融合表達豬圓環病毒2型Cap蛋白和生長抑素的重組杆狀病毒及其亞單位疫苗的製作方法

2023-09-19 23:40:45 2

專利名稱：融合表達豬圓環病毒2型Cap蛋白和生長抑素的重組杆狀病毒及其亞單位疫苗的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及融合表達豬圓環病毒2型Cap蛋白和生長抑素SS 的重組杆狀病毒及重組亞單位疫苗。
背景技術：
杆狀病毒表達系統是目前比較成熟的表達系統之一，具有安全無毒，外源表達量高，可以對蛋白進行翻譯後修飾等優點，已經成功用於多種蛋白的生產和疫苗的製備。而 Cap蛋白是由豬圓環病毒2型PCV2的0RF2編碼的大約30kD的衣殼蛋白，包含多個抗原表位和中和抗原表位，已被公認為是PCV2主要的免疫保護性抗原。國外已有用杆狀病毒系統表達Cap製備的商品化疫苗上市使用，並經臨床證明安全有效。生長抑素(SQ是十四個胺基酸的小肽，與下丘腦生長激素釋放因子(GHRF)共同調節生長激素(GH)的釋放，已有研究報導證實通過與載體蛋白融合，主動免疫動物，可使機體產生針對SS抗體，中和體內SSJ^ 除SS的抑制作用，促進動物的生長。本研究將SS與PCV2 Cap融合在杆狀病毒系統中表達， 以期開發一種既可防控PCV2又能促進豬體生長的新型亞單位疫苗。

發明內容
本發明的目的是提供一種融合表達豬圓環病毒2型Cap蛋白和生長抑素的重組杆狀病毒。本發明的另一目的是提供一種能夠有效預防控制PCV2相關疾病的亞單位疫苗， 有效防控PCV2相關疾病。本發明的實施方案如下融合表達豬圓環病毒2型Cap蛋白和生長抑素SS的重組杆狀病毒rAc-Cap-SS，該重組杆狀病毒帶有豬圓環病毒2型Cap蛋白基因開放閱讀框和生長抑素SS基因形成的融合基因0RF2-SS。其中，所述的融合基因0RF2-SS序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的融合表達豬圓環病毒2型Cap蛋白和生長抑素SS的重組杆狀病毒保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2010年12月17日，保藏號 CGMCC No. 4459的。該重組杆狀病毒rAc-Cap-SS在分類上屬於苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒，該重組杆狀病毒可以對目的蛋白進行有效的表達，表達的目的蛋白含量較高，免疫原性較好，並可形成病毒樣顆粒，可用於製備新型PCV2亞單位疫苗和仔豬促生長亞單位疫
田ο本發明重組杆狀病毒是通過以下方法構建而成的(1)0RF2-SS基因的擴增、克隆根據PCV2毒株SH(AY686763)的序列設計擴增Cap 蛋白基因特異性引物以及引入SS基因的引物，引物序列如下Pl :5，CTTGGATCCATGACGTATCCAAGGAG-3『 (SEQ ID NO. 2)
PCV2SS1 :5』 -CTTCCAGAAGAAGTTCTTGCAGCCAGCCATCTTAGGGTTAAGTGGG-3』 (SEQ ID NO. 3)PCV2SS2 :5』 -ATACTCGAGTTACTAACAGGATGTGAAAGTCTTCCAGAAGAAGTTCTTGC-3' (SEQ ID NO. 4)採用常規方法提取PCV2病毒DNA，應用PCR技術分兩次擴增得到引入SS基因的0RF2-SS基因片段，通過BamH I/Xho I酶切位點，將0RF2-SS基因克隆入供體質粒 pFastBac HTB中，通過PCR和酶切鑑定，陽性質粒進一步經測序鑑定，獲得陽性重組質粒 pF-Cap-SS。(2)轉化DHlOBac感受態大腸桿菌參照Bac-to-Bac表達系統說明書的方法將鑑定好的pF-Cap-SS轉化入DHlOBac感受態大腸桿菌，在Helper質粒的輔助作用下，重組質粒pF-Cap-SS和杆狀病毒骨架載體Bacmid之間發生同源重組，實現了把外源基因轉入杆狀病毒骨架載體，經兩次藍白菌落篩選，挑取白色菌落培養，提取重組Bacmid質粒，分別利用 M13F和PCV2SS2以及Pl和M13R進行PCR鑑定，獲得含0RF2-SS基因的重組Bacmid質粒 rBac_Cap_SS。(3)重組杆狀病毒的獲得鑑定好的rBac-Cap-SS通過轉染Sf9細胞，重組質粒在 Sf9細胞內包裝成完整的重組杆狀病毒rAc-Cap-SS。本發明所述的重組杆狀病毒rAc-Cap-SS在製備豬圓環病毒2型疫苗中的應用。所述的重組杆狀病毒rAc-Cap-SS優選保藏號為CGMCC No. 4459的重組杆狀病毒。一種亞單位疫苗，含有所述的重組杆狀病毒rAc-Cap-SS表達的PCV2Cap_SS融合蛋白BCap-SS和佐劑。所述的重組杆狀病毒rAc-Cap-SS優選保藏號為CGMCC No. 4459的重組杆狀病毒。所述的融合蛋白BCap-SS序列如SEQ ID NO. 7所示。所述的亞單位疫苗的製備方法將轉染得到的Fl代重組杆狀病毒rAc-Cap-SS在 Sf9細胞上擴增，獲得F2/3代病毒。Western-blot試驗結果表明BCap-SS蛋白穩定表達， 以接毒後7 表達量最高。將擴增得到的病毒接種Sf9細胞，27°C培養，72小時後收穫細胞，PBS洗滌1次，加入PBS，冰上超聲裂解細胞20min，裂解物經12000rpm，4°C，離心15min 去除細胞碎片，取上清與佐劑混合製備亞單位疫苗。有益效果本發明首次提出了用杆狀病毒表達系統融合表達PCV2 Cap蛋白與生長抑素SS。試驗證明，本發明構建的重組杆狀病毒對外源蛋白表達穩定，而且其效價穩定。通過小鼠免疫和豬體免疫保護試驗證明了表達的重組蛋白能誘導產生了針對PCV2的特異抗體，並可促進增重，在豬體可以提供對PCV2攻毒的保護力，且對人、豬等動物沒有致病性， 容易通過安全性評價。生長抑素(SS)是十四個胺基酸的小肽，與下丘腦生長激素釋放因子(GHRF)共同調節生長激素(GH)的釋放，已有研究報導證實通過與載體蛋白融合，主動免疫動物，可使機體產生針對SS抗體，中和體內SS，解除SS的抑制作用，促進動物的生長。本研究將SS與 PCV2Cap融合在杆狀病毒系統中表達，開發一種既可防控PCV2又能促進豬體生長的新型疫苗。因此在PCV2的防治方面具有廣闊的應用前景。亞單位疫苗含有所述的重組杆狀病毒rAc-Cap-SS表達的PCV2Cap_SS融合蛋白BCap-SS,能夠發揮Cap蛋白和生長抑素SS的雙重功效，用於免疫豬只，既能夠防控PCV2又能促進豬體生長。


圖lPCV2Cap-生長抑素SS基因克隆入載體示意圖。圖2Cap_SS基因重組質粒pF-Cap-SS酶切鑑定結果；1 =PCR 產物對照 2 :pF-Cap-SS 酶切 3 :DNA Marker DL-2000。
圖 3rBac-Cap_SS 質粒的 PCR 鑑定，1 以 Pl 和 M13R 為引物擴增 Bacmid，2，3 以 Pl 和 M13R 為引物擴增 rBac-Cap-SS， 4 :1Kb DNA ladder Marker，5 以 M13F 和 PCV2SS2 為引物擴增 Bacmid，6，7 以 M13F 禾口 PCV2SS2 為引物擴增 rBac-Cap-SS。圖4重組病毒產生的細胞病變(CPE)，A 正常Sf9細胞B :rAc-Cap-SS感染細胞2 :rAc_Cap感染細胞。圖5重組病毒的IFA鑑定，A :rAc-Cap-SS 感染的 Sf9 細胞 B :rAc-Cap 感染的 Sf9 細胞；C 野生型杆狀病毒感染的Sf9細胞D:正常Sf9細胞。圖6重組蛋白表達的Wfestern blot鑑定(A 陽性豬血清；B =SS抗體)；1 :rAc-Cap-SS感染細胞裂解物 2 :rAc-Cap感染細胞裂解物 3 野毒感染細胞裂解物。圖7透射電鏡觀察病毒樣顆粒的形成(A =BCap蛋白；B =BCap-SS蛋白)。
圖8小鼠免疫抗體變化規律。圖9小鼠免疫增重情況。圖10豬體免疫抗體變化規律。圖11豬體免疫後各組RDWG變化情況。圖12豬血清SS水平檢測結果。圖13攻毒後豬體病毒血症檢測結果。圖14豬肺臟、淋巴結組織病理學檢測。圖15豬淋巴結IHC檢測結果。生物材料保藏信息融合表達豬圓環病毒2型Cap蛋白和生長抑素SS的重組杆狀病毒rAc-Cap-SS， 於2010年12月17日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC， 地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCC No.4459。豬圓環病毒2型PCV2-SH毒株，於2008年03月04日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCC No. 2389。
具體實施例方式實施例lPCV2CapSS基因的擴增、克隆和鑑定
1. IPCR引物設計合成根據PCV2毒株SH(AY68676;3)的序列設計擴增Cap蛋白基因特異性引物以及引入 SS基因的引物，引物由上海^witrogen公司合成。引物序列如下Pl :5，CTTGGATCCATGACGTATCCAAGGAG-3』 (SEQ ID NO. 2)PCV2SS1 :5，-CTTCCAGAAGAAGTTCTTGCAGCCAGCCATCTTAGGGTTAAGTGGG-3，(SEQID NO. 3)PCV2SS2 :5』 -ATACTCGAGTTACTAACAGGATGTGAAAGTCTTCCAGAAGAAGTTCTTGC-3' (SEQ ID NO. 4)1.2PCR擴增目的基因採用常規酚氯仿抽提法提取豬圓環病毒2型PCV2-SH毒株(保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2008年3月4日，保藏號=CGMCC No. 2389) 基因組DNA，應用PCR技術分兩次擴增得到引入SS基因的0RF2-SS基因片段。第一次PCR 以PCV2 SH毒株的基因組DNA為模板，以Pl和PCV2SS1為引物；第二次PCR以第一次PCR 產物為模板，以Pl和PCV2SS2為引物。PCR體系=DNA模板2. 0 μ 1，Pl 1. 0 μ 1，PCV2SS1或 PCV2SS2 1. 0μ 1,2. 5mM dNTPs 2. 0 μ 1，無Mg2+緩衝液 2. 5 μ 1，25mM Mg2+L 5 μ 1，Taq DNA 聚合酶0.5μ1，用無菌雙蒸水補至總體積25.0μ1。在PCR儀上進行反應。循環參數為94°C 預變性5min ；94°C變性45s，M°C退火45s，72°C延伸45s，共進行35個循環；然後72°C延伸 IOmin0 PCR產物進行(g/ml)瓊脂糖凝膠電泳。1.3PCR產物的克隆1. 3. IPCR產物回收與純化PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳後，在紫外燈下切下含目的條帶的瓊脂糖膠塊，參照 DNA快速回收純化試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)說明書回收目的片段。1. 3. 2PCR產物酶切與純化酶切反應總體積為20. 0μ 1 :10 Xbuffer 2. 5 μ 1，PCR 回收片段 10. 0 μ 1，BamH I/ Xho I各Ι.ΟμΙ，用無菌雙蒸水補至總體積20.0μ1。37°C作用4.0h，然後進行瓊脂糖凝膠電泳，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對酶切後的產物進行回收，方法同上。1. 3. 3pFastBac HTB 酶切與純化酶切反應總體積為20 μ 1。IOXbuffer 2. 0 μ 1，質粒 pFastBac HTB Qnvitrogen 公司)10. 0 μ 1，BamH I/Xho I各1. 0 μ 1，用無菌雙蒸水補至總體積20. 0 μ 1。37°C作用 4. Oh，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對酶切後的產物進行回收，方法同上。實施例2重組質粒pF-Cap-SS的構建2. 1目的基因克隆入pFaStBaCTMHT B載體通過酶切位點BamH I/Xho I，將1. 3. 2中純化的PCR產物與1. 3. 3中純化的 pFastBac HTB線性大片段連接，從而將0RF2-SS基因克隆入供體質粒pFastBaCTMHTB中(示意圖見圖1)，轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞，挑取單個菌落培養，常規的鹼裂解法提取質粒。通過PCR和酶切鑑定，陽性質粒進一步經測序鑑定，獲得含序列如SEQ ID NO. 1所示的 0RF2-SS基因的陽性重組質粒pF-Cap-SS。2. 2重組質粒的提取和鑑定提取後的重組質粒pF-Cap-SS採用PCR(Pl和PCV2SS2為引物)和BamH I/Xho I雙酶切鑑定，結果見圖2，在PCR和雙酶切鑑定中都可以見到目的條帶。實施例3重組Bacmid質粒rBac-Cap-SS的獲得3. 1大腸桿菌DHlOBac感受態細菌的製備與轉化在卡那黴素(50 μ g/ml)抗性平板上挑取一個新鮮的DHlOBac (Invitrogen)菌落接種於含50yg/ml卡那黴素的5ml LB培養基中，37°C 200rpm過夜振蕩培養；第二天按 1/100體積接種於一新的含卡那黴素的LB培養基中，振蕩培養。取1. 5ml菌液製備感受態細胞，方法參見分子克隆。按照Bac-to-Bac表達系統說明書進行重組質粒pF-Cap-SS 轉化DHlOBac感受態細胞，在DHlOBac中Helper質粒的輔助作用下，重組質粒pF_Cap-SS 和杆狀病毒骨架載體Bacmid之間發生同源重組得到含0RF2-SS基因的重組Bacmid質粒 rBac-Cap-SS，實現了把外源基因轉入杆狀病毒骨架載體，最終以10_\ 10_2兩個梯度塗板。3. 2重組細菌的挑選和質粒提取經過4 培養，挑取平板上大的白色菌落進行第二次藍白斑篩選，挑取二次篩選仍為白色的菌落接種於3. Oml含四環素(10 μ g/ml)、卡那黴素(50 μ g/ml)、慶大黴素(7yg/ml)的LB培養基中，過夜培養；按照說明書提供的方法提取重組Bacmid質粒 rBac-Cap-SS，溶於30 μ 1無菌雙蒸水中，然後進行0. 8% (g/ml)的瓊脂糖凝膠電泳。3. 3重組質粒的PCR鑑定提取的重組質粒rBac-Cap-SS 作為模板，以 Ml3F (5，-GTTTTCCCAGTCACGAC-3，， SEQID NO. 5)、PCV2SS2、P1 以及 M13R(5，-CAGGAAACAGCTATGAC-3，，SEQ ID NO. 6)進行 PCR 鑑定。25. 0μ 1的反應總體積質粒0. 5 μ 1，上、下遊引物各1. 0μ 1,2. 5mM dNTPs 2. 0μ 1， 25mM Mg2+L 5 μ 1,10XMg2+free buffer 2. 5 μ 1，Taq 酶 0. 25 μ 1，加水至終體積 25. 0 μ 1。 PCR循環參數參照Bac-to-Bac表達系統說明書進行，擴增出目的條帶大小約2500bp和 1400bp，結果見圖3。實施例4重組杆狀病毒的獲得與鑑定4. 1重組質粒轉染Sf9細胞轉染在M孔板上進行，在轉染的前一天，在M孔板上的每一孔接種5. OX IO4個 Sf9細胞，每一孔用營養液0. 5ml，營養液含10%的胎牛血清；在轉染前取出_20°C保存的陽離子脂質體轉染試劑I^ransFast Transfection Reagent (Promega)，使之達到室溫並渦漩，如果溶液在管的上部，可以通過離心把它沉到管底；在一個滅菌的EP管中按Iyg質粒加入3 μ L轉染試劑的比例加入rBac-Cap-SS和轉染試劑共11 μ L (重組質粒8 μ L，轉染試劑3 μ L)，然後用無血清的Grace』 s培養基補足體積至200 μ 1，室溫溫育混合物15min ；從溫箱中取出細胞板，棄去上清；把200 μ 1混合物加入細胞孔。然後立即把細胞板放入溫箱中，溫育1. Oh後，輕輕加入0. 5ml室溫的完全生長液，把細胞放入溫箱，每天觀察細胞病變。 轉染同時設立野生型Bacmid轉染對照，以獲得野生型杆狀病毒。4. 2重組病毒的獲得與增殖轉染後每天觀察細胞病變情況，在轉染後3天可以看到細胞出現變大變圓的病變表現(圖4)，繼續培養至第5天，收穫培養上清，2000 X g，離心lOmin，將上清轉移至新的滅菌離心管中，此即為第一代病毒(PI viral stock)。將第一代重組病毒rAc-Cap-SS按 1 10(重組病毒Sf9)的體積比感染處於對數生長期的Sf9細胞，27°C培養3-4d至細胞出現明顯病變時，即可收穫上清得到第二代病毒(P》；用同樣的方法獲得第三代病毒(P3)，每一代病毒均置4°C避光保存。野生杆狀病毒亦用同樣方法擴增保存。4. 3空斑試驗測定重組病毒滴度按照Bac-to-Bac表達系統說明書的方法進行空斑試驗，計算重組病毒的滴度。用營養液將重組病毒作10倍梯度稀釋。然後分別接種於長滿Sf9細胞單層的M孔細胞培養板，每個稀釋度接種2個孔，每孔接種100 μ L。同時設定不接毒的陰性對照。27°C吸附lh， 棄去病毒液，每孔加入配製好的瓊脂0. 5mL，27°C培養7-10天，中性紅染色池後計算每個稀釋度每孔中空斑數量。計算出病毒的滴度可達5Xl(fpfu/mL。4. 4重組病毒的IFA鑑定重組病毒rAc-Cap (本採用引物 Pl 5 『 -CTTGGATCCATGACGTATCCAAGGAG-3 『 (SEQ IDN0. 2)和 P2 5' -CTTCTCGAGTCACTTAGGGTTAAGTGGG-3『 (SEQ ID NO. 8)擴增 Cap 全基因， 克隆入pi^ast載體，轉化DHlOBac獲得重組Bacmid，轉染Sf9細胞得到)(李文良,王先煒， 馬濤，李玉峰，姜平.PCV2SH1分離株Cap蛋白在杆狀病毒中的表達與鑑定.中國獸醫科學 (2010)40(11) :1156-1160.)和rAc-Cap-SS感染培養於96孔板的單層Sf9細胞，同時設野生型杆狀病毒感染和正常Sf9細胞對照，細胞出現病變後，棄培養上清液，PBS洗滌細胞後用預冷的無水乙醇固定，PBS洗2次，加入1 100稀釋的Cap蛋白單克隆抗體，37°C孵育 lh，PBS洗3次，加入1 200稀釋的FITC-羊抗鼠IgG，37°C孵育45min，PBS洗3次，於螢光顯微鏡下觀察，重組病毒感染細胞胞漿內有特異螢光出現，而野生型杆狀病毒感染細胞和正常細胞中無特異螢光出現(圖5)。4. 5ffestern blot 鑑定將擴增得到的重組杆狀病毒rAc-Cap-SS接種Sf9細胞，同時設立野生型杆狀病毒和重組病毒rAc-Cap對照，在感染後7 收取細胞培養物。具體操作為棄去細胞培養上清，加入預冷的0. 01mol/L pH 7. 2PBS洗滌細胞兩次，加入PBS，在冰上超聲裂解細胞，於 40C 12000r/min 離心 15min，吸取上清，加入 5 X Loading Buffer 煮沸處理 5min。取 15 μ L 樣品進行SDS-PAGE，用考馬斯亮藍R-250染色觀察。Western-blot鑑定採用PCV2陽性豬血清(VMRD，pullman，WA，USA)和商品化兔抗 SS多抗(北京博奧森生物公司)進行。SDS-PAGE電泳結束後，採用半乾轉印的方法將蛋白轉印到硝酸纖維素膜上，10%脫脂乳室溫封閉4h，分別加入1 100稀釋的Cap單克隆抗體和1 200稀釋的兔抗SS多抗，室溫孵育2.釙，PBST洗滌3次，加入1 10000稀釋的HRP 標記的羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG (武漢博士德)，室溫孵育1. 5h，PBST洗滌3次，加入化學發光顯色液，在暗室進行X光片顯影，觀察特異性蛋白條帶，結果見圖6，由圖5和圖6可見重組杆狀病毒rAc-Cap-SS能夠對目的蛋白Cap和SS進行有效的表達。將該重組杆狀病毒 rAc-Cap-SS送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)保藏，該中心地址為北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，保藏日期2010年12月17日，保藏號 CGMCC No. 4459。4. 5病毒樣顆粒的形成將重組杆狀病毒rAc-Cap-SS (CGMCC No. 4459)接種Sf9細胞，大量表達重組蛋白 BCap-SS，收穫細胞裂解後4°C 12000r/min離心20min收穫上清，上清60000 X g，4°C，離心 3h,沉澱用PBS重懸，鋪於20-60 %蔗糖上，100000 X g，4°C，離心2h，吸取不同梯度分界面的樣品，進行ffesternblot鑑定，方法同前，選取蛋白含量最高最純的樣品再次超速離心除去蔗糖，沉澱用PBS重懸，進行電鏡觀察，檢測病毒樣顆粒的形成，見圖7，結果表明重組蛋白 BCap-SS可以形成病毒樣顆粒。實施例5亞單位疫苗的製備和小鼠免疫試驗將擴增得到的重組杆狀病毒rAc-Cap和rAc_Cap_SS (CGMCC No. 4459)接種Sf9細胞，27°C培養7 收取細胞培養物。具體操作為棄去細胞培養上清，加入預冷的0. Olmol/ L pH 7. 2PBS洗滌細胞兩次，加入PBS於冰上裂解細胞20min，再於4°C 12000r/min離心 15min,吸取上清，分光光度計測定蛋白濃度，-20°C保存備用。分別取上一步製備的重組蛋白Bcap (rAc-Cap分泌)，BCap-SS，按終濃度0. 5mg/mL 分別加入CP940佐劑，充分混勻，即成亞單位疫苗。取90隻6周齡健康清潔級小白鼠隨機分成3組，每組30隻。BCap、BCap-SS、空白對照(NC)各一組，免疫劑量為0. 2mL，背部皮下多點注射，免疫2次，間隔時間2周，在1免和2免後2周採集小鼠血清做ELISA試驗測定血清抗體水平，結果見圖8。由圖8可見一免後2周可以檢出相應抗體，BCap, BCapSS免疫組抗體效價在1 200左右，2免後抗體效價迅速升高平均可達1 1600，兩個免疫組無顯著差異，空白對照組一直為陰性。首次免疫後第0、14、28、42和56天稱量每隻小鼠體重，計算每組小鼠增重情況。 結果見圖9。由圖9可見第14天時三組無明顯差異，第28天時BCap-SS免疫組增重開始升高，第42天時BCap-SS免疫組增重繼續增加，高於其餘兩組；第56天時，雖然還高於另兩組，但已無明顯差異，說明BCap-SS免疫後能夠在一定時間內促進機體增重。實施例6亞單位疫苗的豬體免疫保護試驗6. 1試驗設計25頭觀日齡斷奶仔豬，經PCR和RT-PCR檢測PCV2和PRRSV為陰性，ELISA檢測抗體陰性。隨機分為5組，每組5頭。第一、二組分別接種PCV2亞單位疫苗(BCap和BCap-SS， 實施例5製備)，第三組接種PCV2滅活疫苗(iPCV2，江蘇南農高科技股份有限公司)，第四、 五組不接種分別作為攻毒對照(CC)和空白對照(NC)，一免後14天前三組分別加強免疫，劑量方法同第一次(表1)。 在第28天每頭豬攻毒2mL (PCV2SH, 105TCID50/mL,滴鼻aiiL，每個鼻孔ImL)，攻毒後第4、7天每頭豬腋下和臀部四點注射經弗氏不完全佐劑乳化的鑰匙孔血藍蛋白(lmg/ mL)，同時腹腔注射IOmL巰基乙酸培養基，第11、19天腹腔注射IOmL巰基乙酸培養基。所有豬在攻毒後25天均剖殺，實驗設計見表1。各組豬隔離飼養，免疫後觀察各免疫組有無異常表現(發熱、腹瀉、精神不好)以及注射部位有無紅腫反應。攻毒後，每天上午測量每頭豬直腸溫度，上下午兩次觀察有無異常臨床表現(精神沉鬱、咳嗽、呼吸困難、皮膚被毛、食慾減退)，並進行打分(0-6分)。首免後14天、觀天，攻毒後7、11、19和25天分別採血，分離血清，用於抗體水平和病毒血症的檢測。首免時、首免後14天、觀天和剖殺時每頭豬分別稱重，用於計算相對日增重(RDWG =(檢測時體重-初始體重)/天數/初始體重)。評價免疫後和攻毒前後各組豬體增重差異。剖殺時觀察每頭豬病變，取淋巴結、肺臟於10%緩衝福馬林固定，用於組織切片製作和免疫組化實驗。表1實驗設計
權利要求
1.融合表達豬圓環病毒2型Cap蛋白和生長抑素SS的重組杆狀病毒rAc-Cap-SS，其特徵在於該重組杆狀病毒帶有豬圓環病毒2型Cap蛋白基因開放閱讀框和生長抑素基因形成的融合基因0RF2-SS。
2.根據權利要求1所述的融合表達豬圓環病毒2型Cap蛋白和生長抑素SS的重組杆狀病毒rAc-Cap-SS，其特徵在於所述的融合基因0RF2-SS序列如SEQ ID NO. 1所示。
3.根據權利要求2所述的融合表達豬圓環病毒2型Cap蛋白和生長抑素SS的重組杆狀病毒rAc-Cap-SS，其特徵在於該重組杆狀病毒保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期:2010年12月17日，保藏號=CGMCC No. 4459。
4.權利要求1所述的重組杆狀病毒rAc-Cap-SS在製備豬圓環病毒2型疫苗中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特徵在於重組杆狀病毒rAc-Cap-SS為保藏號為 CGMCCNo. 4459 的毒株。
6.一種亞單位疫苗，其特徵在於含有權利要求1所述的重組杆狀病毒rAc-Cap-SS表達的豬圓環病毒2型Cap蛋白和生長抑素的融合蛋白BCap-SS和佐劑。
7.根據權利要求6所述的亞單位疫苗，其特徵在於所述的重組杆狀病毒rAc-Cap-SS為保藏號為CGMCC No. 4459的毒株。
8.根據權利要求7所述的亞單位疫苗，其特徵在於所述的融合蛋白BCap-SS序列如 SEQID NO. 7 所示。
9.權利要求6所述的亞單位疫苗的製備方法，其特徵在於將重組杆狀病毒rAc-Cap-SS 接種Sf9細胞，27°C培養，72小時後收穫細胞，PBS洗滌，加入PBS，於冰上超聲裂解細胞，裂解物經12000rpm，4°C，離心15min，取上清測定蛋白濃度後與佐劑混合製得亞單位疫苗。
全文摘要
本發明屬於生物技術領域，涉及融合表達豬圓環病毒2型Cap蛋白和生長抑素SS的重組杆狀病毒及重組亞單位疫苗。融合表達豬圓環病毒2型Cap蛋白和生長抑素SS的重組杆狀病毒保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2010年12月17日，保藏號CGMCC No.4459的。一種亞單位疫苗，含有所述的重組杆狀病毒rAc-Cap-SS表達的PCV2Cap-SS融合蛋白BCap-SS和佐劑。本發明首次提出了用杆狀病毒表達系統融合表達PCV2 Cap蛋白與生長抑素SS該重組杆狀病毒對外源蛋白表達穩定，表達的重組蛋白能誘導產生了針對PCV2的特異抗體，並可促進增重。
文檔編號A61K39/00GK102363770SQ20111030906
公開日2012年2月29日 申請日期2011年10月13日 優先權日2011年10月13日
發明者姜平, 李文良, 李玉峰, 王先煒 申請人:南京農業大學