人類新細胞因子VSTM1-v2及其應用的製作方法

2023-09-20 03:57:00

專利名稱：人類新細胞因子VSTM1-v2及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的人類細胞因子及其應用，特別是涉及VSTMl的一種剪切體 VSTM1-V2的基因或蛋白或它們的免疫性片段，所述VSTM1-V2的基因或蛋白或它們的免疫 性片段在促進Thl7分化和CD8+T淋巴細胞的殺傷功能中的應用以及在製備用於治療免疫 相關疾病的藥物組合物中的應用，還涉及VSTM1-V2的拮抗劑，包含VSTM1-V2的載體、宿主 細胞或組合物，及檢測VSTM1-V2或其免疫性片段的試劑，以及它們的應用。
背景技術：
免疫系統在機體具有至關重要的作用，它對外能夠防禦病原微生物的入侵，對內 則能及時清除衰老、病變和死亡的細胞，維持內環境的穩定。免疫系統通過免疫應答完成 上述功能。機體各種細胞分泌的細胞因子(Cytokine)可以調控細胞生長分化、調節免疫 功能和生理反應並參與病理反應。細胞因子一般多是小分子分泌蛋白，通過與細胞因子 受體結合，在免疫細胞之間傳遞信息，對天然免疫應答和適應性免疫應答均發揮重要調 控作用。至今已發現的細胞因子達200多種，根據功能不同可以將其分為六類1、白細 胞介素(Interleukin，IL) ；2、集落刺激因子(Colony-Stimulating Factor, CSF) ；3、幹 擾素(Interferon, IFN) ；4、腫瘤壞死因子(Tumor-Necrosis Factor, TNF) ；5、趨化因子 (Chemokine，CK) ；6、生長因子(Growth Factor，GF)。細胞因子種類繁多，功能廣泛。Th細胞是適應性免疫應答的樞紐，而細胞因子是其發揮作用的主要方式。Th細胞 可分為ThU Th2和Thl7三類，它們產生的特徵性細胞因子分別是IFN- γ , IL-4和IL-17。 Thl的主要作用是抵禦抗胞內病原微生物的感染，參與類風溼性關節炎、糖尿病等自身免疫 性疾病的發生、發展；Th2參與抗寄生蟲感染和過敏反應；Thl7在抗胞外細菌和真菌感染 中具有重要作用，並參與炎性腸病等自身免疫性疾病的發生、發展(Jinfang Zhu, William Ε.Paul, CD4 T cells :fates, functions, and faults, Blood,2008,112(5) :1557_1568)。 作為CD4+效應T細胞的新亞群，Thl7細胞主要分泌IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-26和腫瘤 壞死因子等細胞因子。這些炎性因子介導了炎性反應(防禦胞外病原菌的感染)、自身免 疫性疾病、腫瘤和移植排斥等。相關研究發現類風溼性關節炎(RA)、多發性硬化症(MS)、哮 喘、狼瘡以及在移植排斥反應中IL-17的表達均增加。研究發現，在自身免疫性炎性腸病如 潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn，s disease, CD)患者急性 期的腸黏膜內有大量IL-17+細胞的存在。IL-17既對炎性腸病黏膜炎症反應的誘導和維 持發揮了重要作用，也促進多種炎性細胞因子的分泌，如IL26、TNF-i3、CC家族的趨化因子 等。近期部分研究還發現在血管炎、多發性硬化症、腎病症候群、銀屑病等患者的血清和組 織中，IL-17的表達量與病程、病情關係密切(Lauren A. Zenewicz，Andrey Antov, Richard A. Flavell, CD4T_cell differentiation and inflammatory bowel disease, Trends in Molecular Medicine,2009,15 (5) :199-207 ；Jennifer Louten, Katia Boniface, Rene de Waal Malefyt, Development and function of TH17 cells in health and disease, J Allergy Clin Immumol，2009，123 (5) : 1004-1011)。最近研究發現很多細胞因子參與了Thl7細胞的分化調節。一般認為，IL-6和TGF-β提供了初始T細胞向Thl7細胞分化的始 動因素，IL-23在維持向Thl7細胞分化中起非常重要的作用；TNF-α ,IL-I β等炎性細胞因 子則能促進Thl7細胞的分化；Thl7細胞可以分泌IL-21，有自反饋作用；而IL-25、IL-27、 IL-35更多表現出對Thl7細胞分化的抑制作用，但其作用可能更為複雜。深入研究Thl7細 胞的分化、生理和病理功能以及調控機制，對研究自身免疫性疾病具有重要的理論意義和 潛在的應用價值。
CDS+T細胞可以識別MHC-I/抗原肽複合物後能夠殺傷靶細胞，又被稱為殺傷性T 細胞CTL，其主要功能是清除被病毒及其它胞內寄生微生物感染的宿主細胞，另外動物實驗 證明腫瘤特異性CTL能夠殺傷相應腫瘤細胞。CD8+T細胞活化之後可以釋放穿孔素和分泌 細胞因子TNF- α和IFN- γ，繼而殺傷靶細胞。
目前利用基因工程技術生產的重組細胞因子或重組可溶性受體以及治療性抗體 等治療腫瘤、造血障礙、感染等已收到良好療效，成為新一代的藥物。重組細胞因子做為藥 物具有很多優越之處，如細胞因子為人體自身成分，可調節機體的生理過程和提高免疫 功能，很低劑量即可發揮作用，因而療效顯著，副作用小，是一種全新的生物製劑，已成為某(Antonella Viola, Andrew D. Luster, Chemokines and Their Receptors :Drug Targets in Immunity and Inflammation, Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 2008,48 :171-197)。目前已批准生產的細胞因子藥物包括 幹擾素α、β、Y，Epo，GM-CSF，G-CSF，IL-2等。另外，據不完全統計，目前國際上至少已有 26個通過基因組藥物進入臨床研究，包括新的重組細胞因子、重組可溶性受體等。同時，細 胞因子或者細胞表面受體檢測也是判斷機體免疫功能和免疫細胞分化等的重要指標，具有 重要的實驗室研究價值，在臨床上有諸多實用價值、包括許多疾病的診斷、病程觀察、療效 判斷及細胞因子治療監測等。發明內容
本發明的一個目的是提供VSTMl的剪切體特別是VSTM1-V2的蛋白或其衍生蛋白 或它們的免疫性片段。
本發明的另一目的是提供編碼VSTM1-V2的蛋白或其衍生蛋白或它們的免疫性片 段的多核苷酸序列。
本發明的另一目的是提供一種包含VSTM1-V2的載體。
本發明的另一目的是提供一種包含VSTM1-V2的宿主細胞。
本發明的另一目的是提供一種VSTM1-V2的拮抗劑。
本發明的另一目的是提供VSTM1-V2的基因或蛋白或它們的免疫性片段在促進 Thl7分化和/或CD8+T淋巴細胞的殺傷功能中的應用。
本發明的另一目的是提供VSTM1-V2的基因或蛋白或它們的免疫性片段，或者它 們的拮抗劑，在製備預防和/或治療免疫系統疾病的組合物中的應用。
本發明的另一目的是提供一種用於預防和/或治療免疫相關疾病的組合物。
本發明的另一目的是提供一種用於檢測VSTM1-V2的基因或蛋白或它們的免疫性 片段的試劑。
本發明的另一目的是提供檢測VSTM1-V2的基因和蛋白或它們的免疫性片段的試4劑的應用。
本發明提供了如下(a)或(b)所示的蛋白或其免疫性片段
(a)由SEQ ID NO 4所示的胺基酸序列組成的蛋白或其免疫性片段；或
(b)在(a)限定的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且與(a) 具有相同功能的由(a)衍生的蛋白或其免疫性片段；
所述的免疫性片段優選為SEQ ID NO :4第17 32位或第62 81位所示的氨基 酸序列組成的多肽，或SEQ ID NO :4第17 205位所示的胺基酸序列組成的蛋白。
本發明還提供了編碼上述(a)或(b)所述蛋白或其免疫性片段的多核苷酸序列； 所述的多核苷酸序列優選為SEQ ID NO :3所示的多核苷酸序列。
本發明還提供了一種基因工程載體，其包含所述的多核苷酸序列；該載體優選為 質粒。
本發明還提供了一種宿主細胞，其經所述的基因工程載體轉化、轉染或轉導得到。
本發明還提供了一種針對所述的蛋白或其免疫性片段或所述的多核苷酸序列的 拮抗劑；優選所述的拮抗劑為抗體、反義RNA或小幹擾RNA。
本發明還提供了所述的蛋白或其免疫性片段或所述的多核苷酸序列在促進Thl7 分化和/或CD8+T淋巴細胞的殺傷功能中的應用。例如，所述的蛋白或其免疫性片段或所述 的多核苷酸序列在製備促進Thl7分化和/或CD8+T淋巴細胞的殺傷功能的製劑中的應用。
本發明還提供了所述的蛋白或其免疫性片段、所述的多核苷酸序列、或所述的拮 抗劑在預防和/或治療免疫相關疾病中的應用，例如，在製備用於預防和/或治療免疫相關 疾病的藥物組合物中的應用；其中，所述的蛋白優選為SEQ ID NO :4第17 205位所示的 胺基酸序列組成的蛋白，所述的多核苷酸序列優選為SEQ ID NO :3所示的多核苷酸序列； 所述的拮抗劑優選為單克隆抗體或多克隆抗體；所述的免疫相關疾病優選為感染性疾病、 自身免疫性疾病或腫瘤。所述的多核苷酸序列可以包含於載體中；所述的載體優選為質粒。
本發明還提供了一種用於預防和/或治療免疫相關疾病的藥用組合物，該組合物 含有所述的蛋白或其免疫性片段，或所述的多核苷酸序列，或所述的載體，或所述的宿主細 胞，或所述的拮抗劑；以及一種或多種藥用賦形劑或藥用載體。
本發明還提供了一種用於檢測所述蛋白或其免疫性片段或所述多核苷酸序列的 試齊LU
本發明還提供了檢測所述的蛋白或其免疫性片段或所述的多核苷酸序列的試劑 的應用，例如在製備用於免疫相關疾病輔助診斷、預後判斷的組合物中的應用。優選所述的 試劑為抗體、反義RNA或小幹擾RNA。所述的免疫相關疾病具體可以為感染性疾病、自身免 疫性疾病或腫瘤等。
本發明研究發現人類基因VSTMl至少存在5種剪切體，分別為VSTMl_vl、 VSTMl-v2、VSTMl-v3、VSTMl-v4、VSTMl-v5。其中，VSTMl_v2 編碼一種經典分泌蛋白，含有 N 糖基化修飾位點，對Thl7分化和CD8+T淋巴細胞的殺傷功能具有促進作用；說明VSTM1-V2 是一個新的潛在細胞因子。因此，VSTM1-V2的基因或蛋白或其免疫性片段、抗體、siRNA在 感染性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤的輔助診斷、預防和/或治療方面具有潛在臨床應用價 值。

圖1顯示利用DNAstar軟體包對VSTMl_v2的親疏水性(1)、抗原性(2)、表面暴露 性(3)等特性分析的結果。圖中矩形框表示的是本發明實施例5中多肽設計的位點。
圖2A和圖2B顯示本發明的VSTM1-V2在正常組織中的表達譜RT-PCR分析。其中， 圖2A為人16種正常組織文庫，各泳道分別為1-腦；2-心臟；3-腎臟；4-肝臟；5-肺臟； 6-胰腺；7-胎盤；8-骨骼肌；9-結腸；10-白細胞；11-卵巢；12-前列腺；13-小腸；14-脾 髒；15-睪丸；16-胸腺。圖2B為人7種正常免疫系統組織文庫，各泳道分別為1-白細胞； 2-骨髓；3-淋巴結；4-脾臟；5-胸腺；6-扁桃體；7-胎肝；8-陰性對照。
圖3A顯示實施例4中SDS-PAGE和質譜分析鑑定GST_VSTMl_v2重組蛋白質的 純化以及凝血酶酶切結果。其中，泳道1和2分別為酶切前後的GST-VSTM1-V2重組蛋白 質樣品。圖片右側為相應條帶的質譜分析結果。圖:3B顯示實施例4中SDS-PAGE鑑定 Trx-His-S-VSTMl-v2重組蛋白質的純化結果。其中，泳道1為細菌裂解的上清，泳道2、3均 為蛋白純化時從鎳柱洗脫的成分。
圖4顯示Wfestern blot鑑定實施例5中以原核蛋白製備的VSTMl抗體的特異性 的結果。其中，泳道1為轉染空載體的陰性對照組，泳道2為轉染了 pcDB-VSTMl-v2的實驗組。
圖5顯示Western blot檢測VSTMl_v2蛋白的超表達情況以及BFA對VSTMl_v2 分泌的影響。
圖6顯示SDS-PAGE和Wfestern blot鑑定真核細胞VSTMl_v2分泌蛋白質的純化 結果。其中，泳道1、2、3、4、5為SDS-PAGE結果，泳道6為^festern blot,泳道1、2、6為純化 的VSTMl-v2蛋白，泳道3、4、5為BSA蛋白標準品。
圖7顯示Wfestern blot檢測真核細胞純化VSTMl_v2分泌蛋白質的糖基化修飾情 況。其中，泳道1為未加入酶的陰性對照，泳道2為加入N糖苷酶F組，泳道3為加入0糖苷酶組。
圖8顯示流式細胞儀檢測VSTM1-V2分泌蛋白對CD4+T細胞的IL-4 (圖片A)、 IFN-Y (圖片B)、IL-17A(圖片C)細胞因子表達的影響。圖中標號1 8分別代表同 型對照組、PBS、VSTMl-v2-l、VSTMl-v2-10、VSTMl-v2_100、Δ VSTMl-v2_100、rVSTMl_v2、 ArVSTMl-v2 組。
圖9顯示實施例9中檢測VSTM1-V2分泌蛋白對Thl7細胞分化的影響結果。其中， 圖片A顯示通過FACS檢測VSTM1-V2分泌蛋白對Thl7細胞分化的影響結果，圖中標號1 5分別代表同型對照組、PBS、VSTMl-v2-l、VSTMl-v2_10、VSTMl-v2_100組。圖片B顯示通 過ELISA檢測細胞因子IL-17A的分泌情況結果。圖片C顯示利用realtime PCR方法檢測 IL-17A轉錄水平的結果。圖片D顯示通過[3H]-TdR摻入實驗檢測細胞增殖結果。圖片B、 C、D 中標號 1 4 分別代表 PBS、VSTMl-v2-l、VSTMl-v2-10、VSTMl-v2-100 組。
圖10顯示檢測VSTM1-V2對⑶8+T細胞的殺傷功能的影響。其中，圖片A顯示FACS 檢測細胞內細胞因子IFN-γ的變化結果；圖片B為CD8+T細胞與K562細胞孵育的光學顯微 鏡照片；圖片C顯示利用流式細胞儀Armexin V-FITC/PI雙染檢測K562細胞的凋亡結果。 圖中標號1、2分別代表PBS和VSTMl-v2-10組。
具體實施方式
本發明發現人類新基因VSTMl至少存在5種剪切體，分別為VSTMl-vl、VSTMl_v2、 VSTMl-v3、VSTMl-v4、VSTMl_v5 (參見實施例1)。其中，VSTMl_v2編碼一種經典分泌蛋白， 即本發明所述的VSTM1-V2蛋白。
根據本發明的一個方面，本發明提供如下(a)或(b)所示的蛋白或其免疫性片 段
(a)由SEQ ID NO 4所示的胺基酸序列組成的蛋白或其免疫性片段；或
(b)在(a)限定的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且與(a) 具有相同功能的由(a)衍生的蛋白或其免疫性片段。
如SEQ ID NO 4所述的胺基酸序列為本發明的VSTMl_v2的蛋白序列，共205個 胺基酸，分子量22. 5kD，等電點4. 84。該蛋白具有兩個N糖基化位點，且具有信號肽序列 (SEQID No :4第1 16位)，由於TMHMM分析無跨膜區，VSTMl_v2可能為一新的分泌蛋白。
由SEQ ID NO 4所示的胺基酸序列組成的蛋白的免疫性片段可以為VSTMl_v2蛋 白的任何具有免疫原性的片段，例如SEQ ID NO :4第17 32位或第62 81位所示的氨 基酸序列組成的多肽，或SEQ ID NO :4第17 205位所示的胺基酸序列組成的蛋白。根據 本發明，可以對VSTM1-V2蛋白或其免疫性片段進行取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸， 而獲得與VSTM1-V2蛋白或其免疫性片段具有相同功能的由所述蛋白或其免疫性片段衍生 的序列。所述取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸而獲得具有相同功能的衍生物的技術是 本領域技術人員所已知的，例如可以是進行非極性胺基酸間或是極性胺基酸間(特別是不 帶電荷的極性胺基酸間或帶相同電荷(帶正電荷或負電荷)的極性胺基酸間)的取代。例 如，本領域技術人員可利用常見胺基酸序列的分類進行非極性胺基酸間或是極性胺基酸間 的取代，例如Asp與Glu之間的互換。
本發明還提供了編碼上述(a)或(b)所述的蛋白或其免疫性片段的多核苷酸序 列。
VSTM1-V2基因為編碼本發明的SEQ ID NO :4的多核苷酸序列，其可以為SEQ ID NO :4所示胺基酸的編碼序列，除了上述胺基酸序列的編碼序列之外，還可以包括非編碼序 列，例如內含子、編碼序列5'或3'端的非編碼序列等。所述多核苷酸序列可以是DNA或 RNA，其中DNA包括cDNA、基因組DNA以及人工合成的DNA，可以是單鏈的或雙鏈的，可以是 編碼鏈或非編碼鏈。其中優選的基因為SEQ ID NO :3所示的多核苷酸序列，該序列全長640 個核苷酸，其包含編碼VSTM1-V2蛋白的序列(例如編碼序列(⑶S 核苷酸第12 6 位) 和5'的非編碼區(核苷酸第1 11位)和3'的非編碼區(核苷酸第630 640位))。 或者，更優選一種分離的核苷酸序列，其只包含VSTMl蛋白的編碼序列。
本領域普通技術人員已知，本發明VSTM1-V2的核苷酸序列可以完全相同於如SEQ IDNO :3所示的編碼序列，也可以由於遺傳密碼的簡併性，不完全等同於上述核苷酸的編碼 序列。例如，根據每個具體的原核宿主或者真核宿主所使用的密碼子的頻率不同，可以選擇 相應的密碼子，從而提高所述的多核苷酸在相應的宿主中表達效率。也可以為了獲得比天 然的核苷酸序列具有更好性能的多核苷酸(如更長的半衰期)而轉換密碼子。
本發明的VSTM1-V2基因或蛋白的免疫性片段包括本發明的VSTMl_v2蛋白的免疫 性片段或VSTM1-V2基因的免疫性片段。本發明的VSTM1-V2基因的免疫性片段可以為編碼所述VSTM1-V2蛋白的免疫性片段的核苷酸序列，例如編碼SEQ ID NO :4第17 205位所 示胺基酸序列的多核苷酸序列，優選SEQ ID NO :3第60 6 位所示多核苷酸序列。
本發明所提供的蛋白或其免疫性片段，以及多核苷酸序列，是分離的蛋白或其免 疫性片段，以及多核苷酸序列。所述「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是 天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多核苷酸或蛋白或多 肽胺基酸序列是沒有分離純化的，但同樣的多核苷酸或蛋白或多肽如果從天然狀態中與共 同存在的其它物質分開，則為分離純化的。這樣的多核苷酸可能是某一載體的一部分，也可 能這樣的多核苷酸或蛋白或多肽是某一組合物的一部分，既然載體或組合物不是它們的天 然環境的成分，這些多核苷酸或蛋白多肽仍然是分離的。
本發明的多核苷酸序列能用本領域已有的方法獲得。這些技術包括但不局限於 (1)通過雜交技術分離DNA序列；( 人工化學合成DNA序列；( 通過構建CDNA文庫大規 模獲得所需的多核苷酸；G)PCR擴增技術。例如，本發明的VSTM1-V2的多核苷酸序列或其 免疫性片段可以依據標準的PCR擴增技術將cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，並選取 合適的寡核苷酸引物擴增得到。這樣得到核苷酸可以克隆進合適的載體中，然後利用在所 述載體中的複製得到。也可以通過標準DNA合成技術得到，例如，使用可以按本領域熟知的 固相亞磷酸醯胺三酯法在DNA合成儀上合成。本發明的基因，或者各種DNA片段等核苷酸 序列的測定可用常規方法，如雙脫氧鏈終止法(Sanger et al. PNAS, 1977, 74 =5463-5467)； 也可用商業測序試劑盒等。為了獲得全長的cDNA序列，測序需要反覆進行。有時需要測定 多個克隆的cDNA序列，才能拼接成全長的cDNA序列。
本發明的VSTM1-V2的蛋白或其免疫性片段可以是重組蛋白或多肽、天然蛋白或 多肽、合成蛋白或多肽、半合成蛋白或多肽，優選重組蛋白或多肽。本發明的蛋白或其免疫 性片段可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主 (如細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。本發明的蛋白或其免疫性片段可 以是糖基化的，也可以是非糖基化的；可以包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明的VSTM1-V2的蛋白或其免疫性片段可以通過常規方法獲得，例如可按照 Steward禾口Young (Steward, J. M.禾口Young,J. D. , Solid PhasePeptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Company, Rockford, 111. , (1984))描述的方法用 Applied Biosystem 合 成儀或PioneerTM合成儀按固相化學技術合成，或者可使用衍生於本發明的DNA構建體的 mRNA，在無細胞翻譯系統中產生所需的蛋白或多肽。也可按常規的生物工程方法由宿主細 胞中的重組DNA序列編碼產生蛋白或多肽產物(Science，1984 ；224 :1431)，例如包括以下 步驟
(1)用本發明的多核苷酸(或其變異體)，或用含有此多核苷酸的表達載體轉化、 轉染或轉導合適的宿主細胞；( 在合適的培養基中培養步驟(1)得到的宿主細胞；(3)從 培養基或細胞中分離、純化所需的蛋白或多肽。
本發明的多核苷酸和蛋白或其免疫性片段優選以分離形式提供，更佳地被純化至 均質。
根據本發明的另一方面，本發明提供一種含有本發明的多核苷酸序列的載體。本 發明中的多核苷酸序列可以插入到重組表達載體中。所述基因工程載體可以是普通載體、 表達載體等。其中普通載體主要用於各種基因組文庫和cDNA文庫的建立，它們通常含有兩個或兩個以上的標記基因，其中一個基因用於選擇轉化體(transformant)，另一基因則是 用於檢查載體中是否有外源DNA插入。表達載體主要用於研究基因的表達或是用於大量生 產一些有用的轉錄產物或蛋白質，有的也可用於cDNA文庫的建立。這類載體除具有普通型 載體的特徵外，表達載體中應含有適當的啟動子、核糖體結合位點、終止子等。為了便於表 達產物在細胞中定位，在多肽編碼序列上遊可加入適當的前導序列。必要時，為了提高編碼 本發明VSTM1-V2的DNA在高等真核細胞中的轉錄效率，可在載體中插入增強子序列。合適 載體和啟動子的選擇為本領域技術人員周知。本領域技術人員周知用於構建含有本發明 的多核苷酸以及合適的轉錄及翻譯調控組件之載體的方法。具體地說，術語「重組表達載 體」指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒，如腺 病毒、逆轉錄病毒，或者其它載體。在本發明中適用的載體可以是原核表達載體，也可以是 真核表達載體。適用於原核細胞的市售表達載體一般均帶有可選擇標誌和細胞複製原點， 帶有 lad、T7 (Rosenberg，et al. Gene，1987，56 125)、λ PL 和 trP 等細菌啟動子，以及已 知克隆載體pBR322(ATCC 37017)的其它遺傳組件。這樣的市售載體包括pGEMQ^romega) 和pH^ZS-SO^harmacia)可根據所選用的適當啟動子和待表達的結構基因序列來選擇衍 生於PBR322的適當載體。GST原核表達系統也可用於本發明。適用於真核細胞的載體帶 有真核細胞啟動子如CMV、SV40等，這樣的載體包括PMT-hILr3(馬大龍，狄春輝，龐健等 (1991)高技術通訊 11 26-29)，pQE-9 (Qiagen)、pDIO、pNHI 8A (Stratagene)、pKK233_3、 pDR540、pRrr5 (Pharmacia)，以及 pcDNA 3. 1/myc-hisB (-) (Invitrogen)、pCI、pffLNEO, pSG(Stratagene)、pSVL(Pharnlacia)、pcDNA3. l/V5-His-T0P0(Invitrogen,以下縮寫為 pcDT)。本發明優選pcDT，它可以直接與PCR產物連接來構建真核表達載體，大大提高規模 化生產的效率。在本發明的具體實施例中，是將VSTM1-V2多核苷酸序列的PCR產物克隆至 pGEM-T Easy (Promega)、pcDNA3. 1/mycHis (-) B、pGEX4T_l 和 pET_32a_c (+)載體中。只要 能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以應用。表達載體的一個重要特徵是通常 含有複製起點、啟動子、標記基因和翻譯控制組件。用本領域的技術人員熟知的方法來構建 含有本發明所述多核苷酸序列和轉錄/翻譯控制信號的表達載體即可。這些方法包括體外 重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組DNA技術等(Sambrook，et al. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. New York,1989)。
本發明還涉及用上述載體或者本發明的多核苷酸經基因工程產生的適於表達本 發明蛋白或其免疫性片段的宿主細胞。本發明的載體和多核苷酸可以用於轉化適當的宿 主細胞，以使其能夠表達人類分泌性細胞因子的蛋白質。該宿主包括但不限於原核宿主， 諸如大腸桿菌、芽孢桿菌屬、鏈黴菌屬等；真核宿主，諸如酵母屬、麴黴屬、昆蟲細胞，諸如 果蠅S2和草地夜蛾Sf9 ；植物細胞；動物細胞，如CH0、COS(猴腎成纖維細胞系，Gluzman (Cell 23 :175,1981))或Bowes黑素瘤細胞、293T、HeLa細胞及其它的能表達相容載體的細 胞系。
本領域的技術人員都知道如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞及將 含有本發明的多核苷酸的構建體導入上述宿主細胞的方法，包括但不限於氯化鈣介導的 轉化、磷酸鈣轉染、DEAE-15葡聚糖介導的轉染、電穿孔、顯微注射、粒子轟擊法或基因槍方 法(Sambrook,J. (1989),Molecular Cloning,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor ft~ess)，在適當的培養條件與培養基中培養經轉化的宿主菌株或細胞，使其生長到恰當的細胞密度之後，用適當的方法(例如溫度轉變或化學藥品誘導)誘導所選擇的啟動子，並將 細胞再培養一段時間。針對不同的宿主菌株或細胞以及所表達的目的蛋白或多肽的性質選 擇相應的培養條件和培養基在本領域技術人員知識範圍之內。當宿主細胞為原核細胞如大 腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收集，用CaCl2法處理，所用步驟是 本領域眾所周知的。可供選擇的是MgCl2處理，也可用電穿孔的方法處理。當宿主是真核細 胞時，可選擇以下轉染方法磷酸鈣共沉澱法、常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包 裝等。獲得的轉化子可以用常規方法培養，來表達本發明的多核苷酸所編碼的蛋白或多肽。 根據所選的宿主細胞選擇合適的常規培養基，在適於宿主細胞生長的條件下培養。在本發 明的實施例中使用的宿主細胞例如大腸桿菌BL21和細胞(ATCC CRL-11268)等。
本發明還提供一種生產所述蛋白或其免疫性片段的方法在適於表達的條件下， 培養含有編碼本發明的多核苷酸或其片段的宿主細胞；從所述細胞培養物中獲得多核苷酸 編碼的蛋白或多肽。上述方法中的重組蛋白或多肽可包被於細胞內、細胞外或在細胞膜上 表達或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分 離和純化重組蛋白或多肽。具體地說，在轉化宿主細胞並在被轉化的宿主細胞生長到適當 的細胞密度後，用適當的方法(如溫度變動或化學特質誘導)誘導啟動子，然後繼續培養。 培養完成後，可用離心法收集細胞，並用任何已知的方法，這些方法是本領域技術人員所熟 知的，如凍融法、超聲處理法、滲透破菌、溶菌酶溶解法或機械破碎法破碎細胞。可以用各種 已知的方法從宿主細胞培養物中回收和純化本發明的蛋白或多肽或其片段或融合蛋白或 多肽，這些方法包括硫酸鐵或乙醇沉澱法、酸萃取法、超離心、超濾法、離子交換層析法、磷 酸纖維層析法、疏水相互作用層析法、凝膠過濾法、親和層析法、高效液相層析和其它各種 液相層析技術或這些方法的結合。
本發明還涉及與本發明多核苷酸的任何一部分同源的核酸片段。如本文所用，「核 酸片段」的長度至少含有15個核苷酸，優選至少30個核苷酸，更優選至少50個核苷酸，最 優選至少100個核苷酸。此核酸片段通常是在本發明的核苷酸序列信息的基礎上化學合成 的DNA序列。上述核酸片段可以用於PCR擴增技術(如作為引物)以確定和/或分離編碼 人類分泌性細胞因子的多核苷酸；也可以作為雜交所用的探針。也可以用於RNA幹擾技術。 本發明的多核苷酸的一部分或全部也可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA晶片 上，用於分析組織中基因的差異表達和基因診斷。探針的標記可用放射性同位素，螢光素或 酶(如鹼性磷酸酶)等。至於這些片段是否編碼蛋白或多肽或編碼的蛋白或多肽是否具有 本發明蛋白或多肽的功能，對於檢測、雜交和/或抑制表達這些用途來說並不是特別重要。
本發明還提供針對所述的VSTM1-V2的基因或蛋白的拮抗劑。拮抗劑(例如蛋白、 核酸、碳水化合物)可以與本發明的VSTM1-V2結合併抑制或封閉VSTM1-V2的生物活性。 優選所述的拮抗劑為抗體、反義RNA或小幹擾RNA。所述抗體包括單克隆抗體或多克隆抗 體，優選中和性抗體。所述的抗體優選為與SEQ ID NO :4的胺基酸殘基17 205所示的 序列、SEQ ID NO 4的胺基酸殘基17 32所示的序列、SEQ ID NO 4的胺基酸殘基62 81所示的序列特異性結合的多克隆抗體或單克隆抗體。所述「特異性結合」是指多克隆抗 體或單克隆抗體特異性識別靶抗原並與靶抗原的不同抗原表位或抗原決定簇結合的特性。 本發明中所述的抗體包括那些能夠結合併抑制本發明VSTMl基因產物的抗體，也包括那些 並不影響本發明VSTMl多肽功能的抗體。上述抗體不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab片段和Fab表達文庫產生的抗體；抗體重鏈； 抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No. 4，946，778)；或嵌合抗 體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。本發明的多肽蛋白或其 免疫性片段的抗體可用本領域公知的抗體製備方法來生產。例子有單克隆抗體可用雜交 瘤技術生產(Kohler and Milstein. Nature，1975，256 :495-497)。多克隆抗體的生產可用 本發明的多肽蛋白或其免疫性片段免疫動物，如家兔、小鼠、大鼠等。在本發明的一個實施 例中(參見實施例5)，以抗原性較強的VSTMl N端(SEQ ID NO 4的胺基酸序列17 32 和62 81)和VSTMl原核蛋白(SEQ ID NO 4的胺基酸序列17 205)為例，製備多克隆 抗體，經ELISA法檢測抗體效價，Western blot鑑定抗體特異性，證實得到效價高、特異性 好的抗體，可將該抗體進一步用於VSTMl的表達譜分析和功能研究。多種佐劑可用於增強 免疫反應，包括但不限於弗氏佐劑。將人恆定區和非人源的可變區結合的嵌合抗體可用已 有的技術產生(Morrison et al. PNAS，1985，81 :6851)。單鏈抗體也可用已有的技術生產 (U.S.Pat No. 4946778)。本發明的各類抗體可以利用本發明的蛋白或其免疫性片段、衍生 物、類似物或表達它們的細胞作為抗原，通過常規免疫技術獲得，這些片段或功能區可以利 用重組方法製備或利用多肽合成儀合成。
根據本發明的一個方面，本發明提供了 VSTM1-V2的基因或蛋白或它們的免疫性 片段在促進Thl7分化中的應用，還提供了 VSTM1-V2的基因或蛋白或它們的免疫性片段在 促進CD8+T淋巴細胞的殺傷功能中的應用。例如，所述的VSTM1-V2的基因或蛋白或它們的 免疫性片段在製備促進Thl7分化和/或CD8+T淋巴細胞的殺傷功能的製劑中的應用。Thl7 在抗胞外細菌和真菌感染中具有重要作用，並參與炎性腸病等自身免疫性疾病的發生、發 展；深入研究Thl7細胞的分化、生理和病理功能以及調控機制，對研究自身免疫性疾病具 有重要的理論意義和潛在的應用價值。而CD8+T淋巴細胞活化後作為CTL，殺傷靶細胞，在 抗腫瘤和抗病毒免疫中發揮重要作用。由於本發明的VSTM1-V2的基因或蛋白或它們的免 疫性片段能夠促進Thl7分化，並能夠促進CD8+T淋巴細胞的殺傷功能，而拮抗劑可以抑制 或封閉VSTM1-V2的生物活性，所以本發明的VSTM1-V2的基因或蛋白或它們的免疫性片段 或它們的拮抗劑可以用於免疫相關疾病(如感染性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤等)的預防 和/或治療，具體而言，VSTM1-V2的基因或蛋白或它們的免疫性片段可以廣泛用於細菌真 菌和病毒感染性疾病的預防和/或治療，以及用於腫瘤的預防和/或治療，而其拮抗劑如中 和性抗體、反義RNA或小幹擾RNA等則可用於自身免疫性疾病的預防和/或治療。
根據本發明的另一方面，本發明提供VSTM1-V2的基因或蛋白或它們的免疫性片 段，或它們的拮抗劑，在製備用於預防和/或治療免疫相關疾病的藥物組合物中的應用。其 中，所述的蛋白優選為SEQ ID NO :4第17 205位所示的胺基酸序列組成的蛋白，所述的 多核苷酸序列優選為SEQ ID NO :3所示的多核苷酸序列；所述的拮抗劑優選為單克隆抗體 或多克隆抗體；所述的免疫相關疾病例如為感染性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤等。本發明 的VSTM1-V2的基因和蛋白可以以基因和蛋白的形式直接包含在用於治療免疫相關疾病的 藥物組合物中利用其瞬時表達產物進行治療，也可以以包含在表達載體中的形式包含在用 於治療免疫相關疾病的藥物組合物中利用瞬時和穩定的表達產物進行治療。
本發明還提供一種用於預防和/或治療免疫相關疾病的藥物組合物，該組合物含 有所述的蛋白或其免疫性片段，或所述的多核苷酸序列，或所述的載體，或所述的宿主細胞，或所述的拮抗劑；以及一種或多種藥用賦形劑或藥用載體。藥用賦形劑或藥用載體指無 毒固態、半固態或液態填充劑、稀釋劑、包囊材料或其他製劑輔料。所述藥物組合物適於局 部、靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、鼻內或皮內給藥等途徑。當以上述或其他方式進行治療時， 治療有效量的本發明的VSTM1-V2可以是本發明VSTM1-V2的基因或蛋白或它們的免疫性片 段的純淨形式、藥用鹽形式，或選擇性與藥用賦形劑組合。對任何特定患者的具體治療有效 劑量取決於許多因素，包括所治療的疾病和其嚴重程度；所用具體化合物的活性；所用的 特定組合物；患者的年齡、體重、性別、飲食和一般健康狀況；給藥時間；給藥途徑；具體化 合物的排洩速度；治療的持續時間聯合或同時服用的其他藥物等。本發明的VSTM1-V2蛋白 或其免疫性片段也可通過在活體表達該蛋白或其免疫性片段來使用。例如患者的細胞可以 通過在體外用編碼本發明蛋白或其免疫性片段的基因進行基因工程操作，然後將工程細胞 提供給患者，使工程細胞在體內高表達這種蛋白或其免疫性片段，從而達到治療目的。
本發明還提供一種體外檢測來自待測者的樣品中本發明所述VSTM1-V2的基因或 蛋白的表達水平是否變化的方法，其包括檢測待測樣品中所述多核苷酸或蛋白或多肽的 表達水平；將待測樣品中所述多核苷酸或蛋白或多肽的表達水平與正常樣品的多核苷酸或 蛋白或多肽的表達水平進行比較；確定待測樣品中多核苷酸或蛋白或多肽的表達水平是否 變化。所述正常樣品可以從已知未患病的正常人的細胞獲得，該細胞應與待測樣品細胞的 組織來源一致；正常樣品的多核苷酸的表達水平可以是從所述正常人的細胞獲得的具有統 計學意義的多核苷酸的表達水平。其中所述檢測待測樣品中多核苷酸水平的方法可以為上 述任何檢測方法，優選利用RT-PCR檢測所述多核苷酸在核酸水平的表達水平；或利用特異 性單克隆或多克隆抗體檢測所述多核苷酸在蛋白質水平的表達水平，例如免疫組織化學檢 測。所述待測樣品可以從來自受試者的細胞獲得，如來自血液、尿、唾液、胃液，活組織檢查 和屍體解剖材料的細胞。
本發明同時提供用於檢測本發明所述的VSTM1-V2的基因或蛋白或它們的免疫性 片段的試劑。例如，用於檢測所述多核苷酸在核酸水平的表達的試劑；或用於檢測所述多核 苷酸在蛋白質水平的表達的試劑。本發明還提供檢測VSTM1-V2的基因或蛋白或它們的免 疫性片段的表達的試劑在製備用於免疫相關疾病輔助診斷、預後判斷的組合物中的應用。 所述試劑可以為蛋白、核酸、碳水化合物等，優選為抗體、反義RNA或小幹擾RNA(siRNA)。本 發明的VSTM1-V2的基因或蛋白或它們的免疫性片段可以作為診斷指標。因此，可以通過檢 測本發明的VSTM1-V2的基因或蛋白或它們的免疫性片段的表達水平而檢測體內因本發明 的VSTM1-V2表達不足或過量所致的病理狀態，具體的檢測方法可以是利用限制性片段長 度多態性分析(RFLP)、反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、螢光原位雜交法(FISH)等方法 或它們的組合。同樣，也可以使用本發明VSTM1-V2蛋白的抗體，通過放射性免疫分析、競爭 性結合法、Western印跡分析法或酶聯免疫吸附法(ELISA)達到相同的目的。
在本發明的具體實施例中，本發明中利用pCDB-VSTMl-V2-myC-his真核細胞轉染 上清、純化重組人VSTM1-V2蛋白進行功能研究，RT-PCR實驗顯示VSTMl_v2僅在免疫系統 和免疫細胞中表達，提示VSTM1-V2主要在免疫系統中發揮作用。本發明進一步通過FACS、 ELISA、realtime PCR等實驗方法發現VSTMl_v2能明顯促進CD4+T細胞IL-17A表達增加， VSTM1-V2可在體外促進Thl7細胞的分化。[3H]-TdR摻入方法檢測發現VSTMl_v2可促進 Thl7細胞的增殖。而且，本發明的具體實施例中還發現VSTM1-V2能明顯促進⑶8+T細胞IFN- γ的表達，並促進⑶8+T細胞殺傷作用。VSTM1-V2可能作為一個細胞因子介導⑶4+T 淋巴細胞的分化和調節CD8+T淋巴細胞的功能，在免疫系統中發揮其重要功能。
本發明的VSTM1-V2是一分泌蛋白，可由免疫系統細胞、白細胞等多種細胞產生， 並在免疫系統中發揮重要調控作用。因此，VSTM1-V2具備了細胞因子的結構和功能特點， 可能作為一個細胞因子發揮其重要功能。VSTM1-V2蛋白、抗體、siRNA在感染性疾病、自身 免疫性疾病、腫瘤輔助診斷、預防和/或治療方面具有潛在臨床應用價值。實施例
下面結合具體實施例進一步闡明本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本 發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按 照常規條件如Sambrook等人，《分子克隆實驗指南》(第三版)(Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL) Press, 2001)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1、VSTMl基因的cDNA的克隆及生物信息學分析
首先採用以下方法製備粒細胞cDNA文庫使用TRIzoKinvitrogen)提取粒 細胞總RNA (按說明書操作)，用Reverse transcript kit (Invitrogen)逆轉錄合成單 鏈cDNA文庫(按說明書操作)。上述外周血單個核細胞和粒細胞的收集方法如文獻所(Boyum, Α. , 1968. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of mononuclear cells by one centrifugation and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at lg. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. Supplement(Oslo)97，77—89)。
通過與NCBI的Hurnan_eSt資料庫比對分析cDNA序列以及可變剪接體。通過 NCBI的tBLASI^n程序尋找同源蛋白，同時從基因組資料庫(http://www. ncbi.nlm.nih. Rov/Renome/)得到染色體定位。蛋白功能結構域分析使用NCBI CDD資料庫(http://www. ncbi. nlm. nih. Rov/Structure/cdd/cdd. shtml)。其它蛋白相關分析使用 ExPASy 資料庫 (http://us. expasy. ors/)，包括;TMHMM(http://www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/)用 於跨膜區分析；Signal P (http //www, cbs. dtu. dk/services/SiRnalP/)用於信號肽分 析；Psort II (http://psort.nibb.ac. jp)用於亞細胞定位預測；GNF SymAtlas (http// symatlas. gnf. org/SymAtlas/)用於表達譜分析；Prosite (http://www, expasy. org/ Prosite/)用於結構域分析。並使用DNAstar軟體分析蛋白質抗原性、親疏水性、表面暴 露性等。通過生物信息學分析，發現UniGene =Hs. 444431，其對應基因為VSTMl, GeneID 觀4415，定位於19ql3. 42，為一未知功能人類新基因，利用Human_est資料庫通過BLASTn方 法進行序列校正無誤，然後根據該序列設計VSTMl基因全長閱讀框架的巢式特異引物外 側正向引物 5，-GCAAGAGTGGGGCAGAG-3，(SEQ ID No 11)；外側反向引物 5，-ACGAAGAGCA AGGAAACAC-3，(SEQID No 12)；內側正向引物 5，-GAAGGGACGCTATG ACCGC-3，(SEQ ID No 13)；內側反向引物5，-CTGTCTTCTTGCTACACTTTC-3，(SEQ ID No 14)。用上述引物，分別以人 正常脾組織cDNA文庫(Clontech =Cat. No. 636743)、人正常胎肝組織cDNA文庫(Clontech Cat. No. 636748)以及人正常粒細胞cDNA文庫(前述製備)為模板進行第一次PCR擴增反 應，反應條件如下
反應體積50 μ 1，其中含有人正常脾/胎肝組織/粒細胞cDNA模板5 μ 1 (5ng)；引物外側正向引物、反向引物終濃度各0. 2 μ M ； dNTP 終濃度各200 μ M ；Taq DNA聚合酶 2. 5U ； 10XTaq DNA聚合酶緩衝液5 μ 1 ；用雙蒸水補足至50 μ 1體積。
反應溫度、時間94°C，變性5分鐘；然後94°C變性30秒，52 °C退火30秒，72°C延 伸1分鐘，擴增30個循環；最後在72°C下延伸10分鐘。
—擴產物用雙蒸水稀釋50倍作為模板進行第二次PCR擴增反應，反應條件如下
反應體積50μ1，其中含有一擴產物稀釋50倍5yl(5ng)；引物內側正向引 物、反向引物終濃度各0. 2μΜ ;dNTP :終濃度各20(^] 汀&卩0嫩聚合酶2. 5U ； 10XTaq DNA 聚合酶緩衝液5 μ 1 ；用雙蒸水補足至50 μ 1體積。
反應溫度、時間94°C，變性5分鐘；然後94°C變性30秒，61°C退火30秒，72°C延 伸1分鐘，擴增30個循環；最後在72°C下延伸10分鐘。
擴增產物為3』有鹼基A的3』突出粘端片段，用QIAquick膠回收試劑盒Oliagen， 28706)按產品說明書進行純化，然後與3，有鹼基T的線性pGEM-T EASY載體(ftOmega， A1360)在16°C下連接8小時，連接產物轉化大腸桿菌DH5a (可由TakaRa等公司市售購 得)，轉化物在含氨苄青黴素的LB平板培養基上生長，挑選克隆，提取質粒，使用AbI PRISM 3700DNA 分析儀(Perkin-Elmer/Applied Biosystem)測序。
本實施例中以人正常脾組織、胎肝組織及粒細胞cDNA文庫為模板擴增VSTM1， 獲得VSTMl基因的五種剪切體形式，本發明將這五種剪切體分別命名為VSTMl-vl、 VSTMl-v2、VSTMl-v3、VSTMl_v4、VSTMl_v5，其蛋白質序列與核酸序列見 SEQ ID No 1 10。將含有VSTMl五種剪切體的cDNA的pGEM_T EASY載體分別命名為pGEM-T_VSTMl_vl、 pGEM-T-VSTMl-v2、pGEM-T_VSTMl_v3、pGEM-T_VSTMl_v4、pGEM-T_VSTMl_v5。
VSTMl-vlVSTMl-v2VSTMl-v3VSTMl-v4VSTMl-v5ORF全 長71 Ibp SEQ ED No 1 第12 722位618bp SEQ ID No 3 第12 629位351bp SEQ ID No 5 第Π 3 位447bp SEQ ID No 7 第67 513位432bp SEQ ID No 9 第12 443位編碼氨基 酸數目236aa SEQ CD No 2205aa SEQ ID No 4116aa SEQ Ε)No 6148aa SEQ ID No 8143aa SEQ ID No 10
VSTMl_v2組織來源為脾、粒細胞。VSTMl_v2編碼一個205個胺基酸的蛋白質，分 子量22. 5kD，等電點4. 84。該蛋白最大特點是具有分泌信號肽序列(SEQ ID No :4第1 16位)，Signal P分析有明顯的信號肽，為N端的16個胺基酸，且具有兩個N糖基化位點， TMHMM分析無跨膜區，VSTMl-v2可能為一新的分泌蛋白。利用DNAstar軟體包(DNASTAR Inc. ,Madison, WI,USA)對VSTMl_v2的抗原性、親疏水性、表面暴露性等特性進行預測結果 請參見圖1。
實施例2、VSTM1-V2在組織和細胞中的表達譜分析
為了分析VSTMl_v2在正常組織中的mRNA表達水平，本實施例中使用購買的 clontech人正常組織cDNA文庫，用實施例1中巢式PCR擴增條件對VSTMl進行擴增。使 用 5，引物(5，-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3，SEQ ID No 15)與 3，引物(5，-CATG TGGGCCATGAGGTCCACCAC-3，SEQ ID No 16)擴增 GAPDH 作為內參，擴增條件為 94°C (5 分 鍾)—94°C (40 秒)，58°C (40 秒)，72°C (40 秒)，擴增 20 個循環一72 °C (7 分鐘)。PCR擴增產物經過瓊脂糖凝膠電泳，EB染色後，GENE Snap凝膠成像系統檢測。
實驗結果請參見圖2A和圖2B所示，其中，圖2A為表示人16種正常組織文庫，各 泳道分別為1，腦；2，心臟；3，腎臟；4，肝臟；5，肺臟；6，胰腺；7，胎盤；8，骨骼肌；9，結腸； 10，白細胞；11，卵巢；12，前列腺；13，小腸；14，脾臟；15，睪丸；16，胸腺。圖2B為表示人7 種正常免疫系統組織文庫，各泳道分別為1，白細胞；2，骨髓；3，淋巴結；4，脾臟；5，胸腺； 6，扁桃體；7，胎肝；8為陰性對照。本實施例的實驗結果表明，VSTM1-V2僅在免疫系統像脾 髒、胸腺、淋巴結、骨髓以及白細胞中表達，提示VSTM1-V2可能作為人體自身重要的一個細 胞因子，在免疫系統中發揮重要的作用。
實施例3、真核細胞表達質粒pcDB-VSTMl-v2-myc_his的構建
為了檢測VSTM1-V2的功能，本實施例中構建了含有VSTMl_v2 cDNA的真核表達 質粒pcDNA3. lB-VSTMl-v2-myc-his (pcDB-VSTMl-v2-myc-his)。用帶有 Not I (TaKaRa) 酶切位點的上遊引物(5，-CGAGCGGCCGCATGACCGCAGAATTCCTCTC-3，SEQ ID No :17)和 Kpn I (TaKaRa)酶切位點的下遊引物(5，-CTTGGTACCGACACTTTCAGTGCCGCATATT-3，SEQ ID No 18)對pGEM-T-VSTMl-v2載體(參見實施例1中製備)進行PCR擴增(反應溫度、時間 94 V，變性5分鐘；然後94 °C變性30秒，56 V退火30秒，72 V延伸1分鐘，擴增35個循 環；最後在72°C下延伸10分鐘)，得到VSTM1-V2的cDNA的全長ORF片段，然後用Not I 和Kpn I酶切該PCR產物，同時用Not I和Kpn I酶切真核表達載體pcDNA3. 1/mycHis (-) B(Invitrogen, V85520,以下縮寫為pcDB，pcDB是設計用於重組蛋白在哺乳類動物細胞系 中高表達的載體，它含有人巨細胞病毒CMV啟動子，可在哺乳類動物細胞系中實現高表達。 將酶切後的VSTM1-V2的cDNA基因片段與載體在16°C下連接8小時，轉化大腸桿菌DH5 α， 轉化物在含氨苄青黴素的LB平板培養基上生長，挑選生長的菌落，提取質粒，PCR鑑定，挑 選陽性克隆，通過測序(同上)，選出正確的插入序列的VSTM 1-ν2的cDNA基因質粒，命名 為 pcDB-VSTMl-v2-myc-his (帶有 c_myc 和 his 標籤)。
實施例4、VSTM1-V2原核表達質粒的構建以及原核蛋白的純化
l、VSTMl_v2原核表達質粒的構建
為了製備VSTMl抗體和進行分泌蛋白VSTM1-V2的功能研究，本實施例中構建了 含有 VSTMl-v2 cDNA 的原核表達載體pGEX4T-l-VSTMl_v2 和 pET_32a_c (+) -VSTMl-v2。 其中插入的VSTMl-v2片段為去除信號肽後的ORF區。首先用帶有BamH I (TaKaRa)酶 切位點的上遊引物(5，-CGCGGATCCTACGAAGATGAGAAAAAGAATG-3，SEQ ID No 19)和 Sma I (TaKaRa)酶切位點的下遊引物(3，-CGCCGTGACTTTCACATCGGGCCCCCT-5，SEQ ID No 20)對 pGEM-T-VSTMl-v2載體(參見實施例1中製備)進行PCR擴增(反應溫度、時間94°C，變 性5分鐘；然後94°C變性30秒，56 °C退火30秒，72 °C延伸1分鐘，擴增35個循環；最後在 72°C下延伸10分鐘)，得到VSTM1-V2的cDNA的全長ORF片段，然後用BamH I和Sma I酶 切該PCR產物，同時用BamH I和Sma I酶切原核表達載體pGEX4T_l，將酶切後的VSTMl_v2 的cDNA基因片段與載體在16°C下連接8小時，轉化大腸桿菌DH5 α，轉化物在含氨苄青黴 素的LB平板培養基上生長，挑選生長的菌落，提取質粒，PCR鑑定，挑選陽性克隆，通過測序 (同上)，選出正確的插入序列的VSTMl-v2的cDNA基因質粒，命名為pGEX4T-l-VSTMl_v2。 其表達的重組蛋白為GST-VSTM1-V2，即蛋白的N端帶有GST標籤，而GST標籤與VSTMl_v2 目的蛋白之間有一個凝血酶的酶切位點，便於酶切與純化。pET-32a-C(+)-VSTMl-v2克隆構建過程與pGEX4T-l-VSTMl-v2 —致。pET-32a_c (+)_VSTMl_v2表達的重組蛋白為 Trx-His-S-VSTMl-v2,即蛋白的N端帶有Trx、His和S三個標籤，而His標籤與S標籤之間 有一個凝血酶的酶切位點，S標籤與VSTM1-V2目的蛋白之間有一個腸激酶的酶切位點，便 於更多選擇地酶切與純化。
2、重組VSTM1-V2蛋白的表達與純化
(l)pGEX4T-l-VSTMl-v2
原核表達質粒pGEX4T-l-VSTMl_v2轉化大腸桿菌BL21 (可由TakaRa等公司市售 購得)，轉化物LB平板培養基(Amp抗性)上生長，牙籤挑單菌落接於5ml LB (Amp抗性) 中，37°C，300rpm，過夜培養，然後按量轉接入100ml 2XYP中(含Amp 110μ 1),37°C, 300rpm,待OD值0. 7 0. 8時，加入IPTG (終濃度為0. 6mM)，22°C，300rpm,誘導表達6小 時。
首先取Iml誘導後菌液進行小量鑑定，8000rpm離心10分鐘，200 μ 1水溶離心後 的菌體，超聲裂菌5次(400w，10s超聲，IOs間隔)，12000印111，41，51^11離心，取100 μ 1上 清，SDS-PAGE 電泳。
然後進行大量純化，收集誘導後的GST-VSTM1-V2工程菌，用PBS洗滌一次， 8000rpm離心10分鐘，棄上清取沉澱，用PBS重懸菌體(PBS lOml/lOOml培養基)。超聲裂 菌90次(400w, IOs超聲，IOs間隔，冰浴)，12000rpm, 4°C, 20min離心，棄沉澱，留上清，上 清過0. 45um濾膜。取Iml Glutathione-kpharose4B裝柱，先用去離子水洗去柱料中的保 存液，再用PBS平衡柱子，將濾過的超聲上清加到平衡好的柱子上，控制流速3ml/min左右。 上樣結束後，用PBS衝洗柱子至基線。封閉柱子下面的出液閥，將凝血酶配製成40imits/ mlPBS溶液，加到層析柱上，使柱料完全浸泡在酶溶液中，室溫放置1小時。打開出液閥，收 集酶切液，再用anlPBS洗柱子，洗柱液與前面收集到的酶切液合併到一起，置於透析袋中， 用預冷的1XPBS(PH7. 4)4°C透析兩次，每次3小時，然後於4°C使用PEG-2000濃縮蛋白至 500 μ 1，吸出蛋白，於4°C，ISOOOg離心20分鐘除菌，取上清分裝保存於_80°C待用。
(2)pET-32a-c(+)-VSTMl-v2
原核表達質粒pET-3h_c (+) -VSTMl-v2轉化大腸桿菌BL21，轉化物LB平板培養 基(Amp抗性)上生長，牙籤挑單菌落接於5ml LB (Amp抗性)中，37°C，300rpm,過夜培養， 然後按1 %量轉接入IOOmlLB中(含Amp 110 μ 1)，37°C，300rpm,待OD值0. 7 0. 8時，加 Λ IPTG(終濃度為0. 6mM)，22°C，300rpm，誘導表達6小時。
首先取Iml誘導後菌液進行小量鑑定，8000rpm離心10分鐘，200 μ 1水溶離心後 的菌體，超聲裂菌5次(400w，10s超聲，IOs間隔)，12000印111，41，51^11離心，取100 μ 1上 清，SDS-PAGE 電泳。
然後進行大量純化，收集誘導後的Trx-His-S-VSTMl-v2工程菌，用PBS洗滌一次， 8000rpm離心10分鐘，棄上清取沉澱，用PBS重懸菌體(PBS 20ml/100ml培養基)。超聲裂 菌90次(400w, IOs超聲，IOs間隔，冰浴)，12000rpm, 4°C，20min離心，棄沉澱，留上清，上清 過0. 45um濾膜。
用Ni2+柱料純化上述處理後上清先將上清經過0. 45 μ m濾器過濾後，在上清中加 入咪唑(IOmM) /NaCl (200mM)，再與柱料結合，流速控制在10滴每分鐘，再用平衡緩衝液咪 唑(20mM)/NaCl QOOmM)溶於1XPBS(PH7. 4)衝洗柱料，以洗去未結合的雜蛋白，至分光回至基線後，用洗脫液咪唑(500mM)/NaCl QOOmM)溶於IXPBS(PH7. 4)洗脫結合蛋白直至 分光光度計測量值不再下降，收集洗脫液於透析袋中，用預冷的IXPBS(PH7. 4)4°C透析兩 次，每次3小時，然後於4°C使用PEG-2000濃縮蛋白至500 μ 1，吸出蛋白，於4°C，18000g離 心20分鐘除菌，取上清分裝保存於-80°C待用。
用BCA方法(按BCA Protein Assay Kit (Pierce, 23227)說明書進行)對兩種重 組蛋白進行蛋白定量，並取部分樣品進行SDS-PAGE，鑑定重組VSTM1-V2蛋白純化的純度。
圖3A顯示了 SDS-PAGE和質譜分析鑑定純化的GST_VSTMl_v2重組蛋白質 (GST-rVSTMl-v2，圖中泳道1)以及經凝血酶酶切後(rVSTMl_v2，圖中泳道2)的SDS-PAGE 結果。GST-VSTM1-V2蛋白純化後SDS-PAGE出現兩條帶，經質譜分析皆為目的蛋白；通過凝 血酶酶切後，重組VSTM1-V2條帶單一，符合預期大小，且純度較高。
圖;3B顯示了 SDS-PAGE鑑定Trx-His-S-VSTMl_v2重組蛋白質的純化結果。可以 看出，重組蛋白Trx-His-S-VSTMl-v2純化後純度稍低，但已達製備抗體要求。
實施例5、VSTMl抗體的製備、純化及鑑定
1、以原核蛋白製備VSTMl多克隆抗體
用實施例4製備的純化的Trx-His-S-VSTM1-V2原核蛋白免疫動物。選用成年雄 性紐西蘭兔，初次免疫將300 μ g的抗原用PBS稀釋至Iml後與等體積的弗氏完全佐劑充分 混合，於兩足部各0.25ml皮下注射，其餘後背部皮下多點(6點)注射。之後每3周加強免 疫一次，用量同前，全部後背部皮下多點(8點)注射。第三次加強免疫後10天取兔耳緣靜 脈血樣檢測效價，至效價達1 IO5以上後，將家兔處死心臟取血，獲取血清。
用CNBR活化的kpharose 4B耦聯GST_VSTM1_V2原核蛋白製備的親和層析柱。 然後加入上述獲取的抗VSTMl的兔免疫血清4°C旋轉混合過夜，留取穿過液備用，再用PBS 衝洗柱料。再加入0. IM甘氨酸緩衝液洗脫(pH2. 4)，洗脫液接入預加入3M Tris (pH9. 0) 的收集管中。然後用微量滴度板檢測管內抗體濃度。純化獲得的特異性抗體，置於4°C用 pH7. 4PBS大體積透析，更換三次，每次間隔8小時。然後用聚乙二醇在4°C將蛋白濃縮至 Iml。
在HEK 細胞中超表達VSTMl_v2(具體參見實施例6)，通過Western blot鑑 定抗體特異性，結果請參見圖4，表明此抗體能特異性識別外源性表達的VSTM1-V2蛋白。
2、以合成多肽製備VSTMl多克隆抗體
本實施例中，還根據對VSTM1-V2的生物學分析，選取了 VSTMl_v2蛋白N端兩段氨 基酸序列SEQ ID NO :4第17 32位、第62 81位所示的胺基酸序列(請參見圖1中矩 形框所示，這兩段序列親水性、抗原性與表面暴露性都較好，且無糖基化修飾)，並將它們返 回到蛋白質資料庫中進行匹配，驗證其特異性後進行多肽合成(多肽委託杭州中肽生化有 限公司合成)。多肽純度要求大於75%，部分多肽偶聯KLH。
然後製備抗體，免疫動物選用成年雄性紐西蘭兔，兩條與KLH偶聯的多肽等質量 混合免疫家兔，一共免疫四次，製備多克隆抗體。初次免疫將300 μ g的混合多肽用PBS稀釋 至Iml後與等體積的弗氏完全佐劑充分混合，於兩足部各0. 25ml皮下注射，其餘後背部皮 下多點(6點)注射。之後每3周加強免疫一次，用量同前，全部後背部皮下多點(8點)注 射。第三次加強免疫後10天取兔耳緣靜脈血樣檢測效價，至效價達1 IO5以上後，將家兔 處死心臟取血，獲取血清。血清用CNBR耦聯VSTM1-V2N端多肽純化獲得抗體，Westernblot鑑定抗體特異性結果(參見圖幻表明該抗體能特異性識別外源性表達蛋白，因此得到 VSTMl特異的多克隆抗體。
實施例6、VSTM1-V2是通過經典途徑分泌的分泌蛋白
生物信息學提示VSTM1-V2為分泌蛋白，本實施例中通過具體實驗驗證這一點。
1、細胞培養、轉染用質粒pcDB-VSTMl-v2-myc_his轉染HEK 293T細胞。
HEK293T細胞為日本T. Matsuda教授饋贈(也可商購如從ATCC購得HEK293T細 胞)，用含 10%胎牛血清(FBS)的 DMEM(Dulbecco' s modified Eagle' s medium,4. 5g/ L葡萄糖，4mM L-穀氨醯胺，100U/ml青黴素，100 μ g/ml鏈黴素)培養。
使用Vigofect陽離子轉染法轉染目的基因pcDB-VSTMl-V2-myc-hiS真核表達質 粒。具體操作步驟如下(1)細胞培養將HEK 細胞(3. OX IO5個)用含10%胎牛血 清的DMEM培養基鋪在IOcm培養皿中，在5% C02、37°C的培養箱中培養M小時；(2)製備 DNA-Vigofect複合物用100 μ IPBS稀釋Sygg的質粒，緩慢混合均勻；同樣用100 μ 1 PBS稀釋2 μ 1 VigoFect,緩慢混合均勻，在室溫下放置5分鐘後，與稀釋的DNA緩慢混合， 室溫放置15分鐘，以形成DNA-VigoFect複合物；( 轉染將DNA-VigoFect複合物緩慢滴 入細胞培養板ΟΟΟμ 1/孔)，輕微搖勻；5% C02，37°C的培養箱中培養。
轉染對小時後，分別在細胞培養上清中加入10mg/ml BFA (Brefeldin-A，布雷菲 德菌素A)和DMSO (用作陰性對照)，處理細胞M小時後，細胞融合率約達到90%時，收集 各實驗組細胞及細胞培養上清用於Western blot分析。
2、獲取細胞培養上清及提取細胞蛋白和Wfestern blot檢測VSTMl蛋白的超表達 情況細胞培養上清的收集細胞轉染48小時後，分別收集各實驗組細胞培養上清，於 4°C，2000g離心10分鐘，棄沉澱，再於4°C，15000g離心15分鐘，然後於37°C真空乾燥濃縮 1小時，留取處理後的細胞培養上清。
細胞總蛋白的提取將留取上清後的細胞置於冰上，用冰預冷的IXPBS洗兩 遍，用冰預冷的ι χPBS吹下細胞，將細胞收集到1. 5mL離心管中，於4°C，2000g離心5分鐘。 去除上清，在沉澱中加入RIPA細胞裂解液(20mM Tris_HCl，pH 7. 4,150mM NaCl, ImMEDTA, ImM EGTA, 1 % Triton X-100，蛋白酶抑制劑 Cocktail)，冰上放置 30 分鐘，4°C，15000g離心 15分鐘，上清轉入新管，存於-80°C備用。
蛋白定量細胞提取的蛋白按照BCA Protein Assay Kit (Pierce, 23227)說明書 提供的方法進行蛋白定量。
Western blot 每組細胞蛋白取30 μ g，每組細胞培養上清取40 μ 1，加入蛋白上 樣緩衝液(北京寶賽生物技術有限公司)，於100°C水浴煮5分鐘。12. 5% PAGE電泳，IOOmV 電轉1小時，TBST液平衡，用5%牛奶室溫封閉2小時，分別加入實施例5中以合成多肽制 備的VSTMl多克隆抗體(1 1000)、單克隆抗β-actin抗體(Sigma，l 3000)作為一 抗，4°C過夜，用TBST充分洗膜3次，每次10分鐘；然後加入相應的IRDye 800標記的二 抗(1 10000)，室溫避光反應1小時；再用TBST充分洗膜3次，每次10分鐘；最後使用 Odyssey Infrared Imager 在 800nm 波長下檢測信號。
Western blot分析結果請參見圖5所示，在超表達VSTMl_v2的細胞的培養 上清中，可檢測到VSTM1-V2，但其蛋白分子量偏大，可能為糖基化等修飾所致。加入經典分 泌途徑(內質網高爾基體途徑)的抑制劑BFA後，VSTM1-V2分泌明顯減少，證明VSTMl_v2為通過經典途徑分泌的分泌蛋白。
實施例7、真核細胞VSTM1-V2分泌蛋白質的表達與純化
將HEK 細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基鋪在IOcm培養皿中，在5% C02、37°C的培養箱中培養對小時。使用Vigofect陽離子轉染法(參見實施例6)轉染目 的基因pcDB-VSTMl-V2-myc-hiS真核表達質粒。轉染6小時後用常溫的IXPBS洗滌細胞 一次，更換新鮮的無血清培養基(但含有低蛋白的培養細胞因子)，在5 % C02，37°C的培養 箱中培養。48小時後收集細胞培養上清，於4°C，2000g離心10分鐘，目的是去除細胞培養 上清的細胞，棄沉澱，再於4°C，ISOOOg離心20分鐘，去除上清中的小顆粒物質，留取處理後 的細胞培養上清。用Ni2+柱料純化上述處理後的細胞培養上清具體方法與實施例4同， 取處理後的上清分裝保存於-80°C待用。取5 μ 1蛋白用BCA方法對其進行BCA蛋白定量， 取部分樣品(每組細胞蛋白取30yg)加入蛋白上樣緩衝液，於100°C水浴煮5分鐘，進行 SDS-PAGE以及western blot，鑑定VSTMl_v2分泌蛋白純化的純度。
結果請參見圖6所示，VSTM1-V2純化蛋白純度較高。
實施例8、真核細胞純化VSTM1-V2分泌蛋白質的糖基化實驗
取3X30 μ 1實施例7中製備的真核細胞純化VSTMl_v2蛋白，加入0. 1 % SDS與 50mM β -巰基乙醇，95°C變性5分鐘，然後加入1 % NP-40、蛋白酶抑制劑cocktail，分別加 入N-糖苷酶F、0-糖苷酶以及雙蒸水，37°C酶切2小時，然後加入蛋白上樣緩衝液終止酶切 反應，通過western blot檢測VSTM 1_ν2的糖基化修飾情況。
結果如圖7所示，與加入雙蒸水的對照(泳道1)相比，加入N-糖苷酶F酶切後 VSTM1-V2條帶(泳道幻明顯變小緻密，而加入0-糖苷酶後(泳道幻沒有明顯變化，提示 VSTM1-V2分泌蛋白具有N糖基化修飾，而無0糖基化修飾。
實施例9、檢測VSTM1-V2對CD4+T細胞活化和分化的影響
1、檢測VSTM1-V2分泌蛋白對CD4+T細胞細胞因子表達的影響
首先應用淋巴細胞分層液從正常人外周血中分離得到PBMC(正常人外周血單個 核細胞)，然後從中用陽性分選磁珠純化得到CD4+T淋巴細胞，將磁珠純化得到CD4+T淋巴 細胞培養於用抗⑶3(1 μ g/ml ；clone 0KT3)和抗；clone 15E8)抗體包被 的細胞培養板，密度為1. 5X IO6個細胞/ml，分為七組，分別加入PBS、真核細胞VSTMl_v2 分泌蛋白(1叫、101^、1001^/1111)、加熱滅活真核細胞￥511112分泌蛋白(lOOng/ml)、原核 細胞VSTM1-V2蛋白(lOOng/ml，GST-VSTMl_v2重組蛋白去掉GST標籤)及其加熱滅活蛋 白，以上七組分別定義為 PBS、VSTMl-v2-l、VSTMl-v2-10、VSTMl-v2-100、Δ VSTMl-v2_100、 rVSTMl-v2 以及 ArVSTMl_v2。
37°C ,5% CO2條件下培養69小時時加入BFA抑制細胞因子的分泌，72小時時收穫 細胞通過流式細胞儀(FACS)檢測細胞內IFN-Y、IL-4、IL-17A等各種細胞因子的變化。細 胞內分子檢測收穫不同類型的免疫細胞，用冷的PBS/0. BSA洗滌兩次，首先用3%多聚 甲醛冰上固定30min ；然後用0. 1% Triton X-100室溫孵育30min，1500rpm離心5min。再 加入100 μ 1封閉液(PBS/10%正常羊血清)重懸細胞，室溫封閉30分鐘。隨後加入PE標 記的 IFN- γ 抗體(BD) ,FITC 標記的 IL-4 抗體(BD)、APC 標記的 IL-17A 抗體(R&D), 4 0Cig 光孵育40min ；使用相應IgG作為陰性對照。最後用PBS/0. 1% BSA洗滌兩次後，通過流式 細胞儀收集細胞，使用Cellquest軟體對結果進行分析。19
檢測結果請參見圖8所示，IFN- γ和IL-4沒有明顯變化(圖片A、B)，而真核和原 核蛋白VSTM1-V2都能明顯促進IL-17A分泌的細胞增多(圖片C)。由於在⑶4+T細胞中， IL-17A主要由Thl7細胞分泌，因此，本實施例結果提示VSTM1-V2可能會影響Thl7細胞的 分化。
2、檢測VSTM1-V2分泌蛋白對Thl7細胞分化的影響
同樣首先應用淋巴細胞分層液從正常人外周血中分離得到PBMC(正常人外周血 單個核細胞)，然後從中用陽性分選磁珠純化得到CD4+T淋巴細胞，在純化的細胞中加入小 鼠抗人CD45R0抗體(BD)和大鼠抗小鼠IgGh陽性分選磁珠(Dynal Biotech)去除CD45R0+ 細胞，餘下的細胞即為CD45RA+的Naive T淋巴細胞。利用流式細胞技術，用螢光標記的抗 ⑶45RA、⑶45R0和⑶4抗體鑑定所分選的⑶4+Naive T淋巴細胞的純度。
將Naive T淋巴細胞培養於包被抗CD3 (1 μ g/ml ;clone 0KT3)和抗⑶觀Q μ g/ ml ；clone 15E8)抗體的細胞培養板中，在培養體系中加入重組人IL-I β (50ng/ml)、 重組人 IL-6 (50ng/ml)、重組人 IL-23 (50ng/ml)、重組人 TNF- α (10ng/ml)、重組人 TGF-β 1 (5ng/ml)、抗人IL-4的抗體(5 μ g/ml)和抗人IFN- γ (5 μ g/ml)的抗體。四天後， 細胞換液去除抗CD3和抗CD^抗體，加入重組人IL-2 (5ng/ml)，其餘細胞因子和抗體不 變，繼續培養三天。在Thl7細胞分化的過程中分別加入PBS、真核細胞VSTM1-V2分泌蛋白 (lng/ml、10ng/ml、100ng/ml)，檢測VSTMl_v2分泌蛋白對Thl7細胞分化的影響。
Thl7細胞誘導分化7天後，用PMA(100ng/ml)和ionomycin(l μ Μ)刺激細胞6小 時，其中後3小時加入BFA抑制細胞因子的分泌，通過FACS檢測其細胞內的IL-17A水平。 結果請參見圖9中圖片A所示，VSTM1-V2能促進IL-17A+Thl7細胞增多。
另外Thl7細胞誘導分化7天後，收穫細胞培養上清，通過ELISA檢測細胞因子 IL-17A的分泌情況。結果請參見圖9中圖片B所示，可以發現VSTM1-V2能促進IL-17A的 分泌。
另外提取上述各組細胞的RNA，利用realtime PCR方法(Real-time PCR採用 SYBRGreen方法和LightCycler儀器進行)檢測IL-17A轉錄水平的變化。結果請參見圖9 中圖片C所示，與FACS結果一致，VSTM1-V2能促進Thl7細胞IL-17A的表達。
另外通過[3H]-TdR摻入實驗檢測細胞增殖，具體實驗操作將分離獲得⑶4+Naive T淋巴細胞，將細胞懸浮在10% FBS RPMI 1640中，調整細胞濃度為2X 106/ml。加入用抗 CD3和CD^抗體包被的96孔平底培養板，100 μ 1/孔，培養條件與誘導Thl7細胞分化體系 相同，同時加入PBS或真核細胞VSTM1-V2分泌蛋白，每組設立3個復孔，培養7天後加入 [3H] -TdR,濃度為1 μ Ci/ml，繼續培養18小時後，收集細胞至96孔Fi Itermat上，MicroBeta Windows Workstation (Wallac)測定[3H]-TdR的摻入情況。[3H]-TdR摻入方法檢測發現 VSTM1-V2分泌蛋白(lOOng/ml)可促進Thl7細胞的增殖，結果請參見圖9中圖片D所示。
以上結果表明VSTM1-V2可在體外促進Thl7細胞的分化。
實施例10、檢測VSTM1-V2對⑶8+T細胞活化和殺傷功能的影響實驗
首先應用淋巴細胞分層液從正常人外周血中分離得到PBMC(正常人外周血單個 核細胞)，然後從中用陽性分選磁珠純化得到CD8+T淋巴細胞，培養於用抗CD3 (1 μ g/ml ； clone0KT3)和抗⑶沘O μ g/ml ；clone 15E8)抗體包被的細胞培養板，密度為1. 5 X IO6個 細胞/ml，分為兩組，分別加入PBS和真核細胞VSTM1-V2分泌蛋白(lOng/ml)。
37°C,5% CO2條件下培養69小時後加入BFA抑制細胞因子的分泌，72小時收穫 細胞通過FACS檢測細胞內細胞因子IFN- γ的變化，結果請參見圖10中圖片A所示，發現 VSTM1-V2能明顯促進CD8+T細胞IFN- γ的表達。
檢測⑶8+Τ細胞殺傷Κ562細胞的功能實驗時，磁珠純化得到的⑶8+Τ淋巴細胞，培 養於用抗⑶3(1μ g/ml)和抗⑶^Ομ g/ml)抗體包被的細胞培養板，密度為1. 5 X IO6個細 胞/ml，細胞共培養六天，中間換一次新鮮培養基，六天後將CD8+T細胞與K562細胞以9 1 的比例共孵育，同時加入抗⑶3(1 μ g/ml)和抗抗體，另外加入PBS或真核 細胞VSTM1-V2分泌蛋白(lOng/ml)，24小時後光鏡下觀察CD8+T細胞對K562細胞的殺傷作 用，並利用流式細胞儀Armexin V-FITC/PI雙染檢測K562細胞的凋亡，從而反映VSTMl_v2 分泌蛋白對⑶8+T細胞殺傷K562細胞功能的影響。
流式細胞儀檢測細胞凋亡的具體操作為收穫細胞並製備成單細胞懸液，預冷的 PBS 洗 2 次後，換 binding buffer (IOmM HEPES, pH 7. 4,140mM NaCl, ImM MgC12, 5mMKCl, 2. 5mM CaC12)洗細胞一次，加入FITC-Annexin V至終濃度0. 5 μ g/ml，4°C孵育30分鐘，加 Apropidium iodide至終濃度1 μ g/ml，上流式細胞儀，以488nm氬激發光檢測細胞程序性死亡。
檢測結果請參見圖10中圖片B與圖片C所示，發現VSTM1-V2能明顯促進⑶8+T細 胞與K562細胞聚集成團以及K562細胞的凋亡，提示VSTMl_v2能促進CD8+T細胞對K562細 胞的殺傷作用。
以上實施例說明，VSTM1-V2作為一個分泌蛋白，在體外介導Th細胞的分化和調 節CD8+T淋巴細胞的功能，在體內可能作為一個細胞因子，在免疫系統中發揮其重要功能。 VSTM1-V2蛋白及VSTMl抗體在抗感染、提高免疫力、抗自身免疫性疾病以及抗腫瘤免疫等 方面具有潛在的臨床應用價值。
序列表
北京大學
人類新細胞因子VSTM1-V2及其應用
GAI09CN1795C
20
PatentIn version 3.5
1
733
DNA
智人(Homo sapiens)

CDS
(12). . (722)
1
gaagggacgc t atg acc gca gaa ttc ctc tcc ctg ctt tgc ctc ggg ctg 50
Met Thr Ala Glu Phe Leu Ser Leu Leu Cys Leu Gly Leu
15100165]tgtCtgggctacgaagatgagSlSlSlaagaatgagCCgCCCaagCCC980166]CysLeuGlyTyrGluAsp GluLysLysAsnGluLysProProLysPro0167]1520250168]tccctccacgcctggCCCagetcggtggttgaagccgagageaatgtg1460169]SerLeuHisAlaTrpProSerSerValValGluAlaGluSerAsnVal0170]303540450171]accCtgaagtgtcaggetcattcccagaatgtgacatttgtgCtgCgC1940172]ThrLeuLysCysGlnAlaHisSerGlnAsnValThrPheValLeuArg0173]5055600174]aaggtgaacgactctgggtacaagcaggaacagagetcggcagaaaac2420175]LysValAsnAspSerGlyTyrLysGlnGluGlnSerSerAlaGluAsn0176]6570750177]gaagetgaattcCCCttcacggacCtgaagcctaaggatgetgggagg2900178]GluAlaGluPheProPheThrAspLeuLysProLysAspAlaGlyArg0179]8085900180]tacttttgtgcctacaagacaacagcctcccatgagtggteagaaage3380181]TyrPheCysAlaTyrLysThrThrAlaSerHisGluTrpSerGluSer0182]951001050183]agtgaacacttgcagCtggtggtcacagatcacgatgaaCttgaa3860184]SerGluHisLeuGlnLeuValValThrAspLysHisAspGluLeuGlu0185]1101151201250186]getCCCteaatgacagacaccagaaccatetttgtcgccatettc4340187]AlaProSerMetLysThrAspThrArgThrliePheValAlaliePhe0188]1301351400189]agetgcatetccateCttctcctcttcctcteagtcttcateatetac4820190]SerCyslieSerlieLeuLeuLeuPheLeuSerValPhelielieTyr0191]1451501550192]agatgcagecagcacggtteateatctgaggaatccaccaagagaacc5300193]ArgCysSerGlnHisGlySerSerSerGluGluSerThrLysArgThr0194]1601651700195]agecattccCttCCggagcaggaggetgccgaggcagatttatcc5780196]SerHisSerLysLeuProGluGlnGluAlaAlaGluAlaAspLeuSer0197]1751801850198]aatatggaaagggtatctctctcgacggcagacCCCcaaggagtgacc6260199]AsnMetGluArgValSerLeuSerThrAlaAspProGlnGlyValThr0200]1901952002050201]tatgetgagctaageaccagegccCtgtctgaggcagetteagacacc6740202]TyrAlaGluLeuSerThrSerAlaLeuSerGluAlaAlaSerAspThr0203]210215220
acccaggagCCCccaggatct catgaatatgcggcaCtggtgtag722
ThrGlnGluProProGly Ser His Glu TyrAlaAlaLeu LysVal
225230235
caagaagaca g733
2
236
PRT
智人(Homosapiens)
2
MetThrAlaGluPheLeuSer LeuLeu CysLeuGlyLeuCysLeuGly
151015
TyrGluAspGluLysLysAsn GluLysProProLysProSerLeuHis
202530
AlaTrpProSerSerValVal GluAlaGluSerAsnValThrLeuLys
354045
CysGlnAlaHisSerGlnAsn ValThrPheValLeuArgLysValAsn
505560
AspSerGlyTyrLysGlnGlu GlnSerSerAlaGluAsnGluAlaGlu
65707580
PheProPheThrAspLeuLys ProLysAspAlaGlyArgTyrPheCys
859095
AlaTyrLysThrThrAlaSer HisGluTrpSerGluSerSerGluHis
100105110
LeuGlnLeuValValThrAsp LysHisAspGluLeuGluAlaProSer
115120125
MetLysThrAspThrArgThr liePheValAlaliePheSerCyslie
130135140
SerlieLeuLeuLeuPheLeu SerValPhelielieTyrArgCysSer
145150155160
GlnHisGlySerSerSerGlu GluSerThrLysArgThrSerHisSer
165170175
LysLeuProGluGlnGluAla AlaGluAlaAspLeuSerAsnMetGlu
180185190
ArgValSerLeuSerThrAla AspProGlnGlyValThrTyrAlaGlu
195200205
LeuSerThrSerAlaLeuSer GluAlaAlaSerAspThrThrGlnGlu
210215220
ProProGlySerHisGlu Tyr AlaAlaLeuLys Val
225230235
3
640
DNA
智人(Homo sapiens)

CDS
(12). . (629)
3
gaagggacgc t atg acc gca gaa ttc ctc tcc ctg ctt tgc ctc ggg ctg 50
Met Thr Ala Glu Phe Leu Ser Leu Leu Cys Leu Gly Leu
1510
tgt ctg ggc tac gaa gat gag aaa aag aat gag aaa ccg ccc aag ccc 98
Cys Leu Gly Tyr Glu Asp Glu Lys Lys Asn Glu Lys Pro Pro Lys Pro
152025
tcc ctc cac gcc tgg ccc age tcg gtg gtt gaa gcc gag age aat gtg 146
Ser Leu His Ala Trp Pro Ser Ser Val Val Glu Ala Glu Ser Asn Val
30354045
acc ctg aag tgt cag get cat tcc cag aat gtg aca ttt gtg ctg cgc 194
Thr Leu Lys Cys Gln Ala His Ser Gln Asn Val Thr Phe Val Leu Arg
505560
aag gtg aac gac tct ggg tac aag cag gaa cag age tcg gca gaa aac 242
Lys Val Asn Asp Ser Gly Tyr Lys Gln Glu Gln Ser Ser Ala Glu Asn
657075
gaa get gaa ttc ccc ttc acg gac ctg aag cct aag gat get ggg agg 290
Glu Ala Glu Phe Pro Phe Thr Asp Leu Lys Pro Lys Asp Ala Gly Arg
808590
tac ttt tgt gcc tac aag aca aca gcc tcc cat gag tgg tea gaa age 338
Tyr Phe Cys Ala Tyr Lys Thr Thr Ala Ser His Glu Trp Ser Glu Ser
95100105
agt gaa cac ttg cag ctg gtg gtc aca gat aaa cac gat gaa ctt gaa 386
Ser Glu His Leu Gln Leu Val Val Thr Asp Lys His Asp Glu Leu Glu
110115120125
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Ala Pro Ser Met Lys Thr Gly Ser Ser Ser Glu Glu Ser Thr Lys Arg
130135140
acc age cat tcc aaa ctt ccg gag cag gag get gcc gag gca gat tta 482
Thr Ser His Ser Lys Leu Pro Glu Gln Glu Ala Ala Glu Ala Asp Leu
145150155
tcc aat atg gaa agg gta tct ctc tcg acg gca gac ccc caa gga gtg 530
SerAsnMetGluArgValSerLeuSerThrAla Asp Pro Gln Gly Val
160165170
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ThrTyrAlaGluLeuSerThrSerAlaLeuSerGluAla Ala Ser Asp
175180185
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ThrThrGlnGluProProGlySerHisGluTyrAlaAla LeuLysVal
190195200205
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4
205
PRT
智人(Homo sapiens)
4
MetThrAlaGluPheLeuSerLeuLeuCysLeuGlyLeu CysLeuGly
151015
TyrGluAspGluLysLysAsnGluLysProProLysPro SerLeuHis
202530
AlaTrpProSerSerValValGluAlaGluSerAsnVal ThrLeuLys
354045
CysGlnAlaHisSerGlnAsnValThrPheValLeuArg LysValAsn
505560
AspSerGlyTyrLysGlnGluGlnSerSerAlaGluAsn GluAlaGlu
65707580
PheProPheThrAspLeuLysProLysAspAlaGlyArg TyrPheCys
859095
AlaTyrLysThrThrAlaSerHisGluTrpSerGluSer SerGluHis
100105110
LeuGlnLeuValValThrAspLysHisAspGluLeuGlu AlaProSer
115120125
MetLysThrGlySerSerSerGluGluSerThrLysArg ThrSerHis
130135140
SerLysLeuProGluGlnGluAlaAlaGluAlaAspLeu SerAsnMet
145150155160
GluArgValSerLeuSerThrAlaAspProGlnGlyVal ThrTyrAla
165170175
GluLeuSerThrSerAlaLeuSerGluAlaAlaSerAsp ThrThrGln
180185190
GluProProGlySerHisGluTyr Ala AlaLeuLysVal
195200205
5
373
DNA
智人(Homo sapiens)

CDS
(12). . (362)
5
gaagggacgc t atg acc gca gaa ttc ctc tcc ctg ctt tgc ctc gac acc 50
Met Thr Ala Glu Phe Leu Ser Leu Leu Cys Leu Asp Thr
1510
aga acc ate ttt gtc gcc ate ttc age tgc ate tcc ate ctt ctc ctc 98
Arg Thr lie Phe Val Ala lie Phe Ser Cys lie Ser lie Leu Leu Leu
152025
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Phe Leu Ser Val Phe lie lie Tyr Arg Cys Ser Gln His Ser Ser Ser
30354045
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Ser Glu Glu Ser Thr Lys Arg Thr Ser His Ser Lys Leu Pro Glu Gln
505560
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Glu Ala Ala Glu Ala Asp Leu Ser Asn Met Glu Arg Val Ser Leu Ser
657075
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808590
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95100105
gaa tat gcg gca ctg aaa gtg tag caagaagaca g373
Glu Tyr Ala Ala Leu Lys Val
110115
6
116
PRT
智人(Homo sapiens)
6
Met Thr Ala Glu Phe Leu Ser Leu Leu Cys Leu Asp Thr Arg Thr lie明25/30頁
151015
PheValAlaliePheSerCyslieSerlieLeuLeuLeuPheLeuSer
202530
ValPhelielieTyrArgCysSerGlnHisSerSerSerSerGluGlu
354045
SerThrLysArgThrSerHisSerLysLeuProGluGlnGluAlaAla
505560
GluAlaAspLeuSerAsnMetGluArgValSerLeuSerThrAlaAsp
65707580
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859095
AlaAlaSerAspThrThrGlnGluProProGlySerHisGluTyrAla
100105110
AlaLeuLys Val
115
7
524
DNA
智人(Homosapiens)

CDS
(67)..(513)
7
gaagggacgctatgaccgca gaattcctctccctgctttgcctcgggctg tgtctgggct60
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Met Arg Lys Arg Met Gly Pro Thr Arg Leu Pro Arg Leu Glu
1510
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15202530
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354045
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505560
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LeuSerValPhelielieTyrArg CysSerGlnHisGlySerSerSer
657075
gaggaatccaccaagagaaccagecattccgaaCttccagagcaggag348
GluGluSerThrLysArg ThrSerHisSerGluLeuProGluGlnGlu
808590
getgccgaggcagatttatccaatatggaaagggtatctctctcg acg396
AlaAlaGluAlaAspLeuSerAsnMetGlu Arg ValSerLeuSerThr
95100105110
gcagacCCCcaaggagtgacctatgetgagctaageaccagegccCtg444
AlaAspProGlnGlyValThrTyrAlaGluLeuSerThrSerAlaLeu
115120125
tctgaggcagetteagacaccacccaggagCCCccaggatctcatgaa492
SerGluAlaAlaSerAspThrThrGlnGluProProGlySerHisGlu
130135140
tatgcggcaCtgSlSlSlgtgtagcaagaagaca g524
TyrAlaAlaLeuLysVal
145
8
148
PRT
智人(Homosapiens)
8
MetArgLys ArgMetGlyProThrArgLeuProArgLeuGluCysSer
151015
GlyAlalieThrAlaHisSerSerLeuAspLeuProGlyProAspLys
202530
HisAspGluLeuGluAlaProSerMetLysThrAspThrArgThrlie
354045
PheValAlaliePheSerCyslieSerlieLeuLeuLeuPheLeuSer
505560
ValPhelielieTyrArgCysSerGlnHisGlySerSerSerGluGlu
65707580
SerThrLysArgThrSerHisSerGluLeuProGluGlnGluAlaAla
859095
GluAlaAspLeuSerAsnMetGluArgValSerLeuSerThrAlaAsp
100105110
ProGlnGlyValThrTyrAlaGluLeuSerThrSerAlaLeuSerGlu
115120125
AlaAlaSerAspThrThrGlnGluProProGlySerHisGluTyrAla
130135140
AlaLeuLysVal
145
9
822
DNA
智人(Homo sapiens)

CDS
(12). . (443)
9
gaagggacgc t atg acc gca gaa ttc ctc tcc ctg ctt tgc ctc ggg ctg 50
Met Thr Ala Glu Phe Leu Ser Leu Leu Cys Leu Gly Leu
1510
tgt ctg ggc tac gaa gat gag aaa aag aat gag aaa ccg ccc aag ccc 98
Cys Leu Gly Tyr Glu Asp Glu Lys Lys Asn Glu Lys Pro Pro Lys Pro
152025
tcc ctc cac gcc tgg ccc age tcg gtg gtt gaa gcc gag age aat gtg 146
Ser Leu His Ala Trp Pro Ser Ser Val Val Glu Ala Glu Ser Asn Val
30354045
acc ctg aag tgt cag get cat ttc cag aat gtg aca ttt gtg ctg cgc 194
Thr Leu Lys Cys Gln Ala His Phe Gln Asn Val Thr Phe Val Leu Arg
505560
aag gtg aac gac tct ggg tac aag cag gaa cag age tcg gca gaa aac 242
Lys Val Asn Asp Ser Gly Tyr Lys Gln Glu Gln Ser Ser Ala Glu Asn
657075
gaa get gaa ttc ccc ttc acg gac ctg aag cct aag gat get ggg agg 290
Glu Ala Glu Phe Pro Phe Thr Asp Leu Lys Pro Lys Asp Ala Gly Arg
808590
tac ttt tgt gcc tac aag aca aca gcc tcc cat gag tgg tea gaa age 338
Tyr Phe Cys Ala Tyr Lys Thr Thr Ala Ser His Glu Trp Ser Glu Ser
95100105
agt gaa cac ttg cag ctg gtg gtc aca gat aaa cac gat gaa ctt gaa 386
Ser Glu His Leu Gln Leu Val Val Thr Asp Lys His Asp Glu Leu Glu
110115120125
get ccc tea atg aaa aca gtg get cac gtc tgt aat acc agg acc ttg 434
Ala Pro Ser Met Lys Thr Val Ala His Val Cys Asn Thr Arg Thr Leu
130135140
gga aga tga ggcaggagga tcacttgagc ccaggggttc aagaccagcc483
Gly Arg
tggacaactt gacaccagaa ccatctttgt cgccatcttc agctgcatct ccatccttct 543
cctcttcctc tcagtcttca tcatctacagatgcagccag cacagttcatcatctgagga603
atccaccaag agaaccagcc attccaaacttccggagcag gaggctgccgaggcagattt663
atccaatatg gaaagggtat ctctctcgacggcagacccc caaggagtgacctatgctga723
gctaagcacc agcgccctgt ctgaggcagcttcagacacc acccaggagcccccaggatc783
tcatgaatat gcggcactga aagtgtagcaagaagacag822
10
143
PRT
智人(Homo sapiens)
10
Met ThrAlaGlu Phe Leu SerLeuLeuCysLeuGlyLeuCysLeu Gly
151015
Tyr GluAspGlu Lys Lys AsnGluLysProProLysProSerLeu His
202530
Ala TrpProSer Ser Val ValGluAlaGluSerAsnValThrLeu Lys
354045
Cys GlnAlaHis Phe Gln AsnValThrPheValLeuArgLysVal Asn
505560
Asp SerGlyTyr Lys Gln GluGlnSerSerAlaGluAsnGluAla Glu
65707580
Phe ProPheThr Asp Leu LysProLysAspAlaGlyArgTyrPhe Cys
859095
Ala TyrLysThr Thr Ala SerHisGluTrpSerGluSerSerGlu His
100105110
Leu GlnLeuVal Val Thr AspLysHisAspGluLeuGluAlaPro Ser
115120125
Met LysThrVal Ala His ValCysAsnThrArgThrLeuGlyArg
130135140
11
17
DNA
人工序列

引物
11
gcaagagtggggcagag17
12
19
DNA30
人工序列

引物
12
acgaagagca aggaaacac19
13
19
DNA
人工序列

引物
13
gaagggacgc tatgaccgc19
14
21
DNA
人工序列

引物
14
ctgtcttctt gctacacttt c21
15
26
DNA
人工序列

引物
15
tgaaggtcgg agtcaacgga tttggt 26
16
24
DNA
人工序列

引物
16
catgtgggcc atgaggtcca ccac 24
17
3權利要求
1.如下(a)或(b)所示的蛋白或其免疫性片段(a)由SEQID NO :4所示的胺基酸序列組成的蛋白或其免疫性片段；或(b)在(a)限定的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且與(a)具有 相同功能的由(a)衍生的蛋白或其免疫性片段；所述的免疫性片段優選為SEQ ID NO :4第17 32位或第62 81位所示的胺基酸序 列組成的多肽，或SEQ ID NO :4第17 205位所示的胺基酸序列組成的蛋白。
2.編碼權利要求1所述的蛋白或其免疫性片段的多核苷酸序列；所述的多核苷酸序列 優選為SEQ ID NO 3所示的多核苷酸序列。
3.一種基因工程載體，其包含如權利要求2所述的多核苷酸序列；所述的載體優選為 質粒。
4.一種宿主細胞，該宿主細胞經權利要求3所述的基因工程載體轉化、轉染或轉導得到。
5.針對權利要求1所述的蛋白或其免疫性片段或權利要求2所述的多核苷酸序列的拮 抗劑；優選所述的拮抗劑為抗體、反義RNA或小幹擾RNA。
6.權利要求1所述的蛋白或其免疫性片段或權利要求2所述的多核苷酸序列在促進 Thl7分化和/或CD8+T淋巴細胞的殺傷功能中的應用。
7.權利要求1所述的蛋白或其免疫性片段，或權利要求2所述的多核苷酸序列，或權 利要求5所述的拮抗劑，在製備用於預防和/或治療免疫相關疾病的藥物組合物中的應用； 其中，所述的蛋白優選為SEQ ID NO :4第17 205位所示的胺基酸序列組成的蛋白，所述 的多核苷酸序列優選為SEQ ID NO :3所示的多核苷酸序列；所述的拮抗劑優選為單克隆抗 體或多克隆抗體；所述的免疫相關疾病優選為感染性疾病、自身免疫性疾病或腫瘤。
8.如權利要求7所述的應用，其中所述的多核苷酸序列包含於載體中；所述的載體優 選為質粒。
9.一種用於預防和/或治療免疫相關疾病的組合物，該組合物含有權利要求1所述的 蛋白或其免疫性片段，或權利要求2所述的多核苷酸序列，或權利要求3所述的載體，或權 利要求4所述的宿主細胞，或權利要求5所述的拮抗劑；以及一種或多種藥用賦形劑或藥用 載體。
10.檢測權利要求1所述的蛋白或其免疫性片段或權利要求2所述的多核苷酸序列的 試劑在製備用於免疫相關疾病輔助診斷、預後判斷的組合物中的應用；優選所述的試劑為 抗體、反義RNA或小幹擾RNA。
全文摘要
本發明涉及人類新細胞因子VSTM1-v2及其應用。具體地說本發明是涉及VSTM1的剪切體VSTM1-v2的基因或蛋白或它們的免疫性片段；所述VSTM1-v2的基因或蛋白或它們的免疫性片段在促進Th17分化和CD8+T淋巴細胞的殺傷功能中的應用，以及在製備用於預防和/或治療免疫相關疾病的藥物組合物中的應用；本發明還涉及VSTM1-v2的拮抗劑例如單克隆抗體或多克隆抗體，包含VSTM1-v2的載體、宿主細胞或組合物，及檢測VSTM1-v2或其免疫性片段的試劑，以及它們的應用。
文檔編號C12N1/19GK102030822SQ20091023560
公開日2011年4月27日 申請日期2009年9月29日 優先權日2009年9月29日
發明者付偉偉, 張巖飛, 李婷, 王平章, 石太平, 郭曉歡, 郭金海, 韓文玲, 馬大龍, 黃晶 申請人:北京大學