進行定量測定的方法

2023-09-19 09:56:45

進行定量測定的方法
【專利摘要】本發明涉及用於確定分析物分子或粒子的濃度估值E(C)的方法，其中將預定體積的樣品分至一定數目的(N)隔室，所述(N)隔室包含不同樣品體積(vi)和/或不同稀釋因數(di)的樣品或由其組成，在所述(N)隔室的任一個中存在的至少部分分子或粒子提供可測量的信號並且所述分子或粒子的估計濃度E(C)為所測量信號的函數，以及涉及用於本發明的方法的裝置，本發明方法的應用，在用於本發明方法樣品架和試劑盒。
【專利說明】進行定量測定的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及用於確定粒子的濃度估值E(C)的方法，其中將預定體積的樣品分至 一定數目的（N)隔室，所述（N)隔室包含不同樣品體積（Vi)和/或不同稀釋因數（cQ的樣 品或由其組成，在所述（N)隔室的任一個中存在的至少部分粒子提供可測量的信號並且粒 子的估計濃度E(C)為所測量信號的函數，以及在本發明的方法中使用的裝置，本發明方法 的應用，在本發明的方法中使用的樣品架和試劑盒。

【背景技術】
[0002] 在分析化學中，定量分析物粒子濃度的標準（或"類似的"）方法為：校準其如何 關聯物理量的可測量振幅，例如光穿過樣品的吸收度。然後將所述分析物粒子的濃度估值 E(C)恢復為所述信號的函數。
[0003] 聚合酶鏈反應（PCR)構成用於定量核酸濃度的現有技術的一種方法。PCR程序一 般允許複製DNA鏈的片段。代表性地，所複製的片段長度不超過10k鹼基對（bp)，並且在 定量PCR中，通常複製較短的片段。根據現有技術的方法，所複製的DNA副本例如用僅在與 雙鏈DNA形成複合物（染料-DNA複合物）後顯示強螢光的螢光染料（例如SYBR Green或 EvaGreen. [Advan. Physiol. Educ. 29:151-159, 2005])進行標記以提供可測量的信號（熒 光水平）。所述螢光水平隨著DNA片段的增加成比例地增加。
[0004] 當靶DNA片段存在於樣品中時，它們的數目在所述PCR過程期間增加得非常快，作 為已完成循環數的函數幾何級地增加。副本數目的快速增加在製備應用中以及在旨在檢測 靶DNA存在的定性診斷測定（例如，作為特定微生物在樣品中存在的證據）中是吸引人的。 同時，靶DNA的複製的指數增長（作為循環數的函數）大大妨礙了進行PCR過程前的樣品 中的靶DNA副本的初始數的測定。根據現有技術，所謂的real-time PCR提供了方法，其中 在每個PCR循環後檢測樣品的螢光活性（即，信號強度），隨後通過比較作為時間函數的樣 品的螢光強度與校準曲線來估計樣品中的初始DNA濃度。這些程序的準確性是有限的。它 們的額外的缺點為對於每個定量必須進行額外的比較（參照）實驗。
[0005] 在1999年，Vogel stein和Kinzler提出一種使用觀察者的能力檢測二元隨機函數 k(C)的數字測定，當已檢查的體積發生於包含至少一種分析物粒子時採取正值（k= 1)或 者否則採取負值（k = 0)。根據"正"隔室的部分（S卩，產生k= 1的那個）估計濃度。由 於所述測定需要存在的分析物粒子的強擴增，所以它們的關鍵應用通常在定量PCR或酶聯 免疫吸附測定（ELISA)中。
[0006] 根據現有技術的數字PCR方法，將總體積V的PCR混合物（樣品和試劑）分至等 體積（v = V/N)的N個隔室。然後，在全部隔室中（優選同時）進行PCR反應循環，例如通 過溫度的周期性變化。隨後，在每個隔室分別完成PCR過程後（終點測量）測量代表性地 螢光強度，並且對於其中完成反應的隔室的數目，計數產生"正"信號的隔室並且正隔室數 K連同N用於計算所測試樣品中的靶DNA副本的實際初始數目Μ的估值E (M)。
[0007] 數次測定概念的發展在分析化學中提供了新範式。它允許絕對定量而無需實驗裝 置（set-up)的校準。並且，它得益於簡化的實驗室程序，即終點測量，以及解釋實驗結果所 需要的相對簡單的數學工具。然而，現有技術的數字測定是受限制的。
[0008] 1.在測定中，有待確定的分析物粒子的最大數目Μ與隔室的數目N成正比。在許 多應用中以及診斷性定量測定的潛在應用中，動態範圍的跨度（Ω = C+AT) (C+代表測定中 的分析物粒子的估計濃度的上限以及Γ代表下限）較大，例如等於1百萬或更多。為了達 到標準數字PCR程序中的這樣大跨度的動態範圍，根據不利地忽略了在非常小濃度的小的 精確度的本領域的知識狀態所述樣品必須被分至適當大量的隔室（在所述實施例中），分 至多達200, 000個隔室或者實際上如下文中的描述所示，甚至600, 000個隔室中。但是將 樣品分至這樣巨大數目的隔室中可能是不利的，因為這樣的測定需要執行專業的、複雜的 和昂貴的設備。尤其是，旨在分配、擴增和檢查好幾萬或數十萬或數百萬的隔室的測定的設 計需要從許多小體積的微加工、自動化以及快速和感光檢測的昂貴技術。
[0009] 此外，通過現有技術的數字測定所實現的精確度和動態範圍不能獨立地調整 (tuned)，縮小了應用的範圍並提高了測定的技術成本。因此，當使用現有技術的數字測定 使用少數N的隔室時，在縮小範圍的濃度獲得高的精確度（低標準偏差）是不可能的。 [0010] 現有技術提高了增加測定的動態範圍跨度的解決方法以及通過將傳統的數 字定量測定與不同的動態範圍結合而減少隔室的數目[Shen，F. ;Sun，B. ;Kreutz，J. E. ；Davydova, E. K. ；Du, ff. ；Reddy P. L. ；Joseph, L. J. ；Ismagilov, R. F. , "Multiplexed Quantification of Nucleic Acids with Large Dynamic Range Using Multivolume Digital RT-PCR on a Rotational SlipChip Tested with HIV and Hepatitis C Viral Load"，J. Am. Chem. Soc.，Article ASAP (X2011)]。所述解決方法依賴同時進行對多 組隔室的測定。屬於每組的隔室具有相同的體積。在引用的實例中，使用Nz = 4組， 每組Nj = 160個隔室（j = 1至4),四組的每組中的隔室體積等於Vj = 1、5、25和 125nL。所述程序在於i)將所述樣品分至組和隔室中，ii)同時進行信號擴增，iii) 在隊組的每組中分別計數正信號的數目Kj以及iv)計算樣品中的粒子的最可能 的初始濃度。所述計算是費勁的和要求高的，因為反覆計算乘積（product)的需求

【權利要求】
1. 用於確定粒子濃度估值E(c)的方法，其中將預定體積的樣品分至一定數目的（N)隔 室中，在所述（N)隔室的任一個中存在的至少部分粒子提供可測量的信號並且所述粒子的 估計濃度E(C)為所測量信號的函數，其特徵在於，所述方法包括以下或由其組成： a) 確定分離的隔室的數目（N)，其中所述數目（N)小於或等於以下函數的值
其中（A)表示為整數6的實數， 其中（C+)表示要以所述方法估計的濃度（C)的區間的預定上限， 其中（Γ)表示要以所述方法估計的濃度（C)的區間的預定下限， 其中（σΜΧ)表示粒子濃度估值E(C)的預定的最大可允許的相對標準偏差，其中 r〈c〈c+，以及 b) 確定調製因數（Zi)，其中（Zi)為所述（N)隔室的至少部分或全部中的樣品的體積 ( Vi)和稀釋因數（cQ的函數；並將所述樣品分至（N)隔室，其中兩個或更多個所述（N)隔 室的至少部分或全部包含不同樣品體積（ Vi)和/或不同稀釋因數（屯）的樣品或由其組成， 其中（i)表示由整數〇至N-1表示的所述（N)隔室的索引號，並且 其中（Vi)表示所述體積以及（屯）表示所述隔室⑴中的樣品的稀釋因數。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述調製因數（Zi)可通過函數Zi= (vAVGA) 或其類似函數確定，其中所述類似函數表達關於隔室中粒子估計數目的逐對差異的信息， 其中（i)、（Vi)和（cQ如權利要求1中所定義的並且 其中（ν〇)表示參照隔室中的樣品的體積以及（d〇)表示參照隔室中的樣品的稀釋因數， 其中所述參照隔室與隔室（i)不同，優選地其中所述參照隔室表示（N)隔室系列中的第一 隔室。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其中在步驟b)中1%、優選地5%、更優選地25%、 甚至更優選地50%、甚至更優選地75%以及最優選地100%的所述（N)隔室在調製因數 ( Zi)的值上彼此不同。
4. 根據權利要求1-3任一項所述的方法，其中在步驟b)中調製因數（Zi)的值基於良 好定義的冪序列，指數序列，多項式序列或者等比序列或者基於優選地通過高斯分布預先 確定的在隔室組中的分布，或者它們的組合。
5. 根據權利要求4所述的方法，其中在步驟b)中將所述樣品以這樣的體積（Vi)和稀 釋因數（屯）分配至（N)隔室以滿足以下條件 ：
其中x>0且X關1，優選地其中（X)的值由大約0.1，0.5,0.8,0.9,0.91，0.92,0.93,0· 94, 0. 95, 0. 96, 0. 97, 0. 98, 0. 99, 1. 01, 1. 02, 1. 03, 1. 04, 1. 05, 1. 06, 1. 07, 1. 08, 1. 09, 1. 1, 1. 2, 1. 3, 1. 4, 1. 5, 2 或 10 表示並且 其中優選地係數X = (^+1屯+1)/(^屯）可通過以下函數確定：
將隔室的數目（N)設置為不小於可由以下函數確定的值的整數：
其中（ΛΝ)為不小於可由以下函數確定的值的整數： ΔΝΖ 4. 5637 (1-χ)-0·798 並且其中cU。的值可由以下函數確定：
其中（C+)，（Γ)，（ σ MX)，（d。）和（V。）如權利要求1和2中所定義的。
6. 根據權利要求1至5任一項所述的方法，其中在步驟b)中將所述樣品以這樣的體積 (Vi)和稀釋因數（cQ分配至（N)隔室以滿足以下條件：
其中㈧和 ⑶表示相互獨立的任意實數，並且其中優選地A = 1/C+和/或B = [1. 95 · In {(C+/T) / N}]°_856,其中優選地將所述樣品分至（N)隔室
優選地
其中（C+)，（σ)，和（σ。如權利要求1中所定義的。
7. 根據權利要求1至6任一項所述的方法，其中所述方法包括下列步驟或由其組成： c) 任選地用一種或多種合適的試劑和任選的一種或多種稀釋劑擴增隔室的粒子以獲 得指示隔室中粒子的預定臨界數目的存在的可測量信號，所述粒子優選地有一個、兩個、三 個或更多， d) 測量所述（Ν)隔室的每一個中的所述信號並對至少部分、優選地全部隔室指定值 0〇,其中（i)表示由整數0至N-1表示的隔室的索引號並且如果隔室（i)包含預定臨界 數目的粒子或更多粒子或由其組成，就對隔室（i)指定第一值0〇,如果隔室（i)包含少於 指示第一值的臨界數目的粒子或由其組成，就對隔室（i)指定第二值0〇,以及 e) 確定粒子的估計濃度E(C)，其中粒子的估計濃度E(C)可通過以下函數確定： i. 第一和/或第二值〇〇的加和K，其中所述函數優選使用校準修正函數進行修正， 和/或 ii. 加權的第一和/或第二值（w^)的加和K，其中所述值〇〇的至少一部分，優選每 個值GO用權重值（Wi)進行調製，其中（i)表示由整數0至N-1表示的所述隔室的索引號， 並且其中權重值（wj優選地與編號（i)的隔室的體積和/或稀釋的程度成反比，並且其中 所述函數優選使用校準修正函數進行修正，和/或 iii. 微態μ的編號、矢量、矩陣、任意階張量或任何其它清楚的表示，其中所述編號、 矢量、矩陣、任意階張量或任何其它表示包含表示微態μ的反映步驟e)中測量的值（1〇的 至少一部分的信息或由其組成，優選地包含矢量k= {kt}，或由其組成，其中所述矢量（k) 包含步驟e)中測量的值〇〇的至少一部分，優選全部，或由其組成。
8. 根據權利要求1-7任一項所述的方法，其中在步驟b)中將所述樣品分配至若干一定 數目的（NUB)兩個或更多分離組的隔室（庫），每個庫組用（j)進行索引編號並含有Ν/>0 個隔室，相同庫中的每個隔室包含具有相同調製因數值的一部分樣品體積或由其組 成，其中\為庫組（j)中的樣品的體積（Vi)和稀釋因數（屯）的函數，並且其中所述N UB個 分離的庫組j可通過不同的調製因數（Zj)值彼此區分，其中j表示由整數〇至N UB-1表示 的庫組數目（NUB)的索引號並且 其中，優選地調製因數（zp通過函數\ = (vAVhd。）或其類似函數進行確定，其中 所述類似函數表達關於隔室中粒子估計數目逐對差異的信息， 其中（')表示庫組（j)的隔室中的樣品的體積並且（4)表示庫組（j)的隔室中的樣 品的稀釋因數並且 其中（ν〇)表示所選擇的參考庫組?)的隔室中的樣品的體積以及（d〇)表示所選擇的 參考庫組（j)的隔室中的樣品的稀釋因數。
9. 根據權利要求8所述的方法，其中在步驟b)中至少部分、優選地全部數目（NUB)的 庫組（j)中的每個庫組（j)包含N/ = Ν'個隔室或由其組成，並且滿足以下條件： (Vf+idf+i) / (Vfdf) - ζ?+1/Zj 一 x 其中x>0且x尹1並且其中優選地以下函數：
表示係數（X)的最大優選值，其中可將係數（X)調至執行所述方法的技術優選值，並且 將每個庫組（j)中的隔室數目N/設置為不小於可通過以下函數確定的值的整數：
並且將分離的庫組（j)的數目（NUB)設置為不小於可由以下函數確定的值的整數：
其中 ANlib = 4. 5637 (1-x)-0·798 並且其中
可通過以下函數確定：
其中（c+)，（σ)和（〇MX)如權利要求1中所定義的，並且（屯）和（V(l)如權利要求13 中所定義的。
10. 根據權利要求8或9所述的方法，其中對NUB個庫組（j)的至少一部分或優選地 每個指定僅
所述值
為對步驟d)中的庫組（j)所包含的隔室的每一個指定的 至少部分、優選地全部值（ki)的函數，並隨後將所述值
繪製為微態μ的編號、矢量、 矩陣、任意階張量或任何其它清楚的表示，其中所述編號、矢量、矩陣、任意階張量或任何 其它表示包含表示微態μ的反映至少部分值 的信息或由其組成，優選地包含矢量
或由其組成，其中所述矢量（kUB)包含至少部分、優選地全部值I
!或由其 組成，其中優選地所述值丨
包含對步驟d)中的庫組（j)所包含的隔室的每一個指定的 值GO的加和或由其組成。
11. 根據權利要求1至10任一項所述的方法，其中兩種或更多種不同的粒子和/或基 本上相同的粒子的兩個或更多不同部分的濃度被確定，其中存在於所述（N)隔室的任一個 中至少部分、優選地全部所述不同粒子和/或基本上相同的粒子的不同部分提供，優選地 被放大以提供兩個或更多可區別的可測量信號，其中所述（N)隔室的任一個中的所述兩個 或更多可區別的信號被測量並且其中對於所述（N)隔室的每一個，分別指定兩個或更多不 同的值，其中所述不同的值彼此獨立地表明在所述隔室中是否存在臨界數目的相同粒子和 /或基本上相同的粒子的相同部分。
12. 用於根據權利要求1至11的任一項確定粒子的濃度的裝置，其特徵在於，所述裝置 被配置為： a) 確定分離隔室的數目（N)，其中所述數目（N)小於或等於以下函數的值
其中（A)表示為整數6的實數，其中（C+)表示要以所述方法估計的濃度（C)區間的預 定上限，其中（Π 表示要以所述方法估計的濃度（C)區間的預定下限，其中（〇MAX)表示粒 子濃度估值（C)的預定的最大可允許的相對標準偏差，其中r〈c〈c+，以及 b) 確定調製因數（Zi)，其中（Zi)為至少部分或全部（N)隔室中的樣品的體積（Vi)和 稀釋因數（cQ的函數，這樣兩個或更多個所述（N)隔室的至少部分或全部包含不同樣品體 積（ Vi)和/或不同稀釋因數（cQ的樣品或由其組成，其中⑴表示由整數0至N-1表示的 所述（N)隔室的索引號，並且其中（ Vi)表示體積，（屯）表示隔室（i)中的預定體積的樣品 的稀釋因數。
13. 根據權利要求1至11的任一項所述方法或根據權利要求12所述裝置對於以下的 應用 a) 減少包含預定樣品體積的隔室的總數目（N)和/或 b) 減少全部（N)隔室中的包含樣品、適合於擴增至少部分粒子至可測量信號的一種或 多種試劑和任選的一種或多種稀釋劑或由其組成的混合物的總體積和/或 c) 預先確定每個（N)隔室中的包含樣品、適合於擴增至少部分粒子至可測量信號的一 種或多種試劑和任選的一種或多種稀釋劑或由其組成的混合物的體積、優選地最小或最大 體積，和/或 d) 預先確定將預先確定的樣品體積分配至所述（N)隔室的調整因數（Zi)、優選最小或 最大適合的調製因數（ Zi)。
14. 用於根據權利要求1至11的任一項確定粒子濃度的方法的樣品架，其特徵在於，所 述樣品架被配置為 a)包含預定數目（N)的隔室或由組成，其中所述數目（N)小於或等於函數
的值 其中（A)表示為整數6的實數，其中（C+)表示要以所述方法估計的濃度（C)區間的預 定上限，其中（σ)表示要以所述方法估計的濃度（C)區間的預定下限，其中（〇MX)表示粒 子濃度估值（C)的預定的最大可允許的相對標準偏差，其中r〈c〈c+，以及 b)其中所述（N)隔室被配置為包含具有預定的調整因數（Zi)的預定的樣品體積，其中 (Zi)為至少部分或全部所述（N)隔室中的樣品的體積（Vi)和稀釋因數（di)的函數，這樣 兩個或更多所述（N)隔室的至少部分或全部包含不同樣品體積（ Vi)和/或不同稀釋因數 (cQ的樣品或由組成，其中⑴表示由整數0至N-1表示的所述（N)隔室的索引號，並且其 中（ Vi)表示體積，（cQ表示隔室⑴中的樣品的稀釋因數。
15.包含根據權利要求14所述的樣品架和適合於擴增所述樣品架的隔室中所包含的 至少部分粒子至可測量信號的一種或多種試劑和用於確定粒子濃度的一種或多種適當的 稀釋劑，優選地用於根據權利要求1至11任一項所述的方法確定粒子濃度的試劑盒。
【文檔編號】C12Q1/68GK104053784SQ201280056869
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2012年11月19日 優先權日:2011年11月17日
【發明者】彼得·加爾斯特茨基, 帕維烏·拉法烏·登布斯基, 米哈烏·奧斯曼尼克, 託馬什·卡明斯基, 亞當·瓦爾霍烏斯基 申請人:好奇診斷有限責任公司