生產輔酶q－10的改進方法

2023-09-19 16:53:10 4

專利名稱：生產輔酶q－10的改進方法
技術領域：
本發明涉及通過微生物對輔酶Q-10進行生產的方法。更具體地，本發明涉及通過經轉化的微生物和轉化子(transformant)本身增加輔酶Q-10產量的方法。轉化子是Rhodobacter屬的微生物，優選地，是已經過來自不同微生物的甲羥戊酸鹽/酯操縱子轉化過的R.sphaeroides，所述不同微生物優選是Paracoccus屬的，更優選是P.zeaxanthinifaciens種的。
輔酶Q-10(2，3-二甲氧基-二甲基-6-十異戊二烯基-1，4-苯醌)，也被稱為泛醌-10，是脂溶性苯醌，具有類異戊二烯側鏈，所述側鏈包括十個C-5類異戊二烯單元。輔酶Q-10(下文中縮寫為CoQ10)被發現於微生物和植物以及動物中。它是人類和大多數哺乳動物中泛醌最普遍的存在形式。已有人提出，並有越來越多的證據表明，CoQ10對人類健康狀況以及對疾病抵抗來說是重要因素。CoQ10的醫藥和健康方面的有益效果已被認為與其兩種主要的生理功能相關，即作為線粒體電子傳遞鏈的重要輔助因子的功能(與三磷酸腺苷的合成偶聯)以及作為脂溶性抗氧化劑發揮作用的功能。
CoQ10的健康方面的好處使得該化合物的商業重要性增加。可以通過化學合成或通過用微生物發酵來生產CoQ10。這些微生物可以是已通過遺傳工程對其CoQ10生產進行過改進的天然的CoQ10生產者，或者它們可以不是天然生產CoQ10的，但是通過遺傳功能改造而能對CoQ10進行合成了。
在細菌中，泛醌的醌環獲得自分支酸(Chorismate)，其是芳香族化合物生物合成中的核心中間產物，而泛醌的類異戊二烯尾巴獲得自C-5化合物異戊烯焦磷酸酯(IPP)。加到醌環上的類異戊二烯尾巴的長度取決於細菌中存在的特定異戊二烯轉移酶。例如，在Escherichia coli中，八異戊二烯焦磷酸酯合酶催化從法尼基焦磷酸酯(FPP，C-15)和五個IPP單位來合成八異戊二烯焦磷酸酯(C-40)的過程。將該分子加入到醌環中導致了泛醌-8的形成。在Paracoccus和Rhodobacter的種中，十異戊二烯焦磷酸酯(DPP)合酶催化用FPP(C-15)和七個IPP單位來形成DPP(C-50)的過程。將DPP加入到醌環中然後會導致泛醌-10(CoQ10)的形成。
自然界中，已知有兩種不同的對IPP進行生物合成的途徑(

圖1)。甲羥戊酸鹽/酯途徑，如其名稱所暗示的，其利用甲羥戊酸鹽/酯作為核心中間產物，該途徑已被很好地研究於真核生物中。多年以來甲羥戊酸鹽/酯途徑都被認為是自然界中IPP合成的普遍途徑。但是，近十年來，還發現了第二條IPP生物合成途徑，其被稱為非甲羥戊酸鹽/酯途徑或MEP途徑(因為其用2C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸酯作為中間產物)。目前已發現，該MEP途徑存在於多種真細菌以及高等植物的質體區室中。
US 4070244公開了一種通過培養Sporidiobolus和Oosporidium屬的某些微生物來生產CoQ10的方法，所述方法在含有可被吸收的碳源和可被消化的氮源的培養基中進行。
Zhu，X.et al.(J.Fermentation Bioengin.，79，493-5，1995)最先描述了對含有泛醌生物合成所涉及的基因的質粒的構建，以及將這些基因在E.coli中過量表達，以生產泛醌。
EP 1070759 A1中公開了一種生產CoQ10的方法，其通過對宿主微生物轉化並對轉化子生物進行培養來進行，所述宿主微生物尤其是E.coli，用來自Agrobacterium屬的、編碼具有十異戊二烯二磷酸酯合酶活性的蛋白質的DNA對其進行轉化。
EP 1072683 A1中公開了一種通過經轉化的微生物來生產(尤其是泛醌)類異戊二烯化合物的方法。在列出的70來種宿主物種中，特別提到了Rhodobacter capsulatus和R.sphaeroides。然而，其實施例僅描述了在E.coli的轉化子中進行的對CoQ8的生產。
EP 1123979 A1公開了通過對E.coli進行轉化使得對CoQ10的生產效率提高的方法，其中，用包含來自Saitoella屬的真菌菌株的、編碼十異戊二烯二磷酸酯合酶的DNA的表達載體對E.coli進行轉化。
WO 02/099095 A2最後公開了一種對細菌進行改造的方法，尤其是對Paracoccus屬的細菌進行的，以通過過量表達甲羥戊酸鹽/酯途徑的基因來生產類異戊二烯化合物，特別是玉米黃質。
革蘭氏陰性細菌Rhodobacter sphaeroides是天然的CoQ10生產者，並且，人們已企圖用其來發展對CoQ10進行工業生產的方法。Yoshida et al.(J.Gen.Appl.Microbiol.44，19-26，1998)描述了通氣情況對於CoQ10生產的影響，還描述了對具有提高的CoQ10含量的R.sphaeroides非重組突變體的分離，此外，Sakato et al.(Biotechnol.Appl.Biochem.16，19-28，1992)也描述了通過優化培養(發酵)條件，在R.sphaeroides的非重組突變體中提高CoQ10產量的方法。最近，人們已在用分子遺傳技術來增加R.sphaeroides對CoQ10的生產。
EP 1227155 A1公開了通過能生產CoQ10的微生物(尤其是Rhodobacter屬的)來提高CoQ10產量的方法。CoQ10產量的增加是通過向微生物中引入一種或多種屬性來獲得的，所述屬性選自由如下屬性所構成的組降低的或有缺陷的牻牛兒基牻牛兒基轉移酶活性，增強的十異戊二烯二磷酸酯合酶活性及增強的對-羥基安息香酸十異戊二烯轉移酶活性。
基於R.sphaeroides中yaeM基因(現在被稱為ispC，其編碼1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸酯還原異構酶)的存在，以及基於近來完成的對R.sphaeroides基因組序列的研究，看上去該細菌排他性地使用MEP途徑用於對IPP進行生物合成。支持R.sphaeroides中排他性使用MEP途徑的其它證據是以下發現與其緊密相關的種，Rhodobacter capsulatus，僅用MEP途徑進行類異戊二烯生物合成。
WO 02/26933公開了在Rhodobacter sphaeroides中提高CoQ10產量的方法，其通過過量表達編碼MEP途徑中某些酶的一些天然和/或異源基因來實現。但是，這些酶的過量表達僅使CoQ10的產量獲得非常有限的提高。這可能是由於如下事實MEP途徑中僅有少量酶的活性被提高，而在R.sphaeroides中顯著提高IPP生物合成還需要其它基因的過量表達。
如上所述，一些細菌僅用甲羥戊酸鹽/酯途徑來對IPP進行生物合成。Paracoccus zeaxanthinifaciens是此類細菌的一個例子。在P.zeaxanthinifaciens中，編碼甲羥戊酸鹽/酯途徑的五個酶的基因加上編碼IPP異構酶的基因(見圖1)，一起成簇於染色體的單個轉錄單元中，即下文中被稱為甲羥戊酸鹽/酯操縱子的操縱子(Hümbelin et al.，Gene 297，129-139，2002)。從乙醯乙醯CoA到IPP的轉化所需要的所有基因的單一簇可以提供有效的遺傳途徑通過將克隆的甲羥戊酸鹽/酯操縱子插入到細胞中，以在任何細菌中增加IPP的產量。這不僅僅可在天然含有用於IPP生物合成的甲羥戊酸鹽/酯途徑的細菌中實現，還可在僅利用MEP途徑的細菌中實現，因為甲羥戊酸鹽/酯途徑的前體，乙醯乙醯CoA是共同的代謝物。乙醯乙醯CoA是通過被稱為β-酮硫解酶的一大家族酶的作用，從兩個乙醯CoA分子製得的。因此，甚至在不用甲羥戊酸鹽/酯途徑進行IPP生物合成的細菌中，也有乙醯乙醯CoA的供應。
在通過對天然CoQ10生產者進行遺傳改造，在微生物中進一步提高CoQ10產量的一種嘗試中，已發現，這可通過將來自Paracoccus屬微生物的克隆的甲羥戊酸鹽/酯操縱子引入到Rhodobacter屬的微生物中來實現。雖然通過引入來自Paracoccus的甲羥戊酸鹽/酯操縱子以在Rhodobacter中增加IPP供應並提高CoQ10產量的概念在推理上看似簡單，但之前並無證據表明，這些來自Paracoccus的基因可在Rhodobacter中進行功能性表達，也沒有證據表明，IPP生物合成中涉及的Paracoccus的酶可在Rhodobacter中正常地發揮作用。此外，鑑於所有可獲得的證據都表明，Rhodobacter原本不含甲羥戊酸鹽/酯途徑的中間產物，因此明顯存在下述可能這些非天然的化合物將被降解，或者，會使異源表達的Paracoccus酶不可用。
本發明涉及在Rhodobacter屬的微生物中，尤其是在Rhodobactersphaeroides中，增加CoQ10產量的方法，這是通過向Rhodobacter菌株中引入來自Paracoccus屬的微生物(尤其是Paracoccus zeaxanthinifaciens)的甲羥戊酸鹽/酯操縱子，並對轉化子進行培養來實現的。因此，本發明提供了一種生產CoQ10的方法，其中包括將屬於Paracoccus屬的微生物中的(尤其是Paracoccus zeaxanthinifaciens中的)甲羥戊酸鹽/酯操縱子引入到屬於Rhodobacter屬的微生物，尤其是Rhodobacter sphaeroides中，並對經過修飾的Rhodobacter菌株進行培養，由此所述方法導致CoQ10產量提高。
換句話說，本發明涉及生產CoQ10的方法，所述方法包括在培養基中培養Rhodobacter屬的微生物，所述微生物中已經引入了來自Paracoccus屬的微生物的甲羥戊酸鹽/酯操縱子，使得CoQ10形成並積累於培養物中；以及從其中回收CoQ10。
本發明還涉及Rhodobacter屬的微生物，尤其是Rhodobactersphaeroides，所述微生物中含有來自Paracoccus屬的微生物(尤其是Paracoccus zeaxanthinifaciens)的甲羥戊酸鹽/酯操縱子。
本發明還涉及來自Paracoccus屬的微生物(尤其是Paracoccuszeaxanthinifaciens)的甲羥戊酸鹽/酯操縱子的用途，用於在Rhodobacter屬的微生物，尤其是Rhodobacter sphaeroides中增加CoQ10產量的方法或過程。
本發明基於如下發現通過將來自Paracoccus屬的微生物的甲羥戊酸鹽/酯操縱子引入到Rhodobacter屬的宿主生物中，並對經轉化的宿主進行培養，後者能以較高產量表達CoQ10。
實際操作中，實現本發明需要進行的所有步驟都是本領域技術人員熟悉的傳統步驟，無須對其進行特別的解釋。
用於本發明的甲羥戊酸鹽/酯操縱子由9066個核苷酸的DNA序列構成，除調控序列(操縱序列)之外，其含有編碼下述酶的結構基因，所述的酶是將乙醯乙醯CoA轉化為DMAPP所必需的，它們按照如下順序MvaA(羥甲基戊二酸單醯-CoA還原酶)、Idi(異戊烯二磷酸異構酶)、Hcs(羥甲基戊二酸單醯-CoA合酶)、Mvk(甲羥戊酸鹽/酯激酶)、Pmk(磷酸甲羥戊酸鹽/酯激酶)和Mvd(二磷酸甲羥戊酸鹽/酯脫羧酶)。該操縱子的DNA序列被公開於WO 02/099095(見，例如SEQ ID NO42)中。該序列獲得自Paracoccus sp.R114，其是生產玉米黃質的菌株(P.zeaxanthinifaciens)，根據《布達佩斯條約》，已於2001年4月24日將其保藏至ATCC，專利保藏號為PTA-3335。必須注意，操縱子中結構基因的順序不同於它們編碼的酶催化連續代謝途徑反應的順序。
術語「Paracoccus屬的微生物的甲羥戊酸鹽/酯操縱子」或「Paracoccus屬甲羥戊酸鹽/酯操縱子」並不意味著用於本發明的該操縱子實際上就分離或獲得自一種Paracoccus生物，而僅表示其與存在於Paracoccus生物中的甲羥戊酸鹽/酯操縱子相同。因此，其可能是完全分離自Paracoccus的、完全合成的或部分分離部分合成的。該操縱子DNA序列的具有完全功能的等位變異體或突變體也被包括於上述術語中。
WO 02/099095的47ff頁中描述了其它的Paracoccus菌種和菌株，以及將Flavobacterium sp.重新作為Paracoccus分類的參考。應當理解，微生物「Paracoccus zeaxanthinifaciens」和「Rhodobacter sphaeroides」還包括具有同樣的物理化學屬性的、此類物種的異名和有效名，如International Code of Nomenclature of Prokaryotes所定義的。
術語「引入」被用於本發明說明書和權利要求中關於對Rhodobacter屬的宿主生物或微生物進行轉化的部分，其包括本領域技術人員公知的、任何可用於將遺傳物質(特別是甲羥戊酸鹽/酯操縱子)有效帶入到宿主生物中的方法，即以能使微生物對其進行表達的方式進行的。引入(例如)可通過載體(優選地，表達質粒)來進行，或根據標準方法，通過整合到宿主基因組中來進行。
雖然根據本發明用於改進CoQ10生產的優選宿主生物是Rhodobactersphaeroides，但是Rhodobacter屬的能生產CoQ10的其它菌種也可以作為宿主使用，例如R.adriaticus、R.capsulatus、R.sulfidophilus和R.veldkampii。所有宿主細胞可代表野生型菌株的突變體，或者代表經過遺傳操作的菌株，所述菌株的特徵在於，較之野生型菌株的CoQ10產量，其具有被提高的CoQ10產量。
將甲羥戊酸鹽/酯操縱子成功引入到宿主微生物之後，根據已知的方法對經轉化的宿主進行培養，即在含有可被宿主吸收的碳源和氮源、無機鹽等的培養基中，在適於有效生長以及適於目標產物CoQ10表達的溫度、pH和通風條件下進行培養。
從發酵培養物和/或轉化子(即，其中已被引入了屬於Paracoccus屬的微生物的甲羥戊酸鹽/酯操縱子的微生物)進行分離，以及，如果需要的話，對獲得的CoQ10進行純化(包括針對人類和動物的使用對其進行配方)，都可按照本領域公知的方法來進行。但是，為用於動物健康和營養用途，可以不需要進行特定的純化。在這種情況下，可對CoQ10和生物物質和/或發酵培養物的其它組分一同進行進一步加工，以得到具有商業吸引力的產品。
圖1示出了在R.sphaeroides中對CoQ10進行生物合成的途徑，其用MEP途徑來形成IPP。框出的區域表示包含甲羥戊酸鹽/酯途徑(導致IPP形成)加上IPP異構酶步驟的反應序列。甲羥戊酸鹽/酯途徑在R.sphaeroides中天然並不存在。在P.zeaxanthinifaciens中，編碼甲羥戊酸鹽/酯途徑的五個酶加上IPP異構酶的基因組成一個操縱子，其在下文中被稱為甲羥戊酸鹽/酯操縱子。
下述實施例用於闡述本發明，而非以任何方式對其進行限制。
實施例該實施例顯示了將來自Paracoccus zeaxanthinifaciens的克隆的甲羥戊酸鹽/酯操縱子引入之後，R.sphaeroides DSM 158中CoQ10產量的提高。
細菌和培養條件Rhodobacter sphaeroides菌株DSM 158(從the Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH獲得)被用作為基礎菌株，以構建具有提高的CoQ10產量的重組菌株。在培養基RS100中，於28℃下對所有的R.sphaeroides菌株進行培養。表1中概括了培養基RS100的組成和製備方法。將50mg/l的卡納黴素加入到培養基中，以培養重組菌株。在LB培養基(Becton Dickinson，Sparks，MD，USA)中，於37℃對E.coli菌株進行培養。為保持重組E.coli菌株中的質粒，向培養基中加入氨苄青黴素(ampicillin，100mg/l)和/或卡納黴素(25-50mg/l，取決於質粒)。在旋轉式搖床中，於200rpm，需氧條件下，對E.coli和R.sphaeroides的液體培養物進行常規培養。當需要固體培養基時，加入瓊脂(1.5％的終濃度)。
表1培養基RS100的組成和製備方法
構建質粒pBBR-K-Nde和pBBR-K-mev-opR114在WO 02/099095中的實施例6(第91頁，12-17行)和實施例13(第105頁，第10行至第106頁第8行)，對質粒pBBR-K-Nde(空質粒)和pBBR-K-mev-op-up-4(含有甲羥戊酸鹽/酯操縱子前4個基因的質粒)的構造分別進行了詳細的描述。
PCR引物hcs-5326(SEQ ID NO1)對應P.zeaxanthinifaciens hcs基因(起始於密碼子214，結束於密碼子220的第二個核苷酸)，而PCR引物mvd-9000(SEQ ID NO2)對應於P.zeaxanthinifaciens mvd基因終止子後104至123位核苷酸序列的反向互補序列(WO 02/099095，分別見SEQ ID Nos46和52)。通過克隆用引物hcs-5326和mvd-9000(用P.zeaxanthinifaciens ATCC 21588基因組DNA作為模板)在pCR2.1-TOPO中獲得的PCR片段，來構建質粒TOPO-pCR2.1-mev-op-d-3wt。因此該質粒含有甲羥戊酸鹽/酯操縱子的下遊一半，其中包括hcs的3』末端和最後三個基因，mvk、pmk和mvd。用限制性內切酶SacI和NdeI來消化質粒pBBR-K-mev-op-up-4和TOPO-pCR2.1-mev-op-d-3wt，將後一消化得到的較短片段與來自pBBR-K-mev-op-up-4的較大片段連接。得到的質粒，pBBR-K-mev-op-wt，含有來自P.zeaxanthinifaciens ATCC 21588的完整的甲羥戊酸鹽/酯操縱子，其中包括其(可能的)啟動子。P.zeaxanthinifaciens菌株ATCC 21588(野生型)和R114的甲羥戊酸鹽/酯操縱子序列之間僅有的區別在於mvk中的突變，導致殘基265從丙氨酸變為纈氨酸(A265V)。因為P.zeaxanthinfaciens ATCC 21588的基因組DNA被用作為PCR模板，以構建質粒TOPO-pCR2.1-mev-op-d-3wt，因此其中含有野生型mvk基因。通過定點誘變向mvk中引入突變(密碼子265從GCC變為GTC)，產生了質粒pBBR-K-mev-op-R114。
用於R.sphaeroides的轉化方法使用標準方法，通過接合，用質粒來轉化E.coli S17-1，用於克隆和隨後將質粒從S117-1轉運到R.sphaeroides DSM 158中(Nishimura et a1.，Nucl.Acids Res.18，6169，1990；Simon et al.，Bio/Technology 1983，784-91)。首先分離出R.sphaeroides DSM 158的、具有自發的利福平抗性的突變體，這是通過如下步驟來進行的在補充有100mg/l利福平(rifampicin)的RS100液體培養基上對DSM 158進行培養，將細胞塗布於含有100mg/1利福平的RS100平板上，分離單個菌落。為達到接合的目的，從受體細胞(具有利福平抗性的R.sphaeroides DSM 158)培養物(生長於含有100mg/l利福平的RS100培養基中)和供體細胞(攜帶有將被轉移的質粒的E.coli S17-1，被培養於含有50mg/l卡納黴素的LB培養基中)中各取1ml，通過離心獲得沉澱。棄去上清液，用新鮮的RS100培養基洗兩次細胞，以去除抗生素。然後將每份沉澱重新懸浮於1ml新鮮的RS100培養基中。混合50微升的供體細胞和0.45ml的受體細胞，通過離心獲得沉澱，重新懸浮於0.03ml的RS100培養基中，點到RS100平板上。在28℃進行過夜培養後，用接種環收穫細胞，將其重新懸浮於0.3ml的RS100培養基中。將該懸浮液的稀釋液塗布到含有100mg/l利福平和50mg/l卡納黴素的RS100平板上，在28℃進行培養。從平板上挑出菌落(可能經過轉化的R.sphaeroides DSM 158細胞)，培養於含有50mg/l卡納黴素的液體RS100培養基中，用合適的引物通過PCR來檢測是否存在質粒。將陽性克隆劃線到含有50mg/l卡納黴素的RS100平板上，獲得單個菌落。然後在含有50mg/l的液體RS100培養基上，再次對來自每個克隆的單個菌落進行培養，通過PCR證實了目標質粒的存在。通過向培養物中加入甘油(15％v/v)並冷凍於-80℃，來保存最終經過轉化的R.sphaeroides DSM 158菌株。
用於評價R.sphaeroides中CoQ10生產情況的培養條件將培養基RS100用於用R.sphaeroides進行的所有實驗(培養重組的R.sphaeroides菌株時，加入50mg/l的卡納黴素)。在200rpm振蕩下，於28℃，在250ml帶蓋Erlenmeyer瓶中，對25毫升培養物進行培養。為檢驗CoQ10的生產情況，用R.sphaeroides菌株的經冷凍和加入甘油的貯藏培養物去接種25ml的種子培養物。對種子培養物進行24-28小時的培養之後，取合適體積的培養物，用於接種實驗用瓶，使得660納米處最初的光密度(OD660)為0.16。以24小時為間隔，分別於無菌條件下取2毫升樣品。分析項目包括生長情況(以OD660來測)、pH、培養物上清液中的葡萄糖、以及CoQ10和類胡蘿蔔素(通過高效液相色譜[HPLC]來測定-見下文中「分析方法」一節)。
分析方法試劑乙腈、二甲基亞碸(DMSO)、四氫呋喃(THF)、叔丁基甲醚(TBME)和丁基化羥基甲苯(BHT)是分析純或HPLC級的，其都獲得自Fluka(瑞士)。CoQ10也購自Fluka。甲醇(Lichrosolv)購自Merck，Darmstadt。類胡蘿蔔素標準品從Chemistry Research Department，RocheVitamins Ltd.，Switzerland獲得。
樣品製備和抽提將全培養液中的400微升轉移到一次性的15ml聚丙烯離心管中。加入4毫升經穩定的抽提溶液(0.5g/l BHT，處於1∶1(v/v)DMSO/THF中)，在實驗室搖床(IKA，德國)中，對樣品進行20分鐘的混合，以促進抽提。最後，對樣品進行離心，將上清液轉移到琥珀色玻璃管中，以通過HPLC進行分析。
HPLC開發了反向HPLC方法，用於對泛醌及其相應氫醌進行同時測定。該方法能將類胡蘿蔔素(八氫番茄紅素、球形酮(spheroidenone)、spheroidene和鏈孢紅素(neurosporene))與CoQ10清楚地分開。用裝備有溫控自動上樣儀和二極體陣列檢測器的Agilent1100HPLC系統來進行色譜分析。該方法的參數如下所示柱 YMC Carotenoid C30柱3微米，鋼質，150mm長×3.0mm I.D.
(YMC，Part No.CT99S031503QT)保護柱 Security Guard C18(ODS，十八烷)4mm長×3.0mm I.D.
(Phenomenex，Part No.AJO-4287)典型柱壓開始時60bar流速0.5ml/min移動相 乙腈(A)∶甲醇(B)∶TBME(C)的混合物
後時間(post time) 4分鐘注射體積 10μl柱溫 15℃檢測 按照表2，用三種波長來對特定化合物進行檢測表2.HPLC保留時間和所用的波長
計算計算基於峰的面積來進行。
靈敏度通過向其中注射相關參照化合物的標準溶液來驗證該方法的靈敏度。目標化合物(輔酶Q10和ubiquinol-10)完全分開，沒有顯示任何的幹擾。
線性範圍和檢測極限對輔酶Q10在穩定抽提溶液中的一系列稀釋物(見上文)進行製備和分析。線性範圍被發現為5mg/l至50mg/l。相關係數為0.9999。用該HPLC方法檢測輔酶Q10的極限被確定為4mg/l。
可重現性對該方法(包括抽提步驟)的可重現性進行了驗證。對十份單獨的樣品製劑進行比較。相對標準差被確定為4％。
測定R.sphaeroides菌株對CoQ10的生產情況在上文指出的條件下，對R.sphaeroides菌株DSM 158、DSM158/pBBR-K-Nde(空載體對照)和DSM 158/pBBR-K-mev-opR114於搖瓶中進行培養，對CoQ10的生產情況進行測定。結果被概括於表3中。其中展示的值是兩次獨立實驗的平均值，在每次獨立實驗中，對每種菌株進行兩次檢測。這些結果清楚地表明，來自P.zeaxanthinifaciens的克隆的甲羥戊酸鹽/酯操縱子的表達顯著地提高了R.sphaeroides中的CoQ10產量。
表3
1比形成率被表示為每mg細胞乾物質生產出的CoQ10的mg數/。SD＝標準差。
序列表110帝斯曼智慧財產權資產管理有限公司120生產輔酶Q-10的改進方法130Case 21841150EP 03015367.01512003-07-081602170PatentIn version 3.2210121120212DNA213人工220
223PCR引物hcs-53364001gcgc tggtcg aggcgtggaa 20210221120212DNA213人工220
223PCR引物mvd-90004002cgtcagcgtg gcgggcaagt20
權利要求
1.一種生產CoQ10的方法，其中包括將屬於Paracoccus屬的微生物的甲羥戊酸鹽/酯操縱子引入到屬於Rhodobacter屬的微生物中，並對經過修飾的Rhodobacter菌株進行培養。
2.如權利要求1所述的方法，其中R.sphaeroides被用作為生產CoQ10的微生物。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中，將Paracoccuszeaxanthinifaciens的甲羥戊酸鹽/酯操縱子引入到Rhodobacter菌株中。
4.一種生產CoQ10的方法，所述方法包括在培養基中培養Rhodobacter屬的微生物，所述微生物中已經引入了Paracoccus屬的微生物的甲羥戊酸鹽/酯操縱子；使得CoQ10形成並積累於培養物中；以及從其中回收CoQ10。
5.Rhodobacter屬的微生物，其中含有Paracoccus屬的微生物的甲羥戊酸鹽/酯操縱子。
6.如權利要求5所述的微生物，它是Rhodobacter sphaeroides。
7.如權利要求5或6所述的微生物，其中含有Paracoccuszeaxanthinifaciens的甲羥戊酸鹽/酯操縱子。
8.Paracoccus屬的微生物的甲羥戊酸鹽/酯操縱子在如權利要求1至4中任意一項所述的方法中的用途。
9.一種用於在Rhodobacter屬的微生物中增加CoQ10產量的方法，所述方法通過下述步驟來實現將Paracoccus屬的微生物的甲羥戊酸鹽/酯操縱子引入到Rhodobacter菌株中，並對轉化子進行培養。
全文摘要
本發明提供了生產CoQ10的改進方法，所述方法通過對Rhodobacter屬的微生物進行發酵來實現，所述微生物已經被Paracoccus zeaxanthinifaciens的甲羥戊酸鹽/酯操縱子所轉化。
文檔編號C12R1/01GK1820077SQ200480019505
公開日2006年8月16日 申請日期2004年6月29日 優先權日2003年7月8日
發明者阿蘭·貝利, 瑪庫斯·胡姆貝利恩, 如爾·羅帕斯-烏裡巴瑞 申請人:帝斯曼智慧財產權資產管理有限公司