誘導細胞死亡和/或凋亡的選定的rna基序的製作方法

2023-09-19 09:48:50 1

專利名稱：誘導細胞死亡和/或凋亡的選定的rna基序的製作方法
發明的技術領域本申請廣義上來說涉及低分子量和高分子量的雙鏈RNA(「dsRNA」)和單鏈RNA(「ssRNA」)在誘導細胞死亡和細胞凋亡尤其是轉化細胞的死亡和凋亡中的應用。
發明的技術背景在二十世紀七十年代和八十年代，有幾項研究表明高分子量DNA能夠與細胞膜結合。已經詳細評價了多種多核苷酸鏈作為生物反應調節劑的應用。其中一個實例是polyI:polyC，其是IFN產生的強誘導劑，還是巨噬細胞激活劑並且是NK活性誘導劑(Talmadge等，「Immunomodulatory effects in mice of polyinosinic-polycytidylic acid complexed with poly-Llysine andcarboxymethylcellulose」，Cancer Res.451058，1985)。然而由細胞因子TNF-α引起的毒副作用防礙了polyI:polyC成為一種有用的治療試劑。
已經表明短的幹擾RNA(siRNA)，如使用具有21和22個核苷酸的RNA，能夠誘導同源RNA的序列-特異性轉錄後基因沉默(Elbashir等，「RNA interference is mediated by 21-22 nucleotide RNAs」。Genes Dev.2001年1月15；15(2)188-200)，這與上述文獻中提到的dsRNA所具有的非-序列特異性活性是完全不同的。
已經報導某些DNA結構還具有激活淋巴細胞的能力。例如，據報導，脾細胞上清液中的核小體蛋白-DNA複合體能夠使B細胞增殖和分泌免疫球蛋白(Bell等，「Immunogenic DNA-related factors」。J.Clin.Invest.851487，1990)。還報導裸DNA具有免疫作用。例如，據報導260到800bp的poly(dG):(dC)片段能夠促進B細胞的有絲分裂(Messina等，「The influence of DNA structure on thein vitro stimulation of murine lymphocytes by natural andsynthetic polynucleotide antigens」.Cell.Immunol.147148，1993)。Pisetsky等報導純的哺乳動物DNA檢測不到免疫作用，但是某些細菌的DNA能夠誘導B細胞激活和分泌免疫球蛋白(Pisetsky等，「Stimulation of in vitro murine lymphocyte proliferationby bacterial DNA」.J.Immunol.1471759；1991)。另外還有某些含有未甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤(CpG)二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸能夠激活淋巴細胞，這已經被體外和體內的試驗數據加以了證實。
用負鏈RNA或某些DNA病毒感染的細胞會產生出非編碼RNA基序。特定的dsRNAs能夠被先天的免疫細胞識別，並且已知其結合到Toll-like受體3上(Alexopoulou等，「Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor3」，Nature 413732-738；2001)。另外，已經發現這些dsRNAs能夠同時影響先天的免疫反應和適應性免疫反應(Wang等，「NoncodingRNA danger motifs bridge innate and adaptive immunity and arepotent adjuvants for vaccination」，J.Clin.Invest，1101175-842002)。
發明概述本申請涉及dsRNA和ssRNA在誘導活細胞凋亡和/或細胞死亡中的應用。具體來說，本申請表明低分子量和高分子量的dsRNA和ssRNA能夠誘導增殖細胞的凋亡和/或細胞死亡，能夠抑制轉化細胞或腫瘤細胞的增殖，能夠快速誘導促炎細胞因子TNF-α，並且還能夠誘導產生IL-12(高分子量的RNA)，其中IL-12是一種謗導IFN-γT細胞和Th1免疫反應的調節劑。
本發明能夠應用於抗-腫瘤治療或抗-白血病治療，能夠分別抑制轉化腫瘤細胞或白血病細胞的增殖，並且能夠快速謗導細胞因子TNF-α和/或IL-12。本發明還能夠應用於抗-微生物治療。這項技術在治療實體瘤和白血病過程中，不需要細胞轉染試劑以使之適用於體內施用，而且不需要表位或基因特異性，然而當使用反義或siRNAs時則需要細胞轉染試劑，另外還需要表位和基因特異性。反義化合物無論是在體外還是在體內應用均需要轉染試劑，而且通常反義化合物僅能夠到達少量的細胞。相比之下，低分子量的RNAs(單鏈和雙鏈)能夠很容易地穿透細胞膜，而且不需要轉染試劑。
某些本發明所公開的dsRNAs誘導天然細胞的促炎(TNF-α)反應或促細胞凋亡反應，或二者兼而有之，這可以增強抗原的交叉呈遞，並且增強特異性免疫效應物特異性指向Th-1反應。凋亡細胞是抗原性物質的良好來源，並且其在癌症和傳染性疾病中對於效應細胞(Th1或Tc1)的誘導也是很重要的。
現在還不是完全清楚低分子量和高分子量的RNA鏈是如何誘導細胞凋亡和/或細胞死亡的。有可能是RNA基序被細胞膜上的Toll樣受體識別，或者被細胞內化，通過介導基因表達的負調節而起作用，導致非-特異性基因沉默。對於低分子量的RNA(ssRNA和dsRNA)，確信它們是可以直接進入細胞的，而不需利用細胞受體。對於高分子量的RNA鏈(ssRNA和dsRNA)，確信它們是通過細胞受體進入細胞的，因此其二級結構對於其功能來說是重要的，或者有可能是決定性的。
本發明教導了小的或低分子量的ssRNA或dsRNA能夠在快速生長的轉化細胞中誘導產生TNF-α，從而快速誘導細胞死亡。另外，本發明教導了在快速生長的轉化細胞中，大的或高分子量的ssRNA或dsRNA通過誘導產生IL-12和TNF-α從而誘導細胞凋亡，但誘導的量小於低分子量的ssRNA或dsRNA，其中上述IL-12是一種已知的誘導IFN-γT細胞和Th1免疫反應的調節劑。此外，正如WO 03/078595和PCT/US2003/030188所教導的，高分子量的ssRNA或dsRNA還可以作為一種佐劑，與抗原一起施用以提高T1免疫性，而且其在對抗傳染性疾病和癌症的應用中是非常重要的，上述兩篇文獻在本申請中全文引作參考。相比之下，低分子量的RNAs(單鏈或雙鏈)僅在一些情況下被用作佐劑。
相信本發明所公開的RNA化合物所具有的促細胞凋亡和/或細胞壞死的作用，與原代細胞相比，在很大程度上對於增殖能力高或快速增殖的細胞(如在具有多種癌症和腫瘤細胞的情況下)更加具有特異性。關於在人體中的治療有效量或劑量，本發明的RNA組合物可以以溶液或乳狀液的形式，局部或系統施用到人患者、或者直接注射到腫瘤，施用量在1ng/kg-999mg/kg的範圍內。在人體中的治療有效劑量為1ng/kg-10ng/kg。至10ng/kg-500ng/kg。至500ng/kg-999ng/kg、1μg/kg-10μg/kg。至10μg/kg-100μg/kg。100μg/kg-200μg/kg、200μg/mg-500μg/mg、500μg/kg-999μg/kg、至1mg/kg-10mg/kg、至10mg/kg-100mg/kg、至100mg/kg-200mg/kg和200mg/kg-500mg/kg。基於本申請，最優選的人施用劑量是1-999μg/kg，更加最優選的劑量是1-500μg/kg或1-100μg/kg。如果直接注射到腫瘤團塊，則預期劑量應當在1mg/kg-500mg/kg和1mg/kg-100mg/kg的範圍內。
本發明的各個具體實施方式
包括1)一種通過給細胞施用RNA鏈，從而誘導患者中轉化或非轉化細胞凋亡或細胞死亡的方法。
2)第1段所述的方法，其中所述RNA鏈的平均大小為1kDa至50kDa。
3)第1段所述的方法，其中所述RNA鏈是dsRNA。
4)第1段所述的方法，其中所述RNA鏈是ssRNA。
5)第3段所述的方法，其中所述dsRNA是pA:pU。
6)第5段所述的方法，其中所述dsRNA的施用劑量選自1-999μg/kg、1-500μg/kg、1-100μg/kg、1-50μg/kg、1-25μg/kg、1-10μg/kg和1-5μg/kg。
7)第6段所述的方法，其中所述dsRNA是靜脈內施用，施用劑量選自1-999μg/kg、1-500μg/kg、1-100μg/kg、1-50μg/kg、1-25μg/kg、1-10μg/kg和1-5μg/kg。
8)第1段所述的方法，其中患者是人，細胞是轉化細胞，dsRNA是pA:pU，並且dsRNA是直接注射到癌細胞。
9)第4段所述的方法，其中ssRNA是pA。
10)第1段所述的方法，其中患者是人，轉化細胞選自T細胞白血病細胞、人單核細胞白血病細胞、人腺癌細胞和人肺成纖維細胞。
11)一種通過給細胞體內施用ssRNA或dsRNA，從而誘導細胞死亡或細胞凋亡的方法，其中所述ssRNA或dsRNA的平均大小小於20kDa。
12)第11段所述的方法，其中ssRNA或dsRNA的平均大小小於10kDa。
13)第12段所述的方法，其中所述細胞是轉化細胞。
14)第12段所述的方法，其中所述ssRNA是pA。
15)第11段所述的方法，其中所述dsRNA是pA:pU。
16)第12段所述的方法，其中所述細胞是癌細胞。
17)第1段所述的方法，其中所述RNA鏈誘導增強的細胞因子TNF-α的產生。
18)第12段所述的方法，其中所述RNA鏈誘導增強的細胞因子TNF-α的產生。
19)第1段所述的方法，其中使用RNA誘導細胞死亡，誘導增強的對所述細胞的免疫反應。
20)第1段所述的方法，其中所述RNA是體內施用給細胞，施用方式選自局部施用、系統施用或直接注射。
21)一種通過給細胞施用ssRNA或dsRNA，從而謗導細胞凋亡的方法，其中所述ssRNA或dsRNA的大小小於10kDa。
22)第21段所述的方法，其中所述RNA是ssRNA，並且是pA。
23)第21段所述的方法，其中所述RNA是dsRNA，並且是pA:pU。
24)第21段所述的方法，其中所述細胞是轉化細胞。
25)第21段所述的方法，其中所述誘導的凋亡細胞與相似的活細胞相比，誘導增強的IL-12細胞因子產生。
26)第21段所述的方法，其中介導了Th-1反應。
27)第1段所述的方法，其中所述RNA是dsRNA，其分子量大於50kDa，並且誘導增強的IL-12反應。
28)一種用於誘導轉化細胞中的細胞死亡或凋亡的組合物，其中所述組合物由平均分子量為1-50kDa的RNA組成。
29)第28段所述的組合物，其中所述dsRNA或ssRNA的平均分子量小於20kDa。
30)第28段所述的組合物，其中所述dsRNA或ssRNA的平均分子量小於10kDa。
31)第28段所述的組合物，其中所述dsRNA是pA:pU。
32)第28段所述的組合物，其中所述dsRNA誘導增強的細胞因子TNF-α的產生，並由此誘導了對轉化細胞的T1免疫反應。
33)一種用於誘導患者中轉化細胞中的細胞死亡或凋亡的組合物，其中所述組合物由寡核苷酸組成，所述寡核苷酸由至少兩個選自腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤和肌苷的鹼基對組成，並且所述寡核苷酸的分子量為1kDa-50kDa。
34)第33段所述的組合物，其中所述寡核苷酸是ssRNA。
35)第33段所述的組合物，其中所述寡核苷酸是dsRNA。
36)第33段所述的組合物，其中所述ssRNA是pA。
37)第35段所述的組合物，其中所述寡核苷酸是pA:pU。
38)第33段所述的組合物，其中所述寡核苷酸的分子量為1kDa-10kDa。
39)第33段所述的組合物，其中所述寡核苷酸的分子量為1kDa-5kDa。
40)組合物在製造用於誘導轉化細胞中的細胞死亡或凋亡的藥物中的用途，其中所述組合物由寡核苷酸組成，所述寡核苷酸由至少兩個選自腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤和肌苷的鹼基對組成，並且所述寡核苷酸的分子量為1kDa-50kDa。
41)第40段所述的用途，其中所述寡核苷酸是ssRNA。
42)第40段所述的用途，其中所述寡核苷酸是dsRNA。
43)第40段所述的用途，其中所述ssRNA是pA。
44)第40段所述的用途，其中所述寡核苷酸是pA:pU。
45)第40段所述的用途，其中所述寡核苷酸的分子量為1kDa-10kDa。
46)第40段所述的用途，其中所述寡核苷酸的分子量為1kDa-5kDa。
47)組合物在製造用於誘導轉化細胞中的細胞死亡或凋亡的藥物中的用途，其中所述組合物由平均分子量為1-50kDa的RNA組成。
48)第47段所述的用途，其中所述dsRNA或ssRNA的平均分子量小於20kDa。
49)第47段所述的用途，其中所述dsRNA或ssRNA的平均分子量小於10kDa。
50)第47段所述的用途，其中所述dsRNA是pA:pU。
51)第47段所述的用途，其中所述dsRNA誘導增強的細胞因子TNF-α的產生。
52)第51段所述的用途，其中所述增強的TNF-α產生誘導了對轉化細胞的T1免疫性。


附圖1顯示高分子量合成RNAs在誘導抗原呈遞細胞(APCs)凋亡過程中的作用；附圖2顯示低分子量和高分子量RNAs在誘導轉化的人單核細胞細胞死亡過程中的作用；
附圖3顯示基於人抗原呈遞細胞的TNF-α和IL-12表達的細胞因子譜；附圖4圖表顯示分級分離的低分子量和高分子量RNA的效果差異；附圖5顯示多種濃度的低分子量pA:pU在誘導人T細胞白血病細胞系的大量凋亡和細胞死亡方面，顯著優於高分子量的pA:pU、完全pA:pU或對照；附圖6表明低分子量pA:pU在誘導人T淋巴細胞系中的凋亡和細胞死亡方面效果顯著，顯著優於高分子量pA:pU和完全pA:pU以及對照；附圖7表明低分子量pA:pU，尤其是在100μg/ml的較高濃度下，能夠在人T細胞淋巴母細胞白血病細胞中，誘導顯著水平的細胞死亡和凋亡；附圖8表明低分子量pA:pU，尤其是在100μg/ml的較高濃度下，在誘導人單核細胞白血病細胞系中的大量細胞凋亡和細胞死亡方面，顯著優於對照或高分子量pA:pU；附圖9表明低分子量pA:pU成功誘導了人宮頸腺癌細胞的凋亡和細胞死亡；附圖10表明低分子量pA:pU在誘導人肺成纖維細胞中的大量細胞凋亡和細胞死亡方面，顯著優於高分子量pA:pU、完全pA:pU或對照；附圖11顯示低分子量或高分子量pA:pU均不能謗導乳腺癌細胞的細胞死亡；附圖12A-12B顯示低分子量或高分子量pA:pU均不能誘導人PBMCs的細胞死亡或細胞凋亡；和附圖13顯示低分子量dsRNA級分和已知寡聚體長度的pA:pU對單核細胞白血病細胞所表現出的細胞死亡誘導效果。
發明詳述定義在本申請中所使用的如下術語或短語具有下述含義「dsRNA」是指雙鏈RNA片段，其可以由鹼基腺嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、鳥嘌呤和肌苷組成，其可以是完全互補的、部分互補的或是混合的核苷酸鏈。
「ssRNA」是指單鏈RNA片段，其可以由鹼基腺嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和鳥嘌呤組成，可以只由一種核苷酸組成，也可以由混合核苷酸組成。
「低分子量dsRNA或ssRNA」是指分子量大約為10kDa或小於10kDa(＜10k MW)的RNA鏈。優選的，本發明的低分子量ssRNA和dsRNA具有2-40個鹼基對；「高分子量dsRNA或ssRNA」是指分子量大約為10kDa或大於10kDa並且在10kDa到50kDa之間，但是也可以是大於50kDa(＞50k MW)的RNA鏈；「完全dsRNA」是指具有任意或所有分子量或寡聚體長度的dsRNA；「APC」是指抗原呈遞細胞；「細胞死亡」是指不同於凋亡的細胞的死亡；「凋亡」是指編程性細胞死亡；「Th-1反應」是指T-輔助細胞1反應；「pA:pU」是指這樣一種dsRNA，其RNA鏈或片段是由腺嘌呤和尿嘧啶組成的，其RNA鏈或片段是互補的，並且包含不均一互補的RNA鏈或片段；「聚體」是寡聚體的簡稱；「HL-1培養基」是指HL-1培養基(BioWhittaker，WalkersvilleMD，cat#344017)，其含有2mM的L-穀氨醯胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11875-085)、50單位/ml的青黴素-鏈黴素(Invitrogen，cat#15070-063)、1.0mM的丙酮酸鈉(Invitrogen，cat#11360-070)，並補加了0.05mM的2-巰基乙醇(Invitrogen，cat#21985-023)；「＜」是指小於；和「＞」是指大於。
實施例1高分子量人工合成RNA能夠誘導人抗原呈遞細胞(APC)的大量凋亡。
在ATCC建議的下述條件下維持人APCs(THP-1細胞，美國典型培養物保藏中心([ATCC]，Manassas，yA)(a)培養基RPMI 1640培養基，含有2mM的L-穀氨醯胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11875-085)，調節為含有10mM的HEPES(Invitrogen，cat#15630-080)、50單位/ml的青黴素-鏈黴素(Invitrogen，cat#15070-063)和1.0mM的丙酮酸鈉(Invitrogen，cat#11360-070)，並補加了0.05mM的2-巰基乙醇(Invitrogen，cat#21985-023)、10％的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，cat#26170-019)；(b)連續培養在細胞培養瓶(Corning，Corning NY，cat#430641)中培養，每3天更換一次新鮮的培養基直到培養4個月，然後開始新一輪的培養；和(c)溫度37℃，5％CO2。
將THP-1細胞懸浮到上述培養基中，加入0.05μM維生素D3(CalBiochem，San Diego，CA)後開始分化。然後將細胞立即加到滅菌的48孔組織培養板上(BD Falcon，cat#353078)，濃度為每孔0.4×106個細胞(每ml是0.8×106個細胞，因此加入0.5ml即可)，使之成熟3天。這時，取0.2ml新鮮的不含FBS的HL-1培養基替換原有的0.5ml培養基，覆蓋微量培養板孔中的貼壁細胞。將已經經過內毒素測試和分級分離的(將單獨描述)高分子量(＞50kDa)聚腺苷酸-聚尿苷酸(pA:pU，Sigma，cat#P1537，lot#022K4068)或聚腺苷酸(pA，Sigma，cat#P9403，lot#022K4022)加入到培養基的細胞中，加入量為50μg/ml。在37℃/5％CO2的無菌條件下，將細胞分別孵育2小時、6小時或24小時。在上述相同時間點，收集上清液，冷凍(-70℃)，用於後面進一步的分析。緩慢加入滅菌的、冷磷酸鹽緩衝液(PBS，Sigma，cat#D8537)，將細胞覆蓋，然後用Yo-Pro(MolecularProbes，Eugene，OR，cat#Y-3603，終濃度為0.15μM))染色，Yo-Pro是一種細胞凋亡指示劑。溫育10分鐘之後將細胞衝洗一次，懸浮在含有2％FBS的緩衝液中，冰浴保存。然後與合適的對照細胞相比較，使用合適的過濾器用FACS Calibur流式細胞計數器(BDBioscience，San Jose，CA)分析細胞對Yo-Pro的攝入情況，分析細胞的凋亡情況。
結果表明較高分子量的dsRNA級分pA:pU(＞50kDa)，能夠誘導人抗原呈遞細胞的大量凋亡。相比之下，對照組在2小時、6小時和24小時時僅觀察到極微量的細胞凋亡。而pA(＞50kDa)在2小時、6小時和24小時時所觀察到的細胞凋亡水平顯著高於對照，同時與pA:pU(＞50kDa)一起孵育的細胞也觀察到顯著更高的細胞凋亡誘導。
實施例2低分子量dsRNA對轉化人單核細胞表現出誘導細胞凋亡和細胞死亡的作用。
在ATCC建議的下述條件下維持人APCs(THP-1細胞，美國典型培養物保藏中心([ATCC]，Manassas，VA)培養基RPMI 1640培養基，含有2mM的L-穀氨醯胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11875-085)，調節為含有10mM的HEPES(Invitrogen，cat#15630-080)、50單位/ml的青黴素-鏈黴素(Invitrogen，cat#15070-063)和1.0mM的丙酮酸鈉(Invitrogen，cat#11360-070)，並補加了0.05mM的2-巰基乙醇(Invitrogen，cat#21985-023)、10％的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，cat#26170-019)；溫度37℃，5％CO2。連續培養在細胞培養瓶(Corning，Corning NY，cat#430641)中培養，每3天更換一次新鮮的培養基直到培養4個月，然後開始新一輪的培養。
將THP-1細胞懸浮到上述培養基中，加入0.05μM維生素D3(CalBiochem，San Diego，CA)後開始分化。然後將細胞立即加到滅菌的48孔組織培養板上(BD Falcon，cat#353078)，濃度為每孔0.4×106個細胞，使之成熟3天。這時，取0.2ml新鮮的不含FBS的HL-1培養基替換原有的0.5ml培養基，覆蓋微量培養板孔中的貼壁細胞。將已經經過內毒素測試和分級分離的(將單獨描述)高分子量(＞50kDa)聚腺苷酸-聚尿苷酸(pA:pU，Sigma，cat#P1537，lot#022K4068)或聚腺苷酸(pA，Sigma，cat#P9403，lot#022K4022)加入到培養基的細胞中，加入量為50mg/ml。在37℃/5％CO2的無菌條件下，將細胞分別孵育2小時、6小時或24小時。在上述相同時間點，收集上清液，冷凍(-70℃)，用於後面進一步的分析。緩慢加入滅菌的、冷磷酸鹽緩衝液(PBS，Sigma，cat#D8537)，將細胞覆蓋，然後用溴化乙錠(Sigma，cat#46067，終濃度為1.5μg/ml))染色，溴化乙錠是細胞死亡指示劑，和/或用Yo-Pro染色(MolecularProbes，Eugene，OR，cat#y-3603，終濃度為0.15μm)，Yo-Pro是一種細胞凋亡指示劑。溫育10分鐘之後使用合適過濾器通過螢光顯微鏡將凋亡細胞和死亡細胞與活細胞區分開來，並用帶有合適過濾器和使用Image Pro軟體(Media Cybernetics，Carlsbad，CA)的圖像分析系統的螢光顯微鏡照像(附圖2所示)分析細胞。
結果表明低分子量RNA鏈(pA和pA:pU＜10kDa)能夠顯著誘導細胞死亡，比較高分子量RNA鏈(pA和pA:pU＞50kDa)更加有效，同時上述兩種RNA比對照(nil)誘導了更多的細胞死亡。結果還顯示出低分子量的ssRNA和dsRNA(＜10kDa)比高分子量的ssRNA和dsRNA(＞50kDa)在誘導細胞凋亡方面更有效，另外與對照相比在誘導細胞凋亡方面更有效。
據推論，低分子量RNAs(＜10kDa)可以在不需要受體的情況下進入細胞，而高分子量RNAs(＞50kDa)是通過佔據細胞受體而進入細胞。還推論，細胞受體對高分子量RNAs的攝入依賴於RNA鏈的二級結構。
實施例3人APC在暴露於RNA基序之後的細胞因子譜。
在ATCC建議的下述條件下維持人APCs(THP-1細胞，美國典型培養物保藏中心([ATCC]，Manassas，VA)培養基RPMI 1640培養基，含有2mM的L-穀氨醯胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11875-085)，調節為含有10mM的HEPES(Invitrogen，cat#15630-080)、50單位/ml的青黴素-鏈黴素(Invitrogen，cat#15070-063)和1.0mM的丙酮酸鈉(Invitrogen，cat#11360-070)，並補加了0.05mM的2-巰基乙醇(Invitrogen，cat#21985-023)、10％的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，cat#26170-019)。溫度37℃，5％CO2。連續培養在細胞培養瓶(Corning，Corning NY，cat#430641)中培養，每3天更換一次新鮮的培養基直到培養4個月，然後開始新一輪的培養。
將THP-1細胞懸浮到上述培養基中，加入0.05μM維生素D3(CalBiochem，San Diego，CA)後開始分化。然後將細胞立即加到滅菌的48孔組織培養板上(BD Falcon，cat#353078)，濃度為每孔0.4×106個細胞，使之成熟3天。這時，取0.2ml新鮮的不含FBS的HL-1培養基替換原有的0.5ml培養基，覆蓋微量培養板孔中的貼壁細胞。將已經經過內毒素測試的完全和分級分離的(將單獨描述)高分子量(＞50kDa)聚腺苷酸-聚尿苷酸(pA:pU，Sigma，cat#P1537，lot#022K4068)或聚腺苷酸(pA，Sigma，cat#P9403，lot#022K4022)加入到培養基的細胞中，加入量為50mg/ml。在37℃/5％CO2的無菌條件下，將細胞分別孵育2小時、6小時或24小時。在上述相同時間點，收集上清液，並在分析細胞因子之前冷凍(-70℃)上清液。使用人IL-12(Biosourse International，Camarillo，CA，cat#KHC0121)或人TNF-α(Biosourse International，cat#KHC3011)的ELISA分析法，檢測細胞上清液中細胞因子的濃度(附圖3)。ELISA分析步驟按照生產商所提供的說明進行。
結果表明(參見附圖3)，低分子量ssRNA和dsRNA(＜10kDa的pA和pA:pU)基序能夠誘導促炎細胞因子TNF-α。在低分子量RNA基序中，dsRNA(＜10kDa的pA:pU)在誘導TNF-α方面比ssRNAs(＜10kDa，pA)稍微有效一些。較高分子量RNA基序(＞50kDa的pA:pU和＞50kDa的pA)在誘導TNF-α方面也顯著優於對照。因此低分子量和高分子量RNAs不僅能夠誘導細胞死亡和細胞凋亡，還能夠誘導促炎細胞因子TNF-α，並由此促進對細胞的免疫反應，同時也由此導致對細胞產生細胞毒性，之後引發對細胞的後續免疫反應或增強對細胞的免疫反應。用低分子量單鏈或雙鏈RNA進行處理後產生了促炎細胞因子TNF-α，相比之下，結果表明較高分子量(＞50kDa的pA:pU)能夠誘導產生顯著水平的IL-12，這是與所有其它處理或對照(nil)相比較後得出的，其中IL-12是Th1反應調節的指示性特徵。
實施例4闡述合成RNA是如何進行分級、純化的，以及在使用前如何確定濃度。
大量的合成RNA材料可以通過標準的有機合成來獲得，也可以通過購買獲得。例如，RNA基序聚腺苷酸-聚尿苷酸(pA:pU，Sigma，cat#P1537，lot#22K4068)或聚腺苷酸(pA，Sigma，cat#P9403，lot#22K4022)可以從Sigma公司購買。本發明大部分實施例所使用的合成RNA的長度小於20bp到大約100bp。但是，本發明還可以使用所有大小的RNA，這也包括在本發明範圍內。
可以通過一系列的離心步驟將合成的RNA進行分級分離，離心時使用具有確定孔徑的過濾器。按照生產商的說明，將大約20mgs的pA:pU置於Centriprep YM-50，50K MWCO(Amicon，cat#4323)中進行離心過濾，在1500Xg離心15分鐘。收集小於50K MW的濾進物，再將YM-50旋轉兩次，如上所述，收集兩次的濾過物(＜50K MW)，並保留滯留物(＞50K MW)。然後將濾過物(＜50K MW)置於CentriprepYM-10，10K MWCO(Amicon，cat#4304)中，在3000Xg離心兩次，每次20分鐘，收集兩次的濾過物(＜10K MW)，並保留滯留物(＞10K MW)。
在將大量的合成RNA材料進行分級後，將RNA材料溶解在滅菌的無內毒素的鹽溶液中(如Dulbecco′s磷酸鹽緩衝液[PBS]，滅菌，進行了內毒素測試，[Sigma，cat#D8537])，分別通過用於去除內毒素的柱子，如AffinitiPak Detoxi-Gel內毒素去除凝膠柱(PierceChemical，cat#20344)，收集洗脫液。然後將洗脫液通過用於去除內毒素的柱子，直到用脂多糖(LPS)濃度測量時內毒素水平低於10EU/mg。使用鱟分析方法來測量LPS(如鱟阿米巴細胞裂解物[″LAL″]顯色試驗[BioWhitakker，Kinetic-QCL，cat#50-650U])。
在去除內毒素之後，將基序以1∶100的比例稀釋到PBS溶液中，並用Beckman DU-640分光光度計在260nm下測定已知基序濃度的PBS(Dulbecco′s磷酸鹽緩衝液，Sigma，cat#D8537)溶液的吸光度。消光係數(「ec」)如下a)pA:pU，(Sigma，Lot#22K4086)ec＝0.0601；b)pA，(Sigma，Lot#22K4022)ec＝0.0575＞然後按照實施例測定上述基序的生物活性。
A.白血病細胞系實施例5低分子量dsRNA級分對T細胞白血病細胞系顯示出細胞凋亡和細胞死亡誘導作用。
人急性T細胞白血病細胞系(Jurkat)來自美國典型培養物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，並在ATCC建議的下述條件下維持上述細胞系(a)培養基RPMI 1640培養基，含有2mM的L-穀氨醯胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11875-085)，調節為含有10mM的HEPES(Invitrogen，cat#15630-080)、50單位/ml的青黴素-鏈黴素(Invitrogen，cat#15070-063)、1.0mM的丙酮酸鈉(Invitrogen，cat#11360-070)，並補加了0.05mM的2-巰基乙醇(Invitrogen，cat#21985-023)、10％的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，cat#26170-019)；(b)連續培養在細胞培養瓶(Corning，Corning NY，cat#430641)中培養，每3天更換一次新鮮的培養基直到培養4個月，然後開始新一輪的培養；和(c)溫度37℃，5％CO2。Jurkat細胞是一種未轉化的人急性T細胞白血病細胞系，能夠在體內模擬人T細胞白血病。選擇性殺死上述細胞和其它白血病細胞在臨床上將是非常具有價值的。
將上述T細胞白血病細胞系置於48孔板上，濃度為每孔0.4×106個細胞，大約為80％鋪滿，在含有FBS的培養基中使之成熟3-4天。第二天，將培養基更換為0.2mls新鮮的不含FBS的HL-1培養基。然後將已經經過內毒素測試和分級分離的dsRNA(pA:pU)(如實施例4所述)對細胞進行脈衝試驗，濃度分別為10、30到100μg/ml，6小時後將培養基更換為新鮮的HL-1培養基，在37℃/5％CO2無菌條件溫育過夜。然後將細胞重懸浮在冷的磷酸鹽緩衝液中(PBS，Sigma，cat#D8537)，其中磷酸鹽緩衝液要緩慢加入到細胞中，然後用Yo-Pro(Molecular Probes，Eugene，OR，cat#Y-3603，終濃度為0.15μM))和溴化乙錠(Sigma，cat#46067，終濃度為1.5μg/ml)染色，其中Yo-Pro是一種細胞凋亡指示劑，溴化乙錠是一種細胞死亡指示劑。溫育10分鐘之後將細胞衝洗一次，懸浮在含有2％FBS的緩衝液中，冰浴保存。然後與合適的對照細胞相比較，使用合適的過濾器用FACSCalibur流式細胞計數器(BD Bioscience，San Jose，CA)分析細胞對Yo-Pro和溴化乙錠的攝入情況，分析得出細胞凋亡和細胞死亡的情況。
結果顯示在附圖5中，該結果表明低分子量pA:pU，也就是分子量小於10kDa或大約為40個bp或小於40bp的pA:pU的混合物，在誘導人T細胞白血病細胞系中的大量細胞凋亡和細胞死亡方面顯著優於高分子量的pA:pU、包含大範圍鹼基長度的寡核苷酸的完全pA:pU(其鹼基長度從幾個到幾千個)和對照。尤其是較高濃度的低分子量pA:pU，如30μg/ml和100μg/ml，在誘導細胞死亡和細胞凋亡方面比較低濃度的低分子量pA:pU(10μg/ml)更加有效。
實施例6低分子量dsRNA級分對人T淋巴細胞顯示出誘導細胞凋亡和細胞死亡的作用。
人T淋巴細胞系(ATL-2)來自美國典型培養物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，並在ATCC建議的下述條件下維持上述細胞系(a)培養基RPMI 1640培養基，含有2mM的L-穀氨醯胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11875-085)，調節為含有10mM的HEPES(Invitrogen，cat#15630-080)、50單位/ml的青黴素-鏈黴素(Invitrogen，cat#15070-063)、1.0mM的丙酮酸鈉(Invitrogen，cat#11360-070)，並補加了0.05mM的2-巰基乙醇(Invitrogen，cat#21985-023)、10％的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，cat#26170-019)；(b)連續培養在細胞培養瓶(Corning，CorningNY，cat#430641)中培養，每3天更換一次新鮮的培養基直到培養4個月，然後開始新一輪的培養；和(c)溫度37℃，5％CO2。ATL-2細胞是一種未轉化的人T細胞白血病細胞系，能夠在體內模擬人T細胞白血病。選擇性殺死上述細胞和其它白血病細胞在臨床上將是非常具有價值的。將上述T淋巴細胞系置於48孔板上，濃度為約每孔0.4×106個細胞，大約為80％鋪滿，在含有FBS的培養基中使之成熟3-4天。之後，將培養基更換為不含FCS的HL-1培養基，每孔大約0.2ml，其過程如上所述，不同之處在於不含FBS。
然後用純化和分級分離的dsRNA(pA:pU)(參見實施例4)對細胞進行脈衝試驗，濃度分別為10、30到100μg/ml，6小時後將培養基更換為新鮮的HL-1培養基，在37℃/5％CO2無菌條件溫育過夜。然後將細胞重懸浮在冷的磷酸鹽緩衝液中(PBS，Sigma，cat#D8537)，其中磷酸鹽緩衝液要緩慢加入到細胞中，然後用Yo-Pro(MolecularProbes，Eugene，OR，cat#Y-3603，終濃度為0.15μM))和溴化乙錠(Sigma，cat#46067，終濃度為1.5μg/ml)染色，其中Yo-Pro是一種細胞凋亡指示劑，溴化乙錠是一種細胞死亡指示劑。溫育10分鐘之後將細胞衝洗一次，懸浮在含有2％FBS的緩衝液中，冰浴保存。然後與合適的對照細胞相比較，使用合適的過濾器用FACS Calibur流式細胞計數器(BD Bioscience，San Jose，CA)分析細胞對Yo-Pro和溴化乙錠的攝入情況，分析得出細胞凋亡的情況。
結果顯示在附圖6中，該結果表明低分子量pA:pU，也就是分子量為10kDa或小於10kDa的pA:pU的混合物，在誘導人T淋巴細胞系的細胞凋亡和細胞死亡方面顯著優於高分子量的pA:pU、完全pA:pU和對照。較高濃度的低分子量pA:pU，如100μg/ml，在誘導T淋巴細胞系細胞死亡和細胞凋亡方面顯著優於較低濃度的低分子量pA:pU。
實施例7低分子量dsRNA級分對人T淋巴母細胞顯示出誘導細胞凋亡和細胞死亡的作用。
人T淋巴母細胞白血病細胞系(CEM)來自美國典型培養物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，並在ATCC建議的下述條件下維持上述細胞系(a)培養基RPMI 1640培養基，含有2mM的L-穀氨醯胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11875-085)，調節為含有10mM的HEPES(Invitrogen，cat#15630-080)、50單位/ml的青黴素-鏈黴素(Invitrogen，cat#15070-063)、1.0mM的丙酮酸鈉(Invitrogen，cat#11360-070)，並補加了0.05mM的2-巰基乙醇(Invitrogen，cat#21985-023)、10％的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，cat#26170-019)；(b)連續培養在細胞培養瓶(Corning，CorningNY，cat#430641)中培養，每3天更換一次新鮮的培養基直到培養4個月，然後開始新一輪的培養；和(c)溫度37℃，5％CO2。CEM細胞是一種未轉化的人T淋巴母細胞白血病細胞系，能夠在體內模擬人T細胞白血病。選擇性殺死上述細胞和其它白血病細胞在臨床上將是非常具有價值的。
將上述人T淋巴母細胞白血病細胞置於48孔板上，濃度為每孔0.4×106個細胞，大約為80％鋪滿，在含有FBS的培養基中使之成熟3-4天。之後，將培養基更換為不含FCS的HL-1培養基，每孔0.2ml。然後用已經經過內毒素測試和分級分離的dsRNA(pA:pU)(參見實施例4)對細胞進行脈衝試驗，濃度分別為10μg/ml、30μg/ml和100μg/ml，6小時後將培養基更換為新鮮的HL-1培養基，在37℃/5％CO2無菌條件溫育過夜。然後將細胞重懸浮在冷的磷酸鹽緩衝液中(PBS，Sigma，cat#D8537)，其中磷酸鹽緩衝液要緩慢加入到細胞中，然後用Yo-Pro(Molecular Probes，Eugene，OR，cat#Y-3603，終濃度為0.15μM))和溴化乙錠(Sigma，cat#46067，終濃度為1.5μg/ml)染色，其中Yo-Pro是一種細胞凋亡指示劑，溴化乙錠是一種細胞死亡指示劑。溫育10分鐘之後將細胞衝洗一次，懸浮在含有2％FBS的緩衝液中，冰浴保存。然後與合適的對照細胞相比較，使用合適的過濾器用FACS Calibur流式細胞計數器(BD Bioscience，San Jose，CA)分析細胞對Yo-Pro和溴化乙錠的攝入情況，分析得出細胞凋亡和細胞死亡的情況。
結果顯示在附圖7中，該結果表明低分子量pA:pU，尤其是在較高濃度下，如100μg/ml，在誘導人T淋巴母細胞白血病細胞系的細胞死亡和細胞凋亡方面顯著優於對照或高分子量的pA:pU和完全pA:pU。
實施例8低分子量dsRNA級分對人單核細胞白血病細胞顯示出誘導細胞凋亡和細胞死亡的作用。
人單核細胞白血病細胞(THP-1)來自美國典型培養物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，並在ATCC建議的下述條件下維持上述細胞系(a)培養基RPMI 1640培養基，含有2mM的L-穀氨醯胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11875-085)，調節為含有10mM的HEPES(Invitrogen，cat#15630-080)、50單位/ml的青黴素-鏈黴素(Invitrogen，cat#15070-063)、1.0mM的丙酮酸鈉(Invitrogen，cat#11360-070)，並補加了0.05mM的2-巰基乙醇(Invitrogen，cat#21985-023)、10％的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，cat#26170-019)；(b)連續培養在細胞培養瓶(Corning，CorningNY，cat#430641)中培養，每3天更換一次新鮮的培養基直到培養4個月，然後開始新一輪的培養；和(c)溫度37℃，5％CO2。THP-1細胞是一種未轉化的人單核細胞白血病細胞系，能夠在體內模擬人單核細胞白血病。選擇性殺死上述細胞和其它白血病細胞在臨床上將是非常具有價值的。
將上述人單核細胞白血病細胞置於48孔板上，濃度為每孔0.4×106個細胞，大約為80％鋪滿，在含有FBS的培養基中使之成熟3-4天。之後，將培養基更換為不含FBS的HL-1培養基，每孔0.2ml。
然後用已經經過內毒素測試和分級分離的dsRNA(pA:pU)(參見實施例4)對細胞進行脈衝試驗，濃度分別為10、30和100μg/ml，6小時後將培養基更換為新鮮的HL-1培養基，在37℃/5％CO2無菌條件溫育過夜。然後將細胞重懸浮在冷的磷酸鹽緩衝液中(PBS，Sigma，cat#D8537)，其中磷酸鹽緩衝液要緩慢加入到細胞中，然後用Yo-Pro(Molecular Probes，Eugene，OR，cat#Y-3603，終濃度為0.15μM))和溴化乙錠(Sigma，cat#46067，終濃度為1.5μg/ml)染色，其中Yo-Pro是一種細胞凋亡指示劑，溴化乙錠是一種細胞死亡指示劑。溫育10分鐘之後將細胞衝洗一次，懸浮在含有2％FBS的緩衝液中，冰浴保存。然後與合適的對照細胞相比較，使用合適的過濾器用FACS Calibur流式細胞計數器(BD Bioscience，San Jose，CA)分析細胞對Yo-Pro和溴化乙錠的攝入情況，分析得出細胞凋亡和細胞死亡的情況。
結果顯示在附圖8中，該結果表明低分子量pA:pU，尤其是在100μg/ml的濃度下，在透導人單核細胞白血病細胞系中的大量細胞凋亡和細胞死亡方面顯著優於對照或高分子量的pA:pU和完全pA:pU。
B非-白血病細胞系實施例9低分子量和高分子量dsRNA級分成功誘導了人腺癌細胞系的細胞死亡或細胞凋亡，其速度高於對照。
人宮頸腺癌細胞系(HeLa)來自美國典型培養物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，並在ATCC建議的下述條件下維持上述細胞系(a)培養基RPMI 1640培養基，含有2mM的L-穀氨醯胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11875-085)、調節為含有10mM的HEPES(Invitrogen，cat#15630-080)、50單位/ml的青黴素-鏈黴素(Invitrogen，cat#15070-063)、1.0mM的丙酮酸鈉(Invitrogen，cat#11360-070)，並補加了0.05mM的2-巰基乙醇(Invitrogen，cat#21985-023)、10％的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，cat#26170-019)；(b)連續培養在細胞培養瓶(Corning，CorningNY，cat#430641)中培養，每3天更換一次新鮮的培養基直到培養4個月，然後開始新一輪的培養；和(c)溫度37℃，5％CO2。HeLa細胞是一種未轉化的宮頸腺癌人細胞系，能夠在體內模擬腺癌。選擇性殺死腺癌和其它癌症在臨床上將是非常具有價值的。
將上述人宮頸腺癌細胞系置於48孔板上，濃度為每孔0.4×106個細胞，大約為80％鋪滿，在含有FBS的培養基中使之成熟3-4天。之後，將培養基更換為不含FBS的HL-1培養基，每孔0.2ml。然後用已經經過內毒素測試和分級分離的dsRNA(pA:pU)(參見實施例4)對細胞進行脈衝試驗，濃度為10-100μg/ml，6小時後將培養基更換為新鮮的HL-1培養基，在37℃/5％CO2無菌條件溫育過夜。然後將細胞重懸浮在冷的磷酸鹽緩衝液中(PBS，Sigma，cat#D8537)，其中磷酸鹽緩衝液要緩慢加入到細胞中，然後用Yo-Pro(Molecular Probes，Eugene，OR，cat#Y-3603，終濃度為0.15μM))和溴化乙錠(Sigma，cat#46067，終濃度為1.5μg/ml)染色，其中Yo-Pro是一種細胞凋亡指示劑，溴化乙錠是一種細胞死亡指示劑。溫育10分鐘之後將細胞衝洗一次，懸浮在含有2％FBS的緩衝液中，冰浴保存。然後與合適的對照細胞相比較，使用合適的過濾器用FACS Calibur流式細胞計數器(BD Bioscience，San Jose，CA)分析細胞對Yo-Pro和溴化乙錠的攝入情況，分析得出細胞凋亡和細胞死亡的情況。
結果顯示在附圖9中，該結果表明低分子量pA:pU在誘導人宮頸腺癌細胞的細胞凋亡和細胞死亡方面不再優於高分子量的pA:pU或對照。
實施例10當低分子量pA:pU的濃度為100μg/ml時，其在誘導人肺成纖維細胞中的大量細胞凋亡和細胞死亡方面顯著優於高分子量pA:pU和完全pA:pU和對照。
人肺成纖維細胞(″WI38″)來自美國典型培養物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，並在ATCC建議的下述條件下維持上述細胞系(a)培養基RPMI 1640培養基，含有2mM的L-穀氨醯胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11875-085)，調節為含有10mM的HEPES(Invitrogen，cat#15630-080)、50單位/ml的青黴素-鏈黴素(Invitrogen，cat#15070-063)、1.0mM的丙酮酸鈉(Invitrogen，cat#11360-070)，並補加了0.05mM的2-巰基乙醇(Invitrogen，cat#21985-023)、10％的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，cat#26170-019)；(b)連續培養在細胞培養瓶(Corning，CorningNY，cat#430641)中培養，每2-3天更換一次新鮮的培養基直到培養50天，然後開始新一輪的培養；和(c)溫度37℃，5％CO2。WI38細胞是一種人肺成纖維細胞系，能夠在體內模擬肺癌。選擇性殺死腺癌和其它癌症在臨床上將是非常具有價值的。
將上述人肺成纖維細胞置於48孔板上，濃度為每孔0.4×106個細胞，大約為80％匯合，在含有FBS的培養基中使之成熟3-4天。之後，將培養基更換為不含FCS的HL-1培養基，每孔0.2ml。然後用已經經過內毒素測試和分級分離的dsRNA(pA:pU)(參見實施例4)對細胞進行脈衝試驗，濃度為10-100μg/ml，6小時後將培養基更換為新鮮的HL-1培養基，在37℃/5％CO2無菌條件溫育過夜。然後將細胞重懸浮在冷的磷酸鹽緩衝液中(PBS，Sigma，cat#D8537)，其中磷酸鹽緩衝液要緩慢加入到細胞中，然後用Yo-Pro(MolecularProbes，Eugene，OR，cat#y-3603，終濃度為0.15μM))和溴化乙錠(Sigma，cat#46067，終濃度為1.5μg/ml)染色，其中Yo-Pro是一種細胞凋亡指示劑，溴化乙錠是一種細胞死亡指示劑。溫育10分鐘之後將細胞衝洗一次，懸浮在含有2％FBS的緩衝液中，冰浴保存。然後與合適的對照細胞相比較，使用合適的過濾器用FACS Calibur流式細胞計數器(BD Bioscience，San Jose，CA)分析細胞對Yo-Pro和溴化乙錠的攝入情況，分析得出細胞凋亡和細胞死亡的情況。
結果顯示在附圖10中，該結果表明當低分子量pA:pU的濃度為100μg/ml時，其在誘導人肺成纖維細胞中的大量細胞凋亡和細胞死亡方面顯著優於高分子量pA:pU和完全pA:pU和對照。
實施例11高分子量和低分子量的dsRNA或ssRNA均不能成功誘導人乳腺癌細胞的細胞死亡或凋亡。
人乳腺癌細胞系(SKBR-3)來自美國典型培養物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，並在ATCC建議的下述條件下維持上述細胞系(a)培養基RPMI 1640培養基，含有2mM的L-穀氨醯胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11875-085)，調節為含有10mM的HEPES(Invitrogen，cat#15630-080)、50單位/ml的青黴素-鏈黴素(Invitrogen，cat#15070-063)、1.0mM的丙酮酸鈉(Invitrogen，cat#11360-070)，並補加了0.05mM的2-巰基乙醇(Invitrogen，cat#21985-023)、10％的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，cat#26170-019)；(b)連續培養在細胞培養瓶(Corning，CorningNY，cat#430641)中培養，每3天更換一次新鮮的培養基直到培養4個月，然後開始新一輪的培養；和(c)溫度37℃，5％CO2。
將上述人乳腺癌細胞系置於48孔板上，濃度為每孔0.4×106個細胞，大約為80％鋪滿，在含有FBS的培養基中使之成熟3-4天。之後，將培養基更換為不含FCS的HL-1培養基，每孔0.2ml。然後用已經經過內毒素測試和分級分離的dsRNA(pA:pU)(參見實施例4)對細胞進行脈衝試驗，濃度為10-100μg/ml，6小時後將培養基更換為新鮮的HL-1培養基，在37℃/5％CO2無菌條件溫育過夜。然後將細胞重懸浮在冷的磷酸鹽緩衝液中(PBS，Sigma，cat#D8537)，其中磷酸鹽緩衝液要緩慢加入到細胞中，然後用Yo-Pro(MolecularProbes，Eugene，OR，cat#Y-3603，終濃度為0.15μM)和溴化乙錠(Sigma，cat#46067，終濃度為1.5μg/ml)染色，其中Yo-Pro是一種細胞凋亡指示劑，溴化乙錠是一種細胞死亡指示劑。溫育10分鐘之後將細胞衝洗一次，懸浮在含有2％FBS的緩衝液中，冰浴保存。然後與合適的對照細胞相比較，使用合適的過濾器用FACS Calibur流式細胞計數器(BD Bioscience，San Jose，CA)分析細胞對Yo-Pro和溴化乙錠的攝入情況，分析得出細胞凋亡和細胞死亡的情況。
結果顯示在附圖11中，該結果低分子量pA:pU和高分子量的pA:pU，以及完全的pA:pU，與對照相比均不能成功誘導人腺癌細胞的細胞死亡。
實施例12低分子量或高分子量的dsRNA不能以高於高分子量的ds RNA或對照的水平誘導人PBMCs的細胞死亡或細胞凋亡。
將Histopaque密度梯度培養基(Sigma，cat#1077-1)在室溫下放置，並翻轉幾次使之混合均勻。取3mL的Histopaque加入到15ml的離心管中。取5-6mL來自人供體(供體1和2)的人血樣品，輕輕鋪於Histopaque培養基，然後在20℃、400xg下離心30分鐘。使用滅菌的吸管，吸取白色的淋巴細胞層，儘可能不要吸取Histopaque介質和血漿汙染。
然後將淋巴細胞層轉移到另外一個15mL的離心管中，向淋巴細胞中加入3倍體積的PBS緩衝液。將淋巴細胞重懸浮在PBS緩衝液中，將離心管在20℃、1500RPM下離心10分鐘。輕輕傾倒出上清液，然後用吸管輕輕地將淋巴細胞重懸浮。然後將離心管在20℃、1200RPM下再次離心10分鐘。輕輕傾倒出上清液，然後將淋巴細胞輕輕地重懸浮在HL-1培養基中。將離心管再次在20℃、1000RPM下離心10分鐘，然後重懸浮在HL-1培養基中。
然後將淋巴細胞計數，並平鋪到帶有HL-1培養基的48孔板上，每孔4×105個細胞。向細胞中加入分級分離的並純化了的RNA基序(pA:pU)(參見實施例4)，終濃度分別為10、30和100μg/ml，或者LPS(大腸桿菌055B5)，濃度為100ng/ml，然後在37℃、5％CO2條件下溫育過夜。
然後將細胞重懸浮，並用溴化乙錠和/或Yo-Pro染色，過程如下向細胞中加入100μl滅菌的冷磷酸鹽緩衝液(PBS，Sigma，cat#D8537)，然後用溴化乙錠(Sigma，cat#46067，終濃度為1.5μg/ml)和/或Yo-Pro(Molecular Probes，Eugene，OR，cat#y-3603，終濃度為0.15μM)染色，其中溴化乙錠是一種細胞死亡指示劑，Yo-Pro是一種細胞凋亡指示劑。將細胞在冰浴中溫育10分鐘，然後重懸浮在含有2％FBS的PBS緩衝液中，隨後與合適的對照(LPS，100ng/ml或Nil，或單純的HL-1介質)相比較，使用合適的過濾器用FACS Calibur流式細胞計數器(BD Bioscience，San Jose，CA)分析細胞對Yo-Pro和溴化乙錠的攝入情況，分析得出細胞凋亡/細胞死亡的情況。通過螢光顯微鏡使用合適過濾器將凋亡細胞和死亡細胞與活細胞區分開來以分析細胞，並用使用Image Pro軟體(MediaCybernetics，Carlsbad，CA)的圖像分析系統拍攝照片。
附圖12A-12B的結果顯示低分子量或高分子量dsRNA與高分子量dsRNA或對照相比，不能更有效誘導人PBMCs的細胞死亡或凋亡。
實施例13低分子量的dsRNA級分和已知寡聚體長度的dsRNA顯示出誘導單核細胞白血病細胞的細胞死亡作用。
人單核細胞白血病細胞(THP-1)來自美國典型培養物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，並在ATCC建議的下述條件下維持上述細胞系(a)培養基RPMI 1640培養基，含有2mM的L-穀氨醯胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11875-085)、調節為含有10mM的HEPES(Invitrogen，cat#15630-080)、50單位/ml的青黴素-鏈黴素(Invitrogen，cat#15070-063)、1.0mM的丙酮酸鈉(Invitrogen，cat#11360-070)，並補加了0.05mM的2-巰基乙醇(Invitrogen，cat#21985-023)、10％的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，cat#26170-019)；(b)連續培養在細胞培養瓶(Corning，Corning NY，cat#430641)中培養，每3天更換一次新鮮的培養基直到培養4個月，然後開始新一輪的培養；和(c)溫度37℃，5％CO2。THP-1細胞是一種未轉化的人單核細胞白血病細胞系，能夠在體內模擬人單核細胞白血病。選擇性殺死上述細胞和其它白血病細胞在臨床上將是非常具有價值的。
將上述人單核細胞白血病細胞置於48孔板上，濃度為每孔0.4×106個細胞，大約為80％鋪滿，在含有FBS的培養基中使之成熟3-4天。之後，將培養基更換為不含FBS的HL-1培養基，每孔0.2ml。
然後用已經經過內毒素測試的完全和分級分離的低分子量(＜10kMW)ds RNA(pA:pU)(參見實施例4)，濃度為100μg/ml，以及腺苷酸(Sigma，cat#A-1752)或尿苷酸(Sigma，cat#U-1752)的50、100、200和400μg/ml的滅菌PBS溶液，或者是5聚體、10聚體或20聚體退火核苷酸(寡聚體)長度的polyA:polyU(Ambion，Austin TX)的50、100、200和400μg/ml的滅菌PBS溶液，對細胞進行脈衝試驗。另外分別以LPS(200ng/ml)或HL-1培養基作為對照。將樣品在37℃/5％CO2無菌條件溫育過夜。然後將細胞重懸浮在冷的磷酸鹽緩衝液中(PBS，Sigma，cat#D8537)，其中磷酸鹽緩衝液要緩慢加入到細胞中，然後用Yo-Pro(Molecular Probes，Eugene，OR，cat#Y-3603，終濃度為0.15μM))和溴化乙錠(Sigma，cat#46067，終濃度為1.5μg/ml)染色，其中Yo-Pro是一種細胞凋亡指示劑，溴化乙錠是一種細胞死亡指示劑。溫育10分鐘之後將細胞衝洗一次，懸浮在含有2％FBS的緩衝液中，冰浴保存。然後與合適的對照細胞相比較，使用合適的過濾器用FACS Calibur流式細胞計數器(BD Bioscience，San Jose，CA)分析細胞對Yo-Pro和溴化乙錠的攝入情況，分析得出細胞凋亡的情況。
結果顯示在附圖13中，該結果表明當低分子量pA:pU的濃度為100μg/ml時，正如前面所顯示的，能夠誘導細胞的大量壞死性細胞死亡，當5聚體pA:pU的濃度為200μg或400μg時，所誘導的壞死性細胞死亡的量較高，並且顯著高於10聚體或20聚體pA:pU、腺苷酸或尿苷酸或對照所誘導的細胞死亡。上述結果還表明，腺苷酸單體或尿苷酸單體僅顯示出背景水平的細胞壞死活性，因此起始的pA:pU寡聚體形式是重要的。另外，低分子量(＜10k MW)pA:pU寡聚體的長度應當小於10聚體，只有這樣才預期具有細胞壞死活性。
權利要求
1.一種通過給細胞施用RNA鏈，從而誘導患者中轉化或非轉化細胞凋亡或細胞死亡的方法。
2.權利要求1所述的方法，其中所述RNA鏈的平均大小為1kDa至50kDa。
3.權利要求1所述的方法，其中所述RNA鏈是dsRNA。
4.權利要求1所述的方法，其中所述RNA鏈是ssRNA。
5.權利要求3所述的方法，其中所述dsRNA是pA∶pU。
6.權利要求5所述的方法，其中所述dsRNA是靜脈內施用，施用劑量是1-999μg/kg。
7.權利要求3所述的方法，其中所述dsRNA施用給患者的濃度範圍是1-500μg/kg。
8.權利要求1所述的方法，其中所述患者是人，細胞是癌細胞，dsRNA是pA∶pU，並且dsRNA是直接注射到癌細胞。
9.權利要求4所述的方法，其中ssRNA是pA。
10.權利要求1所述的方法，其中轉化細胞選自T細胞白血病細胞、人單核細胞白血病細胞、人腺癌細胞和人肺成纖維細胞。
11.一種通過給細胞施用ssRNA或dsRNA，從而誘導細胞死亡或凋亡的方法，其中所述ssRNA或dsRNA的平均大小小於20kDa。
12.權利要求11所述的方法，其中ssRNA或dsRNA的平均大小小於10kDa。
13.權利要求12所述的方法，其中所述細胞是轉化細胞。
14.權利要求12所述的方法，其中所述ssRNA是pA。
15.權利要求11所述的方法，其中所述dsRNA是pA∶pU。
16.權利要求12所述的方法，其中所述細胞是癌細胞。
17.權利要求1所述的方法，其中所述RNA鏈誘導增強的細胞因子TNF-α的產生，並由此介導了對所述細胞的T1免疫反應。
18.權利要求12所述的方法，其中所述RNA鏈誘導增強的細胞因子TNF-α的產生，並由此介導了對所述細胞的T1免疫反應。
19.權利要求1所述的方法，其中使用RNA誘導細胞死亡，誘導增強的對所述細胞的免疫反應。
20.權利要求1所述的方法，其中所述RNA是體內施用給細胞，施用方式選自局部施用、系統施用或直接注射。
21.一種通過給細胞施用ssRNA或dsRNA，從而誘導細胞凋亡的方法，其中所述ssRNA或dsRNA的大小小於10kDa。
22.權利要求21所述的方法，其中所述RNA是ssRNA，並且是pA。
23.權利要求21所述的方法，其中所述RNA是dsRNA，並且是pA∶pU。
24.權利要求21所述的方法，其中所述細胞是轉化細胞。
25.權利要求21所述的方法，其中所述誘導的凋亡細胞誘導增強的IL-12細胞因子的產生。
26.權利要求21所述的方法，其中誘導了Th-1反應。
27.權利要求1所述的方法，其中所述RNA是dsRNA，其分子量大於50kDa，並且誘導增強的IL-12反應。
28.一種用於誘導患者中轉化細胞中的細胞死亡或凋亡的組合物，其中所述組合物由平均分子量為1-50kDa的dsRNA組成。
29.權利要求28所述的組合物，其中所述dsRNA的平均分子量小於20kDa。
30.權利要求28所述的組合物，其中所述dsRNA的平均分子量小於10kDa。
31-權利要求28所述的組合物，其中所述ds RNA是pA∶pU。
32.權利要求28所述的組合物，其中所述dsRNA誘導增強的細胞因子TNF-α的產生。
33.一種用於誘導轉化細胞中的細胞死亡或凋亡的組合物，其中所述組合物由寡核苷酸組成，所述寡核苷酸由至少兩個選自腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤和肌苷的鹼基對組成，並且所述寡核苷酸的分子量為1kDa-50kDa。
34.權利要求33所述的組合物，其中所述寡核苷酸是ssRNA。
35.權利要求33所述的組合物，其中所述寡核苷酸是dsRNA。
36.權利要求33所述的組合物，其中所述ssRNA是pA。
37.權利要求35所述的組合物，其中所述寡核苷酸是pA∶pU。
全文摘要
本申請涉及dsRNA和/或ssRNA在誘導增殖細胞凋亡或細胞死亡中的應用。具體來說，本申請表明低分子量和高分子量的dsRNA和ssRNA均能夠誘導增殖細胞的凋亡和/或細胞死亡，能夠抑制轉化細胞或腫瘤細胞的增殖，並且能夠快速誘導細胞因子TNF－α，和/或能夠誘導產生IL－12，其中IL－12能夠介導Th－1反應。
文檔編號C07H21/00GK1795274SQ200480014353
公開日2006年6月28日 申請日期2004年3月25日 優先權日2003年3月26日
發明者D·史密斯, A·博特 申請人:多單元免疫治療公司