卵巢癌抗獨特型抗體與熱休克蛋白融合蛋白的製備及應用的製作方法

2023-09-19 09:45:15 2

專利名稱：：卵巢癌抗獨特型抗體與熱休克蛋白融合蛋白的製備及應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及卵巢癌抗獨特型單鏈抗體6BllScFv與熱休克蛋白(HSP)融合蛋白(6BllScFvHSP)的製備及其在抗卵巢癌免疫反應中的應用。
背景技術：
：卵巢癌是嚴重威脅婦女健康的疾病，在婦科惡性腫瘤中發病率第二位、死亡率卻居首位，是婦科惡性腫瘤的主要死亡原因。由於其發病隱匿、進展迅速，70%80%的卵巢癌患者發現時已為晚期，5年生存率僅為30%左右，傳統手術、化療效果尚不滿意；即使暫時控制病情，70%以上的卵巢癌最終仍會進展或復發，進一步治療更加困難。因此，目前迫切需要更有效的治療方法來提高卵巢癌患者的生存率，改善生活質量。腫瘤生物治療是繼傳統手術、放療和化療之後的第四大腫瘤治療模式，腫瘤疫苗作為腫瘤生物治療的一種，其能動員機體免疫系統發揮積極抗腫瘤作用，具有特異性、靶向性，成為傳統治療手段的有益補充，已應用於多種惡性腫瘤的臨床治療。隨著生物技術的不斷進步和對機體免疫反應的深入研究，腫瘤疫苗也經歷了極大發展，主要包括細胞疫苗、抗原疫苗、抗獨特型疫苗、肽疫苗或表位疫苗。腫瘤細胞疫苗來源於自體或異體腫瘤細胞或腫瘤細胞粗提物，由於其含有個體全部腫瘤抗原，能誘導出一定的抗腫瘤免疫反應，但是，腫瘤細胞疫苗尚存在免疫原性弱、有致瘤性等缺點，療效和安全性受到質疑；抗原疫苗是從腫瘤細胞中提取的特異性或相關性抗原，成份明確，降低了致瘤性和自身免疫反應，但機體免疫系統對腫瘤抗原發生耐受會導致這類疫苗難以誘導出有效抗腫瘤免疫反應；抗獨特型疫苗是模擬腫瘤抗原表位的內影像，與原始的腫瘤抗原不同，能夠打破機體固有的免疫耐受狀態，激發特異性免疫反應，同時比抗原疫苗製備過程簡單，副作用輕微；6BllScFv即模擬卵巢癌相關抗原OC166-9的抗獨特型單鏈抗體，在體內外都有刺激特異性抗卵巢癌免疫反應的能力，但分子量較小，免疫原性較弱，尋找合適的佐劑具有重要意義。熱休克蛋白(HSP)是從原核生物到真核生物普遍存在的一種高度保守的蛋白質，具有分子伴侶作用，參與細胞內蛋白和多肽的摺疊、裝配和轉運，按其分子量大小可分為多個家族，包括HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP(相對分子質量為2.0kDa)及泛素。近年研究表明熱休克蛋白(HSP)具有免疫剌激作用，作為哺乳動物來源的免疫佐劑，能為免疫細胞提供協同刺激信號，激活DC並促進其分泌細胞因子，增強免疫反應強度；同時在DC表面存在特異性HSP受體(CD91,CD14,CD40,Toll樣受體4和Lox-l)，利於DC細胞以受體依賴方式識別結合與HSP融合的外源性抗原，對其進行攝取呈遞；此外，作為分子伴侶，HSP在DC細胞內可介導外源性抗原的交叉呈遞，運載其進入MHC1類分子通路，激活腫瘤免疫所需的特異性CTL，從而激發有效抗腫瘤免疫反應。由於進化中高度保守，HSP通常被機體視為自身蛋白，作為佐劑不會因為自身複雜的表位結構影響機體對腫瘤抗原表位的免疫應答。因此，HSP作為融合疫苗的佐劑具有顯著優勢，是構建小分子疫苗的理想載體。在腫瘤領域中應用較多的是HSP70和Gp96兩種HSP分子。目前，多種腫瘤組織來源的HSP—多肽複合物、體外結合的HSP/抗原肽複合物、重組HSP—抗原肽疫苗，經證實都能夠活化細胞毒性T淋巴細胞(CTL),誘導抗腫瘤免疫應答，並且發揮免疫作用的只是HSP所伴隨的抗原肽。因此，我們選用HSP70分別與6BllScFv及6Bll兩條T細胞表位肽構建融合疫苗，既保存了6B11的抗原特異性，又引入了HSP的非特異免疫增強活性，預期能夠產生較強的抗卵巢癌免疫反應，為進一步研究及應用奠定基礎。由於HSP在不同物種之間有很高同源性，小鼠HSP70在胺基酸水平與人HSP70同源性達到95X，為了保證融合疫苗小鼠體內實驗研究的順利進行，疫苗構建及體內外研究我們都選取小鼠HSP70與單鏈抗體或表位肽進行融合，用於臨床之前，需要進行人源化改造，用人HSP70替換鼠HSP70，從而消除異源蛋白帶來的免疫不良反應，促進融合疫苗療效的發揮。本發明用卵巢上皮癌可溶性抗原0C166-9免疫BALB/c小鼠製備抗卵巢癌單克隆抗體C0C166-9，再用C0C166-9免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤技術製備出一株可以模擬卵巢癌抗原0C166-9的Ab2e型抗獨特型抗體6Bll(具體參見本申請人在先的專利申請CN1356341，該申請已授權)。經基因工程改造，獲得6BllScFv單鏈抗體(參見中國專利ZL01130756.0)，同時對6B11鑑定獲得了兩條模擬卵巢癌抗原的T細胞表位肽(申請號中國專利申請號2006100832997.7)，這些抗獨特型抗體與原始腫瘤抗原不同，有助於打破腫瘤機體的免疫耐受狀況，可用於調節抗卵巢癌細胞免疫反應和進行臨床治療。
發明內容本發明將6BllScFv與小鼠熱休克蛋白70(mHSP70)進行基因水平的融合，在原核表達系統中表達融合蛋白，鑑定其體內外抗卵巢癌活性，為進一步應用於臨床治療提供基礎。本發明還提供了製備上述融合疫苗的具體方法。優點如下1、本發明選用mHSP70作為佐劑與6BllScFv構建融合疫苗，既保完整保存了6B11的抗原特異性，又引入了HSP的非特異免疫增強活性，預期能夠產生較強的抗卵巢癌免疫反應。2、本發明的單鏈抗體及T細胞表位肽均來源於抗獨特型抗體6B11，為一種模擬抗原，與真實的腫瘤抗原不同，可打破腫瘤機體固有免疫耐受狀態，促進融合疫苗發揮抗腫瘤作用。3、本發明選用HSP70作為融合疫苗載體，可通過多個途徑增強免疫反應，同時作為進化上高度保守的蛋白，HSP70參加構建融合疫苗本身副反應少，使疫苗應用於臨床更加安全有效。圖1為6BllScFvmHSP70融合基因表達載體圖譜圖2為融合蛋白誘導表達圖3為不同誘導時間蛋白的表達圖4為不同濃度IPTG誘導的蛋白表達圖5為0.6mMIPTG，4h誘導的蛋白表達圖6為稀釋復性純化過程圖7為柱上復性過程圖8為純化蛋白_一柱上復性，稀釋復性圖9為Westernblotting測定融合蛋白HSP70部分活性圖10為Westernblotting測定融合蛋白6BllScFv部分活性圖11為直接ELISA測定融合蛋白6BllScFv部分活性圖12為間接ELISA測定融合蛋白HSP70部分活性圖13為競爭抑制ELISA—融合蛋白與OC166-9競爭結合COC166-9的能力測定圖14為直接法ELISA檢測6BllScFv-mHSP70模擬卵巢癌抗原OC166-9的活性的比較圖15為競爭抑制ELISA檢測6BllScFv-mHSP70競爭抑制卵巢癌抗原OC166-9結合卵巢癌單克隆抗體COC166-9的活性的比較圖16為間接法ELISA檢測6BllScFv-mHSP70與小鼠抗-HSP70抗體結合的活性的比較圖17為CCK-8法淋巴細胞增殖實驗圖18為不同蛋白誘導的PBMC對H0C1A的殺傷作用比較圖19為6BllScFv-mHSP70在相同效靶比時對不同細胞系殺傷作用的比較圖20為6BllScFv-mHSP70在同一細胞系時對不同效耙比殺傷作用的比較具體實施例方式實施例1卵巢癌抗獨特型抗體6B11的製備具體的製備過程參見本申請人的在先申請CN1356341，其技術路線包括以下兩個主要步驟1.以卵巢上皮癌可溶性抗原0C166-9免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤技術製備抗卵巢癌單克隆抗體C0C166-9。2.以C0C166-9免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤技術製備模擬卵巢癌抗原0C166-9的抗獨特型抗體。實施例2抗獨特型單鏈抗體6BllScFv的製備.具體的製備過程參見本申請人的在先申請CN1356341，其技術路線包括以下主要步驟16B11卵巢癌抗獨特型單鏈可變區基因的克隆及序列分析2卵巢癌抗獨特型單鏈抗體6BllScFv在大腸桿菌中的高效表達3以包涵體形式表達的6BllScFv的復性、純化和活性研究實施例36BllScFvmHSP70融合基因構建，蛋白表達及活性測定技術路線如下重組6BllScFvmHSP70融合基因的構建用限制性內切酶Spel和EcoRl消化pET30a(+)-6BllScFvmGM質粒，回收純化線型PET30a(+)-6BllScFv質粒；PCR法以pET30-mHSP70為模板，克隆出小鼠HSP70全長cDNA(1929bp)，根據Genebank上基因序列(NM_010478)設計上下遊引物，以粘末端連入pET30a(+)-6BllScFv質粒，構建成融合基因pET30a(+)6BllScFvmHSP70。為得到相同粘末端，在上下遊引物5'端分別加入Spel和EcoRl酶切位點，下遊引物5'端尚加入終止密碼子TTACTA，引物序列為上遊引物5，-GCGACTAGTATGGCCAAGAACACGG-3'下遊引物5'-GCGGAATTCTTACTAATCCACCTCCTCGA-3'PCR條件為:95。C變性2min，95°C，20s，56°C，20s,72。C，30s，30個循環，72。C延伸3min。產物測序正確後，SPel和EcoRl雙酶切，凝膠純化回收，以T4連接酶與pET30a(+)-6BllScFv連接構成目的基因，轉化入大腸桿菌DH5a,篩選陽性克隆，酶切鑑定後測序。二融合蛋白的表達，復性及純化1融合蛋白的誘導表達測序正確的融合基因轉化入大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導表達並對誘導劑濃度(設0，0.2,0.4,0.6,0.8，l.Oand1.2mM)及誘導時間(設lh,2h，3h,4h,5h，6h)進行優化，表達菌在37度生長至0D600達0.8時，加入IPTG，誘導一定時間，收穫菌體，SDS-PAGE分析蛋白表達情況，通過凝膠灰度掃描分析確定目標蛋白最大表達量的誘導時間和IPTG濃度，以此為條件，在1LLB液體培養基中接種表達菌，誘導目的蛋白的大量表達。6000g離心15min收穫細菌沉澱，用電子天平稱取沉澱質量。2包含體分離及裂解細菌沉澱經PBS洗滌，重懸於超聲裂解液中(50mMTris-HC1pH8.0,100mMNaCl,5mMEDTApH8.0)，lg溼菌加20ml超聲裂解液，加入lmg/ml溶菌酶，冰上孵育30min，-80度及37度反覆凍融46次，超聲裂解細菌，釋放包含體，4度，12000rpm離心15min，棄上清，收集包含體沉澱並稱重(共5.4g)，沉澱經2M尿素洗滌液(lOOmMTris-HCl，2Murea，50mMNaCl，O.5mMEDTA,5mMDTT，0.02%TritonX-100)充分洗滌三次，TE(IOmMTris-HC1,lmMEDTA,pH8.O)洗滌一次，洗滌後的包含體溶解於6M鹽酸胍裂解液(每lg包涵體加入20ml裂解液)(50mMTris-HC1，6M鹽酸胍，100mMNaCl,5mMDTT，0.lmMPMSF)中，65度水浴2小時至包含體徹底溶解，12000rpm離心15min，上清用8M尿素裂解液(50mMTris-HCl，8Murea，100mMNaCl,lmMEDTA,5MmB-巰基乙醇)透析34次，離心取上清繼續下步實驗。3重組蛋白復性及純化Bradford法或Gene-Quant測定包含體裂解液上清的蛋白濃度(約20mg/ml),分別通過稀釋復性及柱上復性兩種方法對重組蛋白進行復性及純化(1)稀釋復性將包含體裂解液快速稀釋入新鮮配製的復性液中(50mMTris-HCl，5mMEDTA，O.5ML-Arg，50raMNaCl，pH8.0，GSH0.2mM,GSSGlmM)使蛋白終濃度為100-150iig/ml。為了提高復性效率，我們進行了續貫稀釋(sequentialdilution)的復性方法，即每加入一定量的包涵體裂解液後，室溫放置一小時，連續進行三次稀釋復性，稀釋過程迅速，水平搖晃容器，此後復性液在100C敞口靜置4872小時，離心測上清蛋白濃度62.7ug/ml。稀釋復性蛋白液經Ni-NTA柱(Qiagen)進行親和層析純化，在上柱前用20mMTris-HC1,pH8.0,0.5M尿素透析除去復性液中可能影響Ni2+-NTA柱親和力的小分子如L-Arg和EDTA，純化步驟按照6*His_taggedprotein純化說明書進行(Qiagen,GeneCompanyLimited,China)(2)柱上復性層析柱採用AmershamPharmaciaBiotech公司10ml柱床，填入5mlNi-NTA填料，5倍體積的bufferE(50mMTris-HC1，8M尿素，300mMNaCl，5mM巰基乙醇，20mM咪唑,pH8.0)平衡柱床。lml包含體裂解液(20mg/ml)上樣，然後用5倍體積的bufferE洗柱，去除非特異結合雜蛋白及其他雜質。復性過程是用一系列含不同濃度尿素的復性液進行階梯式流洗。具體過程為依次用含有8M/7M/6M/5M/4M/3.5M/3M/2.5M/2M/1M/0.5M尿素，50mMTris-HC1pH8.0,300mMNaCl，及20mM咪唑的復性液流洗柱床，其中尿素濃度為5M到2M的復性液中加入lmMGSSG和0.2mMGSH組成的氧化還原體系。每種液體10倍體積流洗柱床，速度O.5ml/min。最後，用洗脫液(50mMTris-HClpH8.0，300mMNaCl，250mM咪唑，0.5M尿素)將復性蛋白從柱上洗脫下來。通過流洗液及洗脫液在280nm處的吸收峰來監測並收集蛋白液，收集液體進行SDS-PAGE分析。整個層析復性過程在PharmaciaBiotechGradiFracSystem上進行。全部蛋白洗脫液(體積6ml)用50mMTris-HClpH8.0，200rnMNaCl,0.25M尿素透析除去咪唑，測濃度(0.4mg/ml)。通過下面公式分別計算稀釋復性及柱上復性蛋白復性率蛋白復性得率(％)-復性後樣品量(未純化時)/復性前樣品量X100X三重組蛋白鑑定及測活1ELISA方法測定重組蛋白活性(1)直接ELISA檢測融合蛋白6BllScFv部分活性lOOu110ug/ml的復性蛋白倍比稀釋包板，6B11完整抗體作陽性對照，10%羊血清作陰性對照包板，4oC過夜。次日PBS-T洗三次，每次5min，向各孔分別加入100ul10%羊血清，37oC.封閉1小時；PBS-T洗三次，每次5min，再向各孔加入100p1辣根過氧化物酶標記的COC166-9(本室製備，濃度50ug/ml)，其中空白對照孔用PBS代替酶標COC166-9，37°C孵育1小時，PBS-T洗三次，每次5min，然後分別加入100ix1顯色底物OPDs室溫避光5min，加50u12MH2S04終止反應，酶標儀上讀取490nm光密度值(Bio-RadModel550，Hercules,CA)。(2)間接ELISA測融合蛋甴HSP70部分活性包板同前，抗mHSP70單克隆抗體(l:2500稀釋)作一抗，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG1(396羊血清1:2000稀釋)作二抗，常規ELISA,酶標儀讀取490nm光密度值。(3)競爭抑制ELISA測定融合蛋白模擬0C166-9競爭結合C0C166-9的能力卵巢癌患者腹水提取物100ul包板(濃度20ug/ml,含2ugOClQ6-9)4oC過夜，倍比稀釋的復性蛋白(20ug/m起)分別和酶標COC166-9U.5ug/ml)在EP管中室溫孵育30min進行反應，100u1各管反應產物加入ELISA反應孔，37oC孵育2h，對照孔只加入顯色底物而不加入管內反應產物(未抑制孔)，常規ELISA，酶標儀讀取490咖光密度值(A490)。抑制率(%)=[A490(未抑制孔)—A490(檢測孔)/A490(未抑制孔)]X100%2Westernblotting鑑定融合蛋白復性蛋白經8%SDS-PAGE電泳後，IOOV，1小時溼轉至PVDF膜(Millipore)。5%脫脂奶室溫封閉1小時，加入l:2500稀釋的抗mHSP70單克隆抗體，或者1:50稀釋的COC166-9,搖床，4度孵育過夜，次日TBS-T洗三次，每次15min，加入l:2000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgGl，搖床，室溫孵育l小時，TBS-T充分洗滌後化學發光顯影(SantaCruzBiotechnology)。四融合疫苗體外抗卵巢癌免疫活性的測定16BllScFv-mHSP70融合蛋白的活性比較(1)直接法ELISA檢測6BllScFv-mHSP70模擬卵巢癌抗原OC166-9的活性的比較6BllScFv-mHSP70融合蛋白、6BllScFv自2pmol/ml倍比稀釋，包被酶標板，6B11完整抗體作陽性對照，10。/。羊血清作陰性對照4。C過夜。次日加含10%羊血清的PBS100nl/孔，37。C封閉lh。力卩3。/。羊血清稀釋的HRP-COC166-9(濃度50ug/ml)100nl/孔，其中空白對照孔用PBS代替HRP-COC166-9，37。C孵育lh。每次加樣前PBS-T洗3次，顯色，測吸光度值A490。結果見附圖14。(2)競爭抑制ELISA檢測6BllScFv-mHSP70競爭抑制卵巢癌抗原OC166-9結合卵巢癌單克隆抗體COC166-9的活性的比較含OC166-9的卵巢癌患者腹水提取物100ul包板(濃度lug/ml)，4T過夜。次曰加含10。/。羊血清的PBS100nl/孔，37。C封閉lh。一系列EP管中加入倍比稀釋的6BllScFv曙mHSP70融合蛋白、6BllScFv(2umol/ml起)禾HHRP-COC166-9(50ug/ml)，室溫孵育30分鐘。向反應孔中分別加入100[il各管反應產物，37°C孵育lh。陽性對照只加HRP-COC166-9(未抑制孔)。陰性對照只加顯色底物液。除最後一步外，每次加樣前PBS-T洗3次，顯色，測A490nm值。計算抑制率抑制率(％)二[A490(未抑制孑L)—A490(檢測孔)/A490(未抑制孔)]xl00%。結果見附圖15。(3)間接法ELISA檢測6B11ScFv-mHSP70與小鼠抗-HSP70抗體結合的活性的比較6BllScFv-mHSP70融合蛋白、mHSP70包板(2nmol/ml)。次日加10(HU3%羊血清稀釋的抗一HSP70單克隆抗體(1:2500稀釋)，空白對照孔用PBS代替抗一HSP70，37。C孵育lh。加100[ilHRP-羊抗鼠IgG(3%羊血清l:2000稀釋)，370C孵育lh，每次加樣前PBS-T洗3次，顯色，測A490nm值。結果見附圖16。2外周血單個核細胞(PBMC)的分離採集HLA-A2陽性的女性健康志願者的PBMC，用PBS按1:l比例稀釋混勻，1000rpm/min離心10min，棄上清以去除血小板；鋪制淋巴細胞分離液，2000-2500rpm/min離心20min。外周血PBMC單獨位於一層，呈白色膜狀；吸取PBMC，移入另一離心管，PBS洗滌2次，1000rpm/min離心5min,不全RPMI1640培養液洗滌一次，臺盼藍染色並計數(活細胞佔95%),用完全RPMI1640調整細胞濃度為5xlO"ml。分離過程中，溫度控制在18-28'C。3淋巴細胞增殖實驗(CCK-8法)按照CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所)說明，將用培養基分別倍比稀釋6BllScFv-mHSP70融合蛋白、6BllScFv、mHSP70(從1.6至U0.1umol/ml)50ul至於96孔板中，力口PBMC2xl6/ml50ul。陰性對照只力口lxl6/mlPBMC100ul，空白對照只加100ul培養液。每個樣品有5個復孔。在37'C，5MC02培養箱中共同孵育4h。每孔加入10ulCCK-8溶液，繼續培養4h。測定A450值。結果見附圖17，經融合蛋白刺激PBMC後的增殖作用最高，與其他對照組相比有統計學差異(P<0.05)。4流式細胞儀分析細胞表型調整PBMC4xl6/ml，實驗組每2mlPBMC加入IL-4、GM-CSF各1000u/ml，再分別加入6B11ScFv-mHSP70融合蛋白0.1umol/ml、6B11ScFv0.8umol/ml、mHSP700.2umoI/ml培養3天，培養第四天再次加入IL-4、GM-CSF各1000u/ml和6BllScFv-mHSP70融合蛋白0.1umol/ml、6BllScFv0.8umol/ml、mHSP700.2umol/ml繼續培養3天，最後加入IL-21000u/ml培養3天後做流式分析。培養對照組只加細胞因子。未培養對照組PBMC4xl06/ml，取lml做流式。以上各組各設2個平行管。以上各組PBMC經刺激培養後懸浮為1x106/ml，取1OOul分別加入標記好的小鼠抗人單克隆抗體CD3-PerCP5ul、CD4-FITC5ul、CD8-APC3ul;取標記好的小鼠抗人單克隆抗體IgG-FITC、IgG-APC作為對照；分別吹打混勻，置暗處標記，4'C15分鐘；PBS洗2次，第一次，用800ul含5。/。FBS和0.02Q/。疊氮鈉的PBS洗。第二次，用800ulPBS洗，以洗去多餘的二抗；離心後細胞重懸於200ulPBS中，吹打混勻，置於FCM專用分析管中，用美國BectonDickinson流式細胞儀分析。結果見表l。表l不同蛋白刺激PBMC前後正常人T細胞表型分析tableseeoriginaldocumentpage12*為各蛋白組及培養對照組與未培養對照組相比較差異有統計學意義(P<0.05)PBMC經融合蛋白及細胞因子共同刺激後，CD3+、CD4+、CD8+T細胞比培養對照組及未培養對照組均明顯增加，CD4+ZCD8+比值明顯增加。融合蛋白刺激PBMC後，CD8+、CD3+和CD4+T細胞的增加比6BllScFv及mHSP70刺激組均明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。5LDH釋放實驗復甦凍存的腫瘤細胞卵巢癌H0C1A細胞(HLA-A2+，OC166-9+)、卵巢癌SKOV3細胞(HLA-A2—，OC166-9+)、肝癌HLE細胞(HLA-A2+，OC166-9一)。HOCIA用完全MCDB培養液傳代培養，SKOV3及HLE用完全RPMI1640培養液傳代培養，收穫對數生長期細胞並調整細胞濃度為2xl06/！111。刺激後的PBMC作為效應細胞，培養刺激過程同流式分析。按照LDH試劑盒(Promaga公司)說明，設實驗孔、效應細胞自然釋放孔、靶細胞自然釋放孔、靶細胞最大釋放孔、體積校正對照孔、培養液背景對照孔。於96孔U形培養板中，效應細胞與靶細胞的比例設為100:1、50:1、25:1、12.5:1。在37。C、5。/。C02培養箱中共同孵育4h;收穫前45min，向靶細胞最大釋放孔及體積校正對照孔加10ul裂解液/100ul培養液，在37'C、5y。C02培養箱中繼續培養至4h。1000rpm離心4min;每孔分別吸取50ul上清至96孔酶標板，加入50ul重懸底物混合液/孔，避光，室溫30min;測A490值。每組設4個復孔。計算殺傷率殺傷率(％)=(實驗細胞釋放一效應細胞自然釋放一靶細胞自然釋放)X100。/。/(靶細胞最大釋放一耙細胞自然釋放)。結果見表2，附圖18—20。表2不同蛋白剌激正常人外周血單個核細胞對腫瘤的殺傷作用殺傷率％靶細胞蛋白效紀比tableseeoriginaldocumentpage13*為在相同效靶比時，各蛋白疫苗組對同一靶細胞的殺傷作用與PBMC組比較差異有統計學意義**為在相同效靶比時，各蛋白疫苗組對H0C1A的殺傷作用與對SK0V3及HLE比較異有統計學意義在相同的效靶比下，6BllScFv-mHSP70融合蛋白刺激誘導的PBMC對H0C1A的殺傷高於未經任何蛋白刺激的PBMC組，而且殺傷率的高低隨效靶比的增加而升高，差異有顯著性(屍<0.05)。說明6BllScFv-mHSP70融合蛋白刺激誘導PBMC對耙細胞可以產生特異性的殺傷作用。且在實驗範圍內與效靶比成正比，即效應細胞越多，殺傷作用越大。6B11ScFv-mHSP70融合蛋白刺激誘導的PBMC對HOC1A細胞系的殺傷較6BllScFv、mHSP70組明顯增高；在效耙比為100:1、50:1、25:1時，6BllScFv-mHSP70融合蛋白組對HOClA的殺傷較6BllScFv、mHSP70組高，殺傷率均有顯著性差異(P<0.05)，證明融合蛋白具有刺激PBMC產生特異性的殺傷作用。所以，由融合蛋白誘導PBMC產生的殺傷效果強於6BllScFv組和mHSP70組。權利要求1.一種卵巢癌抗獨特型單鏈抗體6B11ScFv與熱休克蛋白(HSP)構建的融合蛋白(6B11ScFvHSP)。2.如權利要求1所述的融合蛋白，其中熱休克蛋白為鼠熱休克蛋白。3.如權利要求1所述的融合蛋白，其中熱休克蛋白為鼠熱休克蛋白70.4.如權利要求1所述的融合蛋白，其中熱休克蛋白蛋白為人休克蛋白。5.如權利要求1所述的6BllScFvHSP融合蛋白在卵巢癌免疫治療中的應用。全文摘要本發明涉及卵巢癌抗獨特型抗體與熱休克蛋白融合蛋白的製備及應用。本發明進行了卵巢癌抗獨特型單鏈抗體6B11ScFv與熱休克蛋白(HSP)融合蛋白(6B11ScFvHSP)的構建、製備及其體外抗卵巢癌活性的研究，該融合疫苗同時具備了6B11ScFv特異性抗卵巢癌活性及HSP非特異性免疫刺激作用，能夠有效刺激體內外抗卵巢癌免疫反應，在卵巢癌治療中具有良好的應用前景。文檔編號C07K19/00GK101381414SQ200810132978公開日2009年3月11日申請日期2008年7月4日優先權日2008年7月4日發明者付天雲,劉春雨,雪葉,恆崔,果張,成夜霞,昌曉紅,程洪豔申請人:北京大學人民醫院