重組人幹擾素樣蛋白的製作方法

2023-09-19 23:15:25 2

專利名稱：重組人幹擾素樣蛋白的製作方法
技術領域：
本申請涉及具有人幹擾素樣生物學活性的重組蛋白。背景在本申請中採用在Na ture(l)中公布的幹擾素(IFN)術語。人幹擾素(HuIFN)由Isaacs和Lindenmann在1957年發現O)，其是一個熟知的細胞因子家族，所述細胞因子由各種真核細胞在暴露於各種不同刺激如病毒感染或者接觸促細胞分裂原後分泌。IFN可以引起細胞行為的多種變化，包括影響細胞的生長和分化以及調節免疫系統(3-7)。HuIFN 分為 6 個亞型，即 IFN- α，IFN- β，IFN- γ，IFN- ω，IFN- ε 和 IFN-k。HuIFN-α (白細胞衍生的幹擾素)在人白細胞中產生，而少量HuIFN-β (成纖維細胞衍生的幹擾素)在類淋巴母細胞中產生。HuIFN根據其化學和生物學特徵進一步分為兩大類型，即類型I和類型II。類型I包括IFN-a和IFN-β亞型以及最近發現的IFN-ω， IFN- ε和IFN- κ亞型。類型II只有一個成員IFN_ y (免疫幹擾素)。不同的幹擾素亞型具有不同的結構和生物學特徵。HuIFN-β是N-聯糖蛋白(8， 9)，其已被純化至具有均一性並進行了表徵。其大小是不均一的，可能是由於它的糖部分。 但是，只存在一個人IFN-β基因，其編碼含166個胺基酸的蛋白質。IFN-β與IFN-α的同源性低，共享大約30-40%的同一性。與IFN-β基因的單一性不同，HuIFN-α是由大體上14個基因的多基因家族組成的亞型。由一個或兩個胺基酸差異形成的小變體說明了復等位基因的存在(10)。除了假基因IFNAP22以外，存在13個基因，其編碼13種蛋白質。每種蛋白質由165-166個胺基酸組成。IFNA13基因所編碼的蛋白質與IFNAl蛋白相同。因此，存在12種不同的幹擾素-a 蛋白IFNAl、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNAlO, IFNA14、IFNA16、IFNA17 和IFNA21。IFN-a亞型之間的胺基酸序列同一性通常為80-85% (11)。成熟的IFN-ω與IFN-α種類的家族顯示出60%的核苷酸序列同源性，但其C-末端長了 6個胺基酸。IFN-ω與幹擾素-β的相關性更遠(共享大約30%的序列同源性)。 人IFN-ω沒有歸類到IFN-a組，這是因為它在抗原性方面與IFN-α不同，以及在其與I 型IFN-a受體的相互作用方面不同(12)。IFN-ω由感染了病毒的白細胞分泌，作為人白細胞幹擾素的主要組分。成熟的人IFN-ε蛋白含有185個胺基酸，分別與IFN-a 2和IFN-β共享大約33 % 和37%的序列同源性(13，14)。IFN- ε的功能和生物物理學特性還沒有得到有效的詳細表徵；但是，它像I型幹擾素一樣發揮作用。IFN-ε也可能在生殖功能上發揮作用(15)。IFN- K是含180個胺基酸的人細胞因子，其是一種最近鑑定的I型IFN。IFN- κ 的編碼序列與在人中發現的其他I型幹擾素具有 30%的同一性。IFN-k的一個區別性特徵是在未誘導的細胞特別是角質形成細胞中其轉錄物的可檢測的組成性表達。IFN-k可能通過影響先天免疫系統的細胞而在調節全身或局部免疫功能中發揮作用(16)。但是， IFN-K表現出低的抗病毒活性(17)。人I型幹擾素看來似乎結合2個受體亞基，即IFNAR-I和_2，它們廣泛分布在各種細胞類型的細胞表面。配基的參與誘導了分別耦聯至IFNAR-I和-2的酪氨酸激酶 Κ2和 JAK-I的磷酸化。一旦發生磷酸化，STAT蛋白就從受體上釋放出來並形成同源二聚體和異源二聚體(18，19)。釋放後，STATA的二聚體結合幹擾素應答因子9(IRF-9)(其是一種DNA 結合蛋白)，從而形成稱作IFN刺激的基因因子-3(ISGF-3)的複合物，其遷移入細胞核中。 接著，ISGF-3複合物與在所有IFN可誘導的基因的上遊存在的一個DNA元件相結合。這就是所謂的「經典的」信號轉導途徑。目前不斷發現了受I型IFN調控的新的作用方式和生化途徑。例如，在所述信號轉導途徑中PII的下遊，核因子K -B (NF- K B)和PKC-d與在用IFN- β孵育的嗜中性粒細胞中觀察到的抗凋亡效應相關00)。超過300個基因(稱作幹擾素誘導的基因)對IFN處理起反應。研究最多的IFN 蛋白是具有抗病毒特性的那些。例如，2，5寡腺苷酸合成酶家族的酶(0AS-1和- 催化合成短的寡腺苷酸，其結合併活化RNAseL (為一種切割病毒和細胞RNA的酶)，從而抑制蛋白質的合成。經DsRNA活化的蛋白激酶(H(R)使翻譯抑制因子eIF^i磷酸化，還可導致病毒和細胞蛋白質合成的抑制。最近，還發現PKR是活化轉錄因子NF-K B所必需的，NF-K B是在炎性細胞因子誘導、免疫調節和凋亡中的中心作用物。Mx (粘病毒抗性)蛋白通過阻止細胞內病毒顆粒的轉運或者病毒RNA的轉錄來抑制RNA病毒的複製。RNA-特異的腺苷脫氨酶 (ADAR)將腺苷轉化成肌苷，從而造成病毒RNA基因組的超變01)。HuIFN具有廣譜的生物學活性，包括抗病毒、抗腫瘤以及免疫調節功能。已經廣泛研究了人幹擾素的臨床潛能，並總結在下面。在抗腫瘤應用方面，HuIFN可能通過調控免疫調節和抗血管生成應答而間接地或通過影響腫瘤細胞的增殖或細胞分化而直接地介導抗腫瘤效應0幻。幹擾素療法已經用於治療各種白血病(23)，例如多毛細胞白血病(M)、急性和慢性髓細胞白血病05-27)、骨肉瘤( )、基底細胞癌( )、神經膠質瘤(30)、腎細胞癌(31)、多發性骨髓瘤(32)、黑色素瘤(33)、卡波西肉瘤03)和何杰金氏病(34)。對於IFN-α與阿糖胞苷(ara-C)、5_FU、羥基脲(hydroxyura)以及IL_2的聯合治療進行了徹底研究，多數都表現出顯著好於單獨的 HuIFN-α的結果(3)。聯合HuIFN和替莫唑胺來協同治療晚期癌症也已經被報導(35)。在抗病毒應用方面，HuIFN已經在臨床上用於抗病毒療法，例如，治療AIDS (36)， 病毒性肝炎包括慢性B型肝炎、C型肝炎(37，38)，乳頭瘤病毒感染(39)，皰疹病毒感染 (40)，病毒性腦炎，以及預防鼻炎和呼吸道感染GO)。HuIFN也已經在臨床上用於抗菌療法02)，例如，霧化的HuIFN- γ (43)和 HuIFN- α已經用於多藥耐性肺結核患者04)。HuIFN-γ已經用於治療多藥耐性腦結核 05)。HuIFN也已經在臨床上用於免疫調節療法，例如，預防移植物抗宿主的排斥反應， 或減緩自身免疫疾病例如多發性硬化症G6，47)和斯耶格倫症候群G8)的進展。IFN-β 在美國已經被FDA批准用於治療多發性硬化症。最近，已經有報導指出多發性硬化症患者的I型幹擾素和白細胞介素-2的產生減少09)。此外，使用HuIFN-α的免疫調節治療看起來在進行骨髓移植後復發的慢性髓細胞白血病(CML)患者中是一種有效療法(50)。在疫苗輔佐方面，HuIFN已經作為佐劑在臨床上用於治療黑色素瘤(51)，並且也可以在許多其他疾病的預防或治療性疫苗接種中用作佐劑或協佐劑以增強或刺激免疫反應(52)。HuIFN-C^a是第一種在臨床試驗中使用的血管生成抑制劑，其對於治療危及生命的血管瘤在兒童中是有效的(53巧4)。另一種臨床適應症是骨巨細胞瘤。Kaban等人報導了下頌骨的大的、快速生長的復發性的巨細胞瘤的顯著消退(55)。雖然HuIFN有許多重要的臨床應用，但它們也表現出顯著的副作用和其他限制。 大多數細胞因子(包括HuIFN)具有相對較短的循環半衰期，這是因為它們在體內產生從而局部且短暫地發揮作用。由於它們通常作為全身性治療劑進行施用，因此需要頻繁地並且以相對較高的劑量進行施用。頻繁的腸胃外施用既不方便又痛苦。此外，與HuIFN施用相關的毒性副作用經常很嚴重，以至於一些患者不能忍受該治療。這些副作用很可能與高劑量的全身施用相關。此外，在臨床研究中已經發現，一些患者產生針對rHuIFN的抗體，該抗體中和rHuIFN的生物學活性(56)。很明顯，多種應用(例如，抗癌療法，以及抗病毒療法、免疫療法、抗寄生蟲療法、 抗菌療法，或者任何需要幹擾素活性增強和/或副作用降低的醫療狀況或情形)都迫切需要發展新的、效力增強的幹擾素蛋白。總之，HuIFN很有可能在下一代新型抗腫瘤和抗病毒療法中發揮重要作用(10)。在現有技術中熟知，改善細胞因子藥物的藥物學性質的最有效方式是使細胞因子蛋白本身發生突變。隨著時間變化，用於突變幹擾素肽的多種策略和技術得到發展。一般來說，目前有3種策略可用於產生HuIFN-α突變體。第一種策略是製備IFN雜合體。一些研究者已經利用IFN編碼序列中具有天然存在的限制性內切酶(RE)酶切位點這一點來連接同源編碼片段(57，58)。Horisberger和 DiMarco已經對許多雜合體IFN的產生進行了綜述(11)；該文章提供了構建此類分子的過程的概覽。描述了用於構建雜合體幹擾素的方法的具體實例。一些研究者已經利用PCR擴增來構建突變型IFN-α，從而產生有特殊需要的核苷酸片段，進而獲得將不同IFN的新片段進行連接的可能性(59)。美國專利6，685，933 (60)還描述了製備人IFN雜合體的PCR擴增技術。所述幹擾素雜合體可以在一種幹擾素亞型中產生，例如美國專利5，137，720(61) 和美國專利6，685，933 (60)所描述的，或者在至少2種不同的幹擾素類別組之間產生，例如美國專利6174996(62)和美國專利6，685，933 (60)所描述的。此外，雜合體的親本基因可以來自一個物種(主要來自人)，例如HuIFN-α和HuIFN-ω之間的雜合體，或者來自超過一個的動物物種，例如人和鼠幹擾素-α之間的雜合體(63)。第二種構建幹擾素突變體的策略是利用位點定向點誘變，其通過在IFN的DNA分子中引入一個或多個核苷酸的變化(64)。最近，將系統突變和計算機方法用作蛋白質誘變的指導(65)。第三種構建I型HuIFN的策略是將通過RE消化、PCR擴增、化學合成或DNA酶消化獲得的IFN基因片段進行改組，隨後進行PCR以將所述片段進行隨機連接，接著進行擴增。 得到的PCR產物事實上是重排的幹擾素α基因片段的庫，其可用於構建DNA庫，從中可以分離出具有所需表型的DNA克隆(66)。例如，Chang等人已經描述了一種構建和篩選HuIFN改組文庫的方法，以鑑定在小鼠細胞中抗病毒和抗增殖活性增強的HuIFN衍生物(67)。人幹擾素alfacon-1 (複合幹擾素(consensus interferon))是一種重組的非天然存在的HuIFN-α，含166個胺基酸。它是通過根據已知的經克隆的HuIFN-α序列來評估每段相應區域中最高度保守的胺基酸而產生的。在胺基酸水平上，它與HuIFN-α 2b具有 89%的序列同源性，和其特異性抗病毒活性為大約109IU/mg。人幹擾素alfacon-1已經被批准用於治療18歲或18歲以上的代償性肝病患者的慢性HCV感染(68)。儘管現有技術中已知一些重組幹擾素蛋白，但仍然需要生物學活性增強的新型幹擾素樣蛋白和蛋白質組合物。發明_既述根據本發明，公開分離的多核苷酸，其編碼具有人幹擾素樣生物學活性的蛋白質。 在一個實施方案中，所述多核苷酸包含與SEQ ID No :1至少93%同一的核苷酸序列。在其他實施方案中，所述核苷酸序列與SEQ ID No :1至少95%同一或至少98%同一。在一個實施方案中，本發明所包括的蛋白質選自其中每個蛋白質具有與SEQ ID No :2至少85%同一的胺基酸序列的蛋白質的組。優選地，所述蛋白質不是天然存在的，並且具有與人幹擾素α 2b (HuIFN-α 2b)相比而言增強的抗病毒和抗增殖活性。例如，所述蛋白質的抗病毒活性為HuIFN-α 2b的至少2倍，和抗增殖活性為HuIFN-α 2b的至少10倍。 在特定的實施方案中，蛋白質胺基酸序列與SEQ ID No :2至少90%同一或至少95%同一。本發明包括包含所述多核苷酸序列的重組載體以及包含所述載體的宿主細胞。 本發明還包括表現出人幹擾素樣生物學活性的多肽片段。本發明進一步包括表現出幹擾素樣生物學活性的蛋白質構建體和其他組合物，例如包含所述蛋白質和另一部分例如無機聚合物的綴合物。本發明進一步包括所述蛋白質和所述組合物用於治療目的的方法和用途， 例如作為抗病毒劑或抗癌劑。本發明還可用於治療其他對幹擾素療法作出響應的病狀。附圖簡述

圖1描繪了編碼本發明的新型蛋白質的完整DNA序列(SEQ ID No :1)，所述新型蛋白質在此稱為Novaferon (A)。圖1還顯示了 Novaferon的預期胺基酸序列(SEQ ID No 2) (B)，以及Novaferon胺基酸序列和Novaferon DNA序列的比對(C)。成熟Novaferon蛋白的第一個胺基酸半胱氨酸被指定為殘基1。圖 2 顯示了 Novaferon 基因和 HuIFN-α 14 基因(Genebank 編號ΝΜ_002172)的核苷酸序列比對(A)，以及Novaferon蛋白和HuIFN-α 14蛋白(從Genebank編號ΝΜ_002172 翻譯的)的胺基酸序列比對(B)。成熟Novaferon蛋白的第一個胺基酸半胱氨酸被指定為殘基1。Novaferon與HuIFN-α 14在核苷酸水平上共享大約93%的序列同一性062/498)， 和在胺基酸水平上共享大約87%的序列同一性(144/166)。不同的核苷酸用中間線中的空缺來進行標示。圖 3 顯示了 Novaferon 基因和 HuIFN- α 2b 基因(Genebank 編號NM_000605) 的核苷酸序列比對(A)，以及Novaferon蛋白和HuIFN- α沘蛋白(從Genebank編號為 NM_000605的HuIFN- α 2b基因翻譯出的)的胺基酸序列比對⑶。成熟Novaferon蛋白的第一個胺基酸半胱氨酸被指定為殘基1。Novaferon與HuIFN- α 2b在核苷酸水平上共享大約 89%的序列同一性045/498)，和在胺基酸水平上共享大約81%的序列同一性(135/166)。 不同的核苷酸用中間線中的空缺來進行標示。
圖4的圖顯示了，與HuIFN-c^b相比，Novaferon對於Daudi細胞的體外抗增殖抑制。圖5的圖顯示了，Novaferon和HuIFN-α 2b在具有人前列腺癌PC-3異種移植物的裸鼠中的體內抗腫瘤效應。圖 6 的圖顯示了，Novaferon 和 HuIFN-裸鼠中的體內抗腫瘤效應。圖 7 的圖顯示了，Novaferon 和 HuIFN-的裸鼠中的體內抗腫瘤效應。圖 8 的圖顯示了，Novaferon 和 HuIFN-的裸鼠中的體內抗腫瘤效應。圖 9 的圖顯示了，Novaferon 和 HuIFN-的裸鼠中的體內抗腫瘤效應。發明詳述在以下整個說明書中，提供了具體的細節以便更徹底地了解本發明。但是，本發明的實施可以不受這些特殊說明的限制。在其他情況下，沒有顯示或詳細描述眾所周知的元素以避免不必要地使得本發明含糊不清。相應地，本說明書和附圖應當被認為具有舉例說明性的而不是限制性的意義。術語的定義在詳細描述本發明以前，應當了解本發明不限於所述的特定蛋白質分子、方法、操作規程、細胞系、載體和試劑，因為都可以改變。還應當了解，在此使用的術語只在於描述特定的實施方案，而不希望限制本發明的範圍，本發明的範圍僅由所附的權利要求書來限定。為了更完全地了解在此描述的本發明，採用以下術語，它們的定義如下所示。應當了解，在此使用的術語只在於描述特定的實施方案，而不希望限制本發明的範圍，本發明的範圍僅由所附的權利要求書來限定。除非另外定義，在此使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同的含義。所有在此提及的出版物引入本文作為參考，以用於描述和公開在所述出版物中所報導的細胞系、載體和方法，其可用於本發明。在此沒有任何事物可被認為承認了，本發明沒有位於依據在前發明的此類公開內容之前的權利。術語「幹擾素」指由多種真核細胞在暴露於各種不同的環境刺激(包括病毒感染或者接觸促細胞分裂原)後產生的分泌型蛋白質家族。除了具有抗病毒特性以外，幹擾素還顯示出影響多種細胞功能。所有在此表述的幹擾素單位都參考WHO國際標準，94/786(複合 rHuIFN-α (rHuIFN-α consensus))禾口 95/650(rHuIFN-α 2a)。術語「幹擾素樣」指由已知幹擾素或幹擾素類似物所表現的功能和/或結構特徵或與其相似的功能和/或結構特徵。例如，「幹擾素樣生物學活性」包括抗病毒和抗增殖活性。幹擾素樣生物學活性的其他例子在此處進行了描述，並且會被本領域技術人員所理解。 術語「活性」複數形式包括單數形式；即，本發明包括表現出至少一種幹擾素樣活性的重組蛋白或其他蛋白質構建體或組合物。 術語「複合幹擾素(consensus interferon) 」指一種類型的合成幹擾素，其的胺基酸序列是所有已知人α幹擾素亞型的大致平均的序列。已經報導了，複合幹擾素具有比任
α 2b在具有人肝癌H印G2異種移植物的 α 2b在具有人黑色素瘤A-375異種移植物 α 2b在具有結腸癌細胞LS180異種移植物 α 2b在具有人白血病HL60 (S)異種移植物何天然人IFN- α亞型更好(約5倍)的抗病毒、抗增殖和激活NK細胞的活性。在此使用的術語「分離的」指已經離開其天然環境的分子，例如DNA或RNA。例如， 根據本發明的目的，包含在載體中的重組DNA分子被認為是分離的。分離的DNA分子的進一步例子包括在異源宿主細胞中維持的重組DNA分子或在溶液中的(部分或基本上)純化的DNA分子。「分離的"DNA還包括，從含有天然或人工目的DNA片段的文庫中回收的DNA分子以及化學合成的核酸。因此，分離的核酸可以重組產生。術語「核苷酸序列」指包括寡核苷酸、多核苷酸或核苷酸分子及其片段或部分的一連串核苷酸。在DNA分子的情況下，所述序列可以包含一系列脫氧核糖核苷酸，而在RNA 分子的情況下，所述序列可以包含相應的一系列核糖核苷酸。寡核苷酸、多核苷酸或核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，而核苷酸序列可以代表正義鏈或反義鏈。術語「寡核苷酸片段」或「多核苷酸片段」、「部分」、或「區段」或「探針」或「引物」 可互換使用，其是指長度為至少大約5個核苷酸的一連串核苷酸殘基。優選地，所述片段可用於與靶核苷酸序列雜交。引物用作DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆轉錄酶所催化的核苷酸聚合的起始點。片段或區段可唯一地鑑定本發明的每種多核苷酸序列。優選地，所述片段包含與SEQ ID NO 1基本上相似的序列。術語「蛋白質」或「肽」或「寡肽」或「多肽」是指包含一連串胺基酸的天然存在的或合成的分子。術語「開放閱讀框」或ORF表示不含任何終止密碼子的一系列編碼胺基酸的核苷酸三聯體，並通常表示可翻譯成蛋白質的序列。術語「成熟的蛋白編碼序列」指編碼不含信號序列或前導序列的蛋白質或肽的序列。所述蛋白質可以通過在去除任何前導/信號序列的細胞內進行加工來產生。蛋白質可以合成產生，或利用僅編碼成熟蛋白質編碼序列的多核苷酸來產生。在此使用的術語「純化的」或「基本上純化的」表示所示的蛋白質以基本上不存在其他生物大分子例如其他蛋白質、多肽等等的形式存在。純化所述蛋白質，從而其組成了所存在的所示生物大分子的至少95重量％ (但水、緩衝劑和其他小分子，尤其是分子量小於 1000道爾頓的分子可以存在)。術語「重組表達媒介物或載體」指用於從DNA(RNA)序列表達蛋白質的質粒或噬菌體或病毒或載體。表達媒介物可以包含轉錄單元，所述轉錄單元包括(1)在基因表達中具有調節作用的一個或多個遺傳元件，例如啟動子或增強子，(2)結構或編碼序列，其被轉錄成mRNA並翻譯成蛋白質，以及C3)適當的轉錄起始和終止序列。希望在酵母或真核表達系統中使用的結構單元優選地包含前導序列，其使宿主細胞能夠將翻譯的蛋白質分泌到細胞外。備選地，當重組蛋白以沒有前導或轉運序列進行表達時，其可以在氨基末端包含甲硫氨酸殘基。隨後，該殘基可以或可以不從表達的重組蛋白上切割下來從而獲得最終產物。術語「基本上的相似性」涉及當與其他核苷酸或其互補鏈進行最佳比對時，與另一個核酸具有高度序列同一性的核酸或其片段。序列同一性或同源性可以用序列分析軟體例如BLASTN進行測定。如果第一個核酸與第二個核酸在進行最佳比對時顯示出至少大約 85-95%或更高的序列同一性，則認為兩者是基本上相似的。例如，為了測定兩個不同核酸之間的序列同一性或同源性，採用BLASTN程序「BLAST 2seqUences」。該程序可以通過網際網路(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi)從 National Centerfor Biotechnology Information(NCBI)獲得以供公眾使用(69)。作為非限制性實例，可以利用默認的軟體設置進行這種比較(預期=10，過濾器=預設，開放缺口 = 5，延伸缺口 =2罰分，缺口 X降低=50)。同樣，如果第一個蛋白質或多肽與第二個蛋白質或多肽在用採用默認設置的BLAST軟體(blastp)進行最佳比對和比較時顯示出至少大約85-95%或更高的序列同一性，則認為兩者是基本上相似的。作為進一步舉例說明，具有與編碼蛋白質的參考核苷酸序列至少例如95% 「同一的」核苷酸序列的多核苷酸，表示所述多核苷酸的核苷酸序列與參考序列是同一的，除了在每100個編碼所述蛋白質的所述參考核苷酸序列的核苷酸中，所述多核苷酸序列可以包含多達5個的點突變。換言之，為得到具有與參考核苷酸序列至少95%同一的核苷酸序列的多核苷酸，參考序列中多達5%的核苷酸可以被刪除或用另一核苷酸置換，或者高達參考序列總核苷酸的5%的核苷酸數目可以被插入到參考序列中。在此使用的術語「互補的」或「互補性」指多核苷酸在許可的鹽和溫度條件下通過鹼基配對的自然結合。例如，序列「A-G-T」結合至互補序列「T-C-A」。兩條單鏈分子之間的互補性可以是「部分的」，即其中只有一些核酸結合，或者，當單鏈分子之間存在全部互補性時，則可以是完全的。核酸鏈之間的互補程度對於核酸鏈之間的雜交效率和強度有顯著的影響。這對於依賴於核酸鏈之間的結合的擴增反應來說特別重要。術語「轉化」表示將DNA導入生物體從而使所述DNA能夠作為染色體外元件或者通過染色體整合進行複製。術語「轉染」指表達載體被合適的宿主細胞所吸收，而不管編碼序列實際上是否表達。術語「治療」及其語法上的等價詞以最廣泛的含義進行使用，包括治療性處理、阻止、預防和改善某些不希望的症狀或病狀。在此使用的術語「生物學活性」指在活系統中的結構、調控、生化或其他生物學功能，例如與天然或非天然存在的分子相似或同一。在此使用的術語「抗增殖」和「抗增殖的」指減慢和/或阻止細胞的生長和分裂，導致細胞總數的減少和/或在任一細胞周期階段或所有細胞周期階段中靶細胞百分比的降低。細胞靜止在某一特定的細胞周期時相時，可以進一步分為G1期(Gap 1)，S期(DNA合成)，G2期(Gap幻或11期(有絲分裂)。在此使用的術語「抗增殖活性」指蛋白質、蛋白質構建體或組合物在體外或體內抑制細胞增殖的活性，尤其是贅生性細胞如癌細胞的增殖。在此使用的術語「抗腫瘤」或「抗癌」指阻礙或阻止惡性腫瘤的形成。在此使用的 「抗腫瘤活性」或「抗癌活性」指蛋白質、蛋白質構建體或組合物在體外或體內抑制細胞增殖的活性，尤其是贅生性細胞如癌細胞的增殖。術語「 IC5tl」或「半最大抑制濃度」表示在體外抑制50 %細胞生長所需要的抑制劑例如蛋白質的濃度。在此使用的術語「抗病毒的」和「抗病毒」指在體外和/或在體內減緩和/或阻止細胞的病毒感染或者幹擾細胞內的病毒複製，導致病毒繁殖減慢或停止，或者病毒顆粒總數降低。在此使用的「抗病毒活性」表示蛋白質、蛋白構建體或組合物在體外或體內抑制病毒感染或幹擾病毒複製的活性。Novaferon 蛋白本發明涉及製備和鑑定新型人幹擾素樣蛋白，其在此稱為「Novaferon」 。正如下面所詳細描述的，根據在標準體外測試中所測量的，Novaferon蛋白表現出相比天然存在的HuIFN-α 2b而言增強的抗病毒和抗增殖生物學活性。特別地，在相同測試系統中，與 HuIFN- α 2b相比，Novaferon蛋白顯示出當在Wish-VSV系統中進行測試時抗病毒活性增加至12. 5倍，和Daudi細胞生長的抗增殖抑制提高至大約400倍。在一個實施方案中，Novaferon蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸由498個核苷酸組成，如SEQ ID No :1和圖1 (A)所示。成熟的Novaferon蛋白由166個胺基酸組成，如 SEQ ID No :2和圖I(B)所示。本發明所包括的多核苷酸和胺基酸序列及其變體在下面進一步詳細描述。為了比較，發明者對Novaferon和天然存在的HuIFN的同源性進行了研究。BLAST 檢索表明，Novaferon在核苷酸和胺基酸水平上與HuIFN-α 14均具有最高的同源性。如圖2所示，編碼Novaferon的多核苷酸序列(SEQ ID No 1)與HuIFN- α 14具有大約 93% (462/498)的同源性，而胺基酸序列與HuIFN-α 14具有大約87 % (144-166)的同源性。與最廣泛使用的人幹擾素產品HuIFN-α 2b相比，核苷酸水平上的同源性為大約89% G45/498)，而胺基酸水平上的同源性為大約81% (135/166)，如圖3所示。對於合成的IFN alfacon-1 (複合幹擾素)，Novaferon在核苷酸水平上具有大約 91%的序列同一性053/498)，而在胺基酸水平上具有大約84%的序列同一性(140/16)正如下面實驗部分所詳細描述的，多核苷酸序列(SEQ ID No :1)選自I型人幹擾素的DNA改組文庫。簡言之，Novaferon蛋白是通過用含有完整的SEQ ID No 1的多核苷酸序列的重組載體轉染宿主細胞來產生的。純化在宿主細胞系的上清液中所含有的 Novaferon蛋白，並顯示表現出人幹擾素樣生物學活性，例如抗病毒和抗增殖功能。多核苷酸和變體本發明的新型多核苷酸序列/核酸分子由498個核苷酸組成，如在圖1(SEQ ID No:l)中所示的。利用在此提供的信息例如核苷酸序列，可以通過重組表達、化學合成或者通過使用其他標準分子生物學程序例如用於DNA誘變的那些來獲得本發明的編碼 Novaferon蛋白(SEQ ID No 2)的核酸分子。除了分離的核酸分子(SEQ ID No :1)之外，本發明還包括其序列不同於SEQ ID No :1中所示DNA序列的DNA分子，但由於遺傳密碼的簡併性，仍編碼與Novaferon蛋白(SEQ ID Nod)相同或基本上相同的胺基酸序列。遺傳密碼和物種特異的密碼子偏愛在本領域中是已知的。因此，對於本領域技術人員來說常規的是，產生不同於SEQ IDNo :1的DNA序列的DNA序列簡併變體，以便例如對於特定宿主優化密碼子表達(例如，將人mRNA的密碼子變成細菌宿主如大腸桿菌(E. coli)偏愛的密碼子)。本發明進一步提供了具有圖1 (SEQ ID No 1)所示核苷酸序列的分離的核苷酸分子，或具有與SEQ ID No :1的核酸序列互補的序列的核酸分子。本發明還提供了相關信息， 並涉及包含本發明的分離的核酸分子的重組載體，和涉及含有所述重組載體的宿主細胞， 以及涉及製備此類載體和形成表達Novaferon蛋白的宿主細胞以及利用所述宿主細胞來通過重組技術產生Novaferon的方法。根據本發明的核酸序列(SEQ ID No :1，圖1㈧)，本發明包括與其基本上相似的核酸分子，例如，當進行最佳比對時與SEQ ID No :1具有至少大約85-95%或更高的序列同一性的核酸。例如，在一個方面，與SEQ ID No :1所示核苷酸序列具有大約93^^95%,96^^97^^98%或99%序列同一性的核酸在本發明的範圍之內，無論其是否編碼具有相似於Novaferon的生物學活性的蛋白質或多肽(此類活性包括但不限於，相比HuIFN而言增強的抗病毒、抗增殖和抗腫瘤功能)。此類核酸分子例如可用作用於檢測細胞內的mRNA的探針，所述細胞已經用包含本發明核苷酸序列的載體轉染以產生Novaferon。換言之，這些與SEQ ID No :1所示序列至少大約93%、95%、96%、97%、98%或99%同一的核酸序列可用作用於測定宿主細胞中異源基因的表達的標記。此外，本發明包括多核苷酸，其包含SEQ ID No 1的至少大約30個連續核苷酸，優選地至少大約50個連續核苷酸的任何部分。更一般地，本發明包括和涵蓋了，與圖1(SEQ ID No 1)所示核苷酸序列的部分序列同一的任何及所有分離的核酸分子的片段。在一個實施方案中，這些片段的長度為至少大約15個核苷酸，並可用作在此所討論的診斷探針和引物。此外，本發明包括和涵蓋了更大的片段，其長度為大約50個核苷酸或更長。除了 SEQ ID No 1中所示的編碼Novaferon蛋白的核酸序列之外，本發明還包括但不限於編碼完整Novaferon蛋白的胺基酸序列以及額外的胺基酸/肽/多肽例如所添加的分泌前導序列的核酸序列。本發明還包括這樣的核酸序列，其具有SEQ ID No :1中所示的核酸序列，以及另外的非編碼序列，例如包括但不限於內含子以及5'和3'非編碼序列例如轉錄的但不翻譯的序列(它們在轉錄、mRNA加工(即剪接和多腺苷酸化信號、核糖體結合和穩定mRNA)中發揮作用)，和編碼有或無功能的另外胺基酸的另外的編碼序列。本發明進一步涉及本發明核苷酸分子(SEQ ID No 1)的變體，其編碼Novaferon 蛋白的部分、類似物或衍生物。可通過篩選幹擾素改組文庫或者利用誘變技術或/和其他本領域中所描述的已知技術來獲得變體。如上所說明的，此類變體可包括通過核苷酸插入、缺失或置換而產生的那些。插入、缺失或置換可牽涉一個或多個核苷酸。這些突變可發生在參考核苷酸序列的5'或3' 末端位置或那些末端位置之間的任何地方，單獨地散布在參考序列的核苷酸中，或散布在參考序列內的一個或多個連續組中。所述變化可產生保守或非保守的胺基酸置換、缺失或添加。在這些之中尤其優選的是沉默置換、添加和/或缺失，其不改變Novaferon蛋白或其部分的性質和活性。在這方面也尤其優選的是保守置換。本發明還提供了分離的核酸分子，其包含具有與選自下列的多核苷酸至少93%同一的，更優選地至少大約95 %、96 %、97 %、98 %或99 %同一的核苷酸序列的多核苷酸(a) 編碼具有SEQ ID No 2中的完整胺基酸序列(即SEQ ID No 2的1-166位)的Novaferon 蛋白的核苷酸序列；和(b)編碼(a)的蛋白質的生物學活性片段的核苷酸序列；和(c)與上面(a)或(b)中任一核苷酸序列互補的核苷酸序列。由於遺傳密碼的簡併性，本領域普通技術人員將會馬上認識到，大量其序列與圖1 所示核酸序列(SEQ ID No 1)至少大約93%、95%、96%、97%、98%或99%同一的核酸分子將編碼具有與Novaferon蛋白相似或相同活性的蛋白質。實際上，由於簡併變體都編碼相同蛋白質，這對於本領域技術人員來說是清楚的，即使沒有進行比較測定法。在本領域中將進一步認識到，對於不是簡併變體的此類核酸分子，也有相當數目將編碼具有幹擾素樣生物學活性的蛋白質。這是因為本領域技術人員完全知道較不可能或不可能顯著影響蛋白質功能的胺基酸置換(例如，用另一個脂肪族胺基酸置換一個脂肪族胺基酸)，如下面所進一步描述的。例如，Bowie等人(70)提供了關於如何進行表型沉默胺基酸置換的指導，其中作者指出許多蛋白質都耐受胺基酸置換。蛋白和多肽變體和構津體本發明包括SEQ ID No :2的Novaferon蛋白以及與其基本上相似的蛋白質或多肽，例如與SEQ ID No :2具有至少大約85-95%或更高的胺基酸序列同一性的非天然存在的蛋白質。例如，與SEQ ID No :2所示胺基酸序列具有至少大約85^^90^^95^^96%, 97%,98%或99%序列同一性的非天然存在的蛋白質在本發明範圍之內。此外，為了增強其功能和性質，本發明的Novaferon蛋白可通過將其融合至其他蛋白質或蛋白質片段或其他分子來進行結構修飾。例子包括但不限於將其融合至其他蛋白質/蛋白質片段以增加其表達或進一步穩定Novaferon蛋白。在一個實施方案中，本發明的編碼Novaferon的核酸序列和/或Novaferon蛋白可利用除支架以外的標記物進行標記。此處，「經標記的」表示核酸序列(SEQ ID No:l)或 Novaferon蛋白(SEQ ID No 2)的化合物已附著有至少一種元素、同位素或其他化學物質 (標記物)以使得能夠檢測所述化合物。一般而言，標記物分為三類a)同位素標記物，其可以是放射性同位素或重同位素；b)免疫標記物，其可以是抗體或抗原；和c)有色或螢光染料。標記物可以摻入到所述化合物的任何位置。一旦製得，Novaferon蛋白還可以進行共價修飾。共價修飾的一種類型包括用能夠與Novaferon蛋白的所選側鏈或者N-或C-末端殘基進行反應的有機衍生化劑 (derivatizing agent)處理Novaferon蛋白。用雙功能試劑進行衍生化可用於例如將 Novaferon蛋白與水不溶性支持基質或表面交聯，以用於純化抗Novaferon抗體或篩選測定法。通常使用的交聯劑包括1，1_雙(重氮乙醯基)-2-苯基乙烷，戊二醛，N-羥基琥珀醯亞胺酯(例如，與4-疊氮基水楊酸形成的酯)，同基雙功能亞氨酸酯，包括二琥珀醯亞氨基酯例如3，3』 - 二硫代雙(琥珀醯亞氨基丙酸酯)，雙功能馬來醯亞胺例如二 -N-馬來醯亞胺基-1，8-辛烷，以及諸如甲基-3-[ (ρ-疊氮基苯基)聯硫基]propioimidate的試劑。Novaferon蛋白的其他修飾包括穀氨醯胺醯和天冬醯胺醯殘基分別脫醯氨成穀氨醯和天冬氨醯殘基；脯氨酸和賴氨酸的羥基化；絲氨醯和蘇氨醯殘基的羥基的磷酸化； 賴氨酸、精氨酸和組氨酸側鏈的氨基的甲基化(71)；將N-末端胺的乙醯化；和將任何C-末端羧基的醯胺化。本發明Novaferon蛋白的另一種類型的共價修飾包括改變所述蛋白質的天然的糖基化模式。這例如可以通過以下方式達到(1)刪除和/或添加一個或多個在Novaferon 蛋白的天然序列中發現的糖部分，或者( 添加和/或刪除一個或多個在Novaferon蛋白的天然序列中不存在的糖基化位點。向Novaferon蛋白添加糖基化位點可通過改變Novaferon蛋白的胺基酸序列來完成。例如，通過在Novaferon蛋白的天然序列中添加或置換為一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來達到這種改變(對於0-聯糖基化位點)。Novaferon蛋白的胺基酸序列的改變可通過DNA水平上的變化來達到，特別是通過在預選擇的核苷酸鹼基處突變編碼Novaferon蛋白的DNA序列，從而改變的密碼子可以翻譯成所需的胺基酸。增加Novaferon蛋白中糖部分的數目的另一種方式是將糖苷通過化學或酶促的方式偶聯到所述蛋白質上。此類方法在現有技術中已有描述，例如，早在1981年，Aplin JD JC Jr已經描述了蛋白質和脂質的糖綴合物的製備、性質和應用(72)。去除Novaferon蛋白中存在的糖部分可通過化學或酶促的方式來完成，或者通過突變置換編碼用作糖基化靶標的胺基酸殘基的密碼子來完成。化學去糖基化技術在現有技術中是已知的，並例如由Edge AS等人(73)進行了描述。對多肽上的糖部分的酶促切割可以通過使用多種內切和外切糖苷酶來達到，如Thotakura等人所描述的(74)。此類衍生的構建體可包括改善溶解性、吸收、穿過血腦屏障的滲透性、生物學半衰期等的部分。Novaferon蛋白的此類部分或修飾可二者擇一地清除或減弱所述蛋白質的任何可能的不希望的副作用等等。已經公開了能夠介導此類效應的部分，例如在Remington The Science and Practice of Pharmacy (75)中。Novaferon的另一種類型的共價修飾包括，例如以U. S. Pat. Nos. 4，640，835 (76) ；4，496，689 (77) ；4，791，192 (78)或 4，179，337 (79)中所示的方式，將 Novaferon蛋白連接至各種非蛋白質聚合物之一上，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。此外，還可修飾本發明的Novaferon蛋白，以形成包含融合至另一個異源多肽或胺基酸序列的Novaferon蛋白的嵌合分子。在一個實施方案中，這樣的嵌合分子包含 Novaferon蛋白與標籤多肽的融合化合物，所述標籤多肽提供抗標籤抗體能夠選擇性地結合的表位。該表位標籤通常位於Novaferon蛋白的氨基或羧基末端。Novaferon蛋白的此類加有表位標籤的形式的存在可以用抗該標籤多肽的抗體進行檢測。此外，表位標籤的提供使得Novaferon蛋白能夠容易地通過親和純化進行純化，所述親和純化使用抗標籤抗體或與所述表位標籤結合的另一類型的親和基質。在一個備選的實施方案中，所述嵌合分子可包含Novaferon蛋白與免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定區域/片段的的融合化合物。例如，為了形成二價形式的嵌合分子，可將Novaferon蛋白融合至IgG分子的Fc區。多種標籤多肽和它們各自的抗體在現有技術中是熟知的。例子包括聚組氨酸 (poly-his)或聚-組氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)標籤；flu HA標籤多肽及其抗體 12CA5(80) ；c-myc標籤及針對其的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗體(81)；以及單純皰疹病毒糖蛋白D(gD)標籤及其抗體(8 。其他標籤多肽包括Flag-肽(8 ；微管蛋白表位肽 (84)；和T7基因10蛋白肽標籤(85)。此外，本發明的Novaferon蛋白可通過本領域普通技術人員已知的化學合成程序來產生。例如，在商購可得的433A型號肽合成儀(Applied Biosystems, Inc.，Foster City, CA US)上可產生長度為高達大約80-90個胺基酸殘基的多肽。此外，高達120個殘基的更長的化學合成的肽也是商購可得的，例如，從Bio-synthesis，Inc. Lewisville, TX USA獲得。因此，很容易理解，全長的成熟Novaferon蛋白能夠合成產生(例如，先合成片段，然後將所述片段連接在一起)。因此，本發明的Novaferon蛋白(SEQ ID No 2)包括所有具有與SEQ ID No 2所示胺基酸序列相同的胺基酸序列的蛋白質和多肽製備物和構建體，無論這些Novaferon蛋白和蛋白質衍生物是否是通過化學合成程序產生，和/或通過重組技術從原核或真核宿主細胞或其他細胞和宿主(包括但不限於細菌、酵母、植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。 根據重組產生方法中所採用的宿主，本發明的蛋白質可以是糖基化或非糖基化的、PEG化或非PEG化的。此外，本發明的蛋白質還可包括起始的經修飾的甲硫氨酸殘基，在某些情況下這是宿主介導的加工的結果。因此，現有技術中熟知，由翻譯起始密碼子編碼的N-末端甲硫氨酸通常在所有真核細胞中於翻譯後從任何蛋白上被高效去除。在大多數原核生物中， 大多數蛋白質的N-末端甲硫氨酸也被有效去除，而對於某些蛋白質，這種原核去除過程是無效的，這依賴於N-末端甲硫氨酸所共價連接的胺基酸的性質。產牛本發明還涉及包含本發明的分離的DNA分子的重組載體，用所述重組載體進行遺傳工程改造/轉染的宿主細胞，以及通過重組技術產生Novaferon蛋白或其片段。載體可以是，例如，質粒、噬菌體、病毒或逆轉錄病毒載體。逆轉錄病毒載體可以是能夠複製的或複製缺陷的。在後一種情況下，病毒繁殖通常只發生在補充性宿主細胞中。詳細描述Novaferon 產生的例子如下。用於表達本發明的Novaferon蛋白的優選載體包括但不限於，包含有效連接至待表達的多核苷酸的順式作用調控區的載體，所述順式作用調控區對於在宿主中的表達是有效的。合適的反式作用因子由宿主提供，由補充性載體提供，或在導入宿主後由所述載體本身提供。本發明所公開的核酸序列(SEQ ID No:l)可以有效連接至合適的啟動子。此處 「啟動子」表示能夠結合RNA聚合酶並起始Novaferon蛋白的編碼序列的外顯子(通常在下遊(3'))轉錄從而轉錄成mRNA的任何核酸序列。細菌啟動子具有通常接近編碼序列的 5'末端的轉錄起始區。該轉錄起始區通常包括RNA聚合酶結合位點和轉錄起始位點。編碼代謝途徑酶的序列可提供特別有用的啟動子序列。例子包括源自糖代謝酶例如半乳糖、乳糖和麥芽糖代謝酶的啟動子序列，以及源自生物合成酶例如色氨酸合成酶的序列。還可以利用來自噬菌體的啟動子，這些啟動子在本領域中是已知的。此外，合成啟動子和雜合啟動子也是有用的；例如，tac啟動子是trp和Iac啟動子序列的雜合體。此外，細菌啟動子可包括天然存在的非細菌來源的啟動子，其具有結合細菌RNA聚合酶並起始轉錄的能力。優選的細菌啟動子包括但不限於，大腸桿菌laci、trp、phoA和IacZ啟動子，T3和T7啟動子， gpt啟動子，λ PR、PL啟動子，和trp啟動子。真核啟動子具有通常接近編碼序列的5'末端的轉錄起始區，通常位於轉錄起始位點上遊25-30個鹼基對(bp)的TATA盒。TATA盒被認為指導RNA聚合酶II在正確的位點開始RNA的合成。哺乳動物的啟動子還含有上遊啟動子元件(增強子元件)，其通常位於 TATA盒上遊100至200個鹼基對以內。上遊啟動子元件決定轉錄起始的速率並能在任一方向發揮作用。特別可用作哺乳動物啟動子的是來自哺乳動物病毒基因的啟動子，因為病毒基因通常高表達並具有廣的宿主範圍。例子包括SV40早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒LTR 啟動子。優選的動物細胞啟動子包括但不限於，腺病毒主要晚期啟動子、單純皰疹病毒啟動子和CMV啟動子。在已知的真核啟動子中，適合這方面的是CMV即時早期啟動子、延伸因子 1 α (EFlA)啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、SV40早期和晚期啟動子、以及逆轉錄病毒LTR的啟動子例如勞斯肉瘤病毒(「RSV」)的那些。用於在酵母中進行表達的優選啟動子序列包括可誘導的GAL1/10啟動子，來自乙醇脫氫酶、烯醇化酶、葡糖激酶、葡糖-6-磷酸異構酶、 甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、果糖磷酸激酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶和酸性磷酸酶基因的啟動子。用於增殖和表達的載體還通常包括一個或多個選擇標記。此類標記適合於擴增，或者所述載體為此目的含有另外的標記。在這方面，表達載體優選地含有一個或多個選擇標記基因從而為選擇轉染的宿主細胞提供表型性狀，雖然本領域技術人員會識別到某些系統選擇標記可以由分開的載體提供。對於在大腸桿菌和其他細菌中進行培養，優選的標記包括，例如氨苄青黴素(Amp)、四環素(Tet)或潮黴素(HYG)抗性基因。酵母選擇標記包括 ADE2、HIS4、LEU2、TRPl和ALG7，其賦予對於衣黴素的抗性；新黴素磷酸轉移酶基因，其賦予對於G418的抗性；以及CUPl基因，其使酵母能夠在銅離子存在的條件下生長。動物細胞選擇標記包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因、新黴素(neo)或潮黴素(HYG)抗性基因。此外，用於增殖和表達的載體通常含有一個或多個用於轉錄起始、終止的位點，以及在經轉錄的區域中含有用於翻譯的核糖體結合位點。由構建體表達的轉錄物的編碼部分優選地在開始處含有翻譯起始密碼子，以及包含合適地位於待翻譯的DNA序列的末尾處的終止密碼子(UAA，UGA或UAG)。啟動子、終止子、選擇標記、載體和其他元件的選擇是在本領域技術人員能力範圍之內的常規設計問題。許多此類元件在文獻中有描述並能通過商業供應商獲得。下列載體是商購可得的，並優選地在細菌中使用來自Sianghai Sangon的 PBV220 (86)及其衍生物；來自Qiagen的pQE系列；來自Qiagen的pET載體；來自 Stratagene 的 pBSPhagescript i^#、Bluescript i^#、pNH8A> pNH16a> pNH18A> pNH46A ；以及來自 Pharmacia 的 ptrc99a、pKK223_3、pKK233_3、pDR540、pRIT5。其中優選的真核載體為來自Promega的pCI載體；來自hvitrogen的pcDNA載體；來自Mratagene 的 pSV2CAT、pOG44、pXTl 禾口 pSG ；以及來自 Pharmacia 的 pSVK3、pBPV、pMSG 禾口 pSVL。單獨列出這些載體作為例子來證明，本領域技術人員可以獲得許多商購可得的熟知的載體以用於通過遺傳/重組方法產生本發明所公開的Novaferon蛋白。在這方面的某些優選的實施方案中，載體提供特異表達的手段。此類特異表達可以是可誘導的表達或只在某些細胞類型中的表達，或者可以是可誘導的且細胞特異的。其中特別優選的可誘導的載體是能夠被容易操控的環境因素例如溫度和營養添加物誘導進行表達的載體。多種適合於該應用的載體是熟知的並被本領域技術人員經常採用，包括在原核和真核宿主中使用的組成型和誘導型表達載體。利用各種本領域已知的技術，例如可以將包含SEQ ID No :1所示DNA序列以及合適的啟動子和其他合適的調控序列的載體導入合適的宿主細胞中，所述宿主細胞適合於表達所需蛋白。此類合適的宿主的代表包括細菌細胞，例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、鏈黴菌(Str印tomyces)細胞；酵母細胞，例如巴斯德畢赤酵母 (Pichia pastoris)細胞；昆蟲細胞，例如果蠅(Drosophila) S2和灰翅夜蛾(Spodoptera) Sf9細胞；哺乳動物細胞，例如CHO和COS ；以及植物細胞。用於各種各樣的表達構建體的宿主是熟知的，利用本發明所公開的信息，本領域技術人員能夠容易地選取用於表達SEQ ID No 2所示的Novaferon蛋白的宿主。可以遺傳工程改造宿主細胞以整合編碼Novaferon的多核苷酸和表達本發明的 Novaferon蛋白。例如，可利用本領域中已知的轉染技術將編碼Novaferon的多核苷酸導入宿主細胞中。此類方法描述於許多標準實驗手冊中，例如Kingston所論述的那些(87)。 編碼Novaferon的多核苷酸可以單獨地或與其他多核苷酸一起導入/轉染。這樣的其他多核苷酸可以獨立地導入，或與SEQ ID No 1所示的編碼Novaferon的多核苷酸共導入或聯合導入。例如，對於在哺乳動物細胞中的共轉染和標記的選擇，本發明的編碼Novaferon 的多核苷酸可以與分開的編碼選擇標記的多核苷酸一起轉染到宿主細胞中。備選地，對於誘導宿主細胞中的增殖，編碼Novaferon的多核苷酸可以整合到含有編碼選擇標記的DNA 序列的載體中。用含有編碼Novaferon的多核苷酸的載體轉染的、經改造的宿主細胞可以在常規營養培養基中進行培養，所述營養培養基可為了激活啟動子、選擇轉化體或擴增靶基因進行特殊的修飾。調整培養條件例如溫度、PH等，以適合於所選的宿主細胞表達本發明的 Novaferon 蛋白。為了促進翻譯的蛋白質多肽分泌到內質網的內腔、周質空間或細胞外環境中，可以將合適的分泌信號與Novaferon蛋白合併和共表達。iML通常根據靶蛋白的性質並考慮其他條件例如生產成本、擴大生產是否容易、工業生產的規模等等，來選擇合適的宿主細胞類型用於表達重組靶蛋白。然後，選擇出以最高產率表達靶蛋白的經轉染的細胞克隆，並且將具有最佳表達的最終克隆命名為表達靶蛋白的細胞系並用於生產靶蛋白。表達靶蛋白的細胞系生長在含有各種營養物質的培養基中。為了獲得細胞的最佳生長和/或靶蛋白的最佳表達，利用多種試劑或條件來誘導選擇性啟動子，其與靶蛋白的cDNA序列一起整合在轉染載體中。如果宿主細胞類型/表達系統為細菌， 通常通過離心從培養基中收穫培養的細胞。通過物理或化學手段來破裂收穫的細胞體，保留收穫的、含有合成的靶蛋白的粗提物，以用於所述蛋白質的進一步純化。應用於破裂微生物細胞的方法包括但不限於冷凍-解凍循環、超聲處理、機械破裂或使用細胞裂解劑。此類方法對於本領域技術人員來說是熟知的。本發明者利用大腸桿菌這種細菌作為用於表達重組Novaferon蛋白的宿主細胞。如下所述，用含有編碼Novaferon的多核苷酸序列的載體轉染大腸桿菌，並選取具有 Novaferon蛋白最佳表達的一種大腸桿菌菌株以用於生產Novaferon蛋白。一旦合成，所述蛋白質可以以不溶性顆粒的形式保留在細胞質中，或者可以以可溶形式分泌到細胞質中。 在前一種情況下，所述顆粒在裂解細胞體後回收，並用例如異硫氰酸胍或尿素變性。然後， 通過下列方式獲得變性的多肽/Novaferon蛋白的重摺疊用過量的稀釋溶液稀釋變性劑， 或者逆尿素與還原型和氧化型穀胱甘肽組合的溶液進行透析，隨後逆緩衝鹽水溶液進行透析。在後一種情況下，所述蛋白質能夠在破裂收穫的細胞後直接從周質空間中以可溶的且有功能的形式回收，而無變性。通過避免變性和重摺疊過程，可溶的Novaferon蛋白沒有遭到破壞並不含變形或錯誤摺疊的蛋白質分子。本發明者發現，在大腸桿菌細胞系中產生的合成Novaferon蛋白的很大部分被分泌到細胞質中。然後，如以下所描述的，純化該部分。活性分析和醫學用途如上所示，Novaferon蛋白與幹擾素家族的許多成員顯示出序列同源性，特別是與由HuIFN-α 14的mRNA所翻譯的幹擾素蛋白(圖2)。HuIFN-α已經顯示出寬範圍的生物學活性，包括抗病毒、抗增殖和免疫調節活性(10)。因為與HuIFN- α的同源性，預期Novaferon能表現出與HuIFN- α相似的生物學功能，包括但不限於，抑制腫瘤的增殖、抗病毒活性、激活NK細胞、以及調節免疫系統。特別重要的是不僅保留了 HuIFN-α樣功能特性，而且與HuIFN-α相比，Novaferon蛋白的這些生物學功能的效力增強。為了驗證和確定其功能特性的效力，因而用標準的常規體外測定法來測定Novaferon蛋白的生物學活性，所述測定法被涉及用於檢測抗病毒和抗增殖特性。如以下實驗部分中所描述的，在一些實驗中，進一步在各種人癌症類型的動物模型中觀察Novaferon蛋白的抗增殖特性的體內效力，並與HuIFN-α以及化學抗癌劑進行比較。許多用於測定HuIFN活性的合適測定法是本領域中熟知的。本發明者採用基於細胞的體外測定法系統來測定抗病毒和抗增殖活性。相同的體外測定法用於所有與本發明相關的程序和實驗，包括但不限於篩選人I型幹擾素基因改組文庫，從人I型幹擾素基因改組文庫的所表達的蛋白質中選擇Novaferon，以及測定純的重組Novaferon蛋白的生物學活性。有許多通過觀察細胞對病毒的抗性程度來測量受試樣品/試劑的抗病毒活性的測定法(88)。已經有3種主要的生物測定法用於測量HuIFN和它們的雜交體的抗病毒活性。根據用於測定病毒對於培養的細胞的各種不同方面的方法，將它們進行分類。用於測定病毒誘導的致細胞病變效應的抑制的測定法測量在用IFN預處理的培養的細胞中病毒誘導的裂解性致細胞病變效應的減少程度。該測定法可以在96孔板中進行(89)，並已經廣泛用於重組HuIFN-α，因為它為篩選大量樣品提供了一種簡便方法。病毒噬斑形成的抑制是另一種定量HuIFN在組織培養物中的抗病毒活性的方法。 噬斑減少測定法的結果不依賴於感染複數。此外，以高精確度可檢量到噬斑形成的50%減少。例如利用普遍存在的水泡性口膜炎病毒(VSV)來誘導噬斑形成，能夠通過篩選大量來自不同動物物種的細胞系來測定特定重組IFN的跨物種活性的特性(90)。第三種測定法基於測定病毒產量的減少。通常在單個細胞生長周期內，通過釋放的病毒數量來測量病毒的產生。該測定法特別可用於測試IFN對於不引起致細胞病變效應的病毒或在靶細胞培養物中不形成噬斑的病毒的抗病毒活性。但是，在該測試中，感染複數影響由固定濃度的IFN所誘導的保護的表觀程度(91)。使用WISH細胞和水泡性口膜炎病毒(VSV)，通過標準的致細胞病變效應-抑制測定法來測量Novaferon的抗病毒活性。使用WHO國際標準的標準參考樣品 95/650 (rHuIFN- α 2a)和94/786 (複合rHuIFN- α )，來測定並校準抗病毒活性。1個單位的抗病毒活性定義為，對於達到50%抑制VSV對培養的細胞的致細胞病變效應時所需要的蛋白質量。正如下面進一步描述的，Novaferon蛋白的活性為2. 5X 109IU/mg，這為HuIFN-α 2b 的活性的大約12. 5倍。這些測試表明，與HuIFN- α 2b相比，Novaferon的抗病毒特性極大增強。Novaferon蛋白表現出這種增強的抗病毒效力，這為預測在人體內的增強的抗病毒效應提供了基礎。基於HuIFN的性質，預期Novaferon具有非常廣的抗病毒特性是合理的。 換言之，對於寬範圍的病毒，Novaferon應當比天然的HuIFN更有效。Novaferon的增強的抗病毒效力可以轉化為在臨床情況下對於具有多種病毒疾病的患者的更好的抗病毒效應或更好的治療效應。正如上面所解釋的，IFN還通過多種機制來抑制細胞增殖和表現出潛在的抗腫瘤效應。利用細胞培養系統，已經建立了幾種體外抗增殖測試，這在現有技術中進行了充分描述。在這些測定法中，可以通過下列方式來測量細胞增殖細胞計數；結晶紫生物測定法(92，93)；對中性紅染料的化學敏感性(94 96)；整合經放射性標記的核苷酸(97)；將 5-溴-2'-脫氧尿苷整合入正在增殖的細胞的DNA中(98)；使用四唑播鹽(99，100)。人類淋巴母細胞Daudi細胞系對於HuIFN-α的抗增殖效應是非常敏感的，並且它的懸浮培養生長有助於定量其細胞數目(101)。該細胞系用於測量HuIFN-α和雜交體的抗增殖活性已經有很多年了(102)。其他細胞系也可用於測試受試試劑的抗增殖活性。通過觀察由於向具有各種不同人腫瘤異種移植物的動物模型施用Novaferon而引起的腫瘤塊生長的抑制，而在體內觀察到Novaferon蛋白的抗增殖活性。將Novaferon 的體內抗腫瘤效應與HuIFN-α 2b進行比較，並在一些異種移植模型中還與化學抗腫瘤試劑進行比較。正如下面所詳細描述的，本發明者發現，用標準Daudi細胞方法測得的Novaferon 的體外抗增殖活性的效力為天然HuIFN-α 2b的400倍，在所有天然HuIFN中，HuIFN- α 2b 可能表現出最有效的抗增殖活性。Novaferon的增強的抗增殖效力是廣泛的和普遍的，因為它對於本發明者在體外所測試的所有人癌症細胞系都表現出比天然HuIFN-α 2b更有效或增強的抑制。這表明，Novaferon對人癌症的有效抑制沒有選擇性。雖然Novaferon對於所有受試類型的人癌症細胞系的增強的抗增殖活性程度不同，但它具有成為臨床情況下的廣譜抗癌劑的潛力。這是超過化學抗癌劑、單克隆抗體和其他靶特異性抗癌劑的顯著優點。下面所描述的異種移植動物模型進一步確立了 (1)與天然HuIFN- α北相比，Novaferon的體內抗增殖效應極大地增強或更有效。(2)在相同的異種移植模型中，劑量低得多的Novaferon的體內抗增殖效應比受試化學試劑5-氟尿嘧啶(5-FU)更好。(3)在異種移植模型中，Novaferon能夠達到癌症生長的超過90%的抑制，但在受試動物中不引起體重減少、活力改變和其他消極的副作用，這與在經5-FU治療的動物中顯著的體重減少和活力降低形成鮮明對比。這些結果表明，與天然HuIFN-c^b相比，Novaferon的體外和體內抗增殖特性極大增強。Novaferon的增強的抗增殖效力被轉化成小鼠動物模型中人腫瘤生長的有效抑制 (> 90% )，並且這種抑制似乎非常廣泛地作用於所有受試人癌症類型，並且比傳統的抗癌劑5FU更好。這些結果還表明，Novaferon對於癌細胞生長的有效抑制對於所述癌細胞是非常特異的，而不針對正常細胞，其支持依據是，在經Novaferon治療的動物中觀察到正常飲食和動作行為並且體重沒有減少。因此，Novaferon具有在所有或大部分人癌症中發揮作用的可能性。在一個優選的實施方案中，完整的或部分的Novaferon蛋白(SEQID No :2)分子 (使用SEQ ID No :1的多核苷酸序列通過重組技術製備或化學合成)，可在人和/或非人物種中用於治療和/或預防任何和/或所有人來源或非人來源的腫瘤和癌症。這些腫瘤例如包括但不限於，骨原性肉瘤；多發性骨髓瘤；何杰金病；結節性低分化淋巴瘤；急性淋巴細胞白血病；急性髓細胞白血病；乳腺癌；黑色素瘤；乳頭瘤；以及鼻咽癌，結腸癌，肝癌和黑色素瘤。在另一個實施方案中，完整的或部分的Novaferon蛋白(SEQ IDNo 2)分子(使用 SEQ ID No :1的多核苷酸序列通過重組技術製備或化學合成)，可在人和/或非人物種中用於治療和/或預防任何和/或所有病毒疾病。易感的病毒感染的例子包括但不限於，病毒性腦心肌炎，流行性感冒和其他呼吸道病毒感染，狂犬病和其他病毒性動物傳染病，和蟲媒病毒感染，以及單純皰疹性角膜炎，急性出血性結膜炎，水痘帶狀皰疹，和乙型和C型肝炎， SARS和禽流感，人免疫缺陷症候群(AIDS，HIV)。在另一個實施方案中，完整的或部分的Novaferon蛋白(SEQ IDNo 2)分子(使用 SEQ ID No :1的多核苷酸序列通過重組技術製備或化學合成)，可在人中用於治療和/或預防任何和/或所有免疫系統相關的病症。免疫病症的例子包括但不限於風溼性關節炎、多發性硬化症和斯耶格倫症候群糖尿病。Novaferon蛋白還可以用於預防移植物抗宿主的排斥反應。在另一個實施方案中，完整的或部分的Novaferon蛋白(SEQ IDNo 2)分子(使用 SEQ ID No :1的多核苷酸序列通過重組技術製備或化學合成)，可作為免疫佐劑用於治療和 /或預防任何和/或所有血管發生疾病。血管發生疾病的例子包括但不限於血管瘤、腫瘤誘導的新血管系統、與年齡相關的黃斑變性以及糖尿病性視網膜病。Novaferon蛋白可以單獨地或與任何其他蛋白質/載體材料或其他構建體一起， 以任何藥學上可接受的製劑/配劑，通過任何施用/遞送途徑/方法，施用給人和/或非人物種，所述施用/遞送途徑/方法包括但不限於口服攝取、吸入、鼻內噴霧、腹膜內、靜脈內、 肌內、損傷內或皮下注射。包含Novaferon蛋白作為活性成分的藥物學製劑/配劑可通過摻入合適的固體或液體載體來製備，其形式有液體、固體、半固體和/或任何其他臨床上可接受的形式， 例如片劑、丸劑、粉末、液體溶液或懸浮液、脂質體、栓劑、可注射溶液和可輸注溶液。含 Novaferon的製劑/配劑可通過使用本領域中描述的或製藥工業實踐所普遍接受的常規載體、材料、方法來製備。含Novaferon的製劑/配劑還可通過使用本領域中還沒有描述的或製藥工業還沒有使用的非常規方法、材料來製備。例如，腸胃外配劑通常是注射液，其由藥物學和生理學上可接受的材料組成，例如水、生理鹽水、其他平衡的鹽溶液、含水葡萄糖、甘油等。此外，除了 Novaferon蛋白外，注射液還可以包含其他蛋白質，如載體，例如人血清白蛋白或血漿製品。藥物學製劑/配劑還可以包含少量無毒性的輔助物質，例如溼潤劑或乳化劑、防腐劑和PH緩衝劑(例如乙酸鈉或脫水山梨糖醇單月桂酸酯)。配製方法在現有技術中是熟知的，並例如描述在Remington The Science and Practice of Pharmacy. Phamaceutical Sciences (75)中。具體的Novaferon蛋白製劑/配劑可以由所期望的臨床應用和/或使用方法來決定，並且可以由任何一個本領域技術人員使用已知技術來製備。例如，除了注射液之外，還可以採用局部和口服配劑。局部製劑可包括但不限於滴眼劑、軟膏劑和噴霧劑。口服配劑包括但不限於液體形式(例如糖漿劑、溶液或懸浮液)，或固體形式(例如粉末、丸劑、片劑或膠囊)。對於固體製劑/配劑，常規的無毒性固體載體包括但不限於製藥級別的甘露醇、 乳糖、澱粉或硬脂酸鎂。製備這些製劑/配劑的實際過程和/或方法是已知的，或者對於本領域技術人員來說將會顯而易見的(75)。可通過各種途徑將藥學上可接受的Novaferon蛋白的製劑/配劑施用給人和/ 或非人物種，所述途徑包括但不限於口服、皮下、靜脈內、鼻內、經皮、腹膜內、肌內、肺內、陰道、直腸或眼內遞送，以及在治療傷口時，直接局部用藥。根據臨床實踐，Novaferon蛋白在製劑/配劑中的濃度/數量可以為從> O至1.0M和/或從> 0至100% (重量/重量)。每一個和/或所有Novaferon製劑/配劑的確切劑量、施用間隔和治療持續時間由臨床試驗、疾病狀況、患者狀態和衛生保健提供者決定。在一個優選的實施方案中，由於蛋白質降解、全身與局部遞送的差異、合成新蛋白酶的速率、 以及年齡、體重、一般健康狀況、性另U、飲食、施用時間、藥物相互作用和病狀的嚴重性等等， 可能需要調整Novaferon的施用，包括但不限於單次和/或總劑量、施用間隔、治療持續時間和必需的療程，並且可由本領域技術人員通過常規實驗來確定。在一個優選的實施方案中，在施用至人和/或非人物種的體內後，Novaferon蛋白的循環半衰期可發生改變。這些改變包括但不限於Novaferon體內半衰期的延長或縮短。 Novaferon蛋白的體內半衰期的延長可通過多種途徑來獲得，包括但不限於(DNovaferon分子和單克隆抗體之間的複合物形成。此類抗體優選地在不從本質上削弱其治療功能的位點上與Novaferon蛋白連接(103)。(2) Novaferon與其他蛋白質/多肽的融合複合物。Novaferon分子可以重組融合於其他蛋白質/多肽，例如免疫球蛋白的恆定區片段(Fe) (104)。C3) Novaferon蛋白的綴合。例如，Novaferon蛋白可以綴合有非抗原性聚合物，例如聚乙二醇或相關的聚亞烷基二醇部分(105-108)。在另一個優選的實施方案中，治療性化合物可綴合至抗體，優選抗Novaferon 蛋白抗體。所述治療性化合物可以是細胞毒性試劑。在該方法中，通過經綴合的抗體與 Novaferon分子的結合，細胞毒性試劑可以被靶向腫瘤組織或細胞，從而破壞患病細胞並減少患病細胞的數目以達到癌症症狀的降低。細胞毒性試劑包括但不限於，細胞毒性藥物，毒素或此類毒素的活性片段，和放射性化學試劑。合適的毒素及其相應片段包括白喉毒素A 鏈、外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、麻風樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、酚黴素、伊諾黴素等等。在一個優選的實施方案中，編碼Novaferon蛋白的多核苷酸序列(SEQ ID No 1) 的全長序列、部分序列和/或調控序列可由任何一個本領域技術人員用於基因療法相關的施用。基於編碼Novaferon蛋白的多核苷酸序列(SEQ ID No 1)的反義應用也可作為基因療法(即整合到基因組中)或作為反義組合物進行使用，這是本領域技術人員將會意識到的。在基因療法應用中，將基因導入細胞，從而獲得由這些基因編碼的靶蛋白的體內合成。常規基因療法通過單次治療或重複施用治療有效的DNA或mRNA來獲得持續的療效。 另一方面，反義RNA和DNA還可用作治療劑，以在體內阻斷某些基因的表達。已經表明，可以將短的反義寡核苷酸遞送至細胞，在那裡它們作為抑制劑發揮作用(109)。在一個優選的實施方案中，全長或部分長度的編碼Novaferon蛋白的多核苷酸序列(SEQ ID No 1)可用作DNA疫苗。裸露的DNA疫苗在本領域中一般是已知的(110)。本領域普通技術人員熟知將全長或部分長度的編碼Novaferon的基因(SEQ ID No :1)作為 DNA疫苗進行應用的方法，包括但不限於，將Novaferon基因或部分Novaferon基因置於啟動子的調控之下，以用於在人和/或非人物種中表達全長或部分長度的Novaferon蛋白。
實施例下列實施例用於更完整地描述施用上述發明的方式，以及闡明考慮用於實現本發明的各種不同方面的最佳模式。應當了解，這些實施例決不限制本發明的真正範圍，而只是為了舉例說明目的而給出。所有在此引用的參考文獻作為整體引入本文作為參考。實施例1.從人白細胞cDNA中PCR擴增出人IFN-α基因從人外周血白細胞中提取總mRNA。使用Advantage RT-for-PCR試劑盒 (Clontech，Mountain View, CA, US)以及廠家推薦的 cDNA 合成引物(oligo dT18)來製備 cDNA。在MG PTC熱循環儀上通過PCR技術進行人IFN-α cDNA的擴增，採用以下條件 2. 5μ 1 10\卩行擴增緩衝液(11^行1~08611，0&1~18^1(1，〇八，舊)，0.75「1 IOmM dNTP,0. 5μ 1 25mM MgSO4,0. 25 μ 1 Platinum pfx DNA M Bl (2. 5U/μ 1 ；Invitrogen, Carlsbad, CA, US) ,0. 75 μ 1 cDNA,0. 75 μ 1 5 『弓丨物(10 μ M ;IFNa05 :5 ' -TGGTGCTCAGCT (A/G) CAAGTC-3 ' ) (SEQ ID No :3))，0. 75 μ 1 3 『引物混合物(每個 1. 7 μ M ；IFNa03_l 5' -AATCATTTCCATGTTG(A/G)ACCAG-3' (SEQ ID No 4) ；IFNa03-2 5' -AATCATTTCCCGGTTGTACCAG-3' (SEQ ID No :5);IFNa03-3 5' -AATCATTTCCATGTTGAAACAG-3' (SEQ ID No :6) ;IFNa03_4 :5' -AATCATTTCAAGATGAGCCCAG-3' (SEQ ID No :7) ;IFNa03_5 :5' -AATGATTTTCATGTTGAACCAG-3' (SEQ ID No :8) ;IFNa03_6 :5' -AATCATTT(C/G)(C/G)ATGTTGAACCAG-3' (SEQ ID No :9) ;IFNa03_7 :5' -GATCATTTCCATGTTGAATGAG-3' (SEQ ID No :10) ;IFNa03_8 :5' -GAGTCGTTTCTGTGTTGGATCAG-3' (SEQ ID No :11))。將擴增出的PCR產物在1. 0%瓊脂糖凝膠上進行電泳，切取條帶，進行凝膠純化， 並根據廠家推薦克隆入 pCRII-TOPO 或 pCR-4-TOPO 載體 Qnvitrogen, Carlsbad, CA, US) 中。在 ABI 自動測序儀(PE Applied Biosystems, CA, US)上，在 Prism Ready Reaction Dye Termination 混合物中進行自動測序。由於在以上克隆中沒有發現所希望的關於IFNa6、IFNa7和IFNal6編碼序列的插入片段，所以在以上條件下再次進行PCR，除了類型特異引物外。對於特異性地擴增 IFNa6，5 『和 3 『引物分別為 IFNa05 5 『 -TGGTGCTCAGCT (A/G) CAAGTC-3 『 (SEQ ID No 3)， 和 IFNa03-8:5' -GAGTCGTTTCTGTGTTGGATCAG-3 『 (SEQ ID No :11)。對於特異性地擴增 IFNa7，5'和 3'引物分別為 IFNa07U0 5' -ATGCCCCTGTCCTTTTCTTTAC-3 『 (SEQ ID No 12)，禾Π IFNa03_5 與 IFNa03_6 的等摩爾混合物。對於特異性地擴增IFNal6，所用5 『和3 『引物分別為IFNa7U0和 IFNa03-7 5' -GATCATTTCCATGTTGAATGAG-3 『 (SEQ ID No: 10)。將擴增出的片段克隆入 pCRIΙ-Τ0Ρ0或pCR-4-TOPO載體中，並如上進行測序。將所有克隆的I型人IFN-α基因單獨地與Genebank中的那些DNA序列進行比對。本文所涉及的這些基因的GeneBank核苷酸登錄號為NM_024013 (IFN-a 1)， NM_000605(IFN-a 2)，ΝΜ_010504(IFN-a 4)，ΝΜ_010505(IFN-a 5)，NM_008335(IFN-a 6)， NM_008334 (IFN-a 7) , NM_008336 (IFN-a 8) , NM_002 17 1 (IFN-a 10)， NM_002 172 (IFN-a 14) , NM_002 1 73 (IFN-a 16) , NM_021268 (IFN-a 17), NM_002175(IFN-a 21)。實施例2.構建攜帶有I型HuIFN的質粒的改組文庫
為了構建攜帶有I型人IFN-α之一的編碼序列的質粒，基於成熟人I型IFN蛋白的單獨cDNA編碼區，合成了具有BamHI核EcoRI限制性酶切位點的15個鹼基對的寡核苷酸(Genentech，South San Francisco, CA, US)。本文所涉及的這些蛋白質的 GeneBank 核苷酸登錄號為NM_024013 (IFN- α 1)，NM_000605 (IFN- α 2)，ΝΜ_010504 (IFN- α 4)， ΝΜ_010505(IFN-α 5)，ΝΜ_008335(IFN-α 6)，ΝΜ_008334(IFN-α 7)，ΝΜ_008336(IFN-α 8)， ΝΜ_002171 (I FN- α 10) , ΝΜ_002 172 (I FN- α 14) , ΝΜ_002 173 (I FN- α 16), NM_021268(IFN-a 17)，ΝΜ_002175 (IFN-a 21)。將在實施例1中構建的質粒作為模板,和引物一起用於標準PCR(Ill)。得到的產物用限制性內切酶(RE)BamHI和EcoRI進行酶切， 並克隆入大腸桿菌表達載體PBVB中，這是pBV220的衍生表達質粒，其在它的多克隆區域中含有BamHI位點和EcoRI位點(86)。這些最終構建體都通過DNA序列分析進行驗證(PE Applied Biosystems,US)。使用一對寡核苷酸BVF4 5 『 -AGGGCAGCATTCAAAGCAG-3 『 (SEQ IDNo 13)和 BVR3 5' -TCAGACCGCTTCTGCGTTCTG-3 『 (SEQ ID No 14)，以及使用前面構建的攜帶有 I 型 HuIFN的質粒，通過PCR來擴增含有人IFN ORF的DNA片段。將得到的產物等量混合併用 DNA酶I進行消化，並根據Memmer (112)所描述的程序進行PCR組裝。組裝的PCR產物進一步通過一對內部引物進行擴增 BVF 5 『 -GAAGGCTTTGGGGTGTGTG-3 『 (SEQ ID No 15)禾口 BVR: 5' -AATCTTCTCTCATCCGC-3『 (SEQ ID No 16)，接著用 BamHI 和 EcoRI 進行消化，並重新克隆入經RE BamHI和EcoRI酶切的大腸桿菌表達載體pBVB中。這些最終構建體都通過DNA 序列分析進行驗證。將攜帶有改組的HuIFN-α基因的質粒轉化入大腸桿菌DH5 α感受態細胞中。在以上所有PCR程序中，無論PCR擴增還是PCR組裝，都使用常規的DNA聚合酶 (New England Biolab，MA，US)，而不是高保真 DNA 聚合酶。實施例3.篩選改組文庫讓新轉染的大腸桿菌DH5 α細胞在LB平板上於37°C培養過夜。分別挑取單個菌落，並接種於在96孔板中的100 μ 1含50 μ g/ml氨苄青黴素的LB培養基之中。菌落在 300C以250rpm搖動。在培養過夜後，將10 μ 1細菌培養物一式兩份地接種於在96孔板中的ΙΟΟμΙ含50yg/ml氨苄青黴素的LB培養基之中。最初的平板(所謂的原種板(stock plate))暫時保存在4°C。將一式兩份的板中的細胞在30°C下培養，直到0D600變為0. 4， 然後用42°C誘導。經4小時熱誘導後，將細菌培養物直接轉移到-80°C冷凍室中以開始冷凍-解凍循環。2個循環的冷凍-解凍後，將細菌懸浮液/裂解產物稀釋至所需濃度，並在將其暴露於Daudi細胞培養物以進行抗增殖測試(101)或暴露於Wish細胞培養物以進行抗病毒測試(113)。在每一輪篩選步驟中，將20，000個菌落進行初步篩選，並挑選出大約100個具有最高抗增殖或抗病毒活性的菌落以用於進一步的驗證性測試。將在原種板上的所挑選出的細菌培養物在含有50 μ g/ml氨苄青黴素的LB平板上劃線。單個菌落在37°C下培養過夜， 挑取之，並接種於在試管中的Iml含50 μ g/ml氨苄青黴素的LB培養基之中。試管中的細菌在30°C下以250rpm搖動培養過夜。然後，將40 μ 1經培養的細菌接種在另一組試管之一中，所述試管含有Iml具有氨苄青黴素(50yg/ml)的LB。然後，按上文中關於初步篩選步驟時所描述的，讓樣品經歷以下步驟誘導表達，收集細胞培養物，冷凍-解凍循環處理，和抗增殖或抗病毒測試。在每一輪篩選步驟中，在驗證性測試後挑選出大約20個具有最高抗增殖或抗病毒活性的菌落，以對質粒及其插入片段進行自動測序。具有獨一無二的DNA序列的插入片段用一對 PCR 引物進一步擴增，即 BVBF :5' -ACCATGAAGGTGACGCTC-3 『 (SEQ ID No 17)； 和 BVR 5' -AATCTTCTCTCATCCGC-3『 (SEQ ID No 16)，它們分別是 pBVB 載體的多克隆位點上遊和下遊的側翼序列。擴增出的PCR產物用於下一輪改組文庫的構建。基於抗增殖或抗病毒活性的增加，進行5個循環的篩選步驟。實施例4.在大腸桿菌中表達並純化重組Novaferon蛋白在大腸桿菌中表達Novaferon蛋白(SEQ ID No :2)。將人工添加了起始密碼子 ATG的SEQ ID No 1的閱讀框克隆入溫度可誘導的pBVB載體中從而置於λ PRPL啟動子的調控之下(114)。將Novaferon表達質粒pBVBNF轉化到DH5 α細胞中。分別挑取單個菌落，接種於2ml含50yg/ml氨苄青黴素的LB培養基中，並在30°C下培養8小時。然後， 取2ml培養的細菌，進一步用50ml含50 μ g/ml氨苄青黴素的培養基在30°C下攪動培養過夜。第二天早上，將過夜培養的細菌按1 10 1 20的比例接種於含50 μ g/ml氨苄青黴素的大體積的LB培養基中，並於30°C攪動培養。當培養物達到生長對數中期時(A550 = 0. 5-0. 6)，將培養溫度快速升高至42°C並維持4小時，以便誘導Novaferon的表達。經4小時的熱誘導後，將細菌離心並用 PBS(137mM NaCl, 2. 7mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4)洗滌3次，然後保存在-80°C直至進行純化。大多數Novaferon蛋白分子在此處描述的大腸桿菌生產系統中是可溶的，儘管它們在細胞質中過表達。因此，通過細胞裂解緩衝液1(50 mM Tris-Cl (pH8. 0),1 mM EDTA(pH8. 0),100 mM NaCl)中的溶菌酶消化來破裂細胞。裂解產物進一步進行超聲處理以破裂剩餘的完整細胞並剪接DNA分子。然後將裂解產物離心。上清液中的可溶性Novaferon蛋白分子依次通過疏水、離子交換層析和凝膠過濾進行純化。首先，將上清液加載到Wienyl kphar0Se6快速流動柱(GE Healthcare, US)上並通過其。其次，將含有Novaferon蛋白的級分施加至POROS 50 D柱(Applied Biosystem, US)上。第三，將含有 Novaferon 分子的級分用 P0R0S 50 HS 柱(Applied Biosystems, US)進行純化。最後，將收集的Novaferon分子進一步用HiLoad 26/100 Superdex 75pg(Amersham, US)進行純化。純的Novaferon蛋白的純度通過15% SDS-PAGE分析進行驗證。純的重組 Novaferon蛋白顯示為單一的條帶，分子量(MW)為19_20KDa。質譜法分析表明，純化的 Novaferon分子的純度> 98%，分子量為19313道爾頓，這與從其胺基酸序列推測的19315 道爾頓的分子量相一致。實施例5.在大腸桿菌中表達並純化重組HuIFN- α 2bHuIFN- α 2b的表達質粒pBV2b包含成熟HuIFN- α 2b蛋白的cDNA編碼區 (GeneBank核苷酸登錄號NM_000605)，其處於熱可誘導的λ PRPL啟動子的控制之下。 HuIFN- α 2b的表達根據Jowph S和DavidWR所描述的操作規程來進行(116)。將表達質粒pBV2bF轉化到DH5a細胞中。分別挑取單個菌落，接種於2ml含 50 μ g/ml氨苄青黴素的LB培養基中，並在30°C下培養8小時。然後，取2ml培養的細菌，進一步用50ml含50 μ g/ml氨苄青黴素的LB培養基在30°C下攪動培養過夜。第二天早上， 將細菌培養物按1 10 1 20的比例接種於含50 μ g/ml氨苄青黴素的大體積的LB培養基中，並於30°C攪動培養。當培養物達到生長對數中期時(A550 = 0.5-0.6)，將培養溫度快速升高至42°C並維持4小時，以便誘導HuIFN-α 2b的表達。經4小時的熱誘導後，將細胞離心並用 PBS(137mM NaCl, 2. 7mM KCl，10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4)洗滌 3 次，然後保存在-80°C直至進行純化。HuIFN-α 2b在此處描述的大腸桿菌表達系統中以不溶形式表達，因此根據 Molecular Cloning(115)所描述的操作規程來進行內含體的回收和洗滌程序。簡言之， 將收穫的細菌細胞重懸在細胞裂解緩衝液1(50 mM Tris-Cl (pH8.0)，l mM EDTA (pH8. 0), 100 mM NaCl)中，並通過溶菌酶和超聲處理來進行裂解。內含體用冰冷的細胞裂解緩衝液 II (補充有0. 5% (v/v)Triton X-IOO的細胞裂解緩衝液I)洗滌3次。通過在室溫下伴隨攪動在7N胍中懸浮4小時來破裂回收的內含體。在4°C離心 15分鐘後，使變性的蛋白質在0. 15M pH9.5 Borex緩衝液中於4°C再摺疊48小時。在最後一步再摺疊時，用HCl將pH調整到7. 4。然後，通過疏水、離子交換層析和凝膠過濾來純化含有經摺疊的HuIFN- α 2b的溶液。首先，將溶液加載到Wienyl Sepharose 6快速流動柱(GE Healthcare, US)上並通過其。其次，將含有HuIFN-α 2b的級分施加至POROS 50 D柱(Applied Biosystem, US)上。 第三,將含有HuIFN-α 2b的級分用POROS 50 HS柱(Applied Biosystems, US)進行純化。 最後，將收集的 HuIFN-α 2b 分子進一步用 HiLoad 26/100Superdex 75pg (Amers ham, US) 進行純化。在15% SDS-PAGE分析中，純的HuIFN-α 2b蛋白顯示為單一的條帶，並且通過質譜法證實其純度為>98%。實施例6.測定Novaferon的抗病毒活性使用在Armstrong JA(113)所描述的傳統操作規程中的WISH-VSV系統來測定抗病毒活性。第一天，將WISH細胞(ATCC，目錄號CCL2Q以14，000個細胞/孔的密度接種於96孔板中，並於37°C孵育。24小時後，在每孔中加入2倍系列稀釋的Novaferon、 HuIFN-α 2b、WHO人IFN國際標準品或空白培養基，並於37°C再孵育M小時。第三天，去除培養基，替換成含有1，000PFU的水泡性口膜炎病毒(VSV，ATCC，目錄號VR-1421)的培養基。 細胞再次在37°C孵育M小時，接著用0. 85%的NaCl洗滌以去除死細胞。然後，將培養板在染料固定溶液(dye-fixer solution) (0. 5%結晶紫，5%福馬林(V/V)，50%乙醇(V/ V)，和0.85% NaCl)中浸泡1小時。接著，輕輕倒出染料固定溶液，並用自來水充分漂洗微量培養板並讓其乾燥。用O.aiil 2-甲氧基乙醇來溶解染色的細胞。對於結晶紫生物測定法,在 Model Opsys MR (Thermo Labsystems, US)中於 550nm 讀取平板。所有實驗重複3次，Novaferon和HuIFN-c^b樣品在同一塊平板中測試。對於在此製備的Novaferon和HuIFN-α 2b的抗病毒活性作平行分析，參照WHO國際標準品94/786(複合rHuIFN-α )和95/650 (rHuIFN-a 2a)來測定抗病毒單位(國際單位或 IU)，這些 WHO 國際標準品可從 National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC, USA)購得。測得的經純化的Novaferon蛋白在WISH中針對VSV的抗病毒活性為2. 5X IO9 IU/ mg，而HuIFN-α沘的抗病毒活性為2. OX IO8 IU/mg。該數據表明，Novaferon蛋白的抗病毒活性為HuIFN- a 2b的大約12. 5倍。實施例7. Novaferon的抗增埴活性抗增埴活性分析基本上如Evinger和Pestka所述的來進行(101)。A.人腫瘤細胞系的細胞培養人腫瘤細胞系從不同機構購買得到(下表l)，即ATCC(American Type Culture Collection,P. 0. Box 1549,Manassas,VA 20108, USA),DSMZ(German National Resource Centre for Biological Materiai， Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen bmoH, Mascheroder Weg lb,38124 Braunschweig, Germany), JCRB (Japanese Collection of Research Bioresources-Cell Bank,National Institute of Biomedial Innovation,7-6-8 Saito-Asagi, Ibaraki-shi,Osaka 567—0085，Japan)o表1.人腫瘤細胞系
權利要求
1.分離的多核苷酸，其編碼具有人幹擾素樣生物學活性的蛋白質，其中所述多核苷酸選自其中每個多核苷酸包含與SEQ ID No :1至少93%同一的核苷酸序列的多核苷酸的組。
2.權利要求1的多核苷酸，其中所述序列與SEQID No 1至少95%同一。
3.權利要求2的多核苷酸，其中所述序列與SEQID No 1至少98%同一。
4.權利要求1-3中任一項的多核苷酸，其中所述蛋白質不是天然存在的。
5.權利要求4的多核苷酸，其中所述蛋白質具有相比人幹擾素α2b(HuIFN-a2b)而言增強的抗病毒和抗增殖活性。
6.權利要求5的多核苷酸，其中所述蛋白質的抗病毒活性為HuIFN-a2b的至少2倍。
7.權利要求5的多核苷酸，其中所述蛋白質的抗增殖活性為HuIFN-a2b的至少10倍。
8.重組載體，其包含權利要求1的多核苷酸。
9.宿主細胞，其包含權利要求8的重組載體。
10.表現出人幹擾素樣生物學活性的非天然存在的蛋白質，其中所述蛋白質選自其中每個蛋白質包含與SEQ ID No :2至少85%同一的胺基酸序列的蛋白質的組。
11.權利要求10的蛋白質，其中所述序列與SEQID No 2至少90%同一。
12.權利要求10的蛋白質，其中所述序列與SEQID No 2至少95%同一。
13.權利要求10-12中任一項的蛋白質，其中所述蛋白質具有相比HuIFN-a2b而言增強的抗病毒和抗增殖活性。
14.權利要求13的蛋白質，其中所述蛋白質的抗病毒活性為HuIFN-a2b的至少2倍。
15.權利要求14的蛋白質，其中所述蛋白質的抗病毒活性為HuIFN-a2b的至少5倍。
16.權利要求15的蛋白質，其中所述蛋白質的抗病毒活性為HuIFN-a2b的至少10倍。
17.權利要求13的蛋白質，其中所述蛋白質的抗增殖活性為HuIFN-a2b的至少10倍。
18.權利要求17的蛋白質，其中所述蛋白質的抗增殖活性為HuIFN-a2b的至少50倍。
19.權利要求18的蛋白質，其中所述蛋白質的抗增殖活性為HuIFN-a2b的至少100倍。
20.權利要求19的蛋白質，其中所述蛋白質的抗增殖活性為HuIFN-a2b的至少200倍。
21.權利要求10的蛋白質，其中所述蛋白質是重組的。
22.權利要求10的蛋白質，其中所述蛋白質的分子量為大約19315道爾頓。
23.權利要求10的蛋白質，其可選地在N-末端包含甲硫氨酸殘基。
24.包含與SEQID No :2具有0至25個胺基酸差異的序列的非天然存在的蛋白質，其中所述蛋白質表現出人幹擾素樣生物學活性。
25.權利要求對的蛋白質，其中所述蛋白質具有相比HuIFN-a2b而言增強的抗病毒和抗增殖活性。
26.權利要求25的蛋白質，其中所述蛋白質的抗病毒活性為HuIFN-a 2b的至少2倍。
27.權利要求25的蛋白質，其中所述蛋白質的抗增殖活性為HuIFN-a2b的至少10倍。
28.權利要求對的蛋白質，其中所述蛋白質是幹擾素類似物。
29.權利要求M的蛋白質，其中所述蛋白質是重組的。
30.包含權利要求10的蛋白質的片段的多肽，其中所述片段表現出所述人幹擾素樣生物學活性。
31.蛋白質構建體，其包含與另一部分偶聯的權利要求10的蛋白質，其中所述構建體表現出所述人幹擾素樣生物學活性。
32.權利要求31的蛋白質構建體，其中所述蛋白質是糖基化的。
33.權利要求31的蛋白質構建體，其中所述部分是多肽。
34.權利要求31的蛋白質構建體，其中所述部分是非多肽。
35.權利要求34的蛋白質構建體，其中所述部分是聚合物分子。
36.權利要求35的蛋白質構建體，其中所述聚合物分子是線性或分枝的聚乙二醇。
37.權利要求31的蛋白質構建體，其中所述部分是標記分子。
38.組合物，其包含權利要求10的蛋白質和藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
39.編碼權利要求10的蛋白質的多核苷酸。
40.權利要求10的蛋白質作為抗病毒劑的用途。
41.權利要求10的蛋白質作為抗增殖劑的用途。
42.權利要求10的蛋白質作為抗癌劑的用途。
43.權利要求10的蛋白質作為免疫調節劑的用途。
44.治療癌症的方法，包括向需要治療的受試者施用治療有效量的權利要求10的蛋白質。
45.治療病毒疾病的方法，包括向需要治療的受試者施用治療有效量的權利要求10的蛋白質。
46.權利要求44或45的方法，其中所述受試者是人類。
47.權利要求44或45的方法，其中所述蛋白質與藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑一起施用。
48.治療對幹擾素療法作出響應的病狀的方法，包括向需要治療的受試者施用治療有效量的權利要求10的蛋白質。
49.權利要求44的方法，其中所述蛋白質就寬範圍的不同類型的癌症來說是治療上有效的，其中所述癌症選自黑色素瘤、結腸直腸腺癌、肝細胞癌、肝癌、淋巴瘤、前列腺癌、胃腺癌、食管癌、肺癌、子宮頸腺癌和子宮頸癌。
50.表現出人幹擾素樣生物學活性的非天然存在的蛋白質，其中所述蛋白質具有與SEQ ID No :2至少95%同一的胺基酸序列，並且其中所述蛋白質具有相比HuIFN-α 2b而言增強的抗病毒和抗增殖活性。
51.編碼權利要求50的蛋白質的多核苷酸。
52.包含權利要求50的蛋白質的組合物。
53.具有SEQID No :2的胺基酸序列或其片段的蛋白質，其表現出人幹擾素樣生物學活性。
54.編碼權利要求53的蛋白質的多核苷酸。
55.多核苷酸，其選自SEQID No :3_17的多核苷酸。
全文摘要
本發明涉及重組人幹擾素樣蛋白。在一個實施方案中，描述了通過基因改組技術獲得的重組蛋白，其具有相比天然存在的人幹擾素α2b(HuIFN-α2b)而言增強的抗病毒和抗增殖活性。本發明包括編碼所述蛋白質的多核苷酸以及含有該多核苷酸的重組載體和宿主細胞。優選地，所述多核苷酸選自其中每個多核苷酸具有與SEQ ID No1至少93％同一的序列的多核苷酸的組，和所述蛋白質選自其中每個蛋白質具有與SEQ ID No2至少85％同一的胺基酸序列的蛋白質的組。所述蛋白質和包含所述蛋白質的組合物可用於治療對幹擾素療法作出響應的病狀，例如病毒疾病和腫瘤。
文檔編號C12N15/20GK102250918SQ20111015508
公開日2011年11月23日 申請日期2007年6月22日 優先權日2007年6月18日
發明者劉龍斌, 張瑞, 徐靜, 李季枝, 杜勇, 毛春生, 王凌, 王海濤 申請人:諾瓦根控股公司