一種修飾龍舌蘭麻sod凍乾粉的製備方法

2023-09-20 06:02:15

一種修飾龍舌蘭麻sod凍乾粉的製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種修飾龍舌蘭麻SOD凍乾粉的製備方法，屬於有機合成及應用【技術領域】，其以微波輔助琥珀酸酐（SA）和N-羥基琥珀醯亞胺（NHS）活化單甲氧基聚乙二醇（mPEG）為活化修飾劑，以龍舌蘭麻超氧化物歧化酶（SOD）為修飾對象，製備修飾龍舌蘭麻SOD修飾物。該活化修飾劑製備方法，利用微波輔助加熱，大大縮短活化時間，提高活化效率；該龍舌蘭麻SOD利用上述活化修飾劑進行修飾，製備修飾SOD修飾物；所得修飾物耐熱、耐酸鹼，以及抗蛋白酶解能力均比天然龍舌蘭麻超氧化物歧化酶高，免疫原性下降或消除。
【專利說明】一種修飾龍舌蘭麻SOD凍乾粉的製備方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種植物SOD凍乾粉的製備方法，具體涉及一種修飾龍舌蘭麻SOD凍乾粉的製備方法，屬於有機合成及應用【技術領域】。

【背景技術】
[0002]超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是一類廣泛存在於生物體內的金屬酶，與銅(Cu)、鋅(Zn)、鐵(Fe)、猛(Mn)等微量元素(tace elements)代謝有密切關係。SOD是生物體內一種重要的氧自由基清除劑，能夠平衡機體的氧自由基，從而避免當機體內超氧陰離子自由基濃度過高時引起的不良反應，在防輻射、抗衰老、消炎、抑制腫瘤和癌症、自身免疫治療等方面顯示出獨特的功能，受到國內外學者和研究者的廣泛關注，研究領域已涉及到化學、生物學、醫學、食品科學和畜牧獸醫學等多個學科。因此，深入研究SOD及其與機體內銅、鋅、鐵、錳等元素代謝的關係，不僅有著重要的理論意義，而且具有重要的實用價值。
[0003]目前所用SOD產品多為從人血或動物血液中提取，但隨著國際上狂牛症、口啼疫等傳染性疾病的蔓延，動物血液中提取的SOD的使用給人們帶來了不少的危險因素。因此，從植物、菌類中提取S0D，食用安全性高、資源豐富、價廉，具有廣闊的開發前景。
[0004]為了提高超氧化物歧化酶的穩定性，應對超氧化物歧化酶分子進行必要的修飾改造。目前對SOD分子進行分子修飾改造的途徑包括對SOD胺基酸殘基進行化學修飾、用水溶性大分子對SOD胺基酸進行共價修飾、對SOD進行酶切修飾。修飾酶不僅完全保留了天然酶的活性，較天然酶穩定，而且在耐熱、耐酸、耐鹼和抗胃蛋白酶水解能力等方面明顯優於天然酶。CN201010137185.2公開了一種SOD修飾生產工藝，以動物血SOD酶作為修飾對象，採用高純度月桂醯氯做修飾劑；CN201410062990.1公開了一種月桂酸修飾超氧化歧化酶的方法，其將牛血Cu/Zn — SOD溶於弱鹼性緩衝液中，再加入活化後的月桂酸進行修飾。雖然其兩個專利用小分子對SOD分子進行修飾，人體的吸收利用率提高，但是產品的穩定性不夠高，一定程度上限制了其應用，且存在製備成本較高的問題。趙華的《聚乙二醇修飾超氧化物歧化酶的初步研究》(現代生物醫學進展，2008，8 (02):277-279)中分子量為6000Da的活化聚乙二醇(PEG)為修飾劑，對玉米超氧化物歧化酶(SOD)進行共價修飾，PEG — 6000利用氰脲醯氯進行活化，但是該種方法利用在其他植物SOD物中，未必能達到理想效果。
[0005]目前，我國熱帶亞熱帶地區正大量種植龍舌蘭麻，但對其開發利用，主要在於提取纖維以製作纜繩、地毪、麻布等,而龍舌蘭麻中寶貴的SOD等生物活性物質則與廢液一起棄去，如能從龍舌蘭麻中提取高附加值的酶，將大大提高龍舌蘭麻的利用率，並降低SOD製備成本。本發明以微波輔助琥珀酸酐和N-羥基琥珀醯亞胺活化單甲氧基聚乙二醇所得單甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀醯亞胺酯為活化修飾劑，以龍舌蘭麻超氧化物歧化酶為修飾對象，製備龍舌蘭麻超氧化物歧化酶修飾物，開發一種經濟有效的穩定性高、應用範圍廣的植物 S0D。


【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一種修飾龍舌蘭麻SOD凍乾粉的製備方法，以微波輔助琥珀酸酐(SA)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化單甲氧基聚乙二醇(mPEG)為活化修飾劑，以龍舌蘭麻超氧化物歧化酶(SOD)為修飾對象，製備修飾龍舌蘭麻SOD修飾物。該活化修飾劑製備方法，利用微波輔助加熱，大大縮短活化時間，提高活化效率。該龍舌蘭麻SOD利用上述活化修飾劑進行修飾，製備修飾SOD修飾物。
[0007]—種單甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀醯亞胺酯的微波輔助合成及用途，包括以下步驟:
A.微波輔助活化單甲氧基聚乙二醇(mPEG)合成活化修飾劑:
將10(Γ120份質量mPEG，3?6份質量SA, 80^120份質量DMF混合均勻；將混合物置於微波爐回流裝置中，選擇功率1(Γ90%，微波輻射3飛O分鐘，停止輻射；待混合物冷卻到室溫，攪拌下加入無水乙醚或石油醚，使沉澱完全；抽濾，棄濾液留沉澱；攪拌下向所得沉澱中加入有機溶劑，直到沉澱完全溶解，抽濾，棄沉澱留濾液；在所得濾液中再加入無水乙醚或石油醚使其沉澱完全，抽濾，棄濾液留沉澱；重複上述操作3飛次，得到中間產物I，即單甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯(mPEG-S);所述上述操作是指攪拌下向所得沉澱中加入有機溶劑，直到沉澱完全溶解，抽濾，棄沉澱留濾液；在所得濾液中再加入無水乙醚或石油醚使其沉澱完全，抽濾，棄濾液留沉澱；
在4(T45°C下熱浴，在中間產物I中加入3?5份質量NHS、8(Tl20份質量DMF和5?8份質量二環己基碳二亞胺(DCC)，混合均勻，取出，置於室溫下過夜；反應混合物再次置於4(T45°C下熱浴，直至混合物中的沉澱不再溶解為止；取出，趁熱抽濾，棄濾渣留濾液；向所得濾液滴加無水乙醚或石油醚使其沉澱完全，抽濾；所得沉澱用有機溶劑溶解後，加入無水乙醚或石油醚使其沉澱完全，抽濾；重複上述操作3飛次；最後將所得沉澱真空乾燥，為最終產物II，即:活化修飾劑單甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀醯亞胺酯(mPEG-SS)；
B.mPEG-SS修飾龍舌蘭麻SOD
將龍舌蘭麻SOD粉和mPEG-SS，按1:10?1:80摩爾比溶解於350?550份0.lmol/LpH9.2硼酸鹽緩衝溶液，室溫振蕩反應I?3小時，然後在反應液中加入10(Γ150份體積冷ΡΗ7.0的lmol/L磷酸鹽緩衝溶液(PBS)終止反應，所得混合溶液用3?50mmol/L pH7?8的PBS緩衝溶液透析、濃縮，立即上預先平衡好的S^hadex葡聚糖凝膠層析柱洗脫分離，收集280nm第一峰，冷凍乾燥得修飾龍舌蘭麻SOD凍乾粉。
[0008]步驟A所述的有機溶劑為DMF、二氯甲烷、三氯甲烷或四氯化碳；所述的冷磷酸鹽緩衝溶液的溫度為O飛。C。
[0009]步驟B所述的龍舌蘭麻SOD粉為龍舌蘭麻SOD凍乾粉。
[0010]本發明相對於現有技術的有益效果是:
(I)本發明提供的活化修飾劑製備方法利用微波輔助加熱，大大縮短活化時間，提高活化效率；(2)龍舌蘭麻SOD利用上述活化修飾劑進行修飾，所得修飾物耐熱、耐酸鹼穩定性，以及抗蛋白酶解能力均比天然龍舌蘭麻超氧化物歧化酶高，免疫原性下降或消除；(3)本發明提供的修飾龍舌蘭麻超氧化物歧化酶來源於天然植物超氧化物歧化酶經修飾後所得，無病毒、無交叉感染，可用於藥品、食品、保健品和化妝品等。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是本發明的技術路線圖；
圖2是本發明mPEG-SS與NHS的紫外吸收光譜，最終產物II (mPEG-SS)與NHS的紫外吸收峰均在260nm左右，說明NHS與修飾劑原料mPEG鍵合了 ；
圖3、4、5是本發明修飾劑原料(mPEG)、活化修飾劑中間產物I (mPEG_S)和最終產物II (mPEG-SS)的紅外吸收光譜，mPEG-S的紅外吸收光譜(圖4)比mPEG的紅外吸收光譜(圖3)多出1735 CnT1處吸收峰，為酯羰基的吸收峰，說明第一步反應進行並生成中間產物I，mPEG-SS的紅外吸收光譜(圖5)比mPEG的紅外吸收光譜(圖3)多出1775cm^\l736 cnT1、1636 cnT1吸收峰，其中1775cm_\l736 cnT1是兩種酯羰基的吸收，1636 cnT1是N-C=O的伸縮振動峰，說明第二步反應進行並生成最終產物II ；
圖6、7是本發明溫度對修飾SOD的影響，其中a為天然SOD，b為修飾SOD ；
圖8是本發明pH對修飾SOD的影響，其中a為天然SOD，b為修飾S0D。

【具體實施方式】
[0012]下面通過實施例對本發明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發明，並不限制本發明的範圍。
[0013]實施例1
A.微波輔助活化單甲氧基聚乙二醇(mPEG)合成活化修飾劑:
將100份質量mPEG，3份質量SA, 80份質量DMF混合均勻；將混合物置於微波爐回流裝置中，選擇功率10%，微波輻射3分鐘，停止輻射；待混合物冷卻到室溫，攪拌下加入無水乙醚或石油醚，使沉澱完全；抽濾，棄濾液留沉澱；攪拌下向所得沉澱中加入DMF，直到沉澱完全溶解，抽濾，棄沉澱留濾液；在所得濾液中再加入無水乙醚使其沉澱完全，抽濾，棄濾液留沉澱；重複上述操作3次，得到中間產物I，即單甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯(mPEG-S)；
在40°C下熱浴，在中間產物I中加入3份質量NHS、80份質量DMF和5份質量二環己基碳二亞胺(DCC)，混合均勻，取出，置於室溫下過夜；反應混合物再次置於40°C下熱浴，直至混合物中的沉澱不再溶解為止；取出，趁熱抽濾，棄濾渣留濾液；向所得濾液滴加無水乙醚使其沉澱完全，抽濾；所得沉澱用DMF溶解後，加入無水乙醚使其沉澱完全，抽濾；重複上述操作3次；最後將所得沉澱真空乾燥，為最終產物II，即:活化修飾劑單甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀醯亞胺酯(mPEG-SS)；
B.mPEG-SS修飾龍舌蘭麻SOD
將龍舌蘭麻SOD粉和mPEG-SS，按1:10摩爾比溶解於350份0.lmol/L pH9.2硼酸鹽緩衝溶液，室溫振蕩反應I小時，然後在反應液中加入100份體積冷pH7.0的lmol/L磷酸鹽緩衝溶液(PBS)終止反應，所得混合溶液用3mmol/L pH7的PBS緩衝溶液透析、濃縮，立即上預先平衡好的S^hadex葡聚糖凝膠層析柱洗脫分離，收集280nm第一峰，冷凍乾燥得修飾龍舌蘭麻SOD凍乾粉。
[0014]實施例2
A.微波輔助活化單甲氧基聚乙二醇(mPEG)合成活化修飾劑:
將120份質量mPEG，6份質量SA, 120份質量DMF混合均勻；將混合物置於微波爐回流裝置中，選擇功率90%，微波輻射60分鐘，停止輻射；待混合物冷卻到室溫，攪拌下加入無水乙醚或石油醚，使沉澱完全；抽濾，棄濾液留沉澱；攪拌下向所得沉澱中加入二氯甲烷，直到沉澱完全溶解，抽濾，棄沉澱留濾液；在所得濾液中再加入石油醚使其沉澱完全，抽濾，棄濾液留沉澱；重複上述操作5次，得到中間產物I，即單甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯(mPEG-S);
在45°C下熱浴，在中間產物I中加入5份質量NHS、120份質量DMF和8份質量二環己基碳二亞胺(DCC)，混合均勻，取出，置於室溫下過夜；反應混合物再次置於45°C下熱浴，直至混合物中的沉澱不再溶解為止；取出，趁熱抽濾，棄濾渣留濾液；向所得濾液滴加石油醚使其沉澱完全，抽濾；所得沉澱用二氯甲烷溶解後，加入石油醚使其沉澱完全，抽濾；重複上述操作5次；最後將所得沉澱真空乾燥，為最終產物II，即:活化修飾劑單甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀醯亞胺酯(mPEG-SS)；
B.mPEG-SS修飾龍舌蘭麻SOD
將龍舌蘭麻SOD粉和mPEG-SS，按1:80摩爾比溶解於550份0.lmol/L pH9.2硼酸鹽緩衝溶液，室溫振蕩反應3小時，然後在反應液中加入150份體積冷pH7.0的lmol/L磷酸鹽緩衝溶液(PBS)終止反應，所得混合溶液用50mmol/L pH8的PBS緩衝溶液透析、濃縮，立即上預先平衡好的S^hadex葡聚糖凝膠層析柱洗脫分離，收集280nm第一峰，冷凍乾燥得修飾龍舌蘭麻SOD凍乾粉。
[0015]實施例3
A.微波輔助活化單甲氧基聚乙二醇(mPEG)合成活化修飾劑:
將110份質量mPEG，5份質量SA, 90份質量DMF混合均勻；將混合物置於微波爐回流裝置中，選擇功率70%，微波輻射50分鐘，停止輻射；待混合物冷卻到室溫，攪拌下加入石油醚，使沉澱完全；抽濾，棄濾液留沉澱；攪拌下向所得沉澱中加入三氯甲烷，直到沉澱完全溶解，抽濾，棄沉澱留濾液；在所得濾液中再加入無水乙醚使其沉澱完全，抽濾，棄濾液留沉澱；重複上述操作4次，得到中間產物I，即單甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯(mPEG-S)；
在42°C下熱浴，在中間產物I中加入4份質量NHSUOO份質量DMF和6份質量二環己基碳二亞胺(DCC)，混合均勻，取出，置於室溫下過夜；反應混合物再次置於42°C下熱浴，直至混合物中的沉澱不再溶解為止；取出，趁熱抽濾，棄濾渣留濾液；向所得濾液滴加無水乙醚使其沉澱完全，抽濾；所得沉澱用三氯甲烷溶解後，加入無水乙醚使其沉澱完全，抽濾；重複上述操作4次；最後將所得沉澱真空乾燥，為最終產物II，即:活化修飾劑單甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀醯亞胺酯(mPEG-SS)；
B.mPEG-SS修飾龍舌蘭麻SOD
將龍舌蘭麻SOD粉和mPEG-SS，按1:70摩爾比溶解於450份0.lmol/L pH9.2硼酸鹽緩衝溶液，室溫振蕩反應2小時，然後在反應液中加入145份體積冷pH7.0的lmol/L磷酸鹽緩衝溶液(PBS)終止反應，所得混合溶液用40mmol/L pH7.8的PBS緩衝溶液透析、濃縮，立即上預先平衡好的S^hadex葡聚糖凝膠層析柱洗脫分離，收集280nm第一峰，冷凍乾燥得修飾龍舌蘭麻SOD凍乾粉。
[0016]實施例4
A.微波輔助活化單甲氧基聚乙二醇(mPEG)合成活化修飾劑:
將120份質量mPEG，3份質量SA, 90份質量DMF混合均勻；將混合物置於微波爐回流裝置中，選擇功率60%，微波輻射40分鐘，停止輻射；待混合物冷卻到室溫，攪拌下加入石油醚，使沉澱完全；抽濾，棄濾液留沉澱；攪拌下向所得沉澱中加入四氯化碳，直到沉澱完全溶解，抽濾，棄沉澱留濾液；在所得濾液中再加入無水乙醚使其沉澱完全，抽濾，棄濾液留沉澱；重複上述操作4次，得到中間產物I，即單甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯(mPEG-S)；
在42°C下熱浴，在中間產物I中加入4份質量NHSUOO份質量DMF和6份質量二環己基碳二亞胺(DCC)，混合均勻，取出，置於室溫下過夜；反應混合物再次置於42°C下熱浴，直至混合物中的沉澱不再溶解為止；取出，趁熱抽濾，棄濾渣留濾液；向所得濾液滴加無水乙醚使其沉澱完全，抽濾；所得沉澱用四氯化碳溶解後，加入無水乙醚使其沉澱完全，抽濾；重複上述操作4次；最後將所得沉澱真空乾燥，為最終產物II，即:活化修飾劑單甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀醯亞胺酯(mPEG-SS)；
B.mPEG-SS修飾龍舌蘭麻SOD
將龍舌蘭麻SOD粉和mPEG-SS，按1:70摩爾比溶解於450份0.lmol/L pH9.2硼酸鹽緩衝溶液，室溫振蕩反應2小時，然後在反應液中加入145份體積冷pH7.0的lmol/L磷酸鹽緩衝溶液(PBS)終止反應，所得混合溶液用40mmol/L pH7.8的PBS緩衝溶液透析、濃縮，立即上預先平衡好的S^hadex葡聚糖凝膠層析柱洗脫分離，收集280nm第一峰，冷凍乾燥得修飾龍舌蘭麻SOD凍乾粉。
[0017]實施例5
A.微波輔助活化單甲氧基聚乙二醇(mPEG)合成活化修飾劑:
將115份質量mPEG，4.5份質量SA, 88份質量DMF混合均勻；將混合物置於微波爐回流裝置中，選擇功率65%，微波輻射50分鐘，停止輻射；待混合物冷卻到室溫，攪拌下加入石油醚，使沉澱完全；抽濾，棄濾液留沉澱；攪拌下向所得沉澱中加入三氯甲烷，直到沉澱完全溶解，抽濾，棄沉澱留濾液；在所得濾液中再加入無水乙醚使其沉澱完全，抽濾，棄濾液留沉澱；重複上述操作4次，得到中間產物I，即單甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯(mPEG-S)；
在42°C下熱浴，在中間產物I中加入4份質量NHSUOO份質量DMF和6份質量二環己基碳二亞胺(DCC)，混合均勻，取出，置於室溫下過夜；反應混合物再次置於42°C下熱浴，直至混合物中的沉澱不再溶解為止；取出，趁熱抽濾，棄濾渣留濾液；向所得濾液滴加無水乙醚使其沉澱完全，抽濾；所得沉澱用三氯甲烷溶解後，加入無水乙醚使其沉澱完全，抽濾；重複上述操作4次；最後將所得沉澱真空乾燥，為最終產物II，即:活化修飾劑單甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀醯亞胺酯(mPEG-SS)；
B.mPEG-SS修飾龍舌蘭麻SOD
將龍舌蘭麻SOD粉和mPEG-SS，按1:70摩爾比溶解於450份0.lmol/L pH9.2硼酸鹽緩衝溶液，室溫振蕩反應2小時，然後在反應液中加入145份體積冷pH7.0的lmol/L磷酸鹽緩衝溶液(PBS)終止反應，所得混合溶液用40mmol/L pH7.8的PBS緩衝溶液透析、濃縮，立即上預先平衡好的S^hadex葡聚糖凝膠層析柱洗脫分離，收集280nm第一峰，冷凍乾燥得修飾龍舌蘭麻SOD凍乾粉。
[0018]利用紫外吸收光譜、紅外吸收光譜對實施例製備出龍舌蘭麻SOD凍乾粉進行鑑定，結果見圖2?5。
[0019]對實施例製備出龍舌蘭麻SOD凍乾粉進行耐熱能力、耐酸鹼能力、抗蛋白酶解能力測定，結果如下:
(I)修飾SOD的耐熱能力測定
天然SOD和修飾SOD分別在25?90°C水浴中保溫2小時，分別取樣測定其活力。在30?50°C，溫度提高，修飾SOD和天然SOD的活力逐漸提高。當溫度大於50°C，修飾SOD活力逐漸下降，而天然SOD的活力迅速下降。說明修飾SOD耐熱性增強。實驗結果如圖6所
/Jn ο
[0020]天然SOD和修飾SOD在70°C的水浴中保溫3.5小時，每隔一定時間取樣測定其活力。隨著時間的延長，二者活力均逐步降低。保溫時間2.5小時，天然SOD活力下降速度明顯較修飾SOD快。說明所得修飾SOD耐熱性提高。實驗結果如圖7所示。
[0021](2)修飾SOD的耐酸鹼能力測定
天然SOD和修飾SOD分別溶於pH4?11緩衝溶液中，混合均勻，25°C保溫2小時，測定其活力。PH4?6，二者活力逐漸升高。pH大於6，二者活力逐漸下降。pH大於9，天然SOD活力迅速下降；而PH大於10，修飾SOD活力下降速度才加快。說明修飾SOD的耐酸鹼能力較天然SOD高，而且修飾SOD的耐酸能力高於耐鹼能力。實驗結果如圖8所示。
[0022](3)修飾SOD抗蛋白酶解能力測定
在天然SOD和修飾SOD分別加入胃蛋白酶或胰蛋白酶，2小時後測定其活力，活力均有所下降。其中，加入胃蛋白酶或胰蛋白酶後測得天然SOD的殘留活力均低於修飾SOD的殘留活力。說明修飾SOD的抗蛋白酶解能力比天然SOD高。因此天然SOD經過修飾後，有效地提高了抗蛋白酶解能力。
【權利要求】
1.一種修飾龍舌蘭麻300凍乾粉的製備方法，其特徵在於:包括以下步驟: 八.微波輔助活化單甲氧基聚乙二醇成郎合成活化修飾劑: 將100?120份質量成郎，3飛份質量「，80^120份質量0即混合均勻得混合物；將混合物置於微波爐回流裝置中微波輻射，停止輻射待混合物冷卻到室溫，攪拌下加入無水乙醚或石油醚，使沉澱完全；抽濾，棄濾液留沉澱；攪拌下向所得沉澱中加入有機溶劑，直到沉澱完全溶解，抽濾，棄沉澱留濾液；在所得濾液中再加入無水乙醚或石油醚使其沉澱完全，抽濾，棄濾液留沉澱；重複上述操作3飛次，得到中間產物1:單甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯III？郎-3；所述上述操作是指攪拌下向所得沉澱中加入有機溶劑，直到沉澱完全溶解，抽濾，棄沉澱留濾液；在所得濾液中再加入無水乙醚或石油醚使其沉澱完全，抽濾，棄濾液留沉澱； 在40?451下熱浴，在中間產物I中加入3飛份質量順3、80?120份質量0即和5?8份質量二環己基碳二亞胺(0(:0,混合均勻，取出，置於室溫下過夜得到反應混合物；反應混合物再次置於4(^451下熱浴，直至混合物中的沉澱不再溶解為止；取出，趁熱抽濾，棄濾渣留濾液；向所得濾液滴加無水乙醚或石油醚使其沉澱完全，抽濾；所得沉澱用有機溶劑溶解後，加入無水乙醚或石油醚使其沉澱完全，抽濾；重複操作3飛次；最後將所得沉澱真空乾燥，為最終產物I1:活化修飾劑單甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀醯亞胺酯成郎-33 ； 8.成郎-「修飾龍舌蘭麻300 將龍舌蘭麻300粉和成郎-33，按1:10?1:80摩爾比溶解於350?550份硼酸鹽緩衝溶液，室溫振蕩反應1?3小時，然後在反應液中加入100?150份體積的冷磷酸鹽緩衝溶液？83，終止反應，所得混合溶液用？83緩衝溶液透析、濃縮，立即上預先平衡好的3印匕如乂葡聚糖凝膠層析柱洗脫分離，收集280=0第一峰，冷凍乾燥得修飾龍舌蘭麻300凍乾粉。
2.根據權利要求1所述的一種修飾龍舌蘭麻300凍乾粉的製備方法，其特徵在於:步驟八所述的有機溶劑為0班^、二氯甲烷、三氯甲烷或四氯化碳。
3.根據權利要求1所述的一種修飾龍舌蘭麻300凍乾粉的製備方法，其特徵在於:步驟八所述的微波輻射的輻射功率為10、0%。
4.根據權利要求1所述的一種修飾龍舌蘭麻300凍乾粉的製備方法，其特徵在於:步驟八所述的微波輻射的輻射時間為3?60分鐘。
5.根據權利要求1所述的一種修飾龍舌蘭麻300凍乾粉的製備方法，其特徵在於:步驟8所述的硼酸鹽緩衝溶液的濃度為0.111101/1，邱為9.2。
6.根據權利要求1所述的一種修飾龍舌蘭麻300凍乾粉的製備方法，其特徵在於:步驟8所述的冷磷酸鹽緩衝溶液？83的濃度為111101/1，邱值為7.0，溫度為0飛I。
7.根據權利要求1所述的一種修飾龍舌蘭麻300凍乾粉的製備方法，其特徵在於:步驟8所述的透析用的？83緩衝溶液的濃度為3?50臟01凡，邱為7?8。
【文檔編號】C12N9/02GK104357410SQ201410615294
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月5日 優先權日:2014年11月5日
【發明者】陳冰 申請人:嶺南師範學院