一種誘導幹細胞神經分化的方法
2023-09-19 23:01:30 1
專利名稱：一種誘導幹細胞神經分化的方法
技術領域：
本發明涉及細胞工程技術，涉及一種促進幹細胞神經分化的體外誘導方法。
背景技術：
神經系統難治性疾病多由於神經系統損傷導致大量神經元結構和功能的缺失，傳統的觀點認為神經細胞缺乏再生能力，無法產生新的神經元建立突觸聯繫，神經損傷不可逆轉。而近年來研究發現，將幹細胞移植到病損或受傷的腦組織中，可產生新的神經細胞， 從結構及功能上對神經系統進行修復和改善。幹細胞尤其是成體幹細胞作為一種新型的生物治療方法是醫學發展史上一個開創性的探索。
骨髓間充質幹細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是存在於骨髓、外周血和臍血等組織中的一類具有自我更新及跨胚層分化能力的幹細胞，體外研究發現，MSCs在特定的誘導環境下可分化為神經樣細胞，動物實驗也顯示骨髓間充質幹細胞移植可在中樞神經系統內存活並能分化為有功能的神經樣細胞[I]。MSCs取材和體外擴增方便，不受倫理學的限制，具有免疫耐受的優勢，體內移植易於控制，為神經系統疾病治療帶來了新的希望。 如何提高MSCs的神經分化效率及功能替代作用是MSCs用於神經系統疾病治療的關鍵。
目前，MSCs體外定向成神經誘導有化學誘導法、神經營養因子誘導法、神經細胞共培養法等，這些方法均可實現對MSCs的定向成神經誘導，但各有優劣。其中，Woodbury化學誘導法是目前常用的誘導大鼠MSCs成神經分化的方法，MSCs在體外各種化學誘導劑及生長因子培養條件下向神經樣細胞的轉化率高達50%-90%，但分化後的細胞多隻證實具有神經細胞形態及表面標誌的表達，是否具有成熟的神經細胞功能還鮮有報導，且誘導後的神經樣細胞極易發生調亡，存活時間短。發明內容
本發明的一個目的在於提供一種誘導幹細胞神經分化的方法，能有效促進幹細胞神經分化。
本發明的另外一個目的在於提供一種表達相關神經標誌蛋白，並具有神經元細胞功能的神經樣細胞。
本發明的目的是通過以下措施實現的一種誘導幹細胞神經分化的方法，其特徵在於使用全反式維甲酸(all-trans-Retinoic Acid, ATRA)作為誘導劑，改良神經誘導培養基(modified neuronal induction medium, MNM)作為培養基處理幹細胞。
為了更有效的促進幹細胞神經分化，所述ATRA的濃度優選為lyM。更優選地，所述ATRA誘導時間為24小時。
進一步地，為了提高幹細胞向神經元定向分化的分化率和存活率，所述MNM的配方為 2%DMS0，200 u M BHA, 25mM KCL, 2mM 丙戊酸，8uM forsklin, I u M 氫化可的松和 5 y g/ ml胰島素的DMEM/F12培養液。分化率能達到86%，存活率能達到近100%。
更進一步地，所述幹細胞為骨髓間充質幹細胞。具體的說，所述骨髓間充質幹細胞來源於大鼠。
上述誘導幹細胞神經分化的方法，其特徵在於由以下步驟組成1.分離培養及鑑定原代大鼠MSCs2.誘導原代大鼠MSCs分化加入ATRA進行預誘導24小時，再加入MNM誘導24小時。
上述誘導幹細胞神經分化的方法，其特徵在於由以下步驟組成I.分離培養及鑑定原代大鼠MSCs :取SPF級4 8周齡SD大鼠，取股骨，5ml空針吸取DMEM/F12反覆衝洗骨髓腔及幹垢端，離心去上清，加DMEM/F12/10%FBS/1%青鏈黴素完全培養基吹打，按3X IO6個/瓶的濃度接種在底面積25cm2的的塑料培養瓶中，置於37°C， 5%C02溼化孵箱中培養，24小時後傾去上清液及未貼壁細胞，加入新鮮培養液。隨後每3天換液。細胞融合度達80%後胰蛋白酶消化離心，按I :2或I :3的濃度傳代，3-5代細胞用於實驗。流式細胞技術檢測⑶106、⑶90、⑶45、⑶34等幹細胞標誌。
2. MSCs神經誘導方案的優化MSCs以3X 105/ml濃度接種於培養瓶，培養皿或細胞孔板中，6-8小時細胞貼壁後加入終濃度為0-100 ii M的ATRA進行預誘導,24小時後全量換液去除預誘導液，D-hank』 s洗細胞2_3次，儘量去除殘留血清，加入MNM誘導24小時。 光鏡下觀察細胞存活情況及神經樣細胞的形態，計算神經分化效率。Real-time PCR檢測神經細胞相關標誌的表達水平，胎盤藍染色實驗檢測分化後神經樣細胞的存活率，確定最佳誘導方案。
3.誘導後神經樣細胞的鑑定免疫螢光檢測NESTIN、NES、MAP-2、NF等神經元標誌 GFAP、⑶68、BNDF等神經表面標誌。全細胞膜片鉗檢測細胞靜息電位，鈣影像測定KCl刺激後細胞的胞內鈣離子濃度變化。
一種具有一定神經元功能的神經樣細胞，由上述誘導幹細胞神經分化的方法製得。
本發明的有益效果I.本發明誘導幹細胞向神經樣細胞分化的效率提高22. 66%，幹細胞向神經樣細胞分化後的存活率提高12. 58%，同時具有較高的分化率和存活率。
2.本發明誘導幹細胞更容易向神經元而不是膠質神經細胞分化，分化後的神經樣細胞更具有神經元功能。為神經細胞的發育研究提供了一個較好的體外模型，為幹細胞用於臨床治療神經系統疾病提供強有力的依據。
圖I是原代大鼠MSCs的細胞形態1.光鏡，2. H. E染色(100X)圖2是流式細胞技術檢測第3代MSCs的幹細胞表面標誌⑶106，⑶90，⑶45，⑶34 圖3是MSCs經不同濃度ATRA預誘導24小時再MNM神經誘導24小時的神經樣細胞光鏡4是MSCs經不同濃度ATRA預誘導後MNM神經誘導24小時NESTIN，NSE, MAP-2的 real-time PCR 檢測5是MSCs分化的神經樣細胞的神經元及神經膠質細胞相關標誌NESTIN，NSE，MAP-2， GFAP，CD68 RT-PCR 檢測6是MSCs分化的神經樣細胞的神經元及神經膠質細胞相關標誌4NESTIN, NSE, MAP-2,⑶NF的免疫螢光檢測7是I ii M ATRA預誘導聯合MNM誘導MSCs成神經樣細胞過程中NETIN、NSE表達的 Western blot 檢測8是MSCs及誘導後神經樣細胞的細胞靜息膜電位比較9是MSCs及誘導後神經樣細胞的胞內鈣離子濃度比較10是MSCs及誘導後神經樣細胞的8分鐘動態跟蹤340nm/380nm螢光強度比值圖
具體實施例方式下面通過實施例對本發明進行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用於對本發明進行進一步說明，不能理解為對本發明保護範圍的限制，該領域的技術人員可以根據上述本發明內容對本發明做出一些非本質的改進和調整。
本發明實施例中的試劑藥品未做具體說明的均為普通市售，材料方法未做具體說明的均參考《分子克隆實驗指南》(Sambrook和Russell, 2001)實施例I第一步，分離培養及鑑定原代大鼠MSCs :取SPF級4 8周齡SD大鼠，無菌條件下取股骨，5ml空針吸取DMEM/F12反覆衝洗骨髓腔及幹垢端，離心去上清，加DMEM/F12/10%FBS/1% 青鏈黴素完全培養基吹打，按3xl06個/瓶的濃度接種在25cm2的塑料培養瓶中，置於 370C，5%C02溼化孵箱中培養，24小時後傾去上清液及未貼壁細胞，換液後，可見rMSCs呈散在的細胞集落樣生長，細胞個體呈扁平梭形，集落中央的細胞形態較圓，集落邊緣的細胞為扁平梭形。4 5天左右細胞數量明顯增加，集落逐漸擴大。6 7天細胞基本鋪滿瓶底，形態較均一呈梭形且呈漩渦狀生長(見圖I)。傳代細胞均勻分布，生長迅速，約3 4 天可鋪滿瓶底，細胞多呈梭形，漩渦狀生長。MSC傳至第3代，流式細胞技術檢測大鼠MSCs 的細胞表面標誌取接近融合的第3代MSCs，用胰酶消化後，PBS洗滌3次，製成IXlO6/ ml的單細胞懸液。取100 u I細胞懸液5管a管為標準對照，加IgGl-FITC單克隆抗體， b管加⑶34-FITC單克隆抗體，c管加⑶45-PE單克隆抗體，d管加⑶90-PE單克隆抗體，e 管加CD106-PE單克隆抗體，室溫反應30 min，流式細胞儀(FACSCanto TM II system, BD Biosciences)檢測。CellQuest Pro software (BD Biosciences)分析結果顯不99% 以上的MSC表達⑶106、⑶90，幾乎不表達⑶45和⑶34 (見圖2)，提示分離獲得的骨髓間充質幹細胞純度較高，且沒有骨髓造血幹細胞混雜。
第二步，不同濃度ATRA預誘導聯合MNM對骨髓間充質幹細胞神經分化的作用 細胞培養及誘導神經分化採用3-5代的MSCs，初始密度為50%接種於培養瓶或24孔板，DMEM/F12/10%FBS完全培養基培養，4_5小時細胞貼壁後分別加入終濃度為0. 01,0. I、I、10、IOOii M的ATRA，預誘導24小時後，棄去完全培養基，D_hank』 s液洗細胞兩次，加入 MNM 神經誘導液(含 2% DMS0, 200 剛 BHA, 20 mM KCL, I. 6 mM 丙戊酸，8 剛 Forskolin, 0. 8 m氫化可的松，4 ^g/ml胰島素的DMEM/F12無血清培養基)誘導細胞24小時，無ATRA預誘導，僅MNM神經誘導24小時設為對照組。
光鏡下觀察細胞形態，計算分化效率加入預誘導液24小時內，細胞形態未見明顯改變。更換MNM誘導後在倒置顯微鏡下觀察，誘導I小時即可見部分細胞胞體開始收縮， 折光性增強，並逐漸伸出突起，向神經細胞形態轉變，隨時間推移，細胞胞體收縮更加明顯， 突起增多增長。預誘導的ATRA濃度在0.01-10 ii M範圍內，ATRA濃度越高，神經樣細胞分化效率越高，呈雙極或多極神經元細胞形態，神經元胞體直徑越大，軸突更長(圖3，表1，* p〈0. 05)。IOOMm ATRA預誘導處理的MSC神經分化迅速，但24小時大部分細胞死亡，無法計算神經分化效率。
誘導後神經樣細胞的存活率在倒置顯微鏡下動態觀察各誘導階段細胞狀態，未經ATRA預誘導的細胞24小時後可觀察到部分神經元表型細胞逐漸脫壁、漂浮、死亡，36小時大部分神經樣細胞死亡。臺盼藍染色計算細胞存活率胰酶消化貼壁細胞，收集貼壁及漂浮細胞，製備單細胞懸液，並作適當稀釋。細胞懸液與0. 08%臺盼藍溶液以I: I混合混勻，加 IOul細胞混合液入計數板,鏡下觀察,藍色為死細胞,拒染呈無色透明狀為據染的活細胞。 在三分鐘內，分別計數活細胞和死細胞。計算細胞存活率(%)=活細胞總數/(活細胞總數 +死細胞總數)X 100%。ATRA預誘導濃度在0. 01-1 u M，神經樣細胞24小時的存活率明顯增高，而ATRA濃度高於10 u M後，神經樣細胞的死亡率反而高於未預誘導組(見圖3，表1， * p〈0. 05)。
下表(表I)是不同濃度ATRA預誘導24小時再MNM神經誘導24小時後MSC的神經分化效率，神經元胞體直徑，軸突長度和細胞死亡率(*P〈0. 05 vs MNM單獨培養組)
權利要求
1.一種誘導幹細胞神經分化的方法，其特徵在於使用全反式維甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)作為誘導劑，改良神經誘導培養基(modified neuronal induction medium, MNM)作為培養基處理幹細胞。
2.根據權利要求I所述誘導幹細胞神經分化的方法，其特徵在於所述ATRA的濃度優選為I u M。
3.根據權利要求I或2所述誘導幹細胞神經分化的方法，其特徵在於所述ATRA誘導時間為24小時。
4.根據權利要求3所述誘導幹細胞神經分化的方法，其特徵在於所述MNM的配方為 2%DMS0, 200 u M BHA, 25mM KCL, 2mM 丙戊酸，8 y M forsklin, I u M 氫化可的松和 5 u g/ml 胰島素的DMEM/F12培養液。
5.根據權利要求I或2所述誘導幹細胞神經分化的方法，其特徵在於所述幹細胞為骨髓間充質幹細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)。
6.根據權利要求5所述誘導幹細胞神經分化的方法，其特徵在於所述骨髓間充質幹細胞來源於大鼠。
7.根據權利要求I或2所述誘導幹細胞神經分化的方法，其特徵在於由以下步驟組成(1)分離培養及鑑定原代大鼠MSCs；(2)誘導原代大鼠MSCs分化加入ATRA進行預誘導24小時，再加入MNM(含 2%DMS0，200 ii M BHA,25mM KCL，2mM 丙戊酸，8 y M forsklin, IuM 氫化可的松和 5 u g/ml胰島素的DMEM/F12培養液)誘導24小時。
8.根據權利要求7所述誘導幹細胞神經分化的方法，其特徵在於由以下步驟組成(1)分離培養及鑑定原代大鼠MSCs-M SPF級4 8周齡SD大鼠，取股骨，5ml空針吸取DMEM/F12反覆衝洗骨髓腔及幹垢端，離心去上清，加DMEM/F12/10%FBS/1%青鏈黴素完全培養基吹打，按3X IO6個/瓶的濃度接種在底面積25cm2的塑料培養瓶中，置於37°C， 5%C02溼化孵箱中培養，24小時後傾去上清液及未貼壁細胞，加入新鮮培養液；隨後每3天換液；細胞融合度達80%後胰蛋白酶消化離心，按I :2或I :3的濃度傳代，3-5代細胞用於實驗；流式細胞技術檢測⑶106、⑶90、⑶45、⑶34等幹細胞標誌；(2)MSCs神經誘導方案的優化MSCs以3X 106/ml濃度接種於在底面積25cm2的塑料培養瓶中，培養皿或細胞孔板中，6 8小時細胞貼壁後加入終濃度為0-100 ii M的ATRA進行預誘導,24小時後全量換液去除預誘導液，D-hank’s洗細胞2_3次，儘量去除殘留血清， 加入 MNM (含 2%DMS0, 200 y M BHA，25mM KCL，2mM 丙戊酸，8 y M forsklin，I y M 氫化可的松和5 u g/ml胰島素的DMEM/F12培養液)誘導24小時；光鏡下觀察細胞存活情況及神經樣細胞的形態，計算神經分化效率；Real-time PCR檢測神經細胞相關標誌的表達水平，臺盼藍染色實驗檢測分化後神經樣細胞的存活率，確定最佳誘導方案；(3)誘導後神經樣細胞的鑑定免疫螢光檢測NESTIN、NES、MAP-2、NF等神經元標誌 GFAP,⑶68、BNDF等神經表面標誌；全細胞膜片鉗檢測細胞靜息電位，鈣影像測定KCl刺激後細胞的胞內鈣離子濃度變化。
9.根據權利要求I或2所述誘導幹細胞神經分化的方法製得的具有一定神經元功能的神經樣細胞，由上述誘導幹細胞神經分化的方法製得。
全文摘要
本發明使用全反式維甲酸(all-transretinoicacid,ATRA)作為誘導劑，改良神經誘導培養基(modifiedneuronalinductionmedium,MNM)作為培養基處理幹細胞，能有效促進幹細胞神經分化，提高分化率和存活率，製備更具神經元功能的神經樣細胞，為神經細胞的發育研究提供了一個較好的體外模型，為幹細胞用於臨床治療神經系統疾病提供強有力的依據。
文檔編號C12N5/0775GK102533647SQ20121000181
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月5日 優先權日2012年1月5日
發明者張贇, 李廷玉, 畢楊, 陳潔, 魏小平, 龔敏 申請人:重慶醫科大學附屬兒童醫院