合歡皮皂苷佐劑及其製備方法和含該佐劑的疫苗製劑及用途
2023-09-19 09:51:50 1
合歡皮皂苷佐劑及其製備方法和含該佐劑的疫苗製劑及用途
【專利摘要】本發明涉及具有免疫佐劑作用的合歡皮皂苷及其製備方法和含該皂苷佐劑的疫苗製劑，以及它們在製備疫苗製劑中的應用。該皂苷是從中藥合歡皮中提取分離的合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B，可誘導局部組織產生細胞因子和趨化因子，募集免疫細胞到注射部位，誘生機體同時產生Th1型和Th2型免疫應答，顯示出比現有技術中已知的鋁膠佐劑能誘導機體對疫苗產生更強的細胞免疫和體液免疫反應，可以作為多種疫苗的免疫佐劑，發揮理想的免疫效果。以該類皂苷為佐劑的疫苗製備工藝簡單、方法簡便、質量容易控制、使用方便、可冰凍保存。
【專利說明】合歡皮皂苷佐劑及其製備方法和含該佐劑的疫苗製劑及用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及從中藥合歡皮中提取分離的具有免疫佐劑作用的合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B，及其製備方法和含該皂苷佐劑的疫苗製劑，以及它們在製備疫苗製劑中的應用。
【背景技術】
[0002]疫苗接種是預防和控制傳染性疾病最經濟、有效的手段。DNA疫苗、重組疫苗和合成肽疫苗等新型疫苗是近年來發展迅速的一類生物製劑，比常規疫苗具有抗原純度高、特異性強、安全性好等優勢。然而，這些新型疫苗免疫原性弱，免疫效力低下[Oyston P,Robinso K.The current challenges for vaccine development.J Med Microbiol2012; 61(7): 889-894]。同此，當前疫苗研究正面臨一些複雜病原如瘧疾、結核、人免疫缺陷病毒等的重要挑戰[Leroux-Roels G.Unmet needs in modern vaccinology:Adjuvants to improve the immune response.Vaccine 2010; 28 (Supp.3): C25-36]。佐劑是傳統疫苗和當前新型疫苗必不可少的組成成分，不僅能影響機體對疫苗免疫應答的強度，而且能針對特定病原體誘導最有效的免疫應答類型[Mbow ML, De GregorioEj Valiante NMj et al.New adjuvants for human vaccines.Current Opinion inImmunology 2010; 22(3): 411-416]。目前研究的免疫佐劑種類很多，如油佐劑、弗氏佐劑、微生物及其代謝產物、核酸及其類似物、細胞因子、脂質體等[Dey AKj Srivastava IK.Novel adjuvants and delivery systems for enhancing immune responses inducedby immunogens.Expert Rev Vaccines 2011; 10: 227-51]，但由於存在不同程度的毒副作用或安全隱患等一些不可避免的缺陷而難以實際應用[Mbow ML, De Gregorio EjValiante NMj Rappuoli R.New adjuvants for human vaccines.Curr Opin Immunol2010，22(3): 411-6; Batista-Duharte A，Lindblad EBj Oviedo-Orta E.Progressin understanding adjuvant immunotoxicity mechanisms.Toxicol Lett 2011;203(2): 97-105] o鋁膠佐劑自192`0s使用以來，直至最近由鋁鹽和TLR4激動劑3_0_去醯基_4』 -單磷醯脂質A組成的AS04被批准之前一直是唯一通過FDA批准的人用疫苗佐劑[Marrack P， McKee AS， Munks MW.Towards an understanding of the adjuvantaction of aluminium.Nat Rev Immunol 2009; 9: 287-293]。然而，銀膠佐劑存在一些問題:①主要通過誘導Th2型免疫應答產生抗體起保護作用，不能誘生Thl型免疫應答和細胞介導的免疫反應，只適用於以抗體為主要保護性免疫的疫苗(Exley C，SiesjoP，Eriksson H.The immunobiology of aluminium adjuvants: how do they reallywork? Trends Immunol 2010; 31: 103-109) 對人免疫缺陷病毒、C型肝炎病毒、單純皰疹病毒、流感病毒以及血吸蟲病、百日咳和傷寒等多種抗原無佐劑作用[O』 HaganDTj De Gregorio E.The path to a successful vaccine adjuvant - ^the long andwinding road』.Drug Discov Today 2009; 14: 541 - 551] 可促進 IgE 抗體產生，容易誘導機體產生過敏反應有局部反應，會形成肉芽腫，極個別可發生局部無菌性膿腫；⑤因其理化性質特點，含鋁膠疫苗怕凍，凍後鋁膠容易變性；⑥對人、畜神經系統可能有影響。因此，鋁膠佐劑已遠遠不能滿足新型疫苗發展的要求[Kool M, Fierens K，Lambrecht BN.Alum adjuvant: some of the tricks of the oldest adjuvant.J MedMicrobiol 012; 61 (7): 927-934]。尋找安全、有效、新型的免疫佐劑是當前疫苗研究領域的一個熱點[Schijns VEJCj Lavelle EC.Trends in vaccine adjuvants.ExpertRev Vaccines 2011; 10(4): 539-550]。免疫佐劑研究現已被列為疫苗研究的優先領域[Harandi AM， Medaglini D, Shattock RJ.Vaccine adjuvants: A priority forvaccine research.Vaccine 2010; 28(12): 2363-2366; Harand AM， Brewe J， SchijnV.Conference Scene: Recent advancements in immunopotentiators for modernvaccines.1mmunotherapy 2011; 3(11): 1297-301]。
[0003]天然藥物用於防治疾病具有悠久的歷史。當今，FDA批准的藥物約30%來源於天然藥物。新的具有免疫活性的天然產物的發現日益成為研究重點，尤其在尋找新一代疫苗佐劑方面[Licciardi PVj Underwood JR.Plant-derived medicines: A novel classof immunological adjuvants.1nt ImmunopharmacoI 2011; 11 (3): 390-398]。阜苷(saponin)是一類廣泛存在於中藥和天然藥物中的重要免疫活性物質[Rios JL.Effectsof triterpenes on the immune system.J Ethnopharmacol 2010; 128: 1-14]。自1951年發現皂苷能增強機體對口蹄疫疫苗的免疫應答以來，其佐劑作用受到了廣泛的關注。研究最多的是南美阜樹(Quillaja saponaria Molina )樹皮中篩選到具有佐劑活性
總阜苷-Quil A 及其活性成分 QS-21 [Skene CD and Sutton P.Saponin-adjuvanted
particulate vaccines for clinical use.Methods 2006; 40: 53-9]0 Quil A和 QS-21對外源性抗原既能剌激Thl免疫應答，又能誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答。這一獨特的特性使其成為亞單位疫苗、細胞內病原體疫苗及癌症疫苗的理想佐劑[MbawuikeI， Zang Y， Couch RB.Humoral and cell-mediated immune responses of humans toinactivated influenza `vaccine with or without QS21 adjuvant.Vaccine 2007;25(17): 3263-9]。但Quil A存在嚴重的缺陷:①溶血性強、毒副作用大，可引起局部組織壞死，甚至全身不良反應和中毒[Waite DC, Jacobson EWj Ennis FA, Edelman R，WhiteB, Kammer R， et al.Three double-blind, randomized trials evaluating the safetyand tolerance of different formulations of the saponin adjuvant QS-21.Vaccine2001; 19: 3957-7.]。臨床安全性評價結果表明:Quil A用於人不安全。目前除了用於為某些絕症設計的疫苗如癌症疫苗和人免疫缺陷病重組疫苗等人用疫苗外，主要限用於口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗等獸用疫苗。②其主要活性成分如QS-21、QS-17、QS-18和QS-7等分子結構中均存在醯基，易水解，其去醯化水解產物失去誘導Thl型免疫應答及產生特異性CTL 的能力，只能引發 Th2 型免疫應答[Kensil CR.1mmunomodulatory adjuvants fromQuillaja saponaria.1mmunopotentiators in Modern Vaccines 2007; 109-22.] ；(3)南美皂樹資源匱乏，總皂苷含量低，同時Quil A中單體化合物分子量大，化學結構十分複雜，分離製備困難。因此，從天然藥物中尋找篩選高效、低毒的皂苷佐劑受到國內外學者高度的關注[Sun HX, Xie Y，Ye YP.Advances in saponin-based adjuvants.Vaccine 2009,27(12): 1787-1796]。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一類用於疫苗的具有顯著免疫佐劑作用的合歡皮皂苷佐劑。
[0005]本發明的另一個目的是提供從中藥合歡皮中提取分離合歡皮皂苷佐劑的方法。
[0006]本發明的進一步目的是提供一種包含所述合歡皮皂苷佐劑的疫苗製劑。
[0007]本發明的還有一個目的是提供所述合歡皮皂苷佐劑在製備疫苗製劑中的應用。
[0008]本發明的合歡皮皂苷佐劑包括從中藥合歡皮中提取分離的合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B。
[0009]本發明提供的合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B是從中藥合歡皮中提取分離的，製備方法包括以下步驟，
以下所說濃度均為質量濃度:
a.將合歡皮藥材粉碎後，以乙醇提取；
b.濃縮乙醇提取液，以水混懸，用乙醚或醋酸乙酯萃取至有機溶劑層近無色，得到水層溶液；
c.取水層以水飽和的正丁醇或戊醇萃取，合併萃取液，減壓回收、濃縮，得到醇萃取
物；
d.取步驟b中的水層溶液或步驟C中的醇萃取物在大孔吸附樹脂柱中進行色譜純化，以水和濃度75%乙醇依次洗脫，收集濃度75%乙醇洗脫液，濃縮，冷凍乾燥，得合歡皮粗皂苷;`
e.合歡皮粗皂苷經大孔吸附樹脂柱分離，以濃度30%、50%、75%乙醇依次洗脫，分別收集濃度50%乙醇和濃度75%乙醇的洗脫液，濃縮，冷凍乾燥，得到2個流份；
f.取步驟d中合歡皮粗皂苷和步驟e中2個流份再分別經離子交換樹脂色譜柱精製，以濃度70%乙醇進行洗脫，收集濃度70%乙醇吸收液，濃縮，冷凍乾燥，得到合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)。
[0010]上述步驟d和步驟e的中所說的大孔吸附樹脂為DlOl大孔吸附樹脂；步驟f中所說的離子交換樹脂為D941弱鹼性陰離子交換樹脂。
[0011]本發明的含合歡皮皂苷佐劑的疫苗製劑，包含有免疫有效量的合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A或合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B以及含有一種或多種藥物學上可接受的載體。
[0012]本發明的合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A或合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B可在製備疫苗製劑中應用。
[0013]上文所述藥學上可接受的載體是指藥學領域的藥物載體。例如:稀釋劑、賦形劑如水、生理鹽水、葡萄糖、甘露醇、甘油、乙醇及其混合物等；填充劑如澱粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、海藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；溼潤劑如甘油；崩解劑如碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑如吐溫-80 ;潤滑劑如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂和聚乙二醇等。另外還可以在組合物中加入其它輔料如香味劑、甜味劑等。
[0014]本發明的疫苗製劑可以是溶液、混懸液或乳濁液形式，可通過口服、鼻吸入、直腸、腸胃外或經皮給藥的方式施用於需要接種的對象。本發明的疫苗製劑用於口服時，可將其製成常規的固體製劑如片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑、緩釋微丸、固體分散體、包含物等，製成的液體製劑如混懸劑、乳劑、溶膠劑、糖漿劑、合劑、溶液劑等；用於腸胃外給藥時，可將其製成注射用的溶液、水或油性混懸劑、乳劑、凍乾粉、脂質體、微囊、微球、納米囊、納米球等。優先的形式是注射用凍乾粉及溶液。
[0015]本發明的疫苗製劑可按照藥學和疫苗領域的任何常規生產方法製備。
[0016]疫苗製劑的典型單劑量可以根據製劑的形式而變化，並根據抗原種類、所需的抗體水平、接種對象的特異性及所需的免疫程序等各種因素進行確定。本發明的疫苗製劑中合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A或者合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B的量可為0.0 Iiig~I g /單劑量，優選為0.1~IOOiig/單劑量。可以一次或多次施用。 [0017]本發明的優點
本發明具有免疫佐劑作用的皂苷(包括合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B)可誘導局部組織產生細胞因子和趨化因子，募集免疫細胞到注射部位，誘生機體同時產生Thl型和Th2型免疫應答，且顯示出比現有技術中已知的鋁膠佐劑能誘導機體對疫苗產生更強的細胞免疫和體液免疫反應。因此，可以作為多種疫苗的免疫佐劑，發揮理想的免疫效果。以該類皂苷為佐劑的疫苗製備工藝簡單、方法簡便、質量容易控制、使用方便、可冰凍保存。該類皂苷成分的溶血性小和安全性好。所以，本發明的皂苷有望開發成疫苗佐劑。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)對OVA受免小鼠血清中特異性IgG抗體效價的影響。OVA:卵清蛋白；Alum:鋁膠,/X0.05、bZX0.01 和 C/X0.001 ks OVA 對照組；d/X0.05、^<0.01 和f/X0.001 Ks鋁膠對照組。
[0019]圖2為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)對OVA受免免疫小鼠血清中特異性IgGl抗體效價的影響。OVA:卵清蛋白；Alum:鋁膠,/X0.05、屮〈0.01 和 C/K0.001 ks OVA 對照組；d/X0.05,^0.01和f/X0.001 Ks鋁膠對照組。
[0020]圖3為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B(AJSB)對OVA受免小鼠血清中特異性IgG2a抗體效價的影響。OVA:卵清蛋白；Alum:鋁膠,/X0.05、bZX0.01 和 C/X0.001 ks OVA 對照組；d/X0.05、^<0.01 和f/X0.001 Ks鋁膠對照組。
[0021]圖4為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B(AJSB)對OVA受免小鼠血清中特異性IgG2b抗體效價的影響。OVA:卵清蛋白；Alum:鋁膠,/X0.05、bZX0.01 和 C/X0.001 ks OVA 對照組；d/X0.05、^<0.01 和f/X0.001 Ks鋁膠對照組。
[0022]圖5為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)對Con A刺激的OVA受免小鼠脾淋巴細胞增殖反應的影響。OVA:卵清蛋白；Alum:鋁膠；a/X0.05、b/X0.01 和 CP<S).001 ks OVA 對照組；d/X0.05 和e/X0.01 Ks鋁膠對照組。
[0023]圖6為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A(AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B(AJSB)對LPS刺激的OVA受免小鼠脾淋巴細胞增殖反應的影響。OVA:卵清蛋白；Alum:鋁膠 ^/X0.05、b/X0.01 和。/X0.001 ks OVA對照組；d/X0.05 和 eZX0.01 ks
鋁膠對照組。
[0024]圖7為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)對OVA刺激的OVA受免小鼠脾淋巴細胞增殖反應的影響。OVA:卵清蛋白；Alum:鋁膠；b/X0.01和。/X0.001 ks OVA對照組；少〈0.05 ks鋁膠對照組。
[0025]圖8為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)對OVA受免小鼠自然殺傷(NK)細胞活性的影響。OVA:卵清蛋白；Alum:鋁膠^/X0.05和bZX0.01 ks OVA對照組；少〈0.05 ks鋁膠對照組。
[0026]圖9為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A(AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)對禽流感雞痘病毒載體活疫苗(rFPV)免疫小鼠血清中特異性IgG 抗體效價的影響。Alum:鋁膠；^<0.01 和 cZX0.001 ks OVA 對照組;屮〈0.05，eZX0.01和f/X0.001 Ks鋁膠對照組。
[0027]圖10為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)對禽流感雞痘病毒載體活疫苗(rFPV)免疫小鼠血清中特異性IgGl抗體效價的影響。Alum:鋁膠；^<0.001 Ks OVA對照組；^<0.05、e/X0.01和f/X0.001 Ks鋁膠對照組。
[0028]圖11為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)對禽流感雞痘病毒載體活疫苗(rFPV)免疫小鼠血清中特異性IgG2a抗體效價的影響。Alum:鋁膠;bP<0.01和C/X0.001 ks OVA對照組；^<0.01和f/X0.001 Ks鋁膠對照組。
[0029]圖12為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)對禽流感雞痘病毒載體活疫苗(rFPV)免疫小鼠血清中特異性 IgG2b 抗體效價的影響。Alum:鋁膠；CP<0.001 ks OVA 對照組；e/X0.01 和 f/X0.001 ks鋁膠對照組。 [0030]圖13為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)對OVA免疫小鼠遲發性超敏(DTH)反應的影響。OVA:卵清蛋白；Alum:鋁膠。bZX0.01 和 e/X0.001 ks OVA 對照組。
[0031]圖14為合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)肌內注射對小鼠局部組織細胞因子蛋白表達的影響。
[0032]圖15為合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)肌內注射對小鼠局部組織趨化因子蛋白表達的影響。
[0033]圖16為合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)肌內注射對局部組織免疫細胞募集的影響。DCs:樹突狀細胞；neutrophils:中性粒細胞；eosinophils:嗜酸性粒細胞；mastcells:肥大細胞。
【具體實施方式】
[0034]以下通過實例進一步說明本發明，而非限制其範圍。
[0035]以下所說濃度均為質量濃度。[0036]實施例1:合歡皮皂苷製備 製備合歡皮總皂苷
藥材桔梗粗粉I kg，以濃度70%乙醇回流提取3次，每次2小時，濾過，合併濾液，減壓回收乙醇，浸膏加適量水混懸，用乙醚萃取至醚液近無色。水層以水飽和正丁醇萃取，直至萃取液近無色，合併萃取液，減壓回收、濃縮，得到醇萃取物。醇萃取物經DlOl大孔吸附樹脂柱，依次用水和濃度75%乙醇進行洗脫，用薄層色譜檢查洗脫液，具有相同斑點的流份合併，減壓回收、濃縮，冷凍乾燥，得合歡皮粗皂苷。粗皂苷混懸於蒸餾水中，上D941弱鹼性陰離子交換樹脂色譜柱純化，濃度70%乙醇進行洗脫，收集洗脫液，減壓回收、濃縮，冷凍乾燥，得合歡皮總皂苷(AJS)。
[0037]藥材桔梗粗粉I kg，以70%乙醇回流提取3次，每次2小時，濾過，合併濾液，減壓回收乙醇，浸膏加適量水混懸，用乙醚萃取至醚液近無色。水層以醋酸乙酯萃取，直至萃取液近無色，水層減壓回收、濃縮，經DlOl大孔吸附樹脂色譜柱，依次用水和濃度75%乙醇進行洗脫，用薄層色譜檢查洗脫液，具有相同斑點的流份合併，減壓回收、濃縮，冷凍乾燥，得合歡皮粗皂苷。粗皂苷混懸於蒸餾水中，上D941弱鹼性陰離子交換樹脂色譜柱純化，濃度70%乙醇進行洗脫，收集洗脫液，減壓回收、濃縮，冷凍乾燥，得合歡皮總皂苷(AJS)。
[0038]合歡皮總阜苷為淺黃白色粉末。Lieberman-Burchard反應和Molish反應均呈陽性，示含三萜皂苷化合物。以齊墩果酸為對照標準品，香草醛濃硫酸顯色，紫外分光光度儀於540 nm比色測得AJS中總皂苷含量為37.65%。
[0039]製備合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A
藥材桔梗粗粉I kg，以70%乙醇回流提取3次，每次2小時，濾過，合併濾液，減壓回收乙醇，浸膏加適量水混懸，用乙醚萃取至醚液近無色。水層以醋酸乙酯萃取，直至萃取液近無色，水層減壓回收、濃縮，經DlOl大孔吸附樹脂色譜柱，依次用水和濃度75%乙醇洗脫，用薄層色譜檢查洗脫液，具有相同斑點的流份合併，減壓回收、濃縮，冷凍乾燥，得合歡皮粗皂苷。合歡皮粗皂苷進行大孔吸附樹脂柱色譜，以水、濃度30%乙醇和濃度50%乙醇依次洗脫，收集濃度50%乙醇洗脫液，減壓回收、`濃縮，濃縮液上D941弱鹼性陰離子交換樹脂色譜柱純化，以濃度70%乙醇進行梯度洗脫，用薄層色譜檢查洗脫液，具有相同斑點的流份合併，減壓回收、濃縮，冷凍乾燥，得合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)0合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A為近白色粉末。Lieberman-Burchard反應和Molish反應均呈陽性,示含三職阜苷化合物。以齊墩果酸為對照標準品，香草醛濃硫酸顯色，紫外分光光度儀於540 nm比色測得AJS中總皂苷含量為46.72%。
[0040]製備合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B
藥材桔梗粗粉I kg，以濃度70%乙醇回流提取3次，每次2小時，濾過，合併濾液，減壓回收乙醇，浸膏加適量水混懸，用乙醚萃取至醚液近無色。水層以醋酸乙酯萃取，直至萃取液近無色，水層減壓回收、濃縮，經DlOl大孔吸附樹脂色譜柱，依次用水和濃度75%乙醇進行洗脫，用薄層色譜檢查洗脫液，具有相同斑點的流份合併，減壓回收、濃縮，冷凍乾燥，得合歡皮粗皂苷。合歡皮粗皂苷進行大孔吸附樹脂柱色譜，以水、3濃度0%乙醇、濃度50%乙醇和濃度75%依次洗脫，收集濃度75%乙醇洗脫液，減壓回收、濃縮，濃縮液上D941弱鹼性陰離子交換樹脂色譜柱純化，以濃度70%乙醇進行洗脫，用薄層色譜檢查洗脫液，具有相同斑點的流份合併，減壓回收、濃縮，冷凍乾燥，得合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B(AJSB)。合歡皮阜苷佐劑活性有效部位B為淺黃白色粉末。Lieberman-Burchard反應和Molish反應均呈陽性，示含三萜皂苷化合物。以齊墩果酸為對照標準品，香草醛濃硫酸顯色，紫外分光光度儀於540 nm比色測得AJS中總皂苷含量為51.99%。
[0041]實施例2含皂苷佐劑的B肝疫苗製劑
稱取合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A或者合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B 500ii g和重組B型肝炎病毒表面抗原(rHBsAg) IOOii g，以生理鹽水10 ml溶解，以
0.22 ii m微孔濾膜濾過,無菌分裝,每支I ml。每ml含阜苷50 y g和rHBsAg 10 u go
[0042]實施例3含鋁膠和皂苷佐劑的B肝疫苗製劑
稱取合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A或者合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B適量，以生理鹽水溶解，製成濃度為100 u g/ml的溶液，以0.22 ii m微孔濾膜濾過。將該皂苷溶液與等體積的含鋁佐劑B型肝炎病毒表面抗原疫苗原液(每ml含HBsAg 20 Ug和氫氧化招500 ii g),混合均勻,無菌分裝,每支lml。每ml含阜苷50 ii g、HBsAg 10 ii g和氫氧化招250 u go
[0043]實施例4 合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B的溶血性
以真空採血管從兔耳靜脈採 集血液，加生理鹽水，混勻，1500 r/m離心10 min，洗滌3次，收集紅細胞以生理鹽水稀釋製成0.5%紅細胞懸液，備用。取Quil A、合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B，分別用生理鹽水溶解，並作倍比稀釋製成濃度為1000、500、250、125、62.5,31.25、15.63,7.81 u g/ml的稀釋液。於96孔微量板中，分別加入0.5%兔紅細胞懸液100 u I及不同濃度的皂苷稀釋液100 u 1，混勻，每個濃度重複3孔。另設生理鹽水及蒸餾水分別作為最小和最大的溶血性對照。37°C培養箱孵育30 min, 1500 r/m離心lOmin。各孔取上清液100 y I,以酶標儀于波長405 nm處測定OD值。重複3次，計算引起50%溶血的濃度(HD5tl)。結果顯示:合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B對0.5%兔紅細胞的HD50值分別為 25.66 ±0.97、195.8 ±6.2 和 7.87 ±0.30 y g/ml，而 Quil A 在相同條件下測得的 HD50值為2.10±0.08 u g/ml。說明合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B的溶血性均顯著低於Quil A 0° < 0.001)。
[0044]實施例5合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B對OVA受免小鼠免疫應答反應的佐劑作用
實驗方法:清潔級ICR小鼠隨機分組，每組5隻。PBS對照組:每隻注射磷酸緩衝液(PBS) 0.2 ml ;卵清白蛋白(OVA)對照組:每隻注射含OVA 100 y g的PBS 0.2 ml ;氫氧化鋁對照組:每隻注射含200 u g氫氧化鋁和100 u g OVA的PBS 0.2 ml ;合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B試驗組:每隻注射含皂苷(50,100,200 u g)和100 u g OVA的PBS 0.2 ml。各組皮下注射免疫2次，第一次免疫和第二次免疫間隔14天。二免後14天，採血，分離血清，檢測特異性抗體效價；將小鼠斷頸處死，無菌條件下取脾，製備脾細胞懸液，進行脾細胞增殖反應和NK細胞活性分析。
[0045]結果表明:合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)能顯著促進Con A、LPS和OVA誘導的OVA受免小鼠脾細胞增殖反應(圖1~3);提高免疫小鼠血清中OVA特異性IgG, IgGU IgG2a和IgG2b抗體效價(圖4~7);增強免疫小鼠NK細胞對K562細胞的殺傷活性(圖8)。說明合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)不僅能促進免疫小鼠對OVA的體液免疫和細胞免疫應答，而且可誘導平衡的Thl/Th2免疫應答，對模式抗原OVA具有顯著的佐劑作用。
[0046]實施例6 合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B對禽流感雞痘病毒載體活疫苗的佐劑作用
實驗方法:將合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)以PBS溶解製成濃度分別為0.5、1.0和2.0 mg/ml的稀釋液，以0.22 微孔濾膜濾過，備用。將商品鋁膠(Alum)以生理鹽水稀釋製成2 mg/ml的混懸液。將商品禽流感雞痘病毒載體活疫苗(rFPV)加入PBS 50 ml，混勻，製成疫苗稀釋液。取疫苗稀釋液與等量的PBS、鋁膠稀釋液、合歡皮總皂苷(AJS)稀釋液、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)稀釋液或合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)稀釋液混勻，分別於第I和15天皮下注射免疫小鼠。二免後14天，採血，分離血清，進行H5抗原特異性抗體效價檢測。
[0047]結果表明:合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)能顯著提高禽流感雞痘病毒載體活疫苗(rFPV)免疫小鼠血清中H5抗原特異性IgG、IgGU IgG2a和IgG2b抗體滴度，且免疫小鼠血清中H5抗原特異性IgG、IgGU IgG2a和IgG2b抗體滴度顯著高於Alum免疫組(圖9~12)。說明合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)三者都能同時誘導免疫小鼠對禽流感雞痘病毒載體活疫苗的Thl型和Th2型免疫應答反應，對禽流感雞痘病毒載體活疫苗具有顯著的佐劑作用，且佐劑活性顯著優於鋁膠佐劑。
[0048]實施例7合歡皮總`皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B對OVA受免小鼠遲發性超敏反應的影響
實驗方法:清潔級ICR小鼠隨機分組，每組5隻。PBS對照組:每隻注射磷酸緩衝液(PBS) 0.2 ml ;卵清白蛋白(OVA)對照組:每隻注射含OVA 100 y g的PBS 0.2 ml ;氫氧化鋁對照組:每隻注射含200 u g氫氧化鋁和100 u g OVA的PBS 0.2 ml ;合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B試驗組:每隻注射含皂苷(50,100,200 u g)和100 iigOVA的PBS 0.2 ml。皮下注射致敏5天後小鼠左後足墊皮下注射含OVA 100 iig的PBS 0.05 ml進行激發，右後足墊皮下注射PBS 0.05 ml作為對照。24小時後，用遊標卡尺測量後足墊厚度(精確到0.01 mm)，以左右後足墊厚度差作為腫脹度，評定遲發性超敏反應強弱。
[0049]結果表明:合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)能顯著促進OVA受免小鼠對OVA誘導的遲發性超敏反應，而鋁膠佐劑對OVA受免小鼠遲發性超敏反應無顯著影響(圖13)。說明合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)三者均能顯著誘導OVA首免小鼠細胞介導的免疫反應，進一步證實三者對OVA受免小鼠細胞免疫應答具有顯著的佐劑作用，而鋁膠佐劑對細胞介導的免疫應答反應沒有佐劑作用。
[0050]實施例8合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B肌內注射對小鼠局部組織細胞因子和趨化因子蛋白表達水平的影響
實驗方法:清潔級Balb/C小鼠隨機分組，每組3隻。PBS對照組:每隻小鼠右肢肱四頭肌注射PBS緩衝液0.05 ml ;合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)試驗組:每隻小鼠右肢肱四頭肌注射含合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)IOOiig的PBS緩衝液0.05 ml。注射後4小時，斷頸處死小鼠，75%酒精消毒後，剪開皮膚，收集肱四頭肌，採用小鼠炎症因子抗體晶片檢測其中40種細胞因子和趨化因子蛋白表達水平。
[0051]結果表明:合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)注射後可誘導或上調IFN- y、IL-1 ^、IL-3、IL-6、IL-9、IL-10、IL_12p40/p70、IL_12p70、IL-13、TNF-a、可溶性腫瘤壞死因子I型(sTNFRI)、III型(sTNFR III)等12種細胞因子(圖14)，以及嗜酸性粒細胞趨化蛋白(Eotaxin)、巨噬細胞炎症因子la (MIP-1a ), 0 -趨化性細胞因子(RANTES)、人胸腺表達趨化因子(TECK)、CX3C類趨化因子(Fractalkine)、幹擾素誘導的T細胞a型趨化因子(1-TAC)、血漿炎性趨化因子(MIG)、FasL、M-CSF和GM-CSF等10個趨化因子(圖15)蛋白表達。
[0052]實施例9合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B肌內注射對小鼠局部組織免疫細胞募集的影響
實驗方法:清潔級Balb/C小鼠隨機分組，每組4隻。PBS水對照組:每隻小鼠肱四頭肌各注射PBS緩衝液0.05 ml ;卵清白蛋白(OVA)對照組:每隻小鼠肱四頭肌各注射含OVA25 Ug的PBS 0.05 ml ;合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)試驗組:每隻小鼠肱四頭肌各注射含合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB) 50 ii g的PBS緩衝液0.05 ml ;卵清白蛋白與合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)聯合組:每隻小鼠肱四頭肌各注射含OVA 25 U g和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB) 50 iig的PBS緩衝液0.05 ml。注射後24小時，斷頸處死 小鼠，75%酒精消毒後，剪開皮膚，收集肱四頭肌，以0.05% II型膠原酶溶液消化製備單細胞懸液，經抗小鼠⑶16/⑶32抗體封閉，以抗小鼠⑶lie -PE、CDllb - FITC、Ly-6G - PE_Cy5、Ly-6C - APC, F4/80 antigen - PE_Cy5、FcERl - APC 和、Siglec-F - PE等抗體組合染色，流式細胞儀分析樹突狀細胞(⑶IIb+⑶Ilc+)、中性粒細胞(CDllc Ly-6C+Ly6Ghigh)、炎性單核細胞(CDllb+Ly6G_Ly6C+)、巨噬細胞(CDllb+F4/80high)、嗜酸性粒細胞(CDllb+Sigilec F+)和肥大細胞(FcERl+)等6類細胞的數量。
[0053]結果表明:合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)注射後可顯著募集樹突狀細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和肥大細胞進入注射部位(圖16)。
[0054]綜上所述，本發明的合歡皮皂苷具有顯著的免疫佐劑作用，可誘導局部組織產生細胞因子和趨化因子，募集免疫細胞到注射部位，誘生機體同時產生Thl型和Th2型免疫應答，且顯示出比現有技術中已知的鋁膠佐劑能誘導機體對疫苗產生更強的細胞免疫和體液免疫反應。同時，以該類皂苷為佐劑的疫苗製備工藝簡單、方法簡便、質量容易控制、使用方便、可冰凍保存。該類皂苷成分的溶血性小和安全性好。所以，本發明的合歡皮皂苷有望開發成疫苗佐劑。
【權利要求】
1.合歡皮皂苷佐劑，其特徵是從中藥合歡皮中提取分離的合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B。
2.製備權利要求1中所述的合歡皮皂苷佐劑的方法，該方法包括以下步驟， 以下所說濃度均為質量濃度: a.將合歡皮藥材粉碎後，以乙醇提取； b.濃縮乙醇提取液，以水混懸，用乙醚或醋酸乙酯萃取至有機溶劑層近無色，得到水層溶液； c.取水層以水飽和的正丁醇或戊醇萃取，合併萃取液，減壓回收、濃縮，得到醇萃取物； d.取步驟b中的水層溶液或步驟C中的醇萃取物在大孔吸附樹脂柱中進行色譜純化，以水和濃度75%乙醇依次洗脫，收集濃度75%乙醇洗脫液，濃縮，冷凍乾燥，得合歡皮粗皂苷; e.合歡皮粗皂苷經大孔吸附樹脂柱分離，以濃度30%、50%、75%乙醇依次洗脫，分別收集濃度50%乙醇和濃度75%乙醇的洗脫液，濃縮，冷凍乾燥，得到2個流份； f.取步驟d中合歡皮粗皂苷和步驟e中2個流份再分別經離子交換樹脂色譜柱精製，以濃度70%乙醇進行洗脫，收集濃度70%乙醇吸收液，濃縮，冷凍乾燥，得到合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有 效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B。
3.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵是步驟d和步驟e的中所說的大孔吸附樹脂為DlOl大孔吸附樹脂；步驟f中所說的離子交換樹脂為D941弱鹼性陰離子交換樹脂。
4.含合歡皮皂苷佐劑的疫苗製劑，其特徵在於包含有免疫有效量的權利要求1所述的合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A或者合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B和藥物學上可接受的載體。
5.根據權利要求4所述的疫苗製劑，其特徵在於合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A或者合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B的量為0.01 μ g~Ig /單劑量。
6.根據權利要求1所述的合歡皮皂苷佐劑在製備疫苗製劑中的應用。
【文檔編號】A61K36/48GK103768593SQ201410005853
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月3日 優先權日:2014年1月3日
【發明者】孫紅祥 申請人:浙江大學