提高外源蛋白表達的增強子樣基因及其應用的製作方法

2023-09-19 23:27:00

提高外源蛋白表達的增強子樣基因及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種能夠在原核細胞提高外源蛋白表達的原核增強子樣基因，該基因具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列或其截短序列；通過構建融合表達報告基因重組載體篩選出該基因，融合報告基因由人乳頭瘤病毒主要衣殼蛋白L1基因的截短序列L11和氯黴素乙醯轉移酶基因（CAT）組成，將待篩選基因片段和用於篩選的重組載體進行連接、轉化並構建基因文庫，通過提高氯黴素抗性篩選出含有增強子樣基因序列的重組菌株，從而獲得增強子樣序列，該序列能提高融合報告基因重組菌株的氯黴素抗性及外源蛋白的表達水平。
【專利說明】提高外源蛋白表達的增強子樣基因及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，涉及一種提高外源蛋白表達的增強子樣基因序列，用於提高外源蛋白在原核細胞中的表達水平。
【背景技術】
[0002]目前，已經開發出的蛋白表達系統有多種，常用的有大腸桿菌表達系統、酵母表達系統、昆蟲細胞表達系統和哺乳動物細胞表達系統等。大腸桿菌表達系統雖然研究較為成熟，但某些目的蛋白在其中的表達水平仍然很低；酵母表達系統也存在外源基因拷貝數低的問題；哺乳動物細胞表達系統更是存在外源基因不能持久表達、成本高及技術複雜的問題。因此，在這些常用的表達系統中，某些外源基因表達水平低仍然是亟待解決的難題。
[0003]增強子(enhancer，ER)是一類包含轉錄因子結合位點的順式作用元件，對靶基因表達具有激活及增強作用，它的發現為提高外源基因表達水平提供了一個新的方向。隨著對原核生物基因表達調控研究的深入，人們發現原核生物基因組中也存在著一些具有轉錄增強作用的調控模式，這類序列即稱為增強子樣序列(enhancer-Like sequence, ERLS)0常用於提高外源蛋白表達水平的方法主要有增加蛋白表達標籤、優化外源基因表達所需的密碼子以及增加表達系統中外源 基因的拷貝數等，採用增強子樣基因序列提高外源蛋白表達水平使用的還較少，而且很多未知的增強子樣序列尚未被發現。
[0004]增強子長度通常為100_200bp，與啟動子、絕緣子及沉默子等協同作用調控基因的時空表達。無方向性是它的一個重要作用特點，即無論位於啟動子的上遊或下遊，均能激活其相應的啟動子。這種增強活性主要體現在基因表達的水平上，目前已有少數增強子樣序列應用於提高蛋白表達水平。
[0005]基因陷阱(gene trap)是研究基因調控元件與基因功能的一個有力工具。該方法已成功地應用於果蠅、小鼠、擬南芥等重要模式動植物功能基因組的研究(O』 Brochta DAet aL, Proc NatL Acad Sci USA, 2011，108(39): 16339-16344)，並發現了大量新基因。本發明中，增強子樣基因序列的篩選即採用了融合報告基因和基因陷阱的方法，將人乳頭瘤病毒(Human Papilloma virus, HPV)58型主要衣殼蛋白LI基因的截短序列Lll和氯黴素乙醯轉移酶基因(CAT)融合作為增強子樣序列誘捕載體的報告基因，當增強子樣序列插入後，菌株的氯黴素抗性提高，由此，通過增加氯黴素濃度進行大規模篩選，從而獲得相應的能增強基因表達的序列。
[0006]現在已發現的增強子樣序列主要應用於增強低分子量蛋白的表達上，如幹擾素、白細胞介素等。本發明中所使用的融合報告基因可表達出較大的融合蛋白(55KDa)，利用該報告基因篩選的序列也可構建出一種高分子量蛋白表達系統，從而解決一些高分子量蛋白在外源表達系統中產率低 的難題。大腸桿菌是重要的基因工程菌，遺傳背景清楚、操作簡便、快速且成本低廉，成為篩選增強子樣序列的首選。

【發明內容】
[0007]本發明旨在提供一種能夠提高外源蛋白表達水平的原核增強子樣基因，主要目的是要改進外源基因的原核表達系統，該基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或如SEQID NO:1中的I~27Ibp所示的核苷酸序列。
[0008]本發明首先對來自於昆明市呈貢區居民生活汙水樣品和昆明市第四十三解放軍總醫院附近汙水處理廠汙水樣品中的細菌進行富集，然後抽提細菌基因組樣品並對其進行酶切，獲得500bp以下的DNA片段，再將其構建到增強子樣序列篩選重組質粒pET21a-CAT-Lll的啟動子上遊，構建基因文庫，通過融合的氯黴素抗性報告基因篩選含增強子樣序列的菌株，最後對菌株的氯黴素抗性和增強子樣序列來源進行分析並對其增強外源蛋白表達的能力進行檢測。
[0009]本發明通過以下技術方案實現本發明目的:
(O構建含融合報告基因的重組篩選菌株
對雲南省第一人民醫院(雲南省昆華醫院)宮頸癌患者的腫瘤組織樣品進行處理後，抽提DNA，通過PCR方法獲得人乳頭瘤病毒HPV58型LI基因的截短序列LI I，並構建成重組質粒PMD18T-L11，將Lll片段從pMD18T_Lll上酶切下來並通過膠回收純化後，連接至含有報告基因CAT的重組質粒pET21a-CAT上，經酶切鑑定及測序驗證，重組質粒pET2Ia-CAT-L11構建正確。然後採用熱休克法將重組質粒pET21a-CAT-Lll轉化至大腸桿菌表達菌株中，獲得重組篩選菌株 pET2 Ia-CAT-Ll I/BL21 (DE3)。
[0010]大腸桿菌表達菌株可選用萬.BL21 (DE3) coZiBL21 (DE3) pLys、Origam1、Rosetta以及其它可用於表達外源蛋白的原核菌株；
(2)重組菌株抗氯黴素閾值和CAT- Lll融合蛋白表達水平檢測在一定氯黴素濃度梯度的固體A`mp+-LB培養基中，使用IPTG誘導重組篩選菌株pET2Ia-CAT-LlI/BL21 (DE3)，通過記錄生長的菌落數測定菌株的抗氯黴素閾值。同時也使用IPTG誘導液體培養的重組篩選菌pET2Ia-CAT-Ll 1/BL21(DE3)，通過SDS-PAGE檢測融合蛋白CAT-Lll的表達。
[0011](3)基因文庫構建與含增強子樣基因序列菌株的篩選
對待篩選的各汙水樣品進行細菌富集後，獲得菌體，按照《精編分子生物學實驗指南》(科學出版社)中的細菌基因組DNA提取方法得到細菌基因組。利用限制性內切酶將得到的細菌基因組酶切至500bp以下的DNA片段，經膠回收後，將所得片段與重組質粒pET21a-CAT-Lll CBgl Π酶切後再去磷酸化)連接，即利用同尾酶互補連接，將待篩選序列構建到重組質粒的啟動子上遊，然後將其電轉化到疋BL21 (DE3)感受態，構建細菌基因組文庫。之後，使用含高於抗氯黴素閾值的氯黴素選擇性LB培養基篩選出含增強子樣基因序列的重組菌株，對所得菌株進行提質粒並酶切鑑定，再使用氯黴素濃度梯度測定菌株的抗氯黴素閾值，含增強子樣基因序列菌株的篩選即完成。
[0012]發明中所使用的表達載體可以是pET系列、PQE系列、pGEX系列、pMAL系列，以及其他原核表達載體。
[0013](4)序列測定，同源性分析序列來源及其誘導蛋白表達增強活性分析
在增強子樣基因插入位點的下遊設計引物ENHP2，並將質粒和引物送至測序公司測序。利用DNAMAN (5.2.2版)對所測序列和原始載體序列進行比對，以確定插入序列。此外,再將所測序列在NCBI BlastN中進行同源性序列檢索，分析序列來源。[0014]使用IPTG 誘導構建好的重組菌 pET2 Ia-CAT-Ll 1-ER3/BL21 (DE3)和pET2Ia-CAT-LlI/BL21 (DE3)表達蛋白，經SDS-PAGE再次檢測ER3序列是否能夠提高融合蛋白CAT-Lll的表達水平。
[0015]本發明另一目的是將增強外源蛋白表達的原核增強子樣基因應用在增強外源蛋白表達中，將所述增強子樣基因插入到表達載體啟動子的上遊或下遊的鄰近位置，使其作用於該表達載體啟動子。
[0016]與現有技術相比，本發明具有以下有益效果:
1、在目前的表達系統中，經常會出現某些外源基因表達水平低的問題，使得這些基因工程產品的進一步開發受到限制，本發明ER3序列能夠明顯提高重組篩選菌株pET2Ia-CAT-LlI對氯黴素的抗性，且能夠顯著增加人乳頭瘤病毒主要衣殼蛋白LI基因截短序列Lll蛋白的表達。該序列具有增加較大外源基因在原核表達系統中蛋白表達水平的特性。
[0017]2、所用表達載體來自pET系列,ER3序列可用於原核表達系統的所有表達載體,提高了這一序列在各原核表達系統中應用的可能性，這對提高ER3序列的實用性具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是本發明中重組質粒pET21a_CAT酶切鑑定電泳示意圖，其中，泳道1:DNAMarker DL5000 ;泳道 2 -.BamHl、Xho I 雙酶切 I 號菌落質粒 pET21a_CAT ;泳道 3 -.BamHl、Xho I雙酶切2號菌落質粒pET2 Ia-CAT。
[0019]圖2是本發明中重組質粒DET21a-CAT_Lll酶切鑑定電泳示意圖，其中，泳道1:DNAMarker DL5000 ;泳道 2`-5 I和沿ο I雙酶切 1-4 號菌落質粒 pET21a_CAT_Lll ;泳道 6:M/e I 和 Xho I雙酶切 pET2Ia-CAT。
[0020]圖3是本發明中誘導重組菌pET21a-CAT-Lll/BL21 (DE3)表達CAT-L11融合蛋白的SDS-PAGE示意圖，其中，泳道1:Protein Marker ;泳道2:誘導前的pET2Ia-CAT-LlI/BL21 (DE3);泳道 3:誘導後的 pET21a-CAT-Lll/BL21 (DE3);泳道 4:誘導前的 BL21 (DE3)；泳道5:誘導後的BL21 (DE3)。
[0021]圖4是本發明中I酶切基因組並膠回收後的電泳示意圖，其中，泳道1:DNAMarker DL2000 ;泳道2:回收的500bp以下DNA片段。
[0022]圖5是本發明中重組質粒pET2Ia-CAT-L11-ER3的酶切鑑定圖，圖5A中，泳道1:DNA Marker DL5000 ;泳道 2 -.EcoR ? 和 We I 雙酶切 pET2 Ia-CAT-L11 ;圖 5B 中，泳道 I:DNAMarker DL5000 ;泳道2_4 WcoW和M/e I 分別雙切 1、2 和 3 號單菌的 pET21a_CAT-Lll_ER3
重組質粒。
[0023]圖6是本發明中ER3增強CAT-Lll融合蛋白表達的SDS-PAGE電泳圖，其中，泳道I =Protein Marker ;泳道 2:誘導前的 pET21a-CAT-L11-ER3/BL21 (DE3);泳道 3:誘導 4h 後的 pET21a-CAT-Lll-ER3/BL21 (DE3);泳道 4:誘導前的 pET21a_CAT_Lll/BL21 (DE3);泳道5:誘導 4h 後的 pET2Ia-CAT-LlI/BL21 (DE3);泳道 6:誘導前的 BL21 (DE3);泳道 7:誘導4h 後的 BL21 (DE3)。[0024]圖7是本發明中重組質粒pET21a-Lll_ER34的酶切鑑定圖，其中，泳道1:DNAMarker DL5000 ;泳道 2_3 JcoTP V和MZe I 雙酶切 I 號和 2 號菌的 pET2Ia-Ll 1-ER34 重組質粒；泳道4 WcoW和_We I雙酶切pET21a-Lll重組質粒。
[0025]圖8是本發叨屮誘導重組菌pET21a-Lll-ER34/BL21 (DE3)表達Lll蛋白的SDS-PAGE電泳圖，其中，泳道1:誘導前的pET21a-Lll-ER34/BL21 (DE3);泳道2:誘導後的pET21a-Lll-ER34/BL21 (DE3);泳道 3:誘導前的 pET21a_Lll/BL21 (DE3);泳道 4:誘導後的 pET21a-Lll/BL21 (DE3)。
【具體實施方式】[0026]下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明保護範圍不局限於所述的內容；實施例中主要採用常規的基因工程分子克隆的生物學方法，這些方法是本領域普通技術人員所熟知的。按照以下實施例，不難根據具體情況略做修改和變換而成功實施本發明，這些修改和變換均落在本申請權利要求的範圍內。
[0027]實施例1:構建pET21a- CAT-Lll增強子樣序列檢測載體
取雲南省第一人民醫院宮頸癌患者的腫瘤組織，按《精編分子生物學實驗指南》(科學出版社)動物組織基因組DNA提取方法提取樣品基因組，經鑑定，該樣品為人乳頭瘤病毒即￥58型感染，使用引物1^11卩1:5』-GGA ATT CCA TAT GTC TGT TTG GAG ACC TTC_3』;L11P2:5』 -CCG CTC AGA CAG TGA GTC TCC ATA AGG TTC-3』，通過 PCR 擴增獲得 HPV58 型 LI 基因的截短序列LI I，構建成pMD18T-Ll I重組質粒(pMD18T載體購買於TAKARA公司，CK5601C),將該質粒轉化至大腸桿菌DH5a (DH5a購買於TAKARA公司，D9057)，並於37°C振蕩培養重組菌PMD18T-L11/DH5 a，16h後使用質粒小量提取試劑盒(購買於北京莊盟國際生物基因科技有限公司，ZP101-2)，按照質粒抽提說明抽提質粒。
[0028]氯黴素抗性基因CAT來自pACYC184載體(購買於New England BioLabs公司，VKN0287)，通過 PCR 擴增獲得，其上遊引物為 CAT Pl:5』 -TAG CGC GGC CGC AGA GCT CATGGA GAA AAA AAT CAC TG- 3』，其下遊引物為 CAT P2:5』 -CCG CTC GAG TTA CGC CCC GCCCTG CCA CTC- 3』，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。將所獲得的PCR產物純化後回收，取I μ g於37°C利用限制性內切酶及麗71 (購買於TAKARA，CKB701A)和沿ο I (購買於TAKARA, CK2401B)各IOU進行雙酶切，酶切過夜後，通過瓊脂糖膠回收試劑盒(購買於北京莊盟國際生物基因科技有限公司，ZP202-02)回收CAT基因，然後利用相同的酶切位點將回收的CAT基因連接至pET21a (購買於Novagen，69740-3)，經酶切鑑定及測序驗證，重組載體pET21a-CAT構建正確(見圖1)。
[0029]分別用IOU BamHl (來源於 TAKARA，CKB701A)和 IOU Ndel (來源於 TAKARA 公司，CKB701A)於37°C酶切質粒pMD18T_Lll和pET2Ia-CAT,酶切4h後，分別進行膠回收；取Lll和pET21a-CAT酶切純化片段各IOOng以及I μ L T4 DNA連接酶(來源於TAKARA，CK5021B)於20 μ L體系中，16°C連接過夜；通過熱休克法將連接產物轉化至CaCl2法製備的E.colimh α，轉化產物塗布於Amp+-LB選擇性平板上，37°C培養16h，挑取單菌落並接種於Amp+-LB抗性培養液中增菌,使用質粒抽提試劑盒提取質粒，最後使用Me I和ZAo I (來源於TAKARA，1094A)雙酶切鑑定重組質粒，瓊脂糖凝膠電泳觀察，獲得了預期大小的片段(見圖2)，同時，測序結果也表明重組質粒pET21a-CAT-Lll構建成功。
[0030]實施例2:重組菌抗氯黴素閾值和Lll-CAT融合蛋白表達水平檢測
取IOng增強子樣序列檢測質粒pET21a-CAT-Lll與100 μ L Ε.coli BL21(DE3)(購買於Novagen公司，69450-3)感受態混勻，冰水浴30min，42°C溫水浴2min進行熱休克，然後加入Iml LB培養液，37°C振蕩培養45min，離心後棄掉大部分上清並重懸菌體，塗布於Amp+-LB固體培養皿中，於37°C培養12-16h，獲得重組篩選菌株pET21a-CAT-Lll/BL21 (DE3);挑取該單菌落接種到Amp+-LB液體培養基中，於37°C振蕩培養過夜，再按I %的比例接種到Amp+-LB液體培養基，37°C振蕩培養至0D_約為0.5，對菌液進行IO5倍和IO6倍稀釋後，取100 μ L直接塗布在含有ImM IPTG、50y g/ml Amp+以及不同氯黴素(Cam+)濃度梯度的雙抗性固體培養基上，經三次以上重複測定pET2Ia-CAT-Ll I/BL21 (DE3)重組菌株的抗氯黴素閾值在34μ g/ml (見表1重組菌氯黴素抗性生長終濃度檢測結果)。
[0031]另外再挑取上述單菌落，將其接種到Amp+-LB液體培養基，37°C振蕩培養過夜，再按I %的比例接種到Amp+-LB液體培養基，37°C振蕩培養至OD6tltl約為0.5，取適量菌液作為誘導前樣品，之後，在剩餘的菌液中加入IM IPTG至終濃度為lmM，37°C繼續培養，誘導蛋白表達，誘導4h後取出適量樣品進行SDS-PAGE檢測融合蛋白CAT-Lll的表達水平，結果顯示該蛋白有明顯的表達(見圖3)。
[0032]實施例3:基因組提取、酶切及文庫構建
來自於昆明市呈貢區居民生活汙水和昆明市第四十三解放軍總醫院附近汙水處理廠的汙水樣品經振蕩混勻後，取150 μ L加入15ml牛肉膏蛋白腖液體培養基內，於37°C振蕩培養16h，培養液分裝至I Oml離心管，12000gX2min離心，棄上清，並用2ml TE緩衝液將菌體重懸，加入10%的SDS 180yL以及20mg/ml的蛋白酶K 12 μ L，混勻後於37°C孵育lh，再加入5M的NaCl 600 μ L並充分混勻，加入CTAB/NaCl溶液400 μ L，於65°C孵育IOmin ；加入等體積的氯仿，充分混勻後，12000gX5min離心,取上清,加入等體積的酹/氯仿混合液混勻，12000gX5min離心，取上清並分裝至1.5ml的離心管中，700 μ L/管，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻後，於_40°C靜置30min，12000gX IOmin離心，棄上清，然後依次用70%和100%的冰乙醇各Iml漂洗所得沉澱，在室溫條件下，乙醇揮發完全後，再加入50μ L TE緩衝液將沉澱溶解，最後加入2μ L RNase (5mg/ml)消化20min，基因組製備完成。
[0033]取上述製備的基因組DNA 1「8，用限制性內切酶5'故/1^1 (購買於TAKARA，CKA1018) 0.5U於37°C部分酶切lh，回收500bp以下DNA片段(見圖4);取10 μ L酶切並回收的基因組片段，以及300ng經沒貧7 II酶切、FastAP (來源於Fermentas，00087733)去磷酸化後回收的pET21a-CAT-Lll片段，用I μ L T4 DNA連接酶於16°C連接過夜；連接產物經乙醇沉澱純化後，通過電穿孔法將其轉化至疋co7iBL21 (DE3)感受態，電穿孔條件如下:電壓
1.8KV，電極杯1mm，電容2.5 μ F、電阻200 Ω，電轉化後立即加入900 μ L冰冷的SOC培養基，混勻，於37°C振蕩培養30min，將轉化產物塗布於6個Amp+-LB抗性平板上，37°C培養16h後記錄菌落生長數目，再利用IOml Amp+-LB液體培養基將平板上菌落洗脫下來並裝入15ml離心管，即文庫細菌，於_40°C保存。
[0034]實施例4:含增強子樣序列的菌株篩選及其抗抗生素活性增強測定
取保存的文庫細菌10 μ L，利用LB液體培養基進行10倍梯度稀釋，取稀釋了 1000倍的菌液100 μ L塗布於含有ImM IPTG、50 μ g/ml Amp+和102 μ g/ml Cam+的LB固體選擇性培養基進行篩選，同時塗布新鮮培養的pET2Ia-CAT-LlI/BL21 (DE3)作為陰性對照；37°C培養過夜後，獲得能夠在高於抗氯黴素閾值條件下生長的單菌落，命名為pET21a-CAT-Ll 1-ER3/BL21 (DE3)。挑取該單菌落並接種於Amp+-LB培養基中，於37°C振蕩培養過夜，保存菌株。
[0035]採用與實施例2檢測抗氯黴素閾值相同的方法測定通過氯黴素抗性篩選出的菌株 pET2Ia-CAT-Ll1-ER3/BL21 (DE3)的抗氯黴素閾值，結果測出 pET2la-CAT-Ll1-ER3/BL21(DE3)的抗氯黴素閾值為374 μ g/ml，對氯黴素的抗性提高了 10倍(見表1)。提取該菌株的質粒pET2la-CAT-Ll 1-ER3，使用EcoRV (購買於TAKARA，1042A)和Nde I雙酶切鑑定重組
質粒是否已插入基因序列，瓊脂糖凝膠電泳觀察表明，重組質粒中含有ER3插入序列(見圖5)。
[0036]表1:重組菌氯黴素抗性生長終濃度檢測結果
【權利要求】
1.一種提聞外源蛋白表達的增強子樣基因，其核昔酸序列選自: (I)如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列； 或者(2)如SEQ ID NO:1中的I~27Ibp所示的核苷酸序列。
2.權利要求1所述的提高外源蛋白表達的增強子樣基因在增強外源蛋白表達中的應用，其特徵在於:將所述增強子樣基因插入到表達載體啟動子的上遊或下遊的鄰近位置，使其作用於該表達載體啟動子。`
【文檔編號】C12N15/113GK103602684SQ201310591154
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月22日 優先權日:2013年11月22日
【發明者】井申榮, 閆沁男, 王應明, 曾韋錕, 黃芬 申請人:昆明理工大學