轉基因高油酸油菜w-4事件外源插入左邊界旁側序列及應用的製作方法

2023-09-19 22:44:45

專利名稱：轉基因高油酸油菜w-4事件外源插入左邊界旁側序列及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及農業生物技術領域中甘藍型轉基因高油酸油菜的檢測，具體地說，涉 及一種甘藍型轉基因高油酸油菜w-4外源基因整合事件的外源插入載體(pCNFIRnos)左邊 界旁側序列及應用。
背景技術：
油酸是一種18碳單不飽和脂肪酸，是植物油脂的重要組成部分。油酸能降低低密 度脂蛋白膽固醇(LDL)水平，維持高密度脂蛋白膽固醇(HDL)含量；油酸比亞油酸和亞麻酸 等多不飽和脂肪酸穩定，耐高溫不易被氧化；高油酸菜籽油不僅有益於人們的身體健康，而 且耐儲藏。發展高油酸油菜是目前油菜品質育種的一個重要組成部分。通過基因工程途徑抑制油菜種子中油酸脫飽和酶基因(fad2)表達是提高油酸含 量的重要策略。這在國內外均有成功的報導。江蘇省農業科學院經濟作物研究所成功構建甘藍型油菜fad2基因的ihpRNA表達 載體(pCNFIRnos)，並通過農桿菌介導法轉入甘藍型油菜，獲得油酸含量高達84%以上的 甘藍型轉基因高油酸油菜品系W-4。近年來，轉基因玉米、大豆、棉花、油菜、水稻等作物已經在很多國家獲準種植和商 品化，一些轉基因農作物被加工成食用油、食品或飼料。鑑於轉基因農作物的生態安全或食 用安全一直倍受爭議，30多個國家和地區相繼實施了轉基因產品標識制度。轉基因產品的檢測主要依據轉基因產品中外源基因的序列信息、外源基因在植物 表達載體上的組合方式，以及外源基因在受體基因組中的整合位點，而建立起來的方法。不 同的方法各有利弊。1.基因特異性檢測方法一個特定的基因具有特定的序列特徵，即特異性，以此特徵建立的檢測方法對於 檢測特定基因的存在與否是十分有效的，但是，問題是大量的轉基因載體使用了相同的基 因，因此，基因特異性檢測無法區別不同來源的轉了相同基因的轉基因產品。2.載體特異性檢測方法不同的植物表達載體其T-DNA內部基因元件之間的組成或排列具有一定的特徵。 可以依據這些特徵鑑別使用了類似基因元件的不同植物表達載體。但是同一個表達載體可 能獲得一個以上的轉化植株，甚至可能被轉化到不同的物種中，而這些轉化株未必全部通 過了轉基因的安全評估。因此，載體特異性檢測方法不能識別不同的轉基因品系。因此也 無法判別該轉基因產品是否通過了轉基因安全評估。3.事件特異性的檢測方法鑑於獨立的轉基因事件中，外源基因在受體基因組中的整合位點具有隨機性，即 使相同的載體多次轉化，整合的位置也是不可重複的，因此，外源基因的整合位點具有高度 的特異性。可以利用整合位點的序列特徵，開發出轉基因事件特異性的檢測方法。應用於轉基因產品的定性定量分析。分離外源基因插入位點的旁側序列是建立事件特異性檢測方法的基礎。由於外源 基因在整合過程中，T-DNA和基因組之間可能發生重組，導致T-DNA邊界的部分缺失。增加 了分離插入位點旁側序列的難度。2000年2月，歐盟特別資助了 Qpcrgmofood European Project項目，該項目已經成功分離得到多個品種旁側序列並應用於建立轉基因事件的特 異性檢測。國內中國農業科學院油料作物研究所盧長明研究員實驗室也相繼獲得了多種轉 基因油菜的旁側序列，並建立了相應的事件特異性檢測方法。經對現有專利和其他文獻的檢索，尚未發現關於甘藍型轉基因油菜W-4事件外源 基因插入載體(pCNFIRnos)左邊界旁側序列和利用此序列建立的事件特異性PCR檢測的報導。

發明內容
技術問題本發明目的提供一種甘藍型轉基因高油酸油菜W-4事件外源插入載體 旁側序列及其應用。技術方案本發明是這樣實現的本發明以甘藍型轉基因高油酸油菜品系W-4為材料，利用TAIL-PCR技術擴增獲得 W-4事件外源插入載體左邊界旁側序列SEQ ID NO. 1。由來源於油菜基因組序列1至365 個鹼基和來源於外源插入載體序列525個鹼基共同組成。甘藍型轉基因高油酸油菜W-4事件外源插入載體左邊界旁側序列SEQ ID NO. 1，序 列總長度890鹼基，其特徵是第1至365個鹼基來源於油菜基因組序列；
第366至890個鹼基來源於外源插入載體序列。上述甘藍型轉基因高油酸油菜W-4事件外源插入載體邊界旁側序列的應用(1)利用該序列特徵設計的甘藍型轉基因高油酸油菜外源基因整合事件W-4的事 件特異性定性PCR檢測方法；(2)利用該序列特徵設計的甘藍型轉基因高油酸油菜外源基因整合事件W-4的事 件特異性定量PCR檢測方法；(3)利用該序列特徵設計的甘藍型轉基因高油酸油菜W-4的品系特異性定性定性 PCR檢測方法；(4)利用該序列特徵設計的甘藍型轉基因高油酸油菜W-4的品系特異性定性定量 PCR檢測方法；有益效果與現有技術相比，本發明的具有的優點和效果如下1.本發明首次公開甘藍型轉基因高油酸油菜W-4事件外源基因插入載體左邊界 旁側序列。2.本發明首次分析並確認甘藍型轉基因高油酸油菜W-4事件插入載體左邊界序 列中不同鹼基來源，並確定外源插入載體序列和油菜基因組序列的接合位點。3.利用本發明發現的序列特徵，建立甘藍型轉基因高油酸油菜W-4事件以及甘藍
4型轉基因高油酸油菜品系W-4特異性定性PCR檢測方法。4.利用本發明發現的序列特徵，可以建立甘藍型轉基因高油酸油菜W-4事件以及 甘藍型轉基因高油酸油菜品系W-4特異性定量PCR檢測方法。5.本發明適用於建立甘藍型轉基因高油酸油菜W-4事件以及甘藍型轉基因高油 酸油菜W-4的其他事件特異性PCR檢測方法等方面。


圖1-甘藍型轉基因高油酸油菜W-4事件左邊界結合位點，其結合位點特徵序列。圖2-甘藍型轉基因高油酸油菜W-4事件特異性定性PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠 電泳圖譜。其中1-非轉基因油菜Westar基因組DNA模板，引物對LBFN1/LBR2 ；2-非轉基因油菜Westar基因組DNA模板，引物對LBFN2/LBR2 ；3-非轉基因油菜Westar基因組DNA模板，引物對LBFN3/LBR2 ；M DNA 分子量 Marker4-甘藍型轉基因高油酸油菜W-4基因組DNA模板，引物對LBFN1/LBR2 ；5-甘藍型轉基因高油酸油菜W-4基因組DNA模板，引物對LBFN2/LBR2 ；6-甘藍型轉基因高油酸油菜W-4基因組DNA模板，引物對LBFN3/LBR2 ；
具體實施例方式(一 )甘藍型轉基因高油酸油菜W_4(公知公用，見轉基因高油酸甘藍型油菜新種 質的獲得陳松，等江蘇農業學報，2009，25 (6) :1234 1237)事件外源基因插入位點載體 (pCNFIRnos)左邊界旁側序列的TAIL-PCR擴增。(1)甘藍型轉基因高油酸油菜W-4基因組DNA提取採用CTAB方法。取0. 5g葉 片放在研缽中，加液氮研磨成粉末；轉移至2. Oml離心管中；加入1.5ml提取緩衝液(2% CTAB, IOOmM Tris, 20mMEDTA, 1. 4M NaCl, ρΗ8· 0)，混勻；65°C水浴 1. 5 小時；加氯仿異戊 醇溶液(24 1)600 μ 1，上下顛倒數次混勻；13000rpm，離心15min ；取上清液於新的2ml離 心管中，加等體積氯仿異戊醇溶液(24 1)，上下顛倒混勻；離心，收集上清液，加0.6體 積異丙醇，置室溫下15分鐘以沉澱DNA ； lOOOOrpm，離心，IOmin ；去上清，收集沉澱；用70% 乙醇清洗沉澱2次；棄乙醇，真空乾燥5min ；DNA用600 μ 1無菌水溶解；_20°C保存備用。(2) TAIL-PCR擴增用引物設計根據fad2基因的ihpRNA表達載體pCNFIRnos (公 知公用，見甘藍型油菜種子特異性表達fad2基因的ihpRNA載體構建，陳松，等中國油料作 物學報，2006，28 (3) 251-256)的T-DNA左邊界序列設計特異性引物，序列如下LBFNl 5' TAG CGT TGG CTA CCC GTG ATA TTG CTG AAG AGC TT 3'；LBFN2 5' TTC TAT CGC CTT CTT GAC GAG TTC TTC TGA GC 3'；LBFN3 5' AGT TTC TCC ATA ATA ATG TGG AGT AGT TCC CA 3'；隨機引物 AD2 參考 Liu (1995)等(Liu Y-G, N. Mitsukawa and Τ. Oosumi. (1995) Efficientisolation and mapping of Arabidopsis thaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetricinterlaced PCR. Plant Journal 8:457—463.) :5' NGT CGA(G/C)(A/T)G ANA(A/T)GA A3'。(3)第一輪TAIL-PCR擴增以IOOng的基因組DNA作為模板，在20 μ 1的反應體 系中，含IOX緩衝液2μ 1，0. 2mM dNTPs,2. 5mM MgC12，引物濃度0. 25 μ M，左邊界引物組 合 LBFN1/AD2，IU 的 Tag 酶(TaKaRa)；反應條件:95V 2min ；94°C lmin，62°C lmin，72°C 2. 5min，循環 5 次；94°C lmin，25°C 3min,ramp to 72°C 3min，72°C 2. 5min ；94°C 30sec, 68°C lmin,72°C 2. 5min,94°C 30sec,68°C lmin,72°C 2. 5min,94°C 30sec,44°C lmin, 72°C 2. 5min，循環 15 次；72°C 5min ；(4)進行第二輪P°C R時，將第一輪的產物稀釋50倍，取1 μ L作為模板，引物組 合分別為 LBFN2/AD2 ；反應條件94°C 30sec，64°C lmin, 72°C 2. 5min,94°C 30sec，64°C lmin，72°C 2. 5min,94°C 30sec，44°C lmin，72°C 2. 5min，循環 15 次；72°C 5min ；(5)在第3輪PCR時，將第二輪的產物稀釋50倍，取1 μ L作為模板，引物組合分別 為 LBFN3/AD2 ；反應條件:94V lmin, 44°C lmin，72°C 2. 5min，循環 30 次；72°C 5min ；(6) 瓊脂糖凝膠電泳同時檢測第2輪、第3輪擴增產物，參比第2輪擴增產物， 選擇第3輪擴增產物中大小與預期結果相符的條帶，回收、克隆並測序。(7)第3輪TAIL-PCR產物回收採用北京天恩澤基因科技公司出品的DNA凝膠回 收試劑盒。(8)第3輪TAIL-PCR產物克隆採用北京全式金生物技術有限公司出品的 pEASY-ΤΙ克隆試劑盒。取4 μ 1 TAIL-PCR擴增產物與1 μ 1 pEASY-Tl克隆載體(北京全式 金生物技術有限公司出品)室溫下連接5分鐘；加連接產物於50 μ 1 Transl-Tl感受態細 胞(北京全式金生物技術有限公司出品)中，冰浴下25分鐘；42°C熱激40秒，立即置冰上 2分鐘；加800 μ 1 SOC溶液，於37°C下，振蕩培養1小時。(9)取上述培養液100 μ 1塗布於含50mg/L卡那黴素的LB固體培養基上，37°C培 養過夜。(10)挑取單克隆，於1. 5ml含50mg/L卡那黴素的LB液體培養基中培養過夜，抽取 質粒DNA，限制性酶切鑑定重組子。(11)篩選出陽性重組子克隆送上海英俊公司測序。將序列手工去除pEASY-Tl克 隆載體序列後，通過NCBI網站進行序列比對分析和載體序列掃描，確定插入載體左邊界與 油菜基因組的結合位點。(二)應用方法(1)利用本發明提供的旁側序列設計轉基因高油酸油菜W-4事件和轉基因高油酸 油菜品系W-4的事件特異性定性PCR檢測方法。(2)共設計合成的3對巢式引物序列如下LBFNl 5' TAG CGT TGG CTA CCC GTG ATA TTG CTG AAG AGC TT 3' /LBR25' CTA TGT GCA GGG TTG TGC CTG AAAA 3'；LBFN2 5' TTC TAT CGC CTT CTT GAC GAG TTC TTC TGA GC 3' /LBR25『 CTA TGTGCA GGG TTG TGC CTG AAAA 3'；LBFN3 5' AGT TTC TCC ATA ATA ATG TGG AGT AGT TCC CA 3' /LBR25『 CTA TGTGCA GGG TTG TGC CTG AAAA 3'(3)分別提取甘藍型轉基因高油酸油菜W-4，非轉基因油菜Westar基因組DNA，以
6此為模板，用上述3組引物對組合進行PCR擴增。在20μ 1 的反應體系中，含 IOX 緩衝液 2μ 1，0. 2mM dNTPs,2. 5mM MgC12，引物 濃度0. 25 μ M，左邊界引物組合依次為LBFN1/AD2，LBFN2/AD2, LBFN3/AD2, IU的Tag酶 (TaKaRa)；反應條件95°C 4min ；94°C 45sec，58°C 45sec，72°C循環 35 次；72°C 5min。 PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色後，鑑定是否存在特異性擴增產物，且條帶大小依 次為:813bp，709bp，625bp。(三)實驗結果(1)甘藍型轉基因高油酸油菜W-4事件外源插入載體左邊界旁側序列的TAIL-PCR 擴增與測序分析。通過TAIL-PCR的3輪擴增，以轉基因高油酸油菜W_4基因組DNA為模板，獲得一大 小約600bp的擴增產物，經過克隆、測序，及人工剔除克隆載體pEASY-Tl序列後，獲得大小 為641bp的序列。進一步網上Blastn分析，發現其中276bp與插入載體左邊界序列同源， 該轉基因事件中，其左邊界重複序列保持完整，只是發生一個鹼的顛換，由C顛換成了 T。通 過進一步與插入載體序列拼接產生一總長度為890bp的左邊界旁側序列。其中第1-365鹼 基為油菜基因組序列，第366-890鹼基為插入載體序列。在此序列中可以清楚找到所設計 的引物LBFNl，LBFN2和LBFN3的位點。具體轉基因高油酸油菜W-4事件外源插入載體左邊 界旁側序列見序列SEQ IDN0. 1。上述分析顯示的序列包含轉基因高油酸油菜W-4事件外源插入載體左邊界序列 特點，其結合位點特徵序列如圖1所示。第1-365鹼基為油菜基因組序列，與插入載體 pCNFIRnos的T-DNA(transfer_DNA)左側序列序列相鄰；第366-890鹼基為插入載體上 T-DNA的左側序列。(2)利用本發明所提供的旁側序列設計轉基因高油酸油菜W-4事件和轉基因高油 酸油菜品系W-4的事件特異性定性PCR檢測方法。以轉基因高油酸W-4、非轉基因油菜Westar基因組DNA為模板，利用W-4事件外 源插入載體左邊界旁側序列特異性引物LBR2來自油菜基因組序列；LBFN1、LBFN2和LBFN3 來自載體序列。其位置如圖1所示。應用引物組合LBFN1/LBR2、LBFN2/LBR2、LBFN3/LBR2進 行PCR擴增，結果如圖2所示。只有轉基因高油酸油菜W-4可以擴增出大小分別為813bp， 709bp，625bp的產物，而非轉基因油菜則無此特異性產物。因此，可以認為此引物組合具有 很好的特異性，適合於事件特異性檢測。
權利要求
轉基因高油酸油菜W 4事件外源插入載體左邊界旁側序列，其特徵在於，由來源於甘藍型油菜基因組序列和來源於外源插入載體的序列共同組成的DNA序列，即為甘藍型轉基因高油酸油菜W 4事件外源插入載體左邊界旁側序列SEQ ID NO.1，其中(1)SEQ ID NO.1的第1 365鹼基來源於油菜基因組序列；(2)SEQ ID NO.1的第366 890鹼基來源於外源插入載體。
2.權利要求1所述轉基因高油酸油菜W-4事件外源插入載體左邊界旁側序列的應用， 其特徵是利用該旁側序列設計甘藍型轉基因高油酸油菜外源基因整合事件W-4的事件特 異性定性PCR檢測方法。
3.權利要求1所述轉基因高油酸油菜W-4事件外源插入載體左邊界旁側序列的應用， 其特徵是利用該旁側序列設計甘藍型轉基因高油酸油菜W-4品系的特異性定性PCR檢測 方法。
全文摘要
本發明公開一種轉基因高油酸油菜W-4事件外源插入載體左邊界旁測序列及其應用，涉及農業生物技術領域中轉基因油菜的檢測。本發明以甘藍型轉基因高油酸油菜W-4為材料，獲得W-4事件外源插入載體左邊界旁側序列，見序列1。其中第1-365鹼基為油菜基因組序列，第366-890鹼基為載體序列。本發明依據旁側序列設計特異性引物，建立了甘藍型轉基因高油酸油菜外源基因整合事件W-4的事件特異性定性PCR檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK101967478SQ20101051369
公開日2011年2月9日 申請日期2010年10月20日 優先權日2010年10月20日
發明者付三雄, 周曉嬰, 張潔夫, 戚存扣, 浦惠明, 胡茂龍, 陳新軍, 陳松, 陳鋒, 顧彗, 高建芹, 龍衛華 申請人:江蘇省農業科學院