一種培育轉基因耐寒植物的方法
2023-09-19 23:17:35
專利名稱：一種培育轉基因耐寒植物的方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，尤其是一種培育轉基因耐寒植物的方法。
背景技術：
大豆是世界上重要的蛋白和油料作物。低溫對大豆生長造成嚴重影響，特別是在生長後期，冷脅迫往往對大豆產量造成嚴重破壞，成為限制大豆產量提高的重要因素。長期以來，人們主要用傳統遺傳育種的方法對大豆的抗逆性進行改良，然而這種方法具有效率低、周期性長的缺點，並且隨著長期的使用其效果越來越不明顯。利用轉基因技術將抗逆相關基因轉化到大豆中是提高大豆抗逆性的一個更直接有效的途徑和必然趨勢。目前，植物抗冷機制在擬南芥中研究較多，其中研究的最為清楚的是 CBFs (CRT-binding factorl)轉錄因子，包括CBFs的上下遊發揮功能的各個基因所介導的冷信號通路(Jaglo-Ottosen et al.，1998 ；Gilmour et al.，2000)。另外，除了 CBFs 轉錄因子介導的冷信號通路外，其他獨立於CBFs轉錄因子之外的冷信號通路的研究也取了一些進展(Zhu et al.，2004 ；Xin et al.，2007 ；Zhu et al.，2008)。大豆抗冷機理的研究相對較少，冷相關基因的克隆和功能研究相對滯後。目前，主要通過同源克隆的方法在大豆中克隆了一些冷相關的基因。這些基因主要包括一些Ap2、 bZIP、MYB、WRKY等家族的轉錄因子。Chen等通過同源搜索大豆EST資料庫得到一個含有 Ap2結構域的基因GmDREB3，可以和乾旱應答原件DRE結合，此基因受冷誘導上調，同時此基因轉化擬南芥的過表達植株能增強對冷、乾旱、鹽等脅迫條件的抗性(Chen et al.，2008)。 Liao等以擬南芥bZIP結構域為探針對大豆EST序列搜索、拼接，最終鑑定了 4個bZIP家族的基因，其表達受到不同脅迫條件的調節，可以同ABRE元件結合併且其轉化擬南芥的過表達植株增強了對冷凍和鹽脅迫條件的抗性(Liao et al.，2008)。跑皿等通過同源比對的方法鑑定了數個含有WRKY結構域的基因，能同W-box作用元件結合，其表達受鹽、乾旱、 冷等脅迫條件的調節，其轉基因過表達擬南芥植株對鹽、乾旱、冷等脅迫的抗性增加(aiou et al. ,2008). Cheng等利用cDNA-AFLP技術在大豆胚軸中得到一個受冷上調的基因，其過表達擬南芥植株增強了對冷、乾旱和鹽的抗性(Cheng et al.，2009)。Xie等利用RACE 技術得到2個trihelix家族的轉錄因子，其蛋白被定為在細胞核中表達，其過表達擬南芥植株增強了對冷、乾旱和鹽的抗性(Xie et al. ,2009) RCCl (regulator of chromosome condensation 1)家族蛋白是一種啟動染色體集縮的負調節物，RCCl首先從小倉鼠的腎細胞系 BHK-21 中分離出來(Kai et al.，1986 ；Ohtsubo et al.，1987)。RCCl 是目前已知的 Ran鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)，通過調節Ran⑶P到RanGTP的轉換，在核內輸、外運、有絲分裂期紡錘體的形成及核膜重組、防止S期DNA多重複制等過程中起作用(Yamaguchi and Newport, 2003)。RCCl家族基因在生物中的保守性很高，在植物中，對RCCl家族基因的研究剛剛起步。Kliebenstein等在擬南芥中鑑定了一個RCCl家族基因UVR8，能增強擬南芥對紫外線的抗性，但UVR8不具有GEF活性(Kliebenstein et al. ,2002) Favory等研究表明在 UV-B 照射的條件下，UVR8 與 COPl (constitutively photomorphogenic 1)可以發生相互作用，調節UV-B引導的光形態建成，以減少UV-B對植物的損傷(Favory et al., 2009)。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種培育轉基因耐寒植物的方法，將目的基因導入到正常植物體內高表達，獲得與正常植物相比具有高耐寒性的轉基因植物。為解決上述技術問題，本發明所採取的技術方案如下。一種培育轉基因耐寒植物的方法，使序列表中SEQ ID NO 1所示蛋白質的編碼基因在植物體內過表達，獲得與正常植物相比具有高耐寒性的轉基因植物。作為本發明的一種優選技術方案，使序列表中SEQ ID NO 2所示的基因在植物體內過表達，獲得與正常植物相比具有高耐寒性的轉基因植物。作為本發明的一種優選技術方案，首先構建含有SEQ ID NO :2所示基因的重組表達載體，然後利用此重組表達載體構建轉化體，再利用此轉化體侵染目的植物，篩選陽性植株，獲得與正常植物相比具有高耐寒性的轉基因植物。作為本發明的一種優選技術方案，以SUPER1300為載體構建重組表達載體。作為本發明的一種優選技術方案，將目的基因插入到SUPER1300的限制性內切酶 Xba I和Kpn I酶切識別位點之間，得到重組表達載體，命名為SUPER1300-35S_GmIC0。作為本發明的一種優選技術方案，以pES (K)LC為載體構建重組表達載體。作為本發明的一種優選技術方案，將目的基因插入到pESUK)LC的限制性內切酶Kpn I和BamH I酶切識別位點之間，得到重組表達載體，命名為pE^⑷ LC-35S-GFP-GmIC0o作為本發明的一種優選技術方案，利用重組表達載體轉化農桿菌GV3101獲得轉化體，然後再利用農桿菌介導的蘸花法轉化目的植物，篩選陽性植株，經過三代篩選得到純合的與正常植物相比具有高耐寒性的轉基因植物。作為本發明的一種優選技術方案，所述目的植物為大豆。採用上述技術方案所產生的有益效果在於本發明的基因在冷誘導的條件下高表達，通過基因工程技術將此基因轉移到擬南芥中可以顯著提高擬南芥對低溫的抗性；低溫脅迫環境下培育，野生型植株的成活率為42%，兩個導入本發明基因的轉基因株系的成活率分別為69%和74% ；轉基因技術已經成為提高作物抗逆性的主要途徑，本發明為提高大豆等作物的耐冷性提供了重要的基因資源。
圖1為大豆GmICO蛋白與人類RCCl蛋白功能結構域分析結果，圖中著色圓球所示為RCCl重複結構域。圖2為利用RT-PCR技術對GmICO表達模式分析的結果，圖A-D為大豆中GmICO基因在受低溫、ABA、NaCl、PEG脅迫下的RT-PCR電泳圖譜；圖E為不同組織——葉(L)、莖⑶、 根(R)、根瘤(N)、——中GmICO表達模式結果。圖3為pCAMBIAl391-PemiarGUS的⑶S染色對GmICO表達模式的分析結果。圖4為轉基因擬南芥抗冷性表型鑑定結果，圖A為PCR對轉基因植株的鑑定結果，圖B為野生型擬南芥和轉基因擬南芥抗冷性表型比較。
具體實施例方式以下實施例詳細說明了本發明。本發明所使用的各種原料及各項設備均為常規市售產品，均能夠通過市場購買直接獲得。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗， 結果取平均值。本發明的基因及其編碼的蛋白質，來源於大豆屬大豆(Glycine max L.)，其名稱為 GmICOo序列表中SEQ ID NO 1所示為GmICO蛋白的胺基酸序列，參看圖1，GmICO蛋白為一種人類 RCCl (Regulator of chromosome condensation 1)蛋白的同源蛋白，由 477 個胺基酸殘基組成，含有5個RCCl重複結構域，人類的RCCl (NP_001260)蛋白含有7個RCCl重複結構域，GmICO蛋白與RCCl蛋白具有類似的功能結構域分布。可用現有的植物表達載體構建含有所述基因和啟動子的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用於植物基因槍轉化法所用的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3』端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3』端，如農桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3』端轉錄的非翻譯區均具有類似功能。使用所述基因構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，如菸草花椰菜花葉病毒 (CAMV) 35S啟動子、玉米的泛素啟動子⑴biquitin)，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GUS 基因、GFP基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大黴素標記物、卡那黴素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。GmICO基因的逆境及組織表達模式驗證(一)利用RT-PCR技術對GmICO基因的逆境及組織表達模式進行分析驗證(1)、脅迫處理Hoagland營養液生長20天左右的大豆Williams82幼苗用15% PEG6000,200mM NaCl，4°C，100 μ M ABA 分別處理 Oh、lh、3h、6h、12h、24h，取葉片用液氮速凍，_80°C保存備用；同時，另一組大豆種子用70%的灑精滅菌30 S，dH20衝洗6遍後播種於無菌培養皿中，皿底置2張無菌濾紙，dH20浸溼，28°C暗萌發3天。芽長至2cm時，移至放有溼潤濾紙的試管中，芽長至4 5cm，移至活化的根瘤菌菌液中，接種30min，低N水培， 溫度為26 V，相對溼度為70 %，培養觀天，4°C處理5小時，對照為正常環境，取葉、莖、根、 根瘤，液氮冷凍，-80°C儲藏；(2)、mRNA的分離採用Trizol法提取大豆總RNA，①先將組織剪切成小塊，放入研磨中用液氮研磨3次，將研磨好的組織50-100mg加入1. 5mL離心管中然後加入Iml RNAVzol，裂解產物應呈澄清的透明粘稠液體.室溫放置5分鐘；②加200μ 1氯仿，振蕩混勻，室溫靜置5min，12，000r/min，4°C離心IOmin ；③取500 μ 1上清於另一離心管，加等體積異丙醇，室溫放置10min，12，000r / min，4°C離心IOmin ；④加入Iml 75%乙醇洗沉澱， 8，000r/min，4°C離心5min，重複兩次；室溫風乾IOmin左右，加20 μ 1左右DEPC處理過的 RNase Free水(DEPC水)溶解沉澱；(3)、反轉錄為cDNA 將提取的mRNA用!Iomega公司的反轉錄酶AMV反轉錄為 cDNA ；cDNA第一鏈的合成配置第一種混合液totalRNA,7y 1(2μ g) ；oligo dT (10 μ Μ)，3 μ 1 ；總體積 10 μ 1，PCR儀上70°C放置8min，立即置於冰上；配置第二種混合液5XBuffer，4y1 ；dNTPs(dATP, dGTP, dTTP, dCTP 2. 5mmol/ L each), 4 μ 1 ； RNase inhibitot (40U/μ 1) ,0. 5μ 1 ； RNase-free 水，0· 5 μ 1 ；M-MLV (200U/ μ D反轉錄酶， μ ι ；混勻，將第二種混合液加入到第一種混合液中，每管10μ 1，pcr儀上 42°C孵育90min，然後70°C，IOmin終止反應；(4)、利用RT-PCR技術對GmICO基因的逆境及組織表達模式進行分析驗證以上述cDNA作為的模板，設計引物，以ISsrRNA為內參，進行PCR ；其中，引物序列分別為GmICORTF :5』 -ATAATGGCGATGGAACCGAC-3』(SEQ ID NO :4) :GmIC0RTR 5，-AACGAGGGCTCACTTGCTC T-3』 (SEQ ID NO 5) :18srRNAF 5' -CCTTGCTTGTTGCTTTACTAAAT -3，(SEQ ID NO 6) :18srRNAR 5' -ATGCACCTTTTCGTTTGTTTCGGAG-3，(SEQ ID NO 7)RT-PCR 反應體系cDNA 模板，1 μ 1 ； 10 X Buffer, 2 μ 1 ； DNTP, 1. 6μ 1 ；Taq, 0. 2μ 1 ；Primers, 1 μ 1 ； ddH20,14. 2 μ 1 ；Total, 20 μ 1 ； RT-PCR 反應程序94°C，3min ； 94 °C 30s, 550C 30s, 72°C lmin，30循環；72°C 8min ;PCR產物進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測;(5)結果參看附圖2，結果顯示，GmICO基因在冷處理下表達明顯上調，冷處理12小時時，表達最高；ABA，NaCl, PEG處理GmICO變化不明顯(圖2A-D)；另外，冷處理條件下，GmICO基因在葉中表達最高，根瘤中幾乎沒有表達(圖2E)。GmICO基因的逆境及組織表達模式驗證(二)利用Pmcq-GUS染色技術對GmICO 基因的逆境表達模式進行分析驗證(1)、GmTC Fl啟動子的克隆根據GmICO基因的啟動子序列(TAG上遊取1990bp， 參看SEQ ID NO 3)設計引物對，根據載體PCAMBIA1391多克隆位點，引物末端分別引入I^st I和BamH I酶切識別位點，以CTAB法提取的大豆測序品種Williams82的DNA為模板，PCR 擴增 GmICO基因的啟動子；其中，引物序列為GmIC0ProF 5，-AACTGCAGCTGTCTCTGCTGTAAAT CGC-3'(SEQ ID NO 8) ；GmICOProR 5『-CGGGATCCTCCCACATTCAATTCCAAA GG-3，(SEQ ID N0: 9) ；PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，採用上海生工膠回收試劑盒回收純化2Kb左右的條帶；連T載體(pMD19-T，Takara)，挑陽性克隆，搖菌(37°C，200轉/分)，上海生工測序；O)、重組表達載體的構建①用上海生工質粒提取試劑盒提取含有GmICO基因 Promoter序列的T載體質粒，用限制性內切酶I3St I和BamH I (Takara)酶切，回收酶切產
6物；②用限制性內切酶I3St I和BamH I酶切空載體pCAMBIA1391，回收載體骨架；③、用T4 連接酶將步驟1的酶切產物和步驟2的載體骨架連接；④、將步驟3的連接產物熱激轉化感受態DH5ci菌株，37°C過夜培養，挑取陽性克隆進行測序；測序結果表明，得到了重組質粒 pCAMBIAl391-Pcmico-GUS ；(3)、轉基因植物的獲得(一 )、用重組質粒 pCAMBIAl391-PaniarGUS 轉化農桿菌 GV3101①取出凍存的200 μ 1感受態細胞的Eppendorf管，融化後加入5-10 μ 1質粒DNA， 輕彈管壁混勻，冰上放20-30min ；②將Eppendorf管放入液氮中5min ；③取出，將管轉入37 °C熱擊5min後，加入Iml YEP液體培養基，觀°C低速振蕩 (150r/min)4h ；④10，000r/min, 30sec,去上清，加100 μ 1 YEP液體培養基，懸浮菌體後塗YEP固體平板(含50mg/ml卡那黴素，50mg/ml利福平)；⑤倒置培養皿培養至轉化子長出，菌落PCR鑑定出的陽性克隆用於擬南芥植物的轉化；( 二)、利用農桿菌介導的蘸花法轉化擬南芥①挑取陽性克隆於含抗生素的YEP培養基中，28°C活化1_2天；②按1 100比例接入IOOml YEP培養基中，加入乙醯丁香酮(終濃度100 μ g/ ml)，振蕩培養至0D600為1. 5-2. O ；③離心5，000r/min, 6min (室溫)收集菌體，棄上清；④將菌體懸浮於轉化介質O. 2g/L Ms salt，50g/L蔗糖，MES 0.5g/L，6_BA 10μ g/L,pH 5. 7)中，使0D600為0. 8，倒在平皿裡，加入14% Silwet L-77，準備植物轉化；⑤培養室裡生長3到4周的擬南芥，剪去植株上已經盛開的花，將培養缽小心地倒扣於盛有轉化介質的平皿裡；⑥使轉化介質浸沒植株花苞，並保持搖動30SeC ；⑦將蘸花完畢的培養缽取出保溼側放，暗培養24h後，按正常條件培養至種子成熟，收集種子進行純合系的篩選；⑧卡那抗性篩選陽性植株，經過三代篩選得到純合的擬南芥轉化植株；、⑶S染色將轉基因擬南芥4°C處理處理12小時，然後進行⑶S染色，同時將沒有冷處理的轉基因擬南芥和野生擬南芥染色，作為對照；參看圖3，結果顯示在冷處理條件下GmICO基因的啟動子能更多的啟動GUS基因的表達。實施例1 利用GmICO基因培育轉基因耐寒植物(1)、GmICO基因的克隆根據GmICO基因的序列設計引物對，根據載體Superl300的多克隆位點，引物末端分別引入)(ba I和Kpn I酶切識別位點，以大豆測序品種Williams82的cDNA為模板進行 PCR，擴增 GmICO基因；其中引物序列為GmIC0F 5，-GCTCTAGAATGGCCATGAATAATGGCG-3，(SE Q ID NO 10) ；GmICOR :5，-GGGGTACCTCAAGTGTGGGACTCGGC-3，(SEQ ID NO 11) ；PCR 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，採用上海生工膠回收試劑盒回收純化1. 4Kb左右的條帶；連T 載體(pMD19-T，Takara)，挑陽性克隆，搖菌(37°C，200轉/分)，上海生工測序；
O)、重組表達載體的構建①、用上海生工質粒提取試劑盒提取含有GmICO基因序列的T載體質粒，用限制性內切酶Xba I和Kpn I (Takara)酶切，回收酶切產物；②、用限制性內切酶)(ba I和Kpn I酶切空載體SUPER1300，回收載體骨架；③、用T4連接酶(Taraka)將步驟①的酶切產物和步驟②的載體骨架連接；④、將步驟③的連接產物熱激轉化感受態DH5 α菌株，37°C過夜培養，挑取陽性克隆進行測序；測序結果表明，得到了重組質粒SUPER1300-35S-GmIC0 ；(3)、轉基因植物的獲得用重組質粒SUPER1300-35S-GmIC0轉化農桿菌GV3101，利用農桿菌介導的蘸花法轉化擬南芥，篩選陽性植株，經過三代篩選得到純合的擬南芥轉化植株；0)、轉基因植物的PCR鑑定提取轉基因株系RNA，同時提取野生型植株的RNA為對照，反轉錄成cDNA，PCR檢測轉化結果，參看附圖4A;(5)、轉基因植物的耐寒性鑑定種植T3代轉基因株系，同時種植野生型為對照，生長3周後4°C冷馴化一周，然後-8°C處理2. 5小時，統計，比較成活率；參看附圖4B，結果顯示，野生型成活率為42%，轉基因株系T3-14-4成活率為69%，T3-17-3成活率為74% ；說明利用本發明的基因能夠培育出具有高抗寒性的轉基因作物。實施例2 利用GmICO基因培育轉基因耐寒植物，其方法與實施例1的不同之處在於以pE^ (K) LC為空載體構建重組表達載體，將目的基因插入到pE^ (K) LC的限制性內切酶Kpn I和BamH I酶切識別位點之間，得到重組表達載體；其中，pEZR(K)LC與實施例1的 SUPER1300 —樣，都是含有增強型啟動子(35S)的空載體。上述描述僅作為本發明可實施的技術方案提出，不作為對其技術方案本身的單一限制條件。
權利要求
1.一種培育轉基因耐寒植物的方法，其特徵在於使序列表中SEQ ID NO :1所示蛋白質的編碼基因在植物體內過表達，獲得與正常植物相比具有高耐寒性的轉基因植物。
2.根據權利要求1所述的培育轉基因耐寒植物的方法，其特徵在於使序列表中SEQ ID NO :2所示的基因在植物體內過表達，獲得與正常植物相比具有高耐寒性的轉基因植物。
3.根據權利要求2所述的培育轉基因耐寒植物的方法，其特徵在於首先構建含有SEQ ID NO :2所示基因的重組表達載體，然後利用此重組表達載體構建轉化體，再利用此轉化體侵染目的植物，篩選陽性植株，獲得與正常植物相比具有高耐寒性的轉基因植物。
4.根據權利要求3所述的培育轉基因耐寒植物的方法，其特徵在於以SUPER1300為載體構建重組表達載體。
5.根據權利要求4所述的培育轉基因耐寒植物的方法，其特徵在於將目的基因插入到SUPER1300的限制性內切酶)(ba I和Kpn I酶切識別位點之間，得到重組表達載體，命名為 SUPER1300-35S-GmIC0。
6.根據權利要求3所述的培育轉基因耐寒植物的方法，其特徵在於以pES (K)LC為載體構建重組表達載體。
7.根據權利要求6所述的培育轉基因耐寒植物的方法，其特徵在於將目的基因插入到pESUK)LC的限制性內切酶Kpn I和BamH I酶切識別位點之間，得到重組表達載體，命名為 pEZR(K) LC-35S-GFP-GmIC0。
8.根據權利要求3所述的培育轉基因耐寒植物的方法，其特徵在於利用重組表達載體轉化農桿菌GV3101獲得轉化體，然後再利用農桿菌介導的蘸花法轉化目的植物，篩選陽性植株，經過三代篩選得到純合的與正常植物相比具有高耐寒性的轉基因植物。
9.根據權利要求1 8任一項所述的培育轉基因耐寒植物的方法，其特徵在於所述目的植物為大豆。
全文摘要
本發明公開了一種培育轉基因耐寒植物的方法，首先構建含有SEQ ID NO2所示基因的重組表達載體，然後利用此重組表達載體構建轉化體，再利用此轉化體侵染目的植物，篩選陽性植株，獲得與正常植物相比具有高耐寒性的轉基因植物。
文檔編號C12N15/82GK102226190SQ20111015478
公開日2011年10月26日 申請日期2011年6月10日 優先權日2011年6月10日
發明者李霞, 董章輝 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所