一種檢測老年性痴呆易感遺傳風險的試劑盒的製作方法

2023-09-14 19:22:15 1

專利名稱：一種檢測老年性痴呆易感遺傳風險的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和醫學領域，更具體的，本發明涉及一種檢測老年性痴呆易感遺傳風險的試劑盒，通過同時檢測APOE基因上的兩個單核苷酸多態性位點基因型來評估個體老年性痴呆易感遺傳風險。
技術背景老年痴呆是指老年期出現的已獲得的智能在本質上出現持續的損害，也就是由器質性腦損害導致的基 本上不可逆的智能缺失和社會適應能力降低。主要表現為在智能方面出現抽象思維能力喪失、推理判斷與計劃不足、注意力缺失；在人格方面出 現興趣與始動性喪失、遲鈍或難以抑制、社會行為不端、不拘小節；在記憶方面出現遺忘，地形、視覺與 空間定向力差；在言語認知方面出現說話不流利，綜合能力缺失。歐美國家的統計表明，60歲以上老年人6% 12%發生痴呆，85歲以上的老人則有20% 40%發生 痴呆，其中半數以上為老年性痴呆。據統計，全球有超過2000萬的人患有老年性痴呆。調査結果表明， 我國北方地區65歲以上居民痴呆患病率為6.9%，其中老年性痴呆為4.2%。我國南方地區65歲以上居 民痴呆患病率為3.9%，其中老年性痴呆為2.8%。估計我國現有痴呆的老年患者超過400萬，其中老年 性痴呆約佔1 / 3。 2000年我國60歲以上的人口達1. 3億，佔人口總數的10%;到2020年將達到2. 3億， 佔人口總數的20%以上。老年人口的不斷增加使老年性痴呆患者的人數大幅度上升。據預測到2030年， 全球患老年痴呆的人數將達到6000萬，僅我國就將有1200萬。己知APOE基因與老年性痴呆有密切關係。APOE是一種含299個胺基酸殘基的分泌性糖蛋白，它存在於多種脂蛋白的顆粒中，是參與膽固醇代 謝的重要血清脂蛋白。該基因定位於19號染色體上，分別由3種等位基岡e2、 e3、 e4編碼，並組合 產生6種基因型，即e2/2、 e3/3、 e 4/4、 e 2/3、 e 2/4、 e 3/4 ，相對應的6種遺傳表型為E2/2、 E3/3、 E4/ 4、 E2/3、 E2/4、 E3/ 4。正常人群中APOE基因型以E 3/3最多，APOE基因的多態性是由APOE基因 的112和158密碼子的單個鹼基變異所致。APOE不能通過血腦屏障，但在腦內可以由星形細胞合成。目前認為E4是AD的危險因子，有人用實 驗對照組相關研究發現AP0Ee4等位基因在AD患者中過量表達，而大量其他的實驗研究也相繼證實了這 點。大約80 9&遲髮型家族性AD和64先散在性AD患者至少攜帶一個e4等位基因，而對照組僅為31 %。 遺傳連鎖和相關研究也顯示APOE ￡ 4可使患AD的危險性增加，且呈劑量依賴關係。AP0Ee4純合子發病 比雜合子早。相反AD患者中APOE e 2減少，說明APOE e 2在SAD中起保護作用。在一個著名的美國晚發阿爾森海默氏症的家族中(該家族的祖先是一對18世紀從法國移民到美國的 夫妻)，Brogaonkar13發現了在6個感染個體上E4亞型的劑量效應。4個E4/E4個體在60多歲即開始發 病，而2個E4/E3個體發病年齡分別是77歲和78歲。YadongHong的綜述中提到帶有兩個E4拷貝的個體 在85歲前AD發病的概率為50-90%,有一個E4拷貝的個體AD發病的概率為45%，相應的一般人群在85 歲前AD發病的概率為20X。Talbot等人15發現E2亞型對阿爾森海默氏症具有保護作用，而且其作用不是單純的因為可以代替 E4亞型。Corder等人16在美國人群中研究也發現了 E4的劑量效應的同時發現了 E2的保護作用。並且發 現雖然65%的AD病人是由E4的存在導致的，且在E2/E3的個體中AD發生率非常少，但同時還發現了有 23%的病人是由於E2的缺失而造成。Bickeboller等人23在法國417例病人和1030例正常對照人群中的研究中確認了 AP0E4與AD發病的 相關性，發現AP0E4亞型對AP0E3的發病危險度為2. 7,而AP0E2則具有保護作用，0R為0. 5。此外E4的 劑量效應也得到了證明。與E3純合子相比，E4純合子的0R為11.2,而E4雜合子的0R為2.2。0h Yong Bang等人針對AD病人的apoE基因型，進行Meta分析。在東亞人群中抽取AD病人1470例， 對照組2247例，其結果為病例組，含有E4等位基因26.8n/。，對照組含有E4等位基因9. 2% 。結果顯示 老年痴呆和E4等位基因顯著相關。發明內容根據國家生物基因檢測技術應用評估認證中心頒布的《中國人口健康服務基因位點認證規程》，對與 老年型痴呆易感相關基因位點的支持文獻、分子生物學機理研究、中國人群適用性等進行綜合分析評估後， APOE基因上rs429358號SNP位點和rs7412號SNP位點通過國家生物基因檢測技術應用評估認證中心認定， 可用於檢測評估老年性痴呆易感遺傳風險。基於APOE基因上rs429358號SNP位點和rs7412號SNP位點多態性可用來評估個體老年性痴呆易感 遺傳風險的基礎上，本發明提供一種檢測個體老年性痴呆易感遺傳風險的試劑盒。該試劑盒包括檢測APOE基因上rs429358號與rs7412號SNP多態性基因型的特異性引物對及DNA測序引物； PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應緩衝液、去離子水等)； PCR產物純化組件(包括SAP酶、Exo I酶、去離子水等)；DNA測序反應組件(包括BigDye mix, EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、去離子 水等)。本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對APOE基因上rs429358號SNP位點和rs7412號SNP位點， 能特異性擴增出包含這2個SNPs位點的DNA片段的引物對。設計這類引物對是本領域技術人員能夠輕易 完成的。優選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 1和2所示序列的引物對。特異性引物對可用常規的合 成技術進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發明的引物不限於這對引物。本試劑盒中所述的DNA測序引物是指針對APOE基因上rs429358號SNP位點和rs7412號SNP位點而 設計，能通過DNA測序技術特異性檢測出這2個SNPs位點基因型的DNA測序引物。設計這類引物是本領 域技術人員能夠輕易完成的。優選地，試劑盒中包含具有SEQIDNO: 3所示序列的DNA測序引物。DNA測 序引物可用常規的合成技術進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發明的DNA測序引物不限於這條引 物，所有可用於DNA測序技術檢測本發明中所述用來評估個體老年性痴呆易感遺傳風險的2個SNPs位點 的DNA測序引物均在本發明範圍內。本發明試劑盒的組分和含量包括1. PCR反應套裝10X PCR反應緩衝液2.5nl,25raM dNTP混合液0.2^1,25raM MgCl2溶液1. 5pl，5units/nl Taq DNA聚合酶0. 125jxl，2(^M特異性引物對每條引物各0.25nl，去離子水19. 175nl。2. PCR產物純化套裝 lunits/nl SAP酶O. 75nl， 10units/nl Exol酶0. 375pl， 去離子水3.875nl。3. 測序反應套裝25% BigDye mix 1^1, 3.2- DNA測序引物lnl， 125mM EDTA溶液 100%乙醇溶液15^1, 70%乙酵溶液3CHil， HIDI溶液8^1， 去離子水2fil。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規 條件，或按照廠商所建議的條件。實施例l.檢測試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取 用矽膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組DNA。步驟2: PCR擴增反應使用檢測試劑盒中的PCR反應套裝，其中，含有下列引物對 有義引物l: 5， - TAAGCTTGCACGGCTGTCCMGGA -3' (SEQ ID NO: 1) 反義引物l: 5' - ACAGMTTCGCCCCGGCCTGGTACAC -3' (SEQ ID NO: 2) 反應的體系為總體積25jxl，包含濃度為12.5ng/nl的DNA模板lpl、10X PCR反應緩衝液2.5nl，25mM dNTP混合液0.2nl， 25mMMgC12溶液1.5nl， 5units/nl Taq DNA聚合酶0.125nl， 20nM特異性引物對每 條引物各0.25^1，去離子水19.175nl。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為94°C 、 12分鐘，進行30個循環的94。C 、 30秒，60 °C、 30秒，72'C、 30秒，然後進行72'C、 IO分鐘。步驟3: PCR產物純化使用檢測試劑盒中的PCR產物純化套裝，反應體系為總體積25nl，包含PCR產物20nl， lunits/nl SAP 酶0.75nl, 10units/nl Exol酶0.375^1,去離子水3.875^1。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為37'C、 15分鐘，72°C、 20分鐘。步驟4: DNA測序反應使用檢測試劑盒中的測序反應套裝，其中，含有下列DNA測序引物DNA測序引物5' - TAAGCTTGCACGGCTGTCCAAGG -3' (SEQ ID NO: 3) 反應的體系為總體積5jil，包含PCR純化產物lnl， 25%BigDyemixlnl, 3.2nMDNA測序引物 去離子水2^1。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為98°C 、2分鐘,進行25個循環的96'C 、30秒，55'C 、 30秒，60'C、 4分鐘。反應結束後加入125mM EDTA溶液lpl和100%乙醇溶液15^1,於室溫下沉澱15分鐘；在4'C以3650 轉/分的轉速離心30分鐘，輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液3(^1,以3650轉/分的轉速離心15分鐘， 輕輕倒去上清液；室溫放置20分鐘後加入HIDI溶液8nl，放入測序儀中。步驟5:基因型分析熟悉DNA測序技術的本領域技術人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的SNP位點的基因型。實施例2.對人們進行個體老年性痴呆易感遺傳風險檢測的服務 步驟l: DNA提取由醫院檢驗科醫師指導被檢者使用口腔採樣拭進行口腔上皮細胞取樣，採用矽膠吸附法進行口腔上皮 細胞的DNA抽提。步驟2:基因分型檢測使用本發明提供的試劑盒，對被檢測者基因組DNA的APOE基因上rs429358號SNP位點和rs7412號 SNP位點進行DNA測序檢測，確定這2個SNPs位點的基因型。步驟3:個體老年性痴呆易感遺傳風險的分析通過對被檢測者SNPs基因型的分析，出具個體老年性痴呆易感遺傳風險的分析報告單。報告中詳細 說明了被檢測者老年性痴呆易感遺傳風險的高低，並由醫師向被檢者詳細說明和解讀個體老年性痴呆易感 遺傳風險分析報告單。序列表〈110〉上海主健生物工程有限公司 —種檢測老年性痴呆易感遺傳風險的試劑盒<160〉 3 1 24 腿 人工序列引物 〈婦1TAAGCTTGCA CGGCTGTCCA AGGA 2 4 2 <211〉 26 DNA 〈213〉人工序列<220〉〈223〉引物 2ACAGAATTCG CCCCGGCCTG GTACAC 2 6 3 <223〉引物 3TAAGCTTGCA CGGCTGTCCA AGG 2權利要求
1. 一種檢測個體老年性痴呆易感遺傳風險的試劑盒，其特徵在於包括檢測APOE基因上rs429358號SNP位點和rs7412號SNP位點的特異性引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應緩衝液、SAP酶、Exo I酶、BigDye mix，EDTA溶液、70％乙醇溶液、100％乙醇溶液、HIDI溶液、去離子水等。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述的特異性引物對是指針對APOE基因上rs429358 號SNP位點和rs7412號SNP位點，能特異性擴增出包含這2個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在T:所述的DNA測序引物是指針對APOE基因上rs429358 號SNP位點和rs7412號SNP位點而設計，能通過DNA測序技術特異性檢測出這2個SNPs位點基因型的DNA 測序引物。
4. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所含的特異性引物對選自具有SEQ ID NO: l和2所 示序列的引物對。
5. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所含的DNA測序引物選自具有SEQ ID NO: 3所示序 列的引物。
6. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於試劑盒的組分和含量包括1) PCR反應套裝:10X PCR反應緩衝液25mM dNTP混合液0. 2ri， 25mM MgC12溶液 5units/W Taq DNA聚合酶0. 20爛特異性引物對每條引物各0.25ri，去離子水19. 175W。2) PCR產物純化套裝:lunits/W SAP酶0.75(4, lOunitsM Exol酶0.375t4,去離子水3.87514。3) 測序反應套裝25% BigDye mix 1W， 3. 2湖DNA測序引物1W, 125mM EDTA溶液100%乙 醇溶液15W， 70%乙醉溶液HIDI溶液8W,去離子水2Hl。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20°C 。
全文摘要
本發明公開了一種檢測個體老年性痴呆易感遺傳風險的試劑盒。該試劑盒包括檢測APOE基因上rs429358號SNP位點和rs7412號SNP位點的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應組件、PCR產物純化組件、DNA測序反應組件等。本發明的試劑盒通過檢測與老年性痴呆易感遺傳密切相關的APOE基因上的單核苷酸多態性位點基因型來評估個體老年性痴呆易感遺傳風險。
文檔編號C12Q1/68GK101240318SQ200710037168
公開日2008年8月13日 申請日期2007年2月6日 優先權日2007年2月6日
發明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司