列腺細胞系DU145(55)從ATCC獲得(atcc.org)。見細胞系生長條件的補充數據。抗體、Fab和肽mAb806 禾口 mAbl75 在生物生產實驗室(Ludwig Institute for CancerResearch, Melbourne)中生產和純化。抗體，抗體片段和肽表位的製備和鑑別見補充數據。使用哺乳動物細胞和酵母中表達的EGFR片段對mAbl75作圖作圖按補充數據中所述進行。表面等離子共振(BIAcore)使用BIAcore 3000進行所有實驗。以5 μ 1/分的流速將含有假定mAb806表位 的肽通過胺、巰基或Pms偶聯固定於CM5感應晶片上(47)。mAb806和mAbl75在25°C下以 5 μ 1/分的流速流過感應器表面。批次間通過以10 μ 1/分的流速注入IOmM HCl再生表面。免疫沉澱和Western印跡細胞用裂解緩衝液(1%Triton X_100，30mM HEPES, 15OmMNaCl, 5OOmM 4_(2_ 氨 乙基)苯磺醯基氟，150ηΜ抑酶肽，ImM Ε-64蛋白酶抑制劑，0. 5mM EDTA和ImM亮肽素， PH7. 4)裂解20分鐘，在14，OOOxg下離心30分鐘使溶液澄清，用有關的抗體在終濃度5 μ g/ ml下免疫沉澱60分鐘，用S印harose-A珠捕獲過夜。隨後用2XNuPAGESDS樣品緩衝液 (Invitrogen)洗脫樣品，在NuPAGE膠(3-8%或4-12% )上解析，電轉移至Immobilon-P轉 移膜(Millipore)上，隨後用有關抗體探測後通過化學發光放射顯影檢測。免疫組織化學凍幹的切片用5 μ g/ml mAbl75或不相關的同種型對照在室溫下染色60分鐘。使 用Dako Envision+HRP檢測系統按廠商說明檢測結合的抗體。切片最後用水淋洗，用蘇木 精復染，包埋。異種移植物模型
將含U87MG. Δ 2-7細胞(3χ106)的100 μ L PBS皮下接種到4至6周齡雌性Balb/ c裸小鼠的兩側腹(Animal Research Centre，Perth，Australia)。所有研究使用先前報 道的已建立的腫瘤模型進行(41)。一旦腫瘤到達適當圖解中給出的平均體積則開始治療。 腫瘤體積(mm3)使用以下公式計算(長X寬2)/2，其中長是最長的軸，寬是垂直的測量值。 每個治療組的數據以平均腫瘤體積士 SE表示，所有的數據用單側Student 』 s檢驗進行顯著 性分析，其中P < 0. 05被認為是統計學顯著性的。該研究計劃已由Austin醫院的動物倫 理委員會批准。表達EGFR突變體構建體的穩定細胞系的產生和鑑定使用定點誘變試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA)產生(wt)EGFR的突變。各個 誘變的模板是人EGFR cDNA(登記號x00588) (2)。每個構建體進行自動核苷酸測序以證實 EGFR突變的完整性。野生型和突變體(C173A/C281A)EGFR通過電穿孔轉染至BaF/3細胞。 關於細胞系鑑定的其他詳細情況見補充數據。Fab 175和Fab806、Fab_肽複合物的晶體結構測定以及806肽表位在溶液中的NMR 結構製備和分析Fab806、Fab 175和單獨的Fab-肽複合物的晶體學方法以及15N-標 記的806表位肽在溶液中的NMR研究詳情描述於補充數據中。通過分子置換法測定結構， 利用下列收斂(converge)精修R = 0. 225/R 自由=0. 289 (Fab806)和 R = 0. 226/R 自 由=0. 279 (Fab806 肽)；R = 0. 210/R 自由=0. 305 (Fab806)和 R = 0. 203/R 自由= 0. 257 (Fab806 肽)。chAb 806腫瘤在患者中的生物分布為證明mAb806體內的腫瘤特異性，工程化並在cGMP條件下產生嵌合的形式 (ch806) (56)。進行I期首次人體試驗評價ch806在806陽性腫瘤患者中的安全性、生物分 布和免疫應答，安全性、生物分布和藥代動力學的結果之前已被報導(44)。為定義與患者正 常組織(即肝)相比的ch806腫瘤特異性，通過從注射5-7mCi (200-280MBq) luIn-ch806後 一周內獲得的全身Y照相機成像計算111In-ChSOem%注射劑量(ID)進行腫瘤和肝內的 ch806定量吸收。肝和腫瘤的劑量測定計算基於每名個體患者感興趣的區域mIn-ch806輸 液成像數據組進行，進行背景和衰減校準，允許計算累積活性。進行劑量測定計算以獲得注 射後一周內腫瘤和肝中的111In-Chsoe濃度。參考文獻1. Holbro, T. and Hynes, N. Ε. (2004) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44 195-217. ，195-217.2. Ullrich, A. , Coussens, L. , Hayflick, J. S. , Dull, T. J. , Gray, A. , Tam, A. W., Lee,J. ,Yarden,Y. ,Libermann,T. A. ,Schlessinger,J. ,and. (1984)Nature. 309,418-425.3. Yen, L. , Benlimame, N. , Nie, Z. R. , Xiao, D. , Wang, Τ. , Al Moustafa, Α. Ε., Esumi, H. , Milanini, J. , Hynes, N. Ε. , Pages, G. , and Alaoui-Jamali, M. A. (2002)Mol. Biol. Cell. 13，4029-4044.4. Clayton, A. H. , Walker, F. , Orchard, S. G. , Henderson, C. , Fuchs, D., Rothacker, J. ，Nice, E. C. ，and Burgess, A. W. (2005)J. Biol. Chem. 280,30392-30399.5. Gadella, T. W. J. and Jovin, Τ. M. (1995) Journal of Cell Biology 129, 1543-1558.
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44液(含lmg/ml BSA的PBS)洗滌IxlO6酵母細胞，隨後用抗-C-myc腹水(1 50稀釋)或 人EGFR單克隆抗體(10yg/ml)在4°C孵育1小時，最終體積為50 μ 1。細胞隨後用冰冷 的FACS緩衝液洗滌，用藻紅蛋白標記的抗-小鼠IgG(l 25稀釋)在4°C避光孵育1小 時，最終體積為50 μ 1。用冰冷的FACS緩衝液洗滌酵母細胞後，用Coulter Epics XL流式 細胞儀(Beckman-Coulter)獲得螢光數據，用WinMDI細胞計量軟體(J. Trotter，Scripps University)分析。為確定線性對構象性表位，用抗體標記前將酵母細胞在80°C加熱30分 鍾，隨後在冰上冷卻20分鐘。表2中列出的EGFR突變體系列如之前所描述(8)。表達EGFR突變體構建體的穩定細胞系的產生和鑑別表達EGFR突變體的細胞系的產生表達突變體EGFR的穩定細胞系通過在含新黴素的培養基中選擇獲得。最終選擇 後，從各個細胞系分離mRNA，逆轉錄並通過PCR擴增EGFR序列。通過對PCR產物測序，驗 證表達的EGFR中所有的突變。EGFR的表達水平通過FACStar (Becton and Dickinson, Franklin Lakes, NJ)上的 FACS 分析確認，使用 10 μ g/ml 的抗 EGFR 抗體 mAb528 (9 ； 10)的 PBS, 5% FCS, 5mM EDTA，隨後加入Alexa 488-標記的抗小鼠Ig (最終按1 400稀釋)。 將所述細胞與無關的、種類匹配的一抗孵育，確定背景螢光。所有細胞均在RPMI，10% FCS， 10% WEHI3B條件培養基以及1. 5mg/ml G418中常規傳代。EGF-依賴的突變體EGFR活化洗滌表達wtEGFR或C271A/C283A-EGFR的細胞，在無血清或IL-3的培養基中孵育 3小時。離心收集細胞，再次懸浮於含EGF(100ng/ml)的培養基或等體積的PBS中。15分鐘 後收集細胞，成粒(pelleted)並直接在含有β _巰基乙醇的SDS/PAGE樣品緩衝液中裂解。 在NuPAGE4-12%梯度膠上分離樣品，轉移至Immobilon PVDF膜上，用抗磷酸酪氨酸(4G10， Upstate Biotechnologies)或抗EGFR抗體(mAb806，產自LICR)探測。通過化學發光檢測 反應條帶。EGF和抗體對細胞增殖的影響收集對數期生長的細胞，用PBS洗兩次，除去殘留的IL-3。將細胞再懸浮於RPMI 1640+10% FCS中，以IO5細胞/孔與僅僅載體或與遞增濃度的EGF —起接種到96孔板中。 適時還向培養物中加入固定濃度的mAb528或mAb806 (2 μ g/孔)。使用MTT測試確定增殖 (11)。與構象特異性抗體的反應性離心收集細胞，用對照或試驗抗體染色(FACS緩衝液中濃度均為10yg/ml，冰 上40分鐘，在FACS緩衝液中洗滌)，隨後加入Alexa 488-標記的抗小鼠Ig(最終按 1 400稀釋，冰上20分鐘)。細胞用冰冷的FACS緩衝液洗滌，離心收集，在FACScan上 分析每個樣品使用CellQuest (Becton and Dickinson)的統計工具確定峰值螢光頻道 (peakfluorescence channel)和中位螢光。從所有測量值中扣除背景(陰性對照)螢光。 選擇中位螢光值為最具代表性的峰形和螢光強度，用於推導mAb806與mAb528結合的比例。175和806Fab、Fab-肽複合物的晶體結構測定以及806肽表位在溶液中的NMR結 構通過懸滴蒸氣擴散法生長天然806Fab的晶體，使用10mg/ml的Fab以及含有0. IM 乙酸鈉緩衝液，PH4. 6,6-8% PEG6000和15-20%異丙醇的貯液池。為進行數據收集，將晶體轉移至含有o．1M乙酸鈉緩沖液，pH4．6，lo％PEG6000，15—20％異丙醇和lo％甘油的冷凍保護劑溶液內。隨後將晶體安裝在尼龍環上，直接迅速冷凍至液氮中。
通過懸滴蒸氣擴散法生長806[；ab一肽複合物的晶體，使用10mg／ml的Fab一肽複合物以及含有o．2M乙酸銨，16一18％PEG5000單甲基醚的貯液池。隨後通過種晶法改善晶體質量。為進行數據收集將晶體轉移至冷凍保護劑溶液中，該溶液由補充有25％甘油的貯液池組成。隨後將晶體安裝在尼龍環上，直接迅速冷凍至液氮中。
175Fab一肽複合物的晶體最初通過自由界面擴散法生長，使用T。paZ結晶系統(Fluidigm，San FranCiSC。)。通過懸滴蒸氣擴散法生長微晶，使用7mg／ml Fab，條件類似，o．1M BiS—triS丙烷緩沖液，o．2M乙酸銨和18％PEG lo，000。然後將微晶劃線種晶到o．15m甲酸鈉和15％PEG 1500中，獲得小片狀晶體以改善微晶。為進行數據收集將晶體轉移至冷凍保護劑溶液中，該溶液由補充有25％甘油的貯液池組成。隨後將晶體安裝在尼龍環上，迅速冷凍至液氮中。
806[；ab和175Fab複合物品體的衍射數據在室內用RigakumiCromaX—007發生器上的R—AX工S IV檢測器收集，該發生器裝有AXC。鏡片。隨後用CryStalClear處理這些數據。806[，ab一肽複合物的數據在布克海文國家實驗室beam「ne X29的ADSC quant＼lm315CCD檢測器上收集，這些數據用HKL2000(12)處理(數據收集統計在表l中列出)。使用程序M。LRE[』(13)和Fab結構2E8的坐標，通過分子置換法解析天然806[；ab。該結構的精修用REFMA(5進行(14)，在C00t(15)中建立模型。806一肽和175Fab一肽結構均使用程序M。LREP和806]了ab結構的坐標通過分子置換法解析，在REFMA(5和C。。T和。中再次精修和重構，最終結構的驗證用PR。CHECK(16)和wIuTCHECK(17)進行。
NMR研究
為進行NMR研究，除大腸桿菌在補充有「NH。Cl的Neidhardt』S基本培養基中培養外(19)，使用先前Fair「e等描述的方法(18)重組製備與SHP2的SH2結構域的融合的「N一標記肽。使用NBr從融合夥伴切割所述肽，通過反相HPLC純化，MALDI—T。F質譜和N一端測序驗證其身份。806抗體結合序列內而非肽本身的甲硫氨酸突變成亮氨酸以能夠從融合夥伴上切割下來。
用於NMR研究的樣品在含有5％』H，。、70ram NaCl和50mMN~lP。。的pH6．8水溶液中製備。所有的譜圖在298K下在BrukerAVanCe500光譜儀上獲得，使用冷凍探頭。使用標準2D T。仁SY和N。ESY以及「N一編輯的T。仁SY和N。ESY譜建立所述肽在無m806[；ab情況下的序列比對。所述肽和Fab806的相互作用通過監測該肽在Fab806存在和不存在情況下的「NrtSQ(譜進行測定。所述肽在Fab806存在下的「N HSQC譜的譜幹擾清楚地顯示該肽能在溶液條件下結合Fab806。然而未測定該肽在複合物形式下的詳細結構。
補充數據表1．數據收集和精修統計
數據收集
806(天然)806(肽)175(天然)175(肽)
空『司群P2，2，2P2，P2，2，2，P2，2，2
晶胞大小(A)
a140．3735．9236．3783．17
b74．6283．1694．8069．26
C83. 8772. 21 β = 92.43 108.9071. 47
光源室內BNL Χ29室內室內
波長(A)1. 5421. 11. 5421. 542
解析度範圍(A)29. 7-2. 250-2. 050-2. 814. 18-1. 59
(2. 27-2. 20)(2. 07-2. 0)(2. 87-2. 80)(1. 65-1. 59)
R合併(% )6. 4(26. 7)6. 6(28. 2)8. 6(30. 0)
1/σ I12. 2(3. 2)22(3. 15)10. 2(2. 2)
完整度(％ )98. 3(91. 3)96. 6(79. 2)98. 4(90. 5)78. 8(11. 8)
98. Iatl. 89 A
總反射15649798374205401
獨特反射4490527692917143879括號內為最高解析度下的數據(精修解析度範圍(A)20-2. 372. 17-2. 0050-2. 614. 18-1.
反射3739726284917141611
R晶體0. 225 0 2260. 2100. 203
R自由0. 289 0 2790. 3050. 257
蛋白原子6580329432763390
溶劑原子20819946247
r. m. s. d 鍵長(A)0. 0220. 0070. 0150. 014
r. m. s. d 鍵角(°) 1. 701. 121. 771. 48
平均B-因子(A2)40. 333. 637. 520. 7
總各向異性B-因子(A2)
Bll-1. 522. 420. 201. 13
B222. 22-0. 26-1. 022-0. 38
B33-0. 70-2. 111. 03-0. 74
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權利要求
分離的抗體，其識別腫瘤發生、過度增殖或異常細胞內發現、正常細胞中檢測不到的EGFR表位，其中所述抗體不識別接合肽LEEKKGNYVVTDH(SEQ ID NO13)，所述抗體具有包含選自SEQ ID NOs1 3的胺基酸序列的輕鏈可變區CDR結構域序列，以及包括選自SEQID NOs4 6的胺基酸序列的重鏈可變區CDR結構域序列。
2.權利要求1的抗體，其識別EGFR胺基酸肽表位287CGADSYEMEEDGVRKC3Q2(SEQID NO:14)。
3.分離的抗體，其具有包含SEQID NOs :4、5和6的重鏈可變區⑶Rl、2和3序列。
4.分離的抗體，其具有包含SEQID NOs :1、2和3的輕鏈可變區⑶Rl、2和3序列。
5.根據權利要求1-4任意一項或更多項所述分離的抗體，其是全人的、人源化的或嵌 合的。
6.分離的抗體，其識別EGFR表位肽287CGADSYEMEEDGVRKC3Q2(SEQ ID NO 14)，不識別 de2-7EGFR接合肽LEEKKGNYVVTDH(SEQ ID NO 13)，其中所述抗體包含基本上如SEQ ID NOs :1、2、3、4、5和/或6的一種或更多種所示的多肽序列。
7.根據權利要求1-4或6的分離的抗體，其中所述結合結構域由人抗體框架攜帶。
8.抗體，其包含具有如SEQID NO :4、5和/或6所示的⑶R序列的可變重鏈和人IgGl 恆定區。
9.抗體，其包含具有如SEQID NO :1、2和/或3所示的⑶R序列的可變輕鏈和人κ恆定區。
10.根據權利要求1至9任一項所述的抗體，其是抗體F(ab' )2、ScFv片段、雙抗體、 三抗體或四抗體的形式。
11.根據權利要求1至10任一項所述的抗體，其攜帶可檢測的或功能性的標記。
12.根據權利要求11的抗體，其中所述標記是共價連接的藥物。
13.根據權利要求11的抗體，其中所述標記是放射性標記。
14.根據權利要求1至14任一項所述的抗體，其中所述抗體是PEG化的。
15.分離的核酸，其包含編碼如權利要求1至9任一項所定義抗體的序列。
16.製備如權利要求1至14任一項所定義的抗體的方法，其包括在一定條件下表達權 利要求15的核酸，以產生所述抗體的表達，以及回收所述抗體。
17.用於治療或診斷人或動物體方法的根據權利要求1至14任一項所述的抗體。
18.製備能結合EGFR腫瘤抗原的抗體的方法，該方法包括a)提供編碼缺乏CDR編碼 區的VH結構域的核酸的起始群；b)使所述群與編碼基本上如SEQ ID NO :4、5或6的一種 或更多種所示的胺基酸序列的供體核酸組合，使得所述供體核酸插入所述缺失的CDR區， 以提供編碼VH結構域的核酸的產物群；c)表達所述產物群的核酸；以及d)選擇在試驗動 物中具有最大腫瘤血液定位比> 1 1的特異性結合成員，任選在所述比率下，無腫瘤器 官與血液比<1 1;以及e)回收所述結合成員或編碼其的核酸。
19.治療人類患者腫瘤的方法，其包括向所述患者施用有效量的權利要求1至14和17 任一項所定義的特異性結合成員或抗體。
20.用於診斷其中EGFR異常表達或EGFR被擴增或是突變體的腫瘤的試劑盒，所述試劑 盒包含權利要求1至14任一項的抗體，任選含試劑和/或使用說明。
21.藥物組合物，其包含如權利要求1至12和15任一項所定義的抗體，以及任選可藥用的賦形劑、載體或稀釋劑。
22.用於治療人類患者腫瘤的試劑盒，其包含權利要求21的藥物組合物的藥物劑型， 以及分離的包含其他抗癌劑的藥物劑型，該其他抗癌劑選自化學治療劑、抗EGFR抗體、放 射免疫治療劑及其組合。
23.權利要求22的試劑盒，其中所述化學治療劑選自酪氨酸激酶抑制劑、磷酸化級聯 抑制劑、翻譯後調節劑、細胞生長或分裂抑制劑(例如抗有絲分裂劑)、信號轉導抑制劑及 其組合。
24.權利要求23的試劑盒，其中所述酪氨酸激酶抑制劑選自AG1478，ZD1839，STI571, 0SI-774, SU-6668 及其組合。
25.權利要求22的試劑盒，其中所述抗EGFR抗體選自抗EGFR抗體528，225，SC-03， DR8. 3，L8A4, Y10, ICR62, ABX-EGF 及其組合。
26.用重組DNA分子轉化的單細胞宿主，所述重組DNA分子包含編碼權利要求1_9任一 項的抗體或其片段的DNA序列或其簡併變體。
27.權利要求26的單細胞宿主，其中該單細胞宿主選自組織培養物中的大腸桿菌、假 單胞菌屬、芽孢桿菌屬、鏈黴菌屬、酵母、CHO, YB/20, NSO, SP2/0, Rl. 1，B_W，L-M, COS 1，COS 7，BSCl，BSC40，和BMTlO細胞，植物細胞、昆蟲細胞和人類細胞。
28.檢測擴增的EGFR或de2-7EGFR存在的方法，其中所述EGFR按下述測定A.使其中懷疑存在擴增的EGFR或de2-7EGFR的來自哺乳動物的生物樣品與權利要求 1-14任一項的抗體在允許所述EGFR與所述抗體結合的條件下接觸；以及B.檢測來自所述樣品的所述EGFR是否與所述抗體結合；其中檢測到結合表明在所述 樣品中所述EGFR的存在或活性。
29.檢測哺乳動物癌症的方法，包括根據權利要求28的方法檢測EGFR的存在或活性， 其中檢測到EGFR的存在表明所述哺乳動物中存在腫瘤或癌症。
30.預防和/或治療哺乳動物癌症的方法，包括向哺乳動物施用治療有效量的權利要 求21的藥物組合物或權利要求22的試劑盒。
31.治療哺乳動物中產生異常表達的EGFR的存在於腦中的癌症的方法，包括向哺乳動 物施用治療有效量的權利要求21的藥物組合物或權利要求22的試劑盒。
32.權利要求31的方法，其中所述存在於腦中的癌症選自成膠質細胞瘤、成神經管細 胞瘤、腦脊膜瘤、星形細胞瘤和腫瘤性動靜脈畸形。
33.權利要求30或31的方法，其中所述藥物組合物或所述試劑盒是全身給藥的。
34.治療哺乳動物惡性神經腫瘤的方法，包括向哺乳動物施用治療有效量的權利要求 21的藥物組合物或權利要求22的試劑盒。
35.權利要求1至14任一項的特異性結合成員或抗體在治療或預防哺乳動物癌症中的 用途。
36.權利要求21的藥物組合物或權利要求22的試劑盒在治療或預防哺乳動物癌症中 的用途。
37.權利要求1至14任一項的抗體在製備治療或預防哺乳動物癌症的藥物中的用途。
38.權利要求35至37任一項的用途，其中所述癌症位於或接近腦。
39.權利要求1至14任一項的抗體在製備治療或預防哺乳動物神經腫瘤的藥物中的用途。
40.權利要求35至39任一項的用途，其中所述治療方法包括放射免疫療法。
41.權利要求35至39任一項的用途，其中首先施用權利要求21的抗體組合物，隨後施 用包含化學治療劑的組合物。
全文摘要
本發明涉及抗體、尤其是抗體175及其片段或來源於其的抗體，其與EGF受體、尤其是擴增或過表達的表皮生長因子受體(EGFR)和EGFR的de2-7EGFR截短體結合。這些抗體可用於診斷和治療癌症。還提供了具有抗體175可變區重鏈或輕鏈序列的重組或雜合抗體。本發明的抗體也可用於與化療劑或抗癌劑和/或與其他抗體或其片段聯合治療。
文檔編號C12N15/13GK101896503SQ200880110993
公開日2010年11月24日 申請日期2008年8月14日 優先權日2007年8月14日
發明者A·M·斯科特, A·W·伯吉斯, L·J·奧爾德, T·G·約翰斯 申請人:路德維格癌症研究所