殼聚糖載體的dmt單克隆抗體免疫親和柱的製備及應用的製作方法
2023-09-19 23:24:10
專利名稱：殼聚糖載體的dmt單克隆抗體免疫親和柱的製備及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於免疫親和層析及獸藥殘留檢測技術領域，涉及一種以殼聚糖 (CTS)為載體去氫甲睪酮(DMT)單克隆抗體免疫親和柱的製備方法及其應用。
背景技術：
外源性蛋白同化激素去氫甲睪酮(DMT)作為一種生長促進劑被廣泛用於畜牧生產領域，它的過量添加也給動物源性食品造成了嚴重的安全問題。包括我國在內的許多國家和國際組織明確禁止蛋白質同化激素在畜牧生產中應用，並開始相關的監測工作。與儀器檢測方法相比，免疫親合色譜(IAC)作為一種定量分析方法用於食品安全檢測中的獸藥、農藥殘留檢測。它特異性強、解析度高、純化效能高、可重複使用、能簡化樣品前處理，因而備受關注。IAC不僅要有合適的抗體，而且還要有合適的載體。目前應用最多的是載體是瓊脂糖凝膠，它具有理想載體的特性非特異性吸附低、穩定性好、孔徑均勻、宜於活化等，但是此種凝膠最大的缺點是活化和再生過程中需要用到劇毒的溴化氰，此外價格也過於昂貴。 因此，尋找開發一種性能優良且經濟實用的新型載體是目前許多實驗室致力研究的方向。殼聚糖(Chitosan，CTS)是自然界資源量僅次於纖維素的可再生資源，是迄今為止唯一發現的陽離子動物纖維和唯一的鹼性多糖。它具有獨特的理化性質和生物功能，並且含有大量的可修飾功能基團(羥基和氨基)，可以通過醯化、羥基化、醚化、希夫氏反應、酯化、水解等反應製備出各種衍生物。CTS及其衍生物通過吸附、吸附交聯、複合載體、凝膠包埋等方式能作為蛋白、酶、細胞等的固定化載體。由於CTS來源豐富，具有網狀結構，機械性能好，化學結構穩定，具有良好的吸附性、生物相容性生物可降解性，且無毒、價廉，是一種性能優良且應用前景廣闊的載體。
發明內容
本發明的目的在於提供一種以殼聚糖為載體的DMT單克隆抗體免疫親和柱的製備與使用方法，所研製的親和柱利用反相懸浮交聯法將殼聚糖進行交聯，使其成網狀結構，與 DMT單抗偶聯得到的免疫親和吸附劑填充於固相萃取管中，用於純化含有DMT的待測樣品。本發明所述的以殼聚糖為載體的DMT單克隆抗體免疫親和柱的製備方法，即(1) 殼聚糖的交聯利用反相懸浮交聯法，甲醛作為預交聯劑，環氧氯丙烷作為交聯劑，將乳化後的殼聚糖進行交聯，製備出成球性能優良，具有較強吸附性能的交聯殼聚糖；
(2)免疫親和吸附劑的製備採用戊二醛作為交聯劑將步驟(1)中製備的交聯殼聚糖與去氫甲睪酮單克隆抗體偶聯製成對去氫甲睪酮具有特異性吸附的免疫親和吸附
劑；
(3)裝柱將步驟(2)製備的免疫親和吸附劑填充到固相萃取柱中，加入PBS緩衝液後自然沉降，即得到以殼聚糖為載體的去氫甲睪酮單克隆抗體免疫親和柱，於4 °C保存備用。具體按照下述步驟進行製備
(1)殼聚糖的交聯利用反相懸浮交聯法，將殼聚糖樣品完全溶解於2 % (ν/ν)的醋酸緩衝液中配成1 % (w/v)的CTS溶液，用等體積的石蠟油進行乳化，加入終濃度為0.5 % (ν/ν)的甲醛反應1 h;再加入交聯劑環氧氯丙烷，使其終濃度為0.4 % 0.6 % (ν/ν), 70 °C交聯3 5 h，pH保持在9 10 ；反應完畢後，用大量的蒸餾水清洗後用石油醚索氏抽提 10 12 h，用蒸餾水洗滌至中性後冷凍乾燥即製備出成球性能優良，具有較強吸附性能的交聯殼聚糖；
(2)免疫親和吸附劑的製備採用25%戊二醛作為交聯劑將步驟(1)中製備的交聯殼聚糖與DMT單抗以質量比為500:3進行偶聯，戊二醛的終濃度為0. 4 % 0. 6 % (ν/ν)，在 40 °C下振蕩交聯8 10 h，按反應體系NaBH4體積比10:1的比例加入5 mol/L NaBH4室溫還原1 h，用蒸餾水和PBS洗滌後製成對DMT具有特異性吸附的免疫親和吸附劑；
(3)裝柱將步驟(2)製備的免疫親和吸附劑填充到與其體積比為4:1固相萃取柱中， 得到以殼聚糖為載體的DMT單克隆抗體免疫親和柱，於4 °C保存待用。本發明以殼聚糖為載體的DMT免疫親和柱的應用，可以應用於DMT的快速檢測本發明的有益效果(1)本發明開發了一種來源豐富，結構穩定，具有良好的吸附性，
且無毒、價廉的載體一殼聚糖；(2)本發明製備的以殼聚糖為載體的免疫親和柱能夠與DMT 特異性結合，一次淨化能除去絕大部分幹擾物，能得到純度較高的DMT ； (3)本發明製備的免疫親和柱最大結合容量約為896 ng DMT/0.05 g交聯殼聚糖；(4)本發明製備的免疫親和柱的洗脫條件為3 mL 90%的甲醇-水溶液；(5)本發明製備的免疫親和柱的加標回收率為 86. 85% 96. 95%。
其中圖1.本發明純化後DMT單抗的SDS-PAGE圖； 圖2.本發明IAC柱外觀圖3.本發明IAC柱洗脫液選擇優化圖； 圖4.本發明IAC柱最大結合容量圖； 圖5.本發明icELISA評價方法標準曲線圖； 圖6.本發明HPLC評價方法標準曲線圖。
具體實施例方式本發明下面的實施例僅作為本發明內容的進一步說明，不能作為本發明的限定內容或範圍。下面通過實施例對本發明作進一步說明。實施例1以殼聚糖為載體DMT單克隆抗體免疫親和柱的製備 (1)交聯殼聚糖的製備
a.取1.0 g CTS，在100 mL 2 %的醋酸溶液(含0. 5 g PEG 4000)中溶解配成1 %的 CTS溶液；
b.加入100mL含有1 % span-80的石蠟油，在60 °C下乳化30 min ；
c.加入1mL的預交聯劑甲醛，60 °C下反應1 h;
d.靜置分層，除去上層的液體石蠟，再用石油醚和蒸餾水反覆清洗；
e.加入交聯劑環氧氯丙烷，使其終濃度為0.4 0.6%，在70 °C下交聯3 5 h，pH保持在9 10 ；f.反應完畢後，用大量的蒸餾水清洗後用石油醚索氏抽提10 12 h，最後再用蒸餾水洗至中性，冷凍乾燥後備用。(2)免疫親和吸附劑的製備
a.稱取0.05 g 的交聯殼聚糖，用 pH 8. 3,0. 1 mol/L NaHCO3 (含 0. 5 mol/L NaCl)的偶聯緩衝液洗滌2次後，沉澱重新懸浮於5 mL的偶聯緩衝液中，再加入1 mL 0. 15 0. 30 mg/mL的單克隆抗體溶液，攪拌吸附3 h ；
b.加入偶聯劑25%戊二醛，使其終濃度為0.4 % 0.6 %;在40 °C下振蕩交聯8 10 h ；
c.交聯結束後，8000r/min離心3 min取上清測定觀0 nm和沈0 nm處的吸光度，根據公式CpMtein(mg/mL) =1. 45A280nm-0. 74A260nm計算未偶聯的抗體含量，進而計算偶聯率；
d.按反應體系NaBH4溶液體積比1:10的比例加入5mol/L NaBH4室溫還原1 h ；
e.用大量水洗至中性，再用PBS洗滌2次。(3)裝柱
將得到的親和吸附劑填充入與其體積比為4:1的固相萃取管中，製成DMT多克隆抗體免疫親和柱，於4 ！冰箱保存待用。所製備的免疫親和柱外觀圖見說明書附圖1。圖中顯示的是裝填了以上親和吸附劑的IAC柱。柱子由兩部分組成柱身和套管，其中的液體是 PBS。用來偶聯的單抗純度如附圖2所示；製備得到的IAC柱外觀圖如附圖3所示。試驗一、本發明所述以殼聚糖為載體的DMT免疫親和柱的條件優化方法
1、實施例1所製備得到的以殼聚糖為載體的DMT免疫親和柱最佳洗脫條件的確定按上述方法製備5支IAC柱，每柱上樣500 ng的DMT溶液，PBS充分洗滌後，分別選用60 %、 70 %、80 %、90 %、100 %的甲醇-水溶液對IAC柱進行洗脫，收集洗脫液，用HPLC法測定回收率，當甲醇濃度在90 %時回收率為84. 70 %，考慮有機溶劑的影響，選擇90 %洗脫液，洗脫液選擇見附圖5。在此基礎上，再用不同體積3、5、7 mL的90 %甲醇-水溶液洗脫，結果見表1，選擇洗脫體積為3 mL，此時回收率大於90 %。表1洗脫體積的優化
洗脫液體積(mL)357回收率(％)90. 7394. 1499. 88
2、實施例1所製備得到的以殼聚糖為載體的DMT免疫親和柱最大結合容量的測定 取0. 5mL製備的免疫親和吸附劑裝柱柱，將10 mL 200 ng/mL (共2000 ng)的DMT標
準品溶液過柱，上樣液每1. 0 mL收集一管，用間接競爭ELISA (icELISA)測定每組份中DMT 含量。根據下式計算柱容量(即被吸附的DMT總量)=DMT上樣總量一洗下的DMT總量。結果顯示，第1 mL上樣液中不含有DMT，上樣第2 mL時開始有DMT被洗下，8.0 mL開始無吸附。因此，IAC柱的最大柱容量約為896/0.5=1792 ng DMT/mL凝膠。最大結合容量的測定如說明書附圖6所示；
3、實施例1、2所製備得到的以殼聚糖為載體的DMT免疫親和柱加標回收率的測定 取製備好的 IAC柱，分別用 2. 5 mL 的 20 ng/mLU00 ng/mL,200 ng/mL (50 ng、250 ng、
500 ng)三種不同濃度的DMT標準品過柱，每種濃度作兩組平行。收集洗滌液後用HPLC測定回收率。結果見表2。用合適的洗脫液洗脫後，平均回收率為92. 25 %； 表2 IAC柱的加標回收率
權利要求
1.殼聚糖載體的DMT單克隆抗體免疫親和柱的製備方法，其特徵在於按照下述步驟進行(1)殼聚糖的交聯利用反相懸浮交聯法，甲醛作為預交聯劑，環氧氯丙烷作為交聯劑， 將乳化後的殼聚糖進行交聯，製備出成球性能優良，具有較強吸附性能的交聯殼聚糖；(2)免疫親和吸附劑的製備採用戊二醛作為交聯劑將步驟(1)中製備的交聯殼聚糖與去氫甲睪酮單克隆抗體偶聯製成對去氫甲睪酮具有特異性吸附的免疫親和吸附劑；(3)裝柱將步驟(2)製備的免疫親和吸附劑填充到固相萃取柱中，加入PBS緩衝液後自然沉降，即得到以殼聚糖為載體的去氫甲睪酮單克隆抗體免疫親和柱，於4 °C保存備用。
2.根據權利要求1所述的殼聚糖載體的DMT單克隆抗體免疫親和柱的製備方法，其特徵在於按照下述步驟進行(1)殼聚糖的交聯利用反相懸浮交聯法，將殼聚糖樣品完全溶解於體積比計2%的醋酸緩衝液中配成質量與體積比計為1 % WCTS溶液，用等體積的石蠟油進行乳化，加入終濃度體積比計為0.5 %的甲醛反應1 h;再加入交聯劑環氧氯丙烷，使其終濃度體積比計為 0.4 % 0.6 %，70 °C交聯3 5 h，pH保持在9 10 ；反應完畢後，用大量的蒸餾水清洗後用石油醚索氏抽提10 12 h，用蒸餾水洗滌至中性後冷凍乾燥即製備出成球性能優良， 具有較強吸附性能的交聯殼聚糖；(2)免疫親和吸附劑的製備採用25%戊二醛作為交聯劑將步驟(1)中製備的交聯殼聚糖與DMT單抗以質量比為500:3進行偶聯，戊二醛的終濃度體積比計為0. 4 % 0. 6 %， 在40 °C下振蕩交聯8 10 h，按反應體系NaBH4體積比10:1的比例加入5 mol/L NaBH4 室溫還原1 h，用蒸餾水和PBS洗滌後製成對DMT具有特異性吸附的免疫親和吸附劑；(3)裝柱將步驟(2)製備的免疫親和吸附劑填充到與其體積比為4:1固相萃取柱中， 得到以殼聚糖為載體的DMT單克隆抗體免疫親和柱，於4 °C保存待用。
3.權利要求1所述的以殼聚糖為載體的去氫甲睪酮免疫親和柱的應用，可以應用於去氫甲睪酮的快速檢測。
全文摘要
本發明一種以殼聚糖(CTS)為載體去氫甲睪酮(DMT)單克隆抗體免疫親和柱的製備方法及其應用，屬於免疫親和層析及獸藥殘留檢測技術領域。公開了以CTS為載體DMT單克隆抗體免疫親和柱的製備方法及應用。通過將雜交瘤細胞株分泌得到的單克隆抗體純化以後與交聯成球狀的殼聚糖進行偶聯得到的免疫親和吸附劑填充於固相萃取管中製得了對去氫甲睪酮具有特異性吸附的免疫親和柱。本發明製備的免疫親和柱能夠與去氫甲睪酮特異性結合，其最大結合容量約為1792ngDMT/mL凝膠；採用的洗脫液為90%的甲醇-水溶液時，平均加標回收率為86.85%~96.95%。本發明可以應用於去氫甲睪酮的快速檢測。
文檔編號B01J20/30GK102258987SQ201110089189
公開日2011年11月30日 申請日期2011年4月11日 優先權日2011年4月11日
發明者任曉鋒, 張勳, 徐燕, 王雲, 董英 申請人:江蘇大學