顯色試劑、濃度測定試劑盒、濃度測定方法和在該方法中使用的傳感器晶片的製作方法

2023-09-14 17:54:10 1

專利名稱：顯色試劑、濃度測定試劑盒、濃度測定方法和在該方法中使用的傳感器晶片的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種在酶反應中使用的顯色試劑(coloring reagent)、一種濃度測定試劑盒、一種測定待測物質的濃度的方法以及在該方法中使用的傳感器晶片(sensor chip)。特別地，本發明涉及一種在酶反應中使用的顯色試劑，所述酶反應用於通過利用衰減波(evanescentwave)，使用非常少量的樣品以高靈敏度和高準確性迅速測定待測物質的濃度，本發明還涉及一種濃度測定試劑盒、一種測定待測物質的濃度的方法以及在該方法中使用的傳感器晶片。
背景技術：
酶聯免疫吸附測定(ELISA)方法已經作為一種通過利用抗原抗體之間的特異性反應而測定微量成分的方法而被特別地應用於臨床檢測中。
通常稱做微孔板(microplate)的具有96凹孔(孔)的樹脂平板用於ELISA方法。例如，在夾心ELISA方法中，基於測試物質，將初級抗體固定在每個孔上。在該方法中，將測試樣品溶液分散於每個孔中，使固定於平板上的抗體(初級抗體)與測試樣品溶液中的待測物質發生反應(此後稱為初級反應)，隨後通過清洗除去含有未反應測試樣品的溶液。然後，將酶標記的次級抗體溶液分散到平板的每個孔中，使與次級抗體反應的待測物質與次級抗體發生特異性反應(此後稱為次級反應)。除去未反應的次級抗體溶液後，將顯色試劑溶液分散於每個孔中，進行酶反應(此後稱為酶反應)，使酶反應產物顯色，並且通過使用微孔板閱讀儀測定來自通過孔的透射光的強度的吸收，由校準曲線測定待測物質的濃度。
例如，胰島素是一種胰腺β-細胞分泌的激素，已知其具有降低血糖水平的作用。因此，應測定血液中胰島素的濃度以診斷糖尿病及識別患者的病理。胰島素的濃度通過與上面描述相同的使用具有固定有抗胰島素抗體的凹孔的微孔板的ELISA方法測定，所述測定通過將測試樣品溶液分散到所述凹孔中，使所述抗胰島素抗體與測試樣品溶液中的胰島素發生反應來進行。
然而，採用微孔板的ELISA需要數十微升到100微升的測試樣品的量，最少為5μL或者更多，並且在上述濃度中僅僅每毫升數百皮克的數量級中，其測定靈敏度會降低。此外，當增加進行測定的測試樣品量以增加其靈敏度時，反應系統受到測試樣品溶液中含有的抗原-抗體反應的抑制物質的增加的量的影響。由於增加測試樣品的量會降低測定的靈敏度，其只能保持在大約每毫升數百皮克。
ELISA的另一個問題是測定花費很長的時間，因為在需要大量測試樣品的ELISA中，抗原抗體需要更長時間完成反應。例如，初級反應所需的時間通常為數小時，最長可達24小時，次級反應和底物反應需要數十分鐘。
當從嬰兒或較小的動物收集樣品時，人們希望測試樣品(血液、血漿)的量儘可能少。在ELISA中，分配到微孔板的孔中的樣品量需要很精確，但是很難精確測定小於5μL的樣品。因此，為了精確的測定，需要使用大於所需的量的測試樣品，儘管人們希望以較少的樣品量來進行測定。
利用抗原抗體反應的傳感器晶片是已知的。

圖1是顯示具有光波導(optical waveguide)的傳感器晶片構造的示意圖。所述傳感器晶片包括一個在玻璃基板16上形成的由氮化矽膜製成的光波導層1、分別設置於光波導層兩側的一對入射側光柵(grating)13a(衍射光柵)和出射側光柵13b，或者稜鏡(未顯示)，以及一個在光波導層1上形成的抗體固定化層14。
通過將含有抗原的測試樣品溶液與所述傳感器晶片中的抗體固定化層14接觸，發生抗原抗體反應。通過在抗原抗體反應系統中加入螢光色素標記的抗體溶液，在所述基板上形成包含抗體/抗原/螢光色素標記的抗體的免疫複合物。測試樣品溶液中抗原的量通過下列步驟測定，包括用雷射穿透入射側光柵13a進入光波導層1發射出衰減波(evanescent wave)；通過衰減波激發光波導層1上的抗體固定化層14中的螢光色素；通過採用光接受元件(photo-acceptanceelement)測定螢光色素髮出的螢光強度來分析測試樣品溶液中抗原的量(例如，參見日本公開專利申請(JP-A)No.8-285851)。
衰減波指的是一種位於光波導層和外層之間的界面附近的電磁波，在該界面處光被全反射。除採用螢光色素標記測試樣品的方法之外(參見例如KOKOKU
發明者內山兼一, 大宮可容子, 岸本功, 平田雅己, 江藤英雄, 東野一郎, 植松育生, 葛西晉吾, 高瀨智裕, 本庄勉, 杉谷政則 申請人:株式會社東芝