有助於農作物生長的假單孢菌RRj228及含有該菌株的微生物製劑的製作方法

2023-09-14 04:33:40 2

專利名稱：有助於農作物生長的假單孢菌RRj228及含有該菌株的微生物製劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及由1號序列所代表的假單孢菌RRj228(Pseudomonas sp.RRj228)(該菌株於2003年6月11日被保藏在韓國農業培養物保藏中心(KACC)，保藏編號為KACC 91052；於2005年5月27日被重新保藏於韓國典型培養物保藏中心(KCTC)，保藏編號為KCTC 10812BP)，在農作物的種植過程中，該菌株通過定殖於植物根系內外而代替化肥來促進植物生長。本發明還涉及含有假單孢菌RRj228或由其產生的次級代謝物的環境親和性微生物製劑。
根據本發明的環境親和性微生物製劑通過含有假單孢菌RRj228或由其產生的次級代謝物而能夠減少化肥的使用量、穩定農作物產量、保護水質和土壤環境並改善土壤生態系統的健康。
背景技術：
肥料是決定農作物產量的一種重要的農業物資，但它作為農作物生長的劣質因子會導致農作物品質退化、河流富營養化、地下水汙染、土壤營養失衡以及產量降低。因此，為促進農業的持續發展和農業環境的保護，必須合理使用具有促進植物生長的功能並有助於農作物強勢生長的土壤微生物，來替代化肥。
不與寄主植物形成共生關係並能促進植物生長的植物根際促生細菌(Plant growth-promoting rhizobacteria)(PGPR)在1980年由Kloepper等人命名，它包括固氮螺菌屬(Azospirrilum sp.)(Okon，1985)、假單孢菌屬(Kloepper等，1980)、芽孢桿菌屬(Backman等，1994)等。被稱為PGPR的植物生長促進微生物具有多種功能如固定大氣中的氮、產生植物生長促進激素、促進養分吸收(Hallmann等，1997)以及避免植物受病害侵襲(Pleban等，1995)，因此幫助植物生長。
Ward等人在1992年報導指出已經分類並鑑定的該微生物種類佔生活在土壤中全部種類的不到5％，而Torisvik等人在1990年報導指出在土壤中存在許多未被人工培養的微生物。因此，在土壤中還存在比以前發現的數量更多的具有優秀功能的微生物，這由此引起對它們的後續研究。
另外，已經證實接種不同的植物生長促進微生物可以使水稻產量提高19-60％(Baldani，2000)，並可提高西紅柿(Kloepper和Schroth，1981)、豆類(Polonenko等，1987；以及Dashti等，1998)、小麥(Freitas和Germida，1990)和甜菜(Suslow和Schrith，1982)的產量。植物生長促進微生物的應用已經有所研究。
因此，本發明的發明者在研究土壤微生物的同時分離並鑑定了可定殖於水稻植物根系內外的假單孢菌RRj228，並發現該菌株可促進農作物生長，因此可替代化肥。

發明內容
本發明的目的是提供由1號序列所代表的假單孢菌RRj228，在農作物的種植過程中，該菌株通過定殖於植物根系內外而代替化肥來促進植物生長。本發明的目的還在於提供含有假單孢菌RRj228或由其產生的次級代謝物的環境親和性微生物製劑。
本發明提供了由1號序列所代表的假單孢菌RRj228，在農作物的種植過程中，該菌株通過定殖於植物根系內外而代替化肥來促進植物生長。
假單孢菌RRj228是由本發明的發明人發現的一種土壤細菌，在自然條件下，該細菌定殖於植物根系內外，分泌植物生長促進物質，並通過對植物病原真菌和細菌的拮抗作用來抑制多種病原體的生長。
本發明的假單孢菌RRj228為在28±2℃的PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養基中培養的革蘭氏陰性杆狀嗜溫細菌。
使用本發明的假單孢菌RRj228獲得的效果如下1)當使用含有該菌株的微生物製劑作為農作物接種物時，由於本發明的假單孢菌RRj228可提供優秀養分供給並促進植物生長，因此儘管使用少量的化肥，也能提高農作物產量。
2)本發明的假單孢菌RRj228是化肥的替代品，對農作物有廣泛的使用範圍，如可用於水稻、辣椒和黃瓜。
3)當本發明的假單孢菌RRj228接種到農作物中時，該菌株可以通過抑制土壤中的植物病原微生物來幫助農作物生長並免受病原體的危害。
4)本發明的假單孢菌RRj228通過定殖於農作物根系內部可在被接種的農作物中大量表達。
5)根據本發明，除了可替代化肥的功效之外，通過將來自假單孢菌RRj228培養液的植物生長促進或病原生長抑制物質分離並純化而獲得的次級代謝物也可產生更多的價值。
6)由於本發明的假單孢菌RRj228不可能汙染環境，所以可以保護水質和土壤環境，並改善土壤生態系統的健康。
本發明還提供了含有假單孢菌RRj228或其產生的次級代謝物的環境親和性微生物製劑。
可以使用本領域熟知的方法將本發明的微生物製劑配製成植物生長促進劑或植物病原生長抑制劑，但本發明並不局限於此。為替代化肥，本發明的微生物製劑優選配製成用於促進植物生長的有機肥料。
當本發明的微生物製劑為乾粉狀或液態肥料狀的植物生長促進劑時，每1克乾粉或1毫升液體中的假單孢菌RRj228含量為105-107。
當本發明的微生物製劑為乾粉狀或液態肥料狀的病原生長抑制劑時，每1克乾粉或1毫升液體中的假單孢菌RRj228含量應超過107。在這種情況下，其特徵是該菌株含量比植物生長促進劑中的菌株含量高。
根據本發明的環境親和性微生物製劑通過含有假單孢菌RRj228而能夠減少化肥的用量、穩定農作物產量、保護水質和土壤環境並改善土壤生態系統的健康。
假單孢菌RRj228可生產成為合適的微生物製劑，該製劑可接種到農作物如水稻、辣椒和黃瓜中。
生物保藏本發明的RRj228菌株被命名為假單孢菌RRj228，並於2003年6月11日被保藏在附屬於韓國農村振興廳/農業生物技術國家研究所的韓國農業培養物保藏中心(KACC)，保藏編號為KACC 91052。
2005年5月27日，RRj228被重新保藏到韓國典型培養物保藏中心(KCTC)，保藏編號為KCTC10812BP。


圖1表示假單孢菌RRj228培養物的平板；圖2a和2b是假單孢菌RRj228的電鏡照片；圖3是定殖於植物根內部的假單孢菌RRj228的照片。
具體實施例方式
本發明可通過下列與假單孢菌RRj228的分離、鑑定和植物生長促進活性相關的實施例體現出來，假單孢菌RRj228是從俄羅斯聖彼得堡(St.Petersburg)的土壤中分離出來的，它也是從韓國和俄羅斯土壤中分離出的172種菌株之一。然而，提供這些實施例只是用來解釋說明，並不能被認為是對本發明範圍的限制，所附的權利要求對本發明的範圍做了恰當的描述。
實施例1土壤微生物RRj228的分離土壤微生物RRj228的分離方法如下。
如圖1所示，把在無菌培養基中萌發的一粒水稻種子轉移到0.6％瓊脂糖培養基中。將0.5克土壤樣品(來自俄羅斯聖彼得堡)接種在距水稻根部1-2釐米處，然後將培養基在28℃培養48小時。將根碾碎使之形成懸浮液後，將該懸浮液塗在LC培養基上(該培養基含有細菌培養用胰蛋白腖10克、酵母提取物5克、MgSO4·7H2O 8克、1M Tris 1毫升和蒸餾水1升)，以分離菌株。
實施例2土壤微生物RRj228的鑑定A.生理生化特性RRj228菌株的生理生化特性顯示在下表1中。
所述RRj228菌株呈杆狀，大小為2.0-3.0×0.5-0.7微米，如圖2a和2b所示它具有鞭毛。當該菌株在PDB培養基中培養24小時後，會形成黃色略帶紅色的菌落。所述RRj228菌株是革蘭氏陰性菌，進行需氧代謝並具有過氧化氫酶和氧化酶活性。當加入培養基的碳源為阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、甘露醇、蔗糖、甘油或木糖時，該菌株會產生酸，而當加入培養基的碳源為乳糖、糊精、ramnose、山梨糖醇、麥芽糖或半乳糖醇時，該菌株會產生鹼。另外，如圖3所示，本發明的RRj228菌株的特徵是存在於植物根系外部並定殖於根系內部。


B.序列分析為了分析RRj228DNA序列，採用16S rDNA序列分析方法。首先，用PCR(聚合酶鏈式反應)擴增16S rDNA部分，將產物插入pGEMT-T載體中，然後用DNA自動測序儀ABI3100(Applied Biosystem，美國)進行DNA序列分析。PCR反應使用2號序列的fD1(5′-agagtttgatggctcag-3′)和4號序列的rP2(5′-acggctaccttgttacgactt-3′)。另外，使用pUC/M13的正向引物(5′-gttttcccagtcacgac-3′4號序列)和反向引物(5′-gcggataacaatttcacacagg-3′5號序列)進行反應來分析上述引物的兩端區域，並使用4個引物進行反應來分析內部的DNA序列。
根據大腸桿菌(Escherichia coli)16S rDNA序列(GenBank J01695號)，每個DNA序列使用16SP-1的311-330區域(5′-gccacactggaactgagacac-3′)，16SP-2的684-703區域(5′-tgtagcg gtgaaatgcgtg-3′)，16SP-3的944-963區域(5′-ggagcatgtgt tattcg-3′)以及16SP-4的1228-1247區域(5′-ctacacacgtgctacaatgg-3′)。
1號序列代表RRj228菌株的16S rDNA序列。對該菌株和GenBank資料庫中DNA序列之間的同源性進行研究發現，該菌株與許多假單孢菌屬成員如綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、皺褶假單胞菌(P.Corrugata)和P.tolaasii的同源性達99％，由此將該菌株歸類為假單孢菌屬。
因此，本發明的RRj228菌株被命名為假單孢菌RRj228。
實驗實施例1假單孢菌RRj228的植物生長促進效果為了檢測假單孢菌RRj228的植物生長促進效果，對玉米幼苗進行實驗。將玉米根部末端3毫米浸入該菌株培養物懸浮液中1.5小時，其它玉米根部浸入無菌培養液中作為對照。將玉米幼苗放置在塑料箱中的溼濾紙上，然後用濾紙將起始線處的根部末端蓋好，28℃培養24小時。測量新伸長的根的長度，重複10次，所述RRj228菌株的玉米生長促進效果顯示在下表2中。
RRj228菌株的玉米生長促進效果

如表2所示，將原液(4.5×109c.f.u/毫升)以1∶50稀釋並進行接種時，本發明的假單孢菌RRj228的生長促進水平降低了26％，而在將原液以1∶100稀釋並進行接種時，其生長促進水平提高了13％。因此，本發明的菌株在用較低濃度接種時更加有效。
實驗實施例2假單孢菌RRj228的土壤病害拮抗作用使用下列方法檢測假單孢菌RRj228的土壤病害拮抗作用。首先，在PDA中分別接種病原真菌和細菌，然後將培養液轉移到皮氏培養皿中並使之凝固。在每個平板中做一個半徑為4毫米的加樣孔，將100微升的假單孢菌RRj228在PDA液體培養基中28℃培養5天，然後接種到該加樣孔中。將平板在28℃下放置5天，然後檢測PGPR的生長抑制範圍，該結果顯示在下表3中。將5毫升(1×106個孢子/毫升)真菌和5毫升(1×108cfu/毫升)細菌分別與250毫升PDA培養基混合併於45℃振蕩，每個皮氏培養皿各取溶液25毫升塗板，重複三次。
RRj228菌株抑制植物病原真菌和細菌的生長範圍*(抑制生長範圍Φmm)

*接種該菌株5天後的病原體生長抑制範圍結果顯示，本發明的RRj228菌株對辣椒疫黴、腐黴菌、胡蘿蔔軟腐歐氏菌和丁香假單孢菌表現出很強的生長抑制效果。
實驗實施例3假單孢菌RRj228競爭進入植物根部的相對能力為研究假單孢菌RRj228和螢光假單孢菌(Pseudomonasfluorescens)WCS365競爭進入植物根部的相對能力，將兩種菌株同時接種到水稻(Kumo水稻)和蘿蔔(Saxa nova)的根部之後，檢測假單孢菌RRj228佔定殖於根內的所有菌株的百分比，結果在下表4中顯示。
假單孢菌RRj228和螢光假單孢菌WCS365競爭進入植物根部的相對能力

實驗實施例4在農作物中接種假單孢菌RRj228的效果將常規培養的本發明假單孢菌RRj228的培養液接種到水稻、辣椒、黃瓜和番茄上，結果顯示在下表5中。


如表5所示，證實假單孢菌RRj228使水稻生長增加了33.2％、辣椒生長增加了8.5％、黃瓜生長增加了21.4％、番茄生長增加了17.5％，並且本發明的假單孢菌RRj228可用做微生物肥料來替代化肥。
由於本發明的假單孢菌RRj228是直接從植物(水稻)根中分離出來的，而不是象之前的菌株是從土壤中分離的，所以該菌株可適當地定殖於農作物如水稻和黃瓜的根系內，因此當將該菌株接種到農作物上時，它能夠通過穩定地定殖於農作物根系內而在根系內外自我增殖，在農作物存活期間，由於雨水或乾旱很難使其密度減少，所以其接種效果可以長時間保持。
工業適用性根據本發明的環境親和性微生物製劑通過使用假單孢菌RRj228，能減少化肥的使用、穩定農作物產量、保護水質和土壤環境並改善土壤生態系統的健康。
序列表110韓國農村振興廳(Republic of Korea represented by Rural Development Administration)120有助於農作物生長的假單孢菌及含有該菌株的微生物製劑130I5042YOL150KR10-2004-00414571512004-06-071605170Patentln 3.121012111501212DNA213假單孢菌RRj228(Pseudomonas sp.RRj228)4001gagtttgatc ctggctcaga ttgaacgctg gcggcaggcc taacacatgc aagtcgagcg60gtagagagaa gcttgcttct cttgagagcg gcggacgggt gagtaatgcc taggaatctg120cctggtagtg ggggataacg tccggaaacg gacgctaata ccgcatacgt cctacgggag180aaagcagggg accttcgggc cttgcgctat cagatgagcc taggtcggat tagctagttg240gtgaggtaat ggctcaccaa ggcgacgatc cgtaactggt ctgagaggat gatcagtcac300actggaactg agacacggtc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa360tgggcgaaag cctgatccag ccatgccgcg tgtgtgaaga aggtcttcgg attgtaaagc420actttaagtt gggaggaagg gtacttacct aatacgtgag tattttgacg ttaccgacag480aataagcacc ggctaactct gtgccagcag ccgcggtaat acagagggtg caagcgttaa540tcggaattac tgggcgtaaa gcgcgcgtag gtggttcgtt aagttggatg tgaaatcccc600gggctcaacc tgggaactgc atccaaaact ggcgagctag agtatggtag agggtggtgg660aatttcctgt gtagcggtga aatgcgtaga tataggaagg aacaccagtg gcgaaggcga720ccacctggac atgatactga cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat780accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc aactagccgt tgggagcctt gagctcttag840tggcgcagct aacgcattaa gttgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca900
aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg960aagaacctta ccaggccttg acatccaatg aactttccag agatggattg gtgccttcgg1020gaacattgag acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa1080gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta gttaccagca cgttatggtg ggcactctaa1140ggagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat catggccctt1200acggcctggg ctacacacgt gctacaatgg tcggtacaga gggttgccaa gccgcgaggt1260ggagctaatc ccataaaacc gatcgtagtc cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga1320agtcggaatc gctagtaatc gcgaatcaga atgtcgcggt gaatacgttc ccgggccttg1380tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgcaccag aagtagctag tctaaccttc1440gggaggacgg ttaccacggt gtgattcatg actggggtga agtcgtaaca aggtagccgt1500a1501210221117212DNA213人工序列220
223用於擴增假單孢菌RRj228基因的PCR擴增引物fD14002agagtttgat ggctcag 17210321121212DNA213人工序列220
223用於擴增假單孢菌RRj228基因的PCR擴增引物rP24003acggctacct tgttacgact t 21210421117212DNA
213人工序列220
223用於擴增假單孢菌RRj228基因的pUC/M13的PCR擴增正向引物4004gttttcccag tcacgac 17210521122212DNA213人工序列220
223用於擴增假單孢菌RRj228基因的pUC/M13的PCR擴增反向引物4005gcggataaca atttcacaca gg2權利要求
1.一種假單孢菌RRj228(Pseudomonas sp.RRj228)，該菌株含有由1號序列所代表的rDNA序列，該菌株的保藏編號為KCTC10812BP。
2.一種微生物製劑，該微生物製劑含有如權利要求1所述的假單孢菌RRj228作為有效成分。
3.根據權利要求2的微生物製劑，其中，所述製劑為替代化肥的有機肥料。
4.根據權利要求2的微生物製劑，其中，所述製劑用於促進植物生長。
5.根據權利要求2的微生物製劑，其中，所述製劑用於抑制病原體生長。
6.根據權利要求2的微生物製劑，其中，所述製劑還含有假單孢菌RRj228的次級代謝物作為有效成分。
7.一種土壤管理或植物培育方法，該方法通過用如權利要求2-6中任意一項所述的微生物製劑處理土壤或植物來進行土壤管理或植物培育。
全文摘要
本發明涉及由1號序列所代表的假單孢菌RRj228，在農作物的種植過程中，該菌株通過定殖於植物根系內外而替代化肥來促進植物生長。本發明也涉及含有假單孢菌RRj228或由其產生的次級代謝物的環境親和性微生物製劑。
文檔編號C05F11/00GK1876805SQ20051007503
公開日2006年12月13日 申請日期2005年6月7日 優先權日2004年6月7日
發明者姜渭金, 全元泰, 樸琪都, 金旼兌, 樸昌榮, V·切博塔裡 申請人:韓國農村振興廳