一種表達外源基因的重組瘧原蟲及其應用的製作方法

2023-09-19 23:33:35

專利名稱：一種表達外源基因的重組瘧原蟲及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種表達外源基因的重組瘧原蟲及其 應用。
背景技術：
現有的表達載體，特別是用於生物治療和疫苗設計的表達載體，多為細菌 載體或是病毒載體。這些載體因其自身基因組較小，故能表達外源基因的容量 也就較小。用瘧原蟲作為表達載體，特別是作為疫苗的表達載體，有很多自身
獨特的優點1、誘導強烈的天然免疫反應；2、誘導強烈的Thl型免疫反應， 刺激T淋巴細胞增殖，刺激T淋巴細胞分泌IFN-y，並且能夠刺激樹突狀細胞的 成熟，促進抗原的遞呈，作為一種免疫佐劑；3、外源基因的容量大，瘧原蟲不 但能夠表達大的外源基因，而且能夠同時容納，表達多個外源基因，從而可以 同時刺激產生針對多種抗原的免疫反應或表達免疫輔助因子，誘導產生高效的 免疫保護；4、外源基因表達水平高。
但此前，以痴原蟲作為載體表達外源蛋白，仍停留在構建表達體系的基礎 研究階段。有報導採用瘧原蟲表達綠色螢光蛋白(GFP)、螢光素酶(Luciferase) 和氯黴素乙醯轉移酶(CAT)等報告基因和異種的瘧原蟲基因，僅限於基礎研究 範圍。
腫瘤是嚴重威脅人類健康的慢性疾病，腫瘤的治療仍然是目前人類面臨的 重要難題。目前的治療方法主要以化療，放療和手術治療為主，但生物治療越 來越引人注目，逐漸成為一種重要的治療方法，並應用於肺瘤治療。生物治療 是指通過生物反應修飾劑(BRM)對^L體進行治療的一種方法。生物療法的主要作 用是提高患者的全身免疫功能，尤其在腫瘤治療中，現已成為繼外科、放療和化療後最有發展前途的重要的治療手段之一。生物治療的主要特點為1、生物 活性功能多，具有抗腫瘤、抗病毒和免疫調節活性。2、作用範圍廣，在體外這 些生物製劑幾乎對所有腫瘤細胞都有抑制效應。3、對機體的免疫功能有調節增 強作用。
正如前面所述，對機體的免疫調節功能是生物治療的重要特徵之一，而瘧 原蟲感染正好也具有這個特徵。用瘧疾本身作為一種生物療法(瘧疾療法)在 歷史上曾成功地應用於治療神經性梅毒，發明該療法的奧地利醫生Wagner Jauregg因而獲1927年諾貝爾醫學獎。腫瘤的治療性疫苗作為腫瘤生物療法的方 法之一在實驗室中廣泛應用，並在臨床中逐漸推廣。已有文獻報導瘧原蟲感染 能夠直接抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長。但是已有證據表明增強機體對腫瘤特異性 或相關抗原的識別能更有效的加強抑制腫瘤的效果，因此設想表達腫瘤特異性 或相關抗原的重組痴原蟲用於腫瘤治療更加有效。
愛滋病是直接威脅人類健康的重大傳染病。95%以上的感染者生活在發展中 國家。迄今為止，宣傳教育及對高危人群的行為幹預僅能起到減緩傳播速度的 作用，而無法終止其流行。高效抗逆轉錄病毒療法雖然有效但不能達到徹底清 除體內病毒的目的，因而需要終身服藥，對大多數感染者來說價格過於昂貴， 毒副作用較大，容易出現耐藥性。愛滋病疫苗被認定為預防和控制愛滋病的最 有效的武器。-f旦愛滋病疫苗的研製面臨嚴重的"f兆戰，因為4姿傳統的方法研製的 愛滋病疫苗在臨床試驗中累累失敗。近年來，活載體疫苗的研究越來越受到重 視。活載體疫苗是將編碼病毒蛋白的基因插入活的表達載體內，通過表達載體 使外源基因在宿主中表達，由此刺激機體產生更強的特異性免疫應答。這可能 是最有希望的愛滋病疫苗之一。

發明內容
本發明提供一種表達外源基因的重組瘧原蟲，並將該重組瘧原蟲應用於生 物治療和疫苗設計中，尤其是腫瘤的生物治療和HIV疫苗的設計。 本發明的具體技術方案如下
5本發明的一種表達外源基因的重組瘧原蟲，其外源基因包括抗原基因、治 療劑基因、免疫調節劑基因或肽基因。
上述重組疾原蟲應用在生物治療中。
優選的，所述的生物治療包括肺瘤治療。
優選的，上述腫瘤治療為將腫瘤相關抗原基因克隆到表達質粒上，得到 重組質粒，在大腸桿菌中複製後提取並純化，將提取得到的重組質粒轉染到症 原蟲內，得到表達腫瘤相關抗原的重組痴原蟲，最後免疫胂瘤機體。
上述的肺瘤相關抗原基因包括MUC1。 上述的重組痴原蟲應用在疫苗設計中。 優選的，所述的疫苗設計包括HIV-1疫苗設計。
優選的，所述的HIV-1疫苗設計為將HIV-1的編碼基因克隆到表達質粒 上，得到重組質粒，在大腸桿菌中複製後提取並純化，將提取得到的重組質粒 轉染到痴原蟲內，得到表達HIV-1的編碼基因的重組疾原蟲，最後免疫機體。
優選的，所述的HIV-1的編碼基因包括gag基因。 本發明具有如下有益效果
本發明提供的一種重組瘧原蟲，可用於表達外源基因，包括抗原、治療 劑、免疫調節劑、肽等希望傳遞到動物和人或其細胞的任何分子；為在動物和 人或其細胞中引入並表達異源基因、刺激或激發免疫應答提供了 一種新方法， 特別是應用於腫瘤的生物治療和HIV疫苗的設計方面。
下面將結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。


圖1是pL0015-gag重組質粒的結構圖2-A是pL0015-gag重組質粒轉染鼠伯氏瘧原蟲NK65蟲4朱得到的NK65-gag重組瘧原蟲抹的血塗片實驗的一個優選實施例的結果圖2-B是pL0015-gag重組質粒轉染鼠伯氏疾原蟲NK65蟲抹得到的NK65-gag重組疾原蟲抹的western-blot實-瞼的一個優選實施例的結果圖2-C是pL0015-gag重組質粒轉染鼠伯氏瘧原蟲NK65蟲林得到的NK65-
gag重組症原蟲才朱PCR的 一個優選實施例的結果圖3是重組瘧原蟲抹NK65-gag免疫小鼠後ELISPOT檢測的一個優選實施
例的實驗結果圖4是重組瘧原蟲抹NK65-gag免疫小鼠後ELISA檢測的一個優選實施例 的實驗結果圖5是重組痴原蟲林NK65-gag免疫小鼠後，Brdu ELISA檢測針對HIV-1 gag 肽的增值的一個優選實施例的實驗結果圖6是鼠重組瘧原蟲抹NK65-gag免疫小鼠後，用重組表達HIV-1 gag的痘 病毒vaccinia-gag攻毒，檢測保護性的一個優選實施例的實驗結果圖。
具體實施例方式
為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應 理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。
實施例1:以鼠伯氏痴原蟲NK65蟲抹為載體表達1型人免疫缺陷病毒 (HIV-1)的gag基因，並將此重組蟲抹作為一種HIV的概念性疫苗免疫小鼠， 用斑點酶聯免疫實驗(ELISPOT )、 酶聯免疫實驗(ELISA)和大鼠溴脫氧核苷 脲嘧啶酶聯免疫實驗(Brdu ELISA)等方法檢測小鼠針對gag的免疫反應。最 後再用表達Gag蛋白的疽病毒vaccinia-gag攻毒，觀察對小鼠的免疫保護效果。
pL0015-gag重組質粒的構建將HIV-1的gag基因克隆到鼠伯氏痴原蟲 NK65蟲林的表達質粒pL0015上，得到pL0015-gag重組質粒。具體為設計兩端 帶有BamHl酶切位點的gag引物，後用PCR方法擴增出gflg基因，將pL0015 質粒和此gag產物用BamHl酶切，然後切膠回收，連接，轉化到XL-lblue感 受態細菌塗板，挑選轉化子經菌落PCR鑑定，酶切鑑定，測序方向鑑定都正確 後得到重組的pL0015-gag質粒。重組的pL0015-gag質粒結構見圖1。
pL0015-gag重組質粒轉染鼠伯氏瘧原蟲NK65蟲林將保種的轉化了pL0015-gag的大腸桿菌XL-lblue菌抹復豕於大腸桿菌XL-lblue菌4木中複製後 提取並純化。大量培養，提取pL0015-gag，將提取的pL0015-gag質粒轉染鼠伯 氏痴原蟲，用該蟲抹接種小鼠24小時後開始給小鼠每天口服30mg/kg的乙胺嘧 啶，連續四天。用乙胺嘧，定篩選出重組表達gag的鼠重組瘧原蟲抹NK65-gag, 見圖2。圖2-A是pL0015-gag重組質粒轉染鼠伯氏瘧原蟲NK65蟲林得到的重 組痴原蟲抹NK65-gag的血塗片結果圖，該圖顯示NK65-gag重組痴原蟲抹為陽 性。圖2-B是pL0015-gag重組質粒轉染鼠伯氏症原蟲NK65蟲抹得到的重組症 原蟲林NK65-gag的western-blot實驗結果圖，以NK65蟲抹為空白對照，以 pVAX-gag為陽性對照，由圖可見，NK65-gag重組痴原蟲株為gag陽性表達抹。 圖2-C是pL0015-gag重組質粒轉染鼠伯氏疾原蟲NK65蟲抹得到的NK65-gag 重組症原蟲抹PCR的結果圖；泳道1 - 6分別為DNA分子量標準(DNA marker )、 NK65基因組DNA、 NK65-gag基因組DNA、 NK65-gag基因組DNA、 NK65-gag基因組DNA和pVAXl - gag質粒。
之後取尾靜脈血10 |a 1溶於0.2ml生理鹽水中，再腹腔接種於一隻新的小鼠 體內，此小鼠再每天口服乙胺嘧啶30mg/kg,連續四天。待原蟲感染率達到5% 以上時，眼眶採血，保種，並分別提取原蟲DNA和蛋白進行鑑定。當4僉測到 Gag蛋白在原蟲內有表達後，再將保種的蟲林復甦，然後再單克隆化，單克隆化 後的蟲抹再用同樣的方法鑑定有Gag蛋白表達後，將此能穩定表達Gag蛋白的 重組蟲抹命名為pbGAGcon。用同樣方法將空質粒pLOOl5轉染到鼠伯氏痴原蟲 NK65蟲林得到的重組蟲抹命名為pbEMPTYcon。用pbGAGcon和pbEMPTYcon 分別免疫小鼠。
鼠重組瘧原蟲抹NK65-gag免疫小鼠後ELISPOT檢測用NK65-gag重組 蟲林免疫小鼠7天後，殺鼠取脾臟分出脾淋巴細胞，體外用HIV-1的gag肽刺 激，檢測到針對HIV-1的gag的特異性IFN-y的分泌，見圖3。
鼠重組疾原蟲抹NK65-gag免疫小鼠後ELISA檢測用NK65-gag重組蟲抹 免疫小鼠30天後，眼眶採血分離出血清，用ELISA法檢測血清中gag抗體的滴 度，見圖4。圖4顯示，用pbGAGcon免疫小鼠後小鼠中的gag抗體滴度明顯高8於用pbEMPTYcon免疫小鼠後及沒有免疫的小鼠中的gag抗體滴度，說明該重 組痴原蟲蟲抹pbGAGcon能較好的剌激機體對gag的免疫反應。
鼠重組痴原蟲抹NK65-gag免疫小鼠後，Brdu EL1SA檢測針對HIV-1 gag 肽的增值用NK65-gag重組蟲林免疫小鼠21天後，殺鼠取脾臟分出脾淋巴細 胞，體外用HIV-1的gag肽刺激，檢測到針對HIV-1的gag肽刺激的特異性淋 巴細胞的增殖，見圖5。圖5中吸光度表示脾細胞增殖情況，a表示gag肽刺激 的脾細胞與對照相比增殖明顯，在統計學上差異有顯著性。
鼠重組痴原蟲林NK65-gag免疫小鼠後，用重組表達HIV-1 gag的疸病毒 vaccinia-gag攻毒，檢測保護性用NK65-gag重組蟲抹免疫小鼠30天後，腹腔接 種vaccinia-gag痘病毒，4天後，處死小鼠取卵巢，超聲粉碎，研磨卵巢，檢測 小鼠卵巢內vaccinia-gag的病毒滴度，檢測到經鼠重組瘧原蟲株NK65-gag免疫 後，小鼠卵巢內病毒載量在免疫組較對照組低，見圖6。圖6中承表示重組gag 的痴原蟲免疫的小鼠與空載體瘧原蟲免疫的小鼠相比，對vaccinia-gag的攻毒實 驗後的病毒滴度有統計學上的差異顯著性。
實施例2:用鼠伯氏疾原蟲NK65蟲抹為表達載體，並應用於腫瘤疫苗的設 計。將腫瘤相關抗原mucl基因克隆到鼠伯氏瘧原蟲NK65蟲林的表達質粒 pL0015上，得到pL0015-mucl重組質粒。經鑑定方向正確後，於大腸桿菌 XL-lblue菌株中複製後提取並純化。將提取的重組質粒pL0015-mucl轉染到鼠 伯氏痴原蟲NK65蟲抹內，用該蟲林接種小鼠24小時後開始給小鼠每天口服乙 胺嘧啶30mg/kg,連續四天。之後取尾靜脈血10^1溶於0.2ml生理鹽水中，再 腹腔接種於一隻新的小鼠體內，此小鼠再每天口服乙胺嘧啶30mg/kg,連續四天。 待原蟲感染率達到5%以上時，眼眶採血，保種，並分別提取原蟲DNA和蛋白 進行鑑定。當檢測到MUC1蛋白在原蟲內有表達後，再將保種的蟲林復甦，然 後再單克隆化，單克隆化後的蟲株再用同樣的方法鑑定有MUC1蛋白表達後免 疫小鼠，觀察對接種有轉染mucl基因的腫瘤的荷瘤小鼠的腫瘤生長抑制效果和 荷瘤小鼠生存時間。最後應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保護範圍的限制，儘管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和範圍。
權利要求
1、一種表達外源基因的重組瘧原蟲，其特徵在於，所述外源基因包括抗原基因、治療劑基因、免疫調節劑基因或肽基因。
2、 權利要求1所述的重組瘧原蟲在生物治療中的應用。
3、 根據權利要求2所述的應用，其特徵在於，所述的生物治療包括腫瘤治療。
4、 根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述的肺瘤治療為將腫瘤 相關抗原基因克隆到表達質粒上，得到重組質粒，在大腸桿菌中複製後提取並 純化，將提取得到的重組質粒轉染到痴原蟲內，得到表達腫瘤相關抗原的重組 痴原蟲，最後免疫腫瘤機體。
5、 根據權利要求4所述的應用，其特徵在於，所述的腫瘤相關抗原基因包 括MUC1。
6、 權利要求1所述的重組瘧原蟲在疫苗設計中的應用。
7、 根據權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述的疫苗設計包括HIV-1 疫苗設計。
8、 根據權利要求7所述的應用，其特徵在於，所述的HIV-1疫苗設計為 將HIV-1的編碼基因克隆到表達質粒上，得到重組質粒，在大腸桿菌中複製後提取並純化，將提取得到的重組質粒轉染到瘧原蟲內，得到表達HIV-1的編碼 基因的重組症原蟲，最後免疫機體。
9、根據權利要求8所述的應用，其特徵在於，所述的HIV-1的編碼基因包 括gag基因。
全文摘要
本發明公開了一種表達外源基因的重組瘧原蟲，該重組瘧原蟲中的外源基因包括抗原基因、治療劑基因、免疫調節劑基因或肽基因。本發明還將該重組瘧原蟲應用於生物治療和疫苗設計中，尤其是腫瘤的生物治療和HIV疫苗的設計。本發明該種重組瘧原蟲，可用於表達外源基因，包括抗原、治療劑、免疫調節劑、肽等希望傳遞到動物和人或其細胞的任何分子；為在動物和人或其細胞中引入並表達異源基因、刺激或激發免疫應答提供了一種新方法，特別是應用於腫瘤的生物治療和HIV疫苗的設計方面。
文檔編號C12N1/11GK101492643SQ20091003718
公開日2009年7月29日 申請日期2009年2月13日 優先權日2009年2月13日
發明者波 姜, 莉 秦, 陳小平 申請人:中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院