改進的細胞因子設計的製作方法

2023-09-20 04:04:55 2

專利名稱：改進的細胞因子設計的製作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質尤其是細胞因子設計的新方法。這些方法可以穩定細胞因子，並修飾它們對各自受體的選擇性/特異性。本發明還涉及已經由本發明方法設計的各種修飾蛋白質。
細胞因子是主要由白細胞分泌的生長因子的家族，並且是在亞—納摩爾濃度作為能夠影響細胞過程的有效調節因子的信使蛋白質。它們的大小允許細胞因子迅速運輸到全身並在需要時降解。它們在調控廣泛細胞功能、尤其是免疫應答和細胞生長中的作用已經在過去二十年經過大量研究而被揭示(Boppana，S.B(1996)Indian.J.Pediatr.63(4)447-52)。這些作用包括免疫應答調節(Nishihira，J.(1998)Int.J.Mol.Med.2(1)17-28)、炎症(Kim，P.K.et al(2000)Surg.Clin.North.Am.80(3)885-894)、傷口癒合(Clark，R.A.(1991)J.Cell Biochem.46(1)1-2)、胚胎發生和發育、以及凋亡(Flad，H.D.et al(1999)Pathobiology.67(5-6)291-293)。
至今，細胞因子的臨床應用集中在它們作為免疫系統調節因子的作用上(Rodriguez，F.H.et al(2000)Curr.Pharm.Des.6(6)665-680)，例如促進抗甲狀腺癌的應答(Schmutzler，C.et al(2000)143(1)15-24)。它們對細胞生長和分化的調控也使細胞因子成為抗癌靶標(Lazar-Molnar，E.et al(2000)Cytokine.12(6)547-554；Gado，K.(2000)24(4)195-209)。已經顯示細胞因子和細胞因子受體的新突變在有些情況下產生疾病抗性(van Deventer，S.J.et al(2000)Intensive Care Med.26(Suppl 1)S98S102)。為了調節活性和消除潛在的副作用而創建合成細胞因子(突變蛋白質)也已經是重要的研究策略(Shanafelt，A.B.et al(1998)95(16)9454-9458)。
因此細胞因子分子已經顯示在多種生理功能中起作用，其中許多在疾病過程中起作用。改變其活性是改變疾病表型的手段，同樣，鑑定新細胞因子分子具有重大的科學意義。
特別感興趣的是屬於腫瘤壞死因子配體(TNF)家族的配體，這些蛋白質參與從細胞增殖到凋亡的廣泛生物活動。
TNF配體家族的成員通過與它們相應受體相互作用誘發導致凋亡或程序性細胞死亡(PCD)的信號通路。結合配體的受體通過將它們的細胞質部分緊密靠近傳遞跨膜信號，這引起下遊效應蛋白質的募集和活化。凋亡是多細胞生物正常發育和穩態的基本過程。然而，凋亡調節受損似乎與癌症和幾種慢性疾病的發病機理有關，所述慢性疾病包括獲得性免疫缺陷症候群(自身免疫疾病和AIDS)和神經退行性疾病(例如帕金森氏病)。常見實例是慢性移植障礙、類風溼性關節炎、慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘。介導信號轉導失調逆轉的分子可能是有效的疾病治療劑。
TNF配體家族的成員也是免疫功能和免疫耐受的主要執行者。這個家族內在免疫刺激和免疫調節功能之間存在複雜平衡，以確保適當的免疫應答。TNF配體受體家族中的遺傳多態性可以導致免疫穩態的調節異常。這種異常可以引起疾病發生。
TNF家族的配體與其相應受體相互作用以觸發幾個信號通路，除了對組織的保護和致病作用以外，它們在對免疫耐受的調節和有害作用中也起關鍵作用(Rieux-Laucat et al.，2003，Current Opinion in Immunology 15325；Mackay andAmbrose，2003，Cytokine and growth factor reviews，14311；Mackay and Kalled，2002，Current opinion in Immunology，14783-790)。這樣的蛋白質包括配體的實例，例如RANKL、TRAIL和APRIL，似乎與例如以下疾病狀況有關類風溼性關節炎、自身免疫性糖尿病、系統性紅斑狼瘡(SLE)、斯耶格倫症候群、實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)、炎性腸病(IBD)、自身免疫性淋巴增生症候群(ALPS)和多發性硬化症。
TNF配體家族成員的所有單體亞基由反平行β片層組成，組織成果凍卷樣拓撲結構中，這些亞基自我結合成鐘形同源三聚體，配體的生物活性形式。負責三聚體形成的(芳香族)殘基之間的序列同源性是最高的。三聚體結合對應受體的三個亞基，每個受體亞基在兩個鄰近單體亞基之間的溝處結合。配體是II型跨膜蛋白質，但是一些成員的胞外結構域可以從細胞表面經蛋白水解切割，由此得到配體的生物活性的可溶性形式。TNF配體家族的最近的綜述容易獲得(Locksley et al.，Cell 104，487-501(2001)；Bodmer et al.，Trends Biochem.Sci.27，19-26(2002))。
TNF配體家族成員的知識也可以應用於其它信號通路，這些通路由相同或其它家族內的配體受體相互作用而觸發。
儘管天然存在的細胞因子對科學界有重大意義，許多這些分子的特性並不必然適合它們在臨床背景下的應用。例如，細胞因子的穩定性在整個生產過程和對終產物的儲藏期限是重要的，還影響所述蛋白質治療劑的藥物代謝動力學和藥效動力學(Marshall et al.，Drug Discov.Today 8，212-221(2003))。當前有幾種策略被用於增加蛋白質的熱穩定性(Fersht，A. Winter，G.Protein engineering.Trends Biochem.Sci.17，292-295(1992)；Van den Burg et al.，Curr.Opin.Biotechnol.13，333-337(2002))。理性(Pantoliano et al.，Biochemistry 26，2077-2082(1987)；Van den Burget al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 95，2056-2060(1998)；Villegas et al.，Fold.Des 1，29-34(1996))和定向進化方法(Giver et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 95，12809-12813(1998)；Jung et al.，J.Mol.Biol.294，163-180(1999))兩者都已經成功地用於提高穩定性。理性方法的缺點是只能設計少數潛在提高的變體。相反地，定向進化方法允許產生和篩選大量變體。然而，需要合適的選擇/篩選操作，這經常沒有或者是非常勞動密集的。
新近，已經使用計算重新設計算法來增強蛋白質穩定性，以及其它性質(DeGrado et al.，Annu.Rev.Biochem.68，779-819(1999))。這些方法結合計算機設計步驟和計算機(in silico)篩選，由此可以篩選比可能用高通量技術實驗篩選多得多的序列空間。需要高效算法來搜索大序列空間，並且需要精確的評分函數以排序最佳設計(Dantas et al.，J.Mol.Biol.332，449-460(2003))。已經在某些蛋白質上取得了一些有限的成功，例如，近來計算機重新設計已經被用於產生鏈球菌Gβ1結構域蛋白質的超嗜熱變體(Malakauskas，S.M. Mayo，S.L.Nat.Struct.Biol.5，470-475(1998))，用於增強血影蛋白SH3結構域的穩定性(Ventura et al.，Nat.Struct.Biol.9，485-493(2002))和用於提高有治療興趣的四螺旋束細胞因子、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)和人生長激素(hGH)的(熱)穩定性。然而，這些方法的多種短缺不允許它們的廣泛應用。
可以改變細胞因子對它們受體的選擇性/特異性也有很大的用途。例如，TNF配體家族的某些成員結合超過一種受體或結合缺少或含有截短的胞內結構域的誘餌受體。具體的實例是腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TRAIL；TNFSF10)Wiley etal.，Immunity.3，673-682(1995)；Pitti et al.，J.Biol.Chem.271，12687-12690(1996))，其以可溶性形式與其受體DR4(TRAIL-R1)和DR5(TRAIL-R2)結合，此外還與誘餌受體DcR1(TRAIL-R3)、DcR2(TRAIL-R4)和OPG結合。受體DR4(TRAIL-R1)和DR5(TRAIL-R2)包含Fas相關的死亡結構域(FADD)，並且TRAIL與這些受體的結合誘導凋亡。TRAIL也似乎能夠通過腫瘤壞死因子受體相關的死亡結構域(TRADD)誘導增殖性NF-kB途徑。由於兩種死亡受體的假設不同的交聯需要，含有DR4(TRAIL-R1)和DR5(TRAIL-R2)信號的選擇性誘導劑可能具有很大意義。根據交聯，信號通路可以誘導增殖或凋亡途徑。DcR1(TRAIL-R3)和DcR2(TRAIL-R4)分別不包含死亡結構域或包含截短的死亡結構域。與這些受體結合不引起凋亡；相反地，通過封閉可用的TRAIL實際上可以阻止凋亡。然而，DcR2(TRAIL-R4)似乎也能夠誘導NF-kB途徑。不同於其它誘導凋亡的TNF家族成員，TRAIL似乎對正常健康組織沒有活性，所以作為潛在的癌症治療劑引起很大興趣(Ashkenazi et al.，J.Clin.Invest 104，155-162(1999))。然而最近重要的出版物已經表明，通過使用基因毒性藥物、阿黴素，TRAIL-R3在乳腺腫瘤細胞中被p53上調(Ruizde Almodóvar et al.，2003，Nov 17，Manuscript M311243200)。這意味著，野生型TRAIL在抗腫瘤治療中的效力可能被減弱，因為它也結合誘餌受體(不啟動凋亡)。因此，具有改變的選擇性/特異性的TRAIL變體可以被指向促凋亡受體、DR4(TRAIL-R1)或DR5(TRAIL-R2)，並最終在癌症治療中具有改進的應用。
TNF配體家族成員，例如TRAIL、APRIL、RANKL BAFF、LIGHT、FasL和TNF-a都與超過一個受體結合。現在至少鑑別出六個包含死亡結構域的受體—Fas、TNF受體1(TNF-R1)、死亡受體3(DR3；也稱為TRAMP、Wsl、APO-3和LARD)、TNF相關誘導凋亡配體(TRAIL)的兩個受體TRAIL-R1/DR4和TRAIL-R2/DR5，還有DR6。TNF配體家族的特定成員也結合缺少或含有截短的死亡結構域的誘餌受體，例如TRAIL，它與其誘餌受體DcR1、DcR2和OPG結合。該領域最近知識的積累，因此為治療學設計打開了新的方向。在這方面，對於識別不同受體活化的具體作用和因此與幾種受體結合的配體的功能作用，以及對與信號活化相關的相關疾病的發病的伴隨影響，新分子的選擇性最重要。
合理設計只允許設計相對少的變體。對於分子進化/高通量篩選(HTS)方法，必須發展選擇和篩選方法並篩選大的變體庫。尤其對增強穩定性有相對較少的成功選擇或篩選方法的實例。
定向進化方法允許產生和篩選大量變體。然而，需要合適的選擇/篩選操作，這經常不可用或是非常勞動密集的。這種方法依靠特定模板蛋白質的DNA序列的部分隨機化，由此產生幾百萬到上十億的變體。通過使用如噬菌體展示的技術用反覆的選擇或篩選過程經幾輪，從這個大庫中選擇改進的變體。
名稱為「APO-2 LIGAND/TRAIL VARIANTS AND USES THEREOF」(WO2004/001009 A2)的專利於2003年12月31日公開，其中描述了DR4和DR5選擇性TRAIL變體。Kelley等人於2004年公開的科學文章描述了相關的主題(Kelley，R.F.et al.，e-published ahead of print November 1 2004 manuscript numberM410660200vl)。
利用來源於先前進行的丙氨酸掃描的數據(Hymowitz，S.G.et al.Biochemistry39，633-640(2000))，Kelley等人構建了大小在2-25億獨特TRAIL變體之間的文庫。這種方法的潛在缺點，例如利用來源於丙氨酸掃描的位置構建文庫，是錯過了在丙氨酸掃描文庫中未發現的位置上對實現受體選擇性/特異性有利的其它突變。然而，丙氨酸掃描中篩選的位置，如195和218位，突變為丙氨酸沒有產生轉移選擇性的明顯跡象，因此這些位置沒有包括在文庫中。使用噬菌體展示，獲得受體選擇性變體，其相對於野生型TRAIL具有平均～6個胺基酸替換。因此推斷，實現受體選擇性需要多個胺基酸替換。
本領域已知的計算設計方法只應用於提高相對小的單體分子的穩定性，而未用於提高較大的多聚體分子的穩定性。通常這些設計集中在改變分子核心中的胺基酸。改變核心中的殘基(重新包裝核心)確實在一定程度上使分子穩定，但可能導致熔融球狀態。
計算設計方法也已經在本領域中用以改變選擇性，但是也只用於相對小的單體分子，而未用於提高較大的多聚體分子結合伴侶時的選擇性。而且，晶體結構目前是必不可少的。
本發明的一方面使用計算重新設計方法和經驗性手工輸入相結合，以設計比野生型對應物更穩定的蛋白質。
本發明的第二個方面涉及重新設計蛋白質以改變它們對受體的選擇性。

發明內容
根據本發明的第一方面，在此提供了計算機實現的穩定β片層多聚體細胞因子的方法，包括下列步驟突變多聚體細胞因子蛋白質的單體組分中的殘基，以便相對於野生型未突變單體組分提高單體或多聚體複合物的自由能，其中所說的突變殘基在細胞因子家族的同源性成員之間是非保守的。
具有增強穩定性的β片層多聚體細胞因子的變體有很多優點，與野生型相比，包括體內和體外半衰期增加、蛋白質表達期間產率增加、純化期間穩定性更高和保存期延長。因此這些蛋白質的穩定變體可以用作蛋白質治療劑或診斷劑。這些蛋白質與野生型結構具有相對接近的相似性，並因此減少了免疫原性的風險，特別是在與用融合標籤穩定的變體相比較時，而融合標籤是目前常用的穩定蛋白質的方法。當與激動或拮抗性抗體比較時它們也具有優勢。與抗體相反，可以在大腸桿菌中生產變體，並且信號模式更緊密地類似於野生型細胞因子蛋白質使用的信號模式。
在此使用的術語「多聚體細胞因子」的意思包括所有β片層多聚體細胞因子。這種細胞因子的實例在表6中提供。本領域的技術人員知道其它實例。對TNF配體家族的結構的最近綜述是可得到的(Bodmer et al.，2002.Trends Biochem.Sci.27，19)。
β片層多聚體細胞因子的一個特徵是，它們由相同的單體亞基或不同的單體亞基組成。方法可以應用於所有細胞因子蛋白質家族，更尤其應用於TNF配體受體家族的成員。包括於細胞因子超家族之內的蛋白質家族的其它實例包括那些分類為β-三葉草(Beta-Trefoil)、β-三明治(Beta-sanwich)、EGF樣和胱氨酸結細胞因子。
對應用本發明的方法的特別有趣的是腫瘤壞死因子配體家族成員的β片層多聚體細胞因子。屬於這個家族的配體參與從細胞增殖到凋亡的廣泛的生物活動，它們具有相似的結構特徵。這些配體的所有單體亞基由反平行β片層組成，組織成果凍卷拓撲結構，這些亞基自我結合成鐘形同源三聚體，這是配體的生物活性形式。三聚體結合相應受體的三個亞基，每個受體亞基在兩個相鄰單體亞基之間的溝中結合。所述配體是II型跨膜蛋白質，但是一些成員的胞外結構域可以從細胞表面經蛋白質水解被切開，得到配體的生物活性的可溶性形式。
已經發現為了將設計集中在非保守殘基位置使用比對信息是有利的。這種蛋白質穩定方法集中在這些非保守殘基上，這是基於假設保守殘基通常都有良好理由在家族中保留並且有可能保守殘基的任何突變都會降低蛋白質穩定性。另一方面，具有高序列可變性的區域對突變有耐受性並且預期可以在這些區域發現穩定蛋白質的變體。對已經保留在家族成員中的這些殘基存在較小的進化壓力。
本方法的組合策略利用家族比對信息和計算機設計算法。這減少了對被研究蛋白質中每個位置的序列空間搜索，並降低了方法必需的計算時間和能量。
鑑定非保守殘基可以使用本領域技術人員已知的任何一種系統。這種分析可以用肉眼做出，但是使用計算機執行的比對算法更容易實現，例如BLAST(Altschul et al.(1990)J Mol Biol.，215(3)403-10)、FASTA(Pearson Lipman，(1988)Proc NatlAcad Sci USA；85(8)2444-8)、更優選地PSI-BLAST(Altschul etal.(1997)NucleicAcids Res.，25(17)3389-402)、ClustalW(Thompson et al.，1994，NAR，22(22)，4673-4680)等等。評估殘基是不是保守的對有經驗的讀者來說很清楚，並且依賴於用於比對的相關蛋白質的數量和它們之間的關聯性程度。例如，如果只有兩個家族成員被比對並具有50％一致性，那麼保守的殘基是在兩種蛋白質之間同一位置上共有的殘基。另一方面，如果比對同一家族中的20種蛋白質，這些蛋白質的最小相似具有如此高同源性是極不可能的。然後，優選地，在蛋白質家族的突變候選物和代表性成員之間的比對中，保守殘基是家族中至少20％成員共有的殘基，優選地至少30％，優選地至少40％，優選地至少50％，也可能至少60％，優選地70％或更多家族成員。例如，腫瘤壞死因子配體家族中的序列同源性在負責形成三聚體的(芳香族)殘基中最高；因此根據本發明的方法這些殘基不適合作候選突變。
一旦識別出非保守殘基，本方法中下一步需要評價這些殘基中哪一個候選用於突變。
本方法的優選的方面突變非保守殘基，其佔據了多聚體細胞因子蛋白質結構中在單體組分表面的位置。由此，將多聚體結構整體穩定。
在此使用的術語「在表面」意思是指與單體有關的殘基保持暴露於多聚體複合體的表面。這種殘基暴露於溶劑並因此是親水性的。當然，表面暴露的殘基不僅存在於每個單體的表面，而且也表面暴露於多聚體複合體。蛋白質結構中特定殘基的位置的知識可以來自結構自身的知識，或可以通過外推法來源自同一家族中蛋白質的結構中等價殘基的位置。
本方法的另一個優選的方面是突變非保守殘基，所述非保守殘基位於接近多聚體細胞因子蛋白質結構的兩個單體組分之間界面的位置附近。通過穩定鏈之間的界面，這具有穩定蛋白質的多聚體結構的作用。
在此使用的術語「接近兩個單體組分之間界面的位置附近」意思是指單體中相關殘基接近多聚體蛋白質的兩個單體組分結合在一起時形成的界面或在界面處。殘基必須足夠接近這個界面以便它的構成原子影響單體-單體相互作用，優選地以積極的方式。對於疏水相互作用，距離可以接近至對象原子的範德華半徑。對於氫鍵，距離可以是2.7埃-3.1埃；對於靜電相互作用，距離可以為1.4埃直至12埃。這種影響可以通過下列方式實現，例如極性或疏水性溶劑化能量、範德華相互作用、H-鍵能量、靜電、或骨架和側鏈熵。
對於三聚體蛋白質，所述方法的一個優選方面是突變這樣的殘基，其佔據了沿多聚體細胞因子蛋白質結構的中心三聚體軸的位置。這具有穩定三聚體的作用。
在此使用的術語「沿中心三聚體軸的殘基」意思是指單體中相關殘基接近三聚體蛋白質的三個單體組分結合在一起時形成的界面或在界面處。如上述，殘基必須足夠接近這個界面，以便它的構成原子影響三個單體組分匯合成三聚體複合物。
最優選地，根據本發明的方法突變超過一種上述類型的殘基，優選地至少兩種類型，甚至更優選地所有三種這些類型。
就發明人的知識，在此描述的方法是第一次將引入計算工程的技術應用於重新設計大的(＞100個胺基酸)全β片層蛋白質成為更加熱穩定的變體。
直到最近，缺少關於多聚體β片層細胞因子及其受體的蛋白質結構信息，使得在信號轉導起始水平(配體-受體相互作用)上的幹擾不能實現。現在，可以獲得很多這些細胞因子的詳細的晶體結構信息以及可靠的同源性模型。因此，現在有可能研究蛋白質-蛋白質相互作用和闡明配體-受體相互作用與活化的機制。例如，以下TNF配體家族成員已經結晶，或者以複合物或非複合物形式人BAFF、Blys(Liu Y.et al.，2002 Cell 108(3)383-94；Oren DA.et al.，2002 Nat Struct Biol.，9(4)288-92.；Karpusas M.et al.，2002 J Mol Biol.315(5)1145-54.)；人CD40L(Karpusas M.et al.，2001，Structure(Camb).Apr 4；9(4)321-9.)；小鼠RANKL/TRANCE(Lam J.et al.，2001 J Clin Invest.108(7)971-9.，)；人TNF-a(Banner DW.et al.，1993 Cell.1993 May7；73(3)431-45.；Eck MJ.et al.，1992 J Biol Chem.，267(4)2119-22.)；人TRAIL(Mongkolsapaya J et al.，1999 Nat Struct Biol.6(11)1048-53.，Cha SS.et al.，1999，2000 Immunity.1999 Aug；11(2)253-61.2000 J Biol Chem.2000 Oct 6；275(40)31171-7.；Hymowitz SG.et al.，1999 Mol Cell.4(4)563-71)；人TNF-α(Reed C.et al.，1997 Protein Eng.10(10)1101-7；Cha SS.et al.，1998 J Biol Chem.1998 Jan 23；273(4)2153-60；Naismith JH.et al.，1996 Structure.1996 Nov 15；4(11)1251-62.，Naismith JH.et al.，1995，J Biol Chem.1995 Jun 2；270(22)13303-7.1996 J MolRecognit.1996 Mar-Apr；9(2)113-7.；Carter PC.et al.，2001 Proc Natl Acad SciU SA，；98(21)11879-84.Erratum inProc Natl Acad Sci U S A 2001 Dec 18；98(26)15393.)。因此，現在已知組成代表這些配體及其各自受體之間蛋白質-蛋白質相互作用基序的結構域的胺基酸。TNF家族中這些相互作用的結構域具有內在傾向，即啟動與調節疾病如癌症和慢性疾病如自身免疫病相關的信號通路，並且這是藥物設計的起點。
使用一種或其它很多用於這種任務的系統，可以計算機顯示候選細胞因子蛋白質的結構。通常這種系統被設計為輸入描述蛋白質結構的數據(例如來自Protein DataBank(PDB)的結構)並將其轉換成三維圖象。目前，蛋白質結構相關信息的最大公共庫是PDB資料庫(http://www.rcsb.org/pdb)，這個資料庫現在包括超過23,000種蛋白質和核酸結構，這些結構用X-射線晶體衍射和核磁共振方法闡明。蛋白質結構的圖象可以直接分析蛋白質結構以評估蛋白質結構中每個殘基的位置，並且評估哪個殘基參與與其它部分如受體或單體伴侶的相互作用。
例如，在本文所述實例中，TRAIL蛋白質的結構(Accession No.P50591；TN10_HUMAN，(本文中SEQ ID NO 1和2))使用模板PDB結構1DU3顯示(Cha et al.，J.Biol.Chem.275，31171-31177(2000))。解析度為2.2的晶體結構包含與DR5(TRAIL-R2)受體的外部結構域複合的人TRAIL三聚體結構。在此情況下，TRAIL單體缺少外部的、柔性環(130-146)，不參與受體結合或單體-單體相互作用。因此，為了使分子完整，利用1D4V(2.2)(Mongkolsapaya et al.，Nat.Struct.Biol.6，1048-1053(1999))的結構為該環建模，1D4V結構是與DR5(TRAIL-R2)受體複合的單體TRAIL結構，其中有所述環的原子座標。最後，通過從PDB文件中除去受體分子來分離TRAIL分子。
已經存在計算機執行的程序可以從頭預測蛋白質結構，或從緊密相關蛋白質的已知結構來推斷。因此，對於本發明的方法，不是嚴格地必須已知候選蛋白質的結構。很大一部分信息可以從相關蛋白質的結構類推得到；例如，TNF配體家族成員顯示相似的三聚體結構。
例如，對於一些β片層多聚體細胞因子，如APRIL，不能得到與受體的複合體的結構。然而，通常可得到同源配體和受體的結構信息，這樣就可以通過同源性建模(Homology Modelling)構建複合物。對於序列同源性高於40％並且在配體和受體的結合區域沒有插入或缺失的情況下，尤其是如此。
顯像分離單體、單體-單體界面和候選蛋白質的中央核心可以顯示用於產生突變的潛在候選殘基。
在設計穩定性突變體的情況下，為了濾出不適於突變的殘基，應該從潛在的突變候選物列表中排除所有高度保守的疏水殘基。此外，參與受體結合的殘基在設計穩定性突變體的情況下應該排除。這些殘基不能在不破壞與受體相互作用的情況下被突變。通過研究屬於感興趣家族的蛋白質的多序列比對中天然存在的胺基酸，優選地可以簡化每個位置的序列空間搜索，由此降低了計算時間並其後集中於非保守殘基。
優選地，結合顯像工具，使用蛋白質設計算法來幫助鑑定用於突變的候選殘基。合適算法的實例包括「WHATIF」程序(Vriend，(1990)，J Mol Graph 8(1)，52-6，29)或更高級的程序例如算法「PERLA」(蛋白質工程旋轉異構體庫算法)(Fisinger S，Serrano L，Lacroix E.Protein Sci.2001 Apr；10(4)809-18)。後者基於旋轉異構體庫搜索，可以對蛋白質中不同位置同時進行組合研究，並鑑定改進蛋白質結構特性(例如穩定性)的最佳序列。這種算法的詳細描述在其他地方可以找到(Lacroix，E.Protein designa computer based approach，Ph.D.thesis.(U.Libre de Bruxelles，1999))(http://ProteinDesign.EMBL-Heidelberg.DE)，其應用以前已經被描述(Ventura et al.，Nat.Struct.Biol.9，485-493(2002)；Fisinger et al.，Protein Sci.10，809-818(2001)；Lopcz et al.，J.Mol.Biol.312，229-246(2001)；Reina et al.，Nat.Struct.Biol.9，621-627(2002))。其它合適的算法包括3D Jigsaw和EasyPred。
簡而言之，PERLA算法實行嚴格的反向摺疊用來自旋轉異構體庫的胺基酸側鏈修飾固定的骨架結構。蛋白質結構中的張力鬆弛通過產生亞旋轉異構體實現。評分函數的多數項相對於參考狀態進行平衡，以模擬變性蛋白質。側鏈構象異構體利用平均場理論加權並最終產生具有建模結構(PDB坐標)的候選序列。
就多聚體蛋白質如TNF家族配體TRAIL而論，用PERLA進行蛋白質設計需要下列步驟。
首先，必須如上所述識別和選擇可以與鄰近單體建立特異性相互作用的單體的殘基。
其次，必須鑑定接觸候選突變的殘基的側鏈，以允許側鏈活動，這對適應由算法導入的新殘基是必要的。
第三，該算法將胺基酸庫放置在每個位置上，所述胺基酸庫選自在TNF配體家族的多序列比對中的一組天然存在的胺基酸，並排除那些與剩餘部分的結構不相容的側鏈構象和胺基酸。
第四，研究所有可能的成對相互作用以去除那些不太有利的組合。這種能量評價優選經計算機實施，例如使用力場算法如程序FOLD-X(Guerois et al.，J.Mol.Biol.320，369-387(2002))或該程序的修改版本(Schymkowitz，J.，Borg，J.，Rousseau，F. Serrano，L，″manuscript in preparation″)，在(http://fold-x.embl-heidelberg.de)上可以獲得。FOLD-X的力場模塊評價蛋白質的結構性質，例如它的原子接觸圖、它的原子和殘基的可接近性和骨架二面角，以及蛋白質的H-鍵網絡和靜電網絡。優選地也要考慮到水分子對與蛋白質形成兩個或多個H-鍵的貢獻。隨後FOLD-X著手計算所有的力場組分極性和疏水溶劑化能量、範德華相互作用、範德華衝突(clash)、H-鍵能量、靜電、和主鏈與側鏈熵。
最後，輸出對應於最好計算結果的序列和PDB座標(依照能量)，並可以依照自由能排列，例如，使用FOLD-X。
隨後應該將包含突變的所得數據文件(優選地PDB文件或類似)能量最小化。實現這的一種方式是使用程序例如在Swiss-PdbViewer v3.7b2中執行的GROMOS43B1(Guex Peitsch；Electrophoresis 18，2714-2723(1997))，並用FOLD-X(http://fold-x.embl-heidelberg.de)評估。然後將模型的最後能量與參考、野生型結構比較並表達為？？G(kcal mol-1)。
當然可以基於自由能(kcal mol-1)組合併評價有利的突變。不利的突變(例如高範德華衝突)應該被排除。
如果需要，序列和坐標的輸出可以在設計過程之後再次導入設計算法中，再進行一個或多個循環。可以使用第2、第3、第4、第5或更多循環的設計。
上述方法幫助計算自由能，相對於野生型未突變的單體，必須通過單體的突變來改進自由能。「自由能」意思是指摺疊自由能。「摺疊自由能」意思是指摺疊或部分摺疊狀態下蛋白質與完全變性狀態的蛋白質之間吉布斯能的差異(包括焓和熵)。計算摺疊自由能時，計算應該考慮這些因素，例如原子的可接近性、預測出現於摺疊結構中原子之間是否存在氫鍵和靜電電荷、範德華相互作用、溶劑化，還應該考慮主鏈和側鏈熵效應。隨後對這些原子能量計算求和。因此，理想情況下這種計算應該考慮穩定化相互作用的性質，這種穩定化相互作用有利於特定蛋白質摺疊途徑中固有的拓撲限制或與之競爭，當計算主鏈、側鏈和環熵成本以及對蛋白質穩定性的有利貢獻時還要考慮序列。因此這種方法應該引入詳細的能量函數，這些函數有效地一方面估計拓撲限制之間的平衡(熵起源)、另一方面估計使摺疊穩定的相互作用。
特定蛋白質的自由能可以使用技術讀者清楚的任何合適方法評估。有很多合適的電腦程式用於自動計算自由能；一個優選的程序是FOLD-X程序(Guerois R，Nielsen JE，Serrano L.，J Mol Biol.2002 Jul 5；320(2)369-87)，其使用最佳能量函數根據對給定摺疊的適應性來排列序列。
此處鑑定的這些分子特異性幹擾配體受體家族的界面，所述界面處可觸發凋亡或自身免疫信號通路。本發明的一方面包括，利用上面列出的設計方法並結合這些實驗技術的組合方法。
使用上述方法產生的分子也可用於闡明β片層多聚體細胞因子的作用機制。例如，儘管已知TNF家族成員的晶體結構，卻很少知道配體-受體複合物的結合和信號起始的確切機制。幾種TNF配體家族成員，例如TRAIL、APRIL和RANKL，結合一種以上受體類型，這種結合根據受體類型可以或不可以觸發信號轉導途徑。因此，在配體-受體複合物形成和隨後的信號轉導起始的水平上關於疾病如癌症或自身免疫病的分子調節仍然存在很多問題。目的在於表徵這種複合物的體外和體內研究應該有助於更好理解背後的(病理)生理應答並幫助創建獨特的前導分子。使用這些前導化合物將有助於闡明與體外和體內環境下蛋白質一蛋白質相互作用、信號轉導途徑和生物活性相關的更複雜基本問題。
特別是，所產生的蛋白質或肽模擬物可以作為受體激動劑、拮抗劑，其可以被工程化以具有增高或降低的結構穩定性、受體結合選擇性和/或生物活性。具體而言，這些化合物可用於凋亡調節。TNF配體家族成員通過與相應受體相互作用而誘導導致凋亡或程序性細胞死亡(PCD)的信號通路。結合配體的受體通過將它們的細胞質部分緊密接近而傳遞跨膜信號，這引起募集和激活下遊效應蛋白質。凋亡是多細胞生物以受控方式處理過剩或損傷細胞的機制，它是多細胞生物的正常發育和動態平衡的基本過程。然而，凋亡調節受損似乎與癌症和幾種慢性疾病的發病機理有關，所述慢性疾病包括獲得性免疫缺陷症候群(自身免疫疾病和AIDS)和神經退行性疾病(例如帕金森氏病)。常見實例是慢性移植障礙、類風溼性關節炎、慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘。介導信號轉導失調逆轉的分子可能是有效的疾病治療劑。細胞誘導的凋亡主要通過與相應受體相互作用而觸發凋亡的TNF配體家族成員來介導。因此，對於用作多種凋亡障礙相關疾病的治療劑，這些細胞因子或其受體的可溶性部分、或其模擬物是有吸引力的候選物。
此外，對TNF配體家族成員作用的更多認識可以通過淋巴細胞功能實現，從而鑑定自身免疫治療的新靶標。失調的活化誘導的細胞死亡(DeregulatedActivation-Induced Cell Death，AICD)可以導致和促進自身免疫。AICD障礙導致自身反應性和長期活化T細胞的積聚。這些細胞可以表達多種免疫調節性配體，包括APRIL和BAFF，其可以改變B細胞功能，引起自身抗體分泌和最終的自身免疫。TNF受體家族成員的連接可以通過活化caspase-8/10導致凋亡，或者作為替代，通過活化NFkB導致促炎症反應、細胞增殖和分化。活化T細胞表達廣範圍的TNF配體-受體家族成員，所有成員對淋巴細胞命運具有不同的作用。在自身免疫病中APRIL作為T和B細胞的共刺激因子起作用並增強T細胞的存活。BAFF對B細胞T1至T2階段成熟、以及相應的免疫球蛋白分泌是關鍵的。RANKL啟動負責骨重吸收(desorption)的破骨細胞前體的分化。在類風溼性關節中40％的白細胞是T細胞，主要是CD4+。B細胞的比例只有1-5％，雖然它們對慢性疾病發展仍然有很大的貢獻。這些細胞在發炎關節中的積聚導致進一步的淋巴細胞活化和不受控制的系統性免疫應答。在RA中，例如，需要靶向增生的滑膜細胞和積聚於關節囊中並也在體內循環的免疫細胞。
通過促進增殖和參與外周T細胞的AICD，TNF家族成員是重要的免疫調節因子。抑制內源性TRAIL功能導致AICD受阻、自身反應性淋巴細胞和滑膜細胞的增殖導致關節炎和關節組織破壞(Song K et al.J.Exp.Med.，2000；191(7)1095)。另一方面，APRIL可以作為T細胞的共刺激因子並能夠延長T細胞的存活。通過仔細研究T細胞活化的分子途徑和再活化誘導的細胞死亡，我們可以了解TNF配體家族成員在自身免疫中的確切作用。
例如，研究AICD人外周T細胞可以從健康個體的血液中分離。T細胞可以用抗-CD3和抗-CD28抗體、或植物凝集素活化，並在不同量IL-2和/或IL-15存在下維持。通過加入抗-CD3單克隆抗體活化後不同天時將誘導AICD。不同TNF家族成員在不同時間誘導CD4+或CD8+T細胞群體的AICD的能力，然後可以通過加入激動性/拮抗性配體如本文所述的那些來測試；這些將與信號傳遞競爭。
可以測試CD4+和CD8+群體的細胞死亡，例如可以通過7-氨基放線菌素方法(Szondy Z et al.1998，J.Infectious.Dis.1781288)。此外，將檢查使活化T細胞對TRAIL-R和Fas-介導的死亡敏化中對IL-2的需要。由於IL-15顯示抑制AICD，我們將研究IL-15是否幹擾活化T細胞表達TNF受體家族，並因此幹擾AICD的敏化(Marks-Konczalik J.et al.PNAS 200097(21)11445-11450)。基於這些發現，可以建議功能性測試來測試不同自身免疫患者中的可能缺陷。我們將試圖了解APRIL在調節T細胞存活中的功能。與抗-CD3一起，用APRIL作為共活化劑，我們將研究它怎樣調節TRAIL、FasL或TNF信號傳遞、IL-2分泌和因此對T細胞存活的影響。如果TNF配體家族成員或變體顯示具有影響，我們將進一步在幾種形式的自身免疫中表徵這些分子。
根據本發明的進一步方面，提供序列已經被改變的β片層多聚體細胞因子，序列改變的目的是產生比野生型、未改變的細胞因子蛋白質更穩定的細胞因子。優選地，所述β片層多聚體細胞因子如此產生突變多聚體細胞因子蛋白質的單體組分中的殘基，以便相對於野生型未突變的單體組分改進多聚體複合物的單體的自由能，其中所說的殘基是細胞因子家族的同源成員之間的非保守殘基。
包括在本發明術語內的多聚體細胞因子是如上所述的所有β片層多聚體細胞因子。表6中示出了實例。根據本發明優選的多聚體細胞因子是TNF配體家族的成員(見Bodmer et al.，2002.Trends Biochem.Sci.27，19)。優選的TNF配體家族成員是TRAIL蛋白質。
優選地，這種β片層多聚體細胞因子在分子的可溶性C-末端部分被突變。適於突變的殘基的實例是下列位置的殘基a)多聚體細胞因子的單體組分表面的非保守殘基(在此稱為『單體』組)；b)接近多聚體細胞因子的兩個單體組分之間界面的非保守殘基(在此稱為『二聚體』組)；c)對於三聚體細胞因子，沿著中心三聚體軸的非保守殘基(在此稱為『三聚體』組)。
這個清單不是全部-也可以根據具體細胞因子進行各種混雜性突變，它們不屬於上面三類的任何一種。上面描述了非保守殘基的鑑定。相似地，上面也描述了屬於上面a)至c)類的殘基的鑑定。
優選地，a)類突變位於連接細胞因子的C和D反平行β鏈的外部環(CD環)中，代號根據Eck命名(Eck et al.，J.Biol.Chem.267，2119-2122(1992))。TRAIL蛋白質中這種突變的優選實例包括位置E194和I196。其它β片層多聚體細胞因子中等價的突變對本領域的技術人員是顯而易見的。優選地，在這些殘基導入的突變是E194I和/或I196S。
TRAIL蛋白中，當同時產生這兩種突變時，已經發現這導致相對於野生型TRAIL自由能大大提高(ΔΔG＝-9.7kcal mol-1單體-1)。除了晶體結構中存在明顯的範德華衝突(～5kcal mol-1單體-1)以外，這種衝突已經突變除去，這種高能量值是由於三聚體正被研究的這種事實。優選地，在位置E194和I196都產生突變；更優選地，同時產生E194I和I196S兩種突變。可以解釋預測的這種雙重突變的穩定性增加，因為Glu194被疏水基團包圍(Trp231、Phe192、Ala235)並且羧基基團未被補償。Glu194向Ile的突變通過用中等大小的疏水殘基替換帶電殘基改變了這種狀況。相反地，Ile196被極性殘基包圍(Asn202、Lys233)並且非常接近骨架，這導致可能的範德華衝突。突變為Ser避免了衝突並允許與Asn202形成氫鍵，其位於CD環的相反部分。兩種突變都提高極性溶劑化能量，還改善了側鏈和骨架熵。
優選地，二聚體組的突變可以在一個或多個下列位置中進行125、163、185、187、232、234、237、203、205、239、241、271和274。在TRAIL蛋白中，這些位置的殘基如下H125、F163、Y185、Q187、S232、D234、Y237、D203、Q205、L239、S241、E271和F274。技術讀者能夠鑑定其它β片層多聚體細胞因子蛋白質中的等價位置，例如，通過多重比對或通過結構比對。此類中優選的突變包括突變D203、Q205和Y237。優選地，導入這些位置的突變是D203I、Q205M和Y237F中的一個或多個。更優選地，進行兩個或所有三個突變。
包含這三個突變的突變TRAIL蛋白在此被稱為M2。對M2的設計導致產生疏水簇，以穩定一個單體中殘基203和205(D鏈)、與鄰近單體中殘基237(F鏈)之間的相互作用。Gln 205和Tyr 237共同形成了分子間氫鍵，Asp 203指向單體-單體界面中的間隙。突變為Ile(203)、Met(205)和Phe(237)破壞Q205-Y237氫鍵，但是促進這些殘基的緊密包裝，改進範德華相互作用、整個TRAIL分子的疏水和極性溶劑化能量，而沒有進一步增加範德華衝突。
優選的，三聚體組中的突變可以在一個或多個下列位置中產生227、230和240。在TRAIL蛋白中，這些位置的殘基如下所示R227、C230和Y240。技術讀者能夠鑑定其它β片層多聚體細胞因子蛋白質中的等價位置。此類中優選的突變是R227M。
包含這個突變的突變TRAIL蛋白在此被稱為M4。突變體M4的Arg 227殘基位於E鏈，沿著TRAIL三聚體的縱向軸相對於中心位置等距相對。三個精氨酸被疏水(Ile 242)、極性(Ser 241、Ser 225)和芳香族(Tyr 240、Tyr 243)殘基包圍。這些酪氨酸指導羥基基團遠離Arg 227，因此產生更疏水的腔。高濃度的正電荷顯然未被很好的補償，由於其只與骨架形成氫鍵(Ser 241的羰基基團)。因此，這些位置突變為Met可以幫助適應疏水環境，還降低由於未補償的正電荷產生的單體排斥。
另外，C230S和Y240的組合是優選的。用Ser代替Cys 230除去了鋅結合位點，由此引入不利的相互作用。第二個突變(Y240F)除去不利的相互作用以恢復熱穩定性和生物活性。
優選地，混雜組的突變可以在一個或多個下列位置中產生123、272、225、280、163、123和208。在TRAIL蛋白中，這些位置的殘基如下所示A123、A272、S225、V280、F163、A123和V208。技術讀者能夠鑑定其它β片層多聚體細胞因子蛋白質中的等價位置。此類中優選的突變是S225A。
包含這種突變的突變體TRAIL蛋白在此被稱為M3。M3的殘基225(S225A)位於E鏈並以單體形式暴露於溶劑。然而，三聚體化以後，這個位置被掩埋在小袋中，使氫鍵供體Ser的側鏈未補償。突變為Ala後，除了側鏈熵以外，對於極性和疏水溶劑化能量，模型的能量優於野生型TRAIL。
進一步優選的突變體β片層多聚體細胞因子是一個引入上述突變的組合的突變體，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個這樣的突變。這種突變體的一個實例結合了位置194、196和225處的突變。在TRAIL蛋白中，這些位置的殘基是E194、I196和S225。優選地，導入的突變是E194I、I196S和S225A；包含這三個突變的TRAIL突變體已經被工程化並在此稱為C1。
可以將上述突變導入全長細胞因子序列。然而，優選地將上述突變導入β片層多聚體細胞因子的可溶形式。對於TRAIL蛋白質，可以導入這些突變的優選可溶性模板包含全長TRAIL蛋白質的胺基酸114-281。然而，技術讀者將理解，這個模板中的變體很有可能保留這種可溶形式的特性並顯示生物活性，如果包括多肽序列中這些邊界C末端和/或N末端的另外殘基的話。例如，可以在這些邊界的C端和/或N端或兩端，包括來自野生型細胞因子序列或來自同源序列的另外1、2、3、4、5、10、20或甚至30或更多胺基酸殘基，而對多肽序列正確摺疊和展示生物活性的能力沒有損害。相似地，這個模板的截短變體，其中可以在C端或N端的任意一端或兩端刪除一個或幾個胺基酸殘基(例如，1、2、3、4、5、10或更多)，而不損害生物活性。
上述方法已經為了舉例說明被應用於原型實例，TRAIL。應該知道，這個實例只用於舉例說明而不以任何方式限制。為了提高生物活性三聚體的穩定性已經設計了TRAIL的新突變體。由此處包括的實施例證明，使用這種方法成功的延長了β片層蛋白質熱穩定性超過5℃。這與保留了整體結構特徵有關，經實驗測試突出了這些突變體的持久生物活性。例如，當在73℃保溫一小時後測量野生型TRAIL和TRAIL突變體的剩餘生物活性時，已經顯示，野生型TRAIL在約20分鐘後被全部熱滅活，而TRAIL突變體M1、M2、M3和C1明顯地具有提高的穩定性。儘管此處沒有測試，已經表明，對於某些有治療興趣的蛋白質，熱穩定性提高也可以指示體內半衰期增加(Luo et al.，Protein Sci.11，1218-1226(2002)；Filikov et al.，Protein Sci.11，1452-1461(2002))。此外，熱穩定性增加不影響M1、M3和C1的生物活性。明顯地，此處顯示單個單體中CD環的穩定化導致了整個三聚體分子的穩定化。
如上所述，可以期望有可能改變細胞因子對其相應受體的選擇性/特異性。用計算機重新設計，現在發明人第一次實現了改變大三聚體蛋白質結構的受體結合選擇性/特異性。與手工結合併選擇相關殘基，已經使用自動化的計算機算法改變了多聚體全β片層蛋白質TRAIL的受體結合選擇性。
因此，本發明的這個方面提供了改變β片層多聚體細胞因子對目標受體的選擇性的方法，該方法包括鑑定細胞因子中位於受體結合界面的胺基酸，其作為候選用於突變；
排除與細胞因子蛋白結合的受體中保守胺基酸相互作用的殘基；排除與受體骨架相互作用的殘基；和將細胞因子蛋白中一個或多個殘基替換為置換殘基，所述置換殘基包括預測與目標受體的結合界面配合的胺基酸側鏈構象，以提供所述細胞因子蛋白對該目標受體的結合親和性增加。
作為替代，細胞因子蛋白中的一個或多個殘基可以用置換殘基替換，以便降低細胞因子蛋白質對特定目標受體的結合親和性。
本發明也提供通過上述方法得到或可以得到的β片層多聚體細胞因子。
本發明也提供對目標受體具有選擇性的β片層多聚體細胞因子，其中位於受體結合界面的細胞因子中的一個或多個胺基酸替換為置換殘基，所述置換殘基包括預測與目標受體的結合界面配合的胺基酸側鏈構象，以提供所述細胞因子蛋白對該目標受體的結合親和性的增加和所述細胞因子蛋白對目標受體的選擇性/特異性，這是基於這些不是與細胞因子蛋白結合的受體中的保守胺基酸相互作用的殘基。
作為替代，本發明提供對兩個或多個目標受體具有選擇性的β片層多聚體細胞因子，其中實現對第一個目標受體的選擇性是通過將細胞因子中一個或多個胺基酸替換為置換殘基，以便降低對一個或多個不同目標受體的親和性，這是基於這些不是與細胞因子蛋白結合的受體中的保守胺基酸相互作用的殘基。
此處所稱目標受體可以是同源受體(cognate receptor)。
如上討論，改變對受體的選擇性在細胞因子領域具有顯著意義。例如，TNF配體家族成員結合TNF受體家族的受體，經結合而使細胞內信號級聯被活化。不同的細胞亞型具有不同的TNF受體家族表達譜。許多TNF配體家族成員可以通過超過一種類型的TNF受體家族成員蛋白質傳遞信號，根據受體和這些受體在所述細胞表面的表達譜，導致不同的生物活性。對於蛋白質治療/診斷劑，選擇性地活化(或抑制)其中一個受體是有利的，例如區分細胞增殖活性和細胞死亡誘導活性。使用上述本發明的方法，現在這甚至對大多聚體分子也是可能的。此外，改進的選擇性/特異性將允許給予比野生型細胞因子必需量更低濃度的治療性變體。
細胞因子的這種選擇性變體對用作蛋白質治療劑或診斷劑是有利的，因為它們表現與野生型結構的相對緊密類似，由此減少了免疫原性的風險。當與激動性或拮抗性抗體比較時它們也有優勢。與抗體相反，可以在大腸桿菌中生產變體並且信號傳遞模式與野生型信號傳遞模式更緊密地類似。
根據本發明的這方面的方法，對受體的選擇性是第一重要的。因此，為了改進選擇性/特異性對受體的親和性可以稍微妥協。
使用例如此處描述的方法，已經設計了TRAIL蛋白質的新型突變體，以將選擇性/特異性改變為針對不同的膜膜受體(DR4(TRAIL-R1)、DR5(TRAIL-R2)、DcR1(TRAIL-R3)和DcR2(TRAIL-R4))。如上所述，具有DR4(TRAIL-R1)和DR5(TRAIL-R2)信號傳遞的選擇性誘導劑是相當受關注的，這是由於兩種死亡受體的不同交聯需要。根據交聯信號通路可以誘導增殖或凋亡途徑。
通過丙氨酸掃描突變已經在TRAIL中鑑定了對結合和生物活性重要的一些殘基(Hymowitz et al.，Biochemistry.2000 Feb 1；39(4)633-40)，但是在此研究中，發明人不僅關注鑑定對選擇性關鍵的殘基，而且還建議為了得到對選擇性的最大影響在這些位置的最佳胺基酸替換。我們證明一些殘基對受體結合和選擇性是關鍵的；丙氨酸掃描突變不能鑑定這些。結果也證實了對選用於置換的胺基酸的選擇是重要的。
這個實例作為怎樣將本發明的方法應用於大多聚體β片層蛋白質的原型實例。技術讀者可以知道，本研究中使用的方法也可以應用於其它多聚體細胞因子，例如TNF家族配體。
例如，最近的重要的出版物已經表明在乳腺腫瘤細胞中通過使用基因毒性藥物、阿黴素而使TRAIL-R3被p53上調(Ruiz de Almodóvar et al.，J.Biol.Chem 6；279(6)4093-101(2003)。這暗示野生型TRAIL的療效可以在抗腫瘤治療中被消弱，因為它也結合誘餌受體(不引起凋亡)。因此，TRAIL的變體，其具有改變的選擇性/特異性，可以被指向促凋亡受體，DR4(TRAIL-R1)或DR5(TRAIL-R2)並最終在癌症治療中具有改進的應用。
鑑定位於受體結合界面的胺基酸的方法在本領域是已知的。優選地，通過顯示配體蛋白質的結構來實現，理想地以與受體複合的形式，這可以使用許多可用系統中的一個或其它。這種系統通常被設計為輸入描述蛋白質結構的數據(例如來自ProteinData Bank(PDB)的結構)並將其轉換成三維圖象。蛋白質結構的圖象可以直接分析蛋白質結構以評估蛋白質結構中每個殘基的位置，並且評估哪個殘基參與與其它部分如受體或單體伴侶的相互作用。選定的側鏈是蛋白質配體中與受體物理上足夠接近以發生潛在相互作用的那些。
如果不能得到蛋白質結構，有可能得到一個或多個同源配體和受體的結構信息，同源配體和受體允許通過同源性建模構建複合物。對於序列同源性高於40％並且在配體和受體的結合區域沒有插入或缺失的情況下，尤其是如此。例如，在改變TRAIL蛋白質對DR5(TRAIL-R2)或對DR4(TRAIL-R1)的選擇性的具體情況下，可以得到TRAIL與DR5(TRAIL-R2)受體的外結構域形成複合物的晶體模型(PDB識別號1DU3)。TRAIL與三種其它膜受體(DR4(TRAIL-R1)、DcR1(TRAIL-R3)和DcR2(TRAIL-R4))複合的模型可以使用「如何進行同源性建模網絡界面(WhatIf Homology Modeling web interface)」來獲得(Vriend.WHAT IFA molecularmodeling and drug design program.J.Mol.Graph.(1990)8，52-56)(在http://www.cmbi.kun.nl/gv/servers/WIWWWI/得到)。使用程序例如Swiss-PdbViewer v3.7b2(Guex Peitsch.SWISS-MODEL and the Swiss-PdbVieweran environment for comparative protein modeling.Electrophoresis 18，2714-2723(1997))，通過將它們的骨架原子放置於受體DR5(TRAIL-R2)的相同原子處可以生成與這三種受體複合的TRAIL的Pdb文件。最後，從生成的PDB文件中除去模板受體DR5(TRAIL-R2)。
與上述蛋白質穩定化方法同樣的方式中，考慮優先使用比對信息以將設計集中於不與目標受體中保守性殘基位置相互作用的殘基。然而，有時改變保守性殘基也可以引起對受體選擇性的改變。保守性殘基位置意思是指與感興趣蛋白質結合的不同受體之間保守的殘基。例如，TNF配體家族TRAIL結合四種不同的膜受體(DR4(TRAIL-R1)、DR5(TRAIL-R2)、DcR1(TRAIL-R3)和DcR2(TRAIL-R4))。在不同受體之間保守的受體結合界面的殘基可能有助於配體蛋白質的結合，這意味著它們的改變很有可能破壞對有效的配體-受體結合必需的重要的配體-受體相互作用。同樣的原因，預測與受體骨架相互作用的任何殘基不被認為適合做突變的候選殘基。
如上所述，鑑定非保守性殘基可以使用本領域技術人員已知的許多系統中的任一種，但是優選地，計算機執行的比對算法例如PSI-BLAST或ClustalW是優選的。
因此所述方法的組合方式使用家族比對信息和計算機設計算法。這減少了對被研究蛋白質中每個位置的序列空間搜索，並降低了方法必需的計算時間和能量。這種方法允許合理設計蛋白質配體及其受體之間存在的相互作用。也應該對配體和不同受體的結合界面進行整體視覺檢查，如果需要，改變一些旋轉異構體。
本方法需要將配體蛋白質中一個或多個殘基的每個替換為置換殘基，所述置換殘基包括預測與目標受體的結合界面配合的胺基酸側鏈構象，以提供所述細胞因子蛋白對該目標受體的結合親和性增加。這個步驟優選地使用計算機設計算法例如PERLA來實現，所述算法進行反向摺疊。簡單的說，這種算法使用來自旋轉異構體庫的胺基酸側鏈修飾固定的骨架結構。因此PERLA進行旋轉異構體搜索以尋找更好的側鏈構象，目的在於為蛋白質配體及其受體的預期相互作用建立模型。蛋白質結構中張力鬆弛通過產生亞旋轉異構體實現。評分函數的多數項相對於參考狀態進行平衡，以模擬變性蛋白質。側鏈構象異構體利用平均場理論加權並最終產生具有建模結構(PDB坐標)的候選序列。作為該方法的一部分也必須進行建模結構的能量評價，優選地使用程序例如FOLD-X7或改進版本(例如在http://fold-x.embl-heidelberg.de可以得到)。FOLD-X的力場模塊評價蛋白質的結構性質，例如它的原子接觸圖、它的原子和殘基的可接近性和骨架二面角，以及蛋白質的H-鍵網絡和靜電網絡。優選地也要考慮到水分子對與蛋白質形成兩個或多個H-鍵的貢獻。隨後FOLD-X著手計算所有的力場組分極性和疏水溶劑化能量、範德華相互作用、範德華衝突、H-鍵能量、靜電、和主鏈與側鏈熵。
使用這個程序，將所有可能的胺基酸替換(優選排除甘氨酸、脯氨酸和半胱氨酸)以與其餘部分結構相容的構象(側鏈旋轉異構體)導入蛋白質配體中選定的殘基位置中。優選地省去甘氨酸、脯氨酸和半胱氨酸，因為Gly和Pro比其它胺基酸可以相對更多的影響骨架構象(Gly更柔性，Pro更不柔性)。這些殘基也對變性狀態具有相對大的影響(Gly高熵，Pro更低)。Cys也可能是困難的並可能處於未成對狀態，而這是在蛋白質中通常不希望的，這使蛋白質傾向於聚集等等。隨後依據自由能(kcalmol-1)評估有利的突變，並去除不利的突變(例如高範德華衝突)。隨後得到序列和坐標的輸出並依據自由能排序，例如使用FOLD-X程序。一些預測可以在理論能量計算之後直接排除，而不經進一步的實驗分析。另一些進入突變研究。以此方式，因此，本發明的這個方面的方法將配體蛋白質中一個或多個殘基替換為置換殘基，所述置換殘基包括預測與目標受體的結合界面配合的胺基酸側鏈構象，以提供所述細胞因子蛋白對該目標受體的結合親和性增加。
有利的突變當然可以組合併依據自由能(kcal mol-1)評價。不利的結合(例如高範德華衝突)應該被去除。
如果需要，序列和坐標輸出可以在設計過程之後重新導入設計算法再進行一個或多個循環。可以使用第2、第3、第4、第5或更多循環的設計。
優選地，本發明的這個方面的方法可以應用於多聚體β片層細胞因子。這種細胞因子的實例在表6中給出。其它實例對本領域的技術人員是已知的。
對本發明方法的應用特別關注的是腫瘤壞死因子配體家族成員的β片層多聚體細胞因子。屬於這個家族的配體參與廣泛的生物活性，從細胞增殖到凋亡，它們共享相似的結構特徵。
根據本發明的進一步方面，提供已經改變序列的β片層多聚體細胞因子，以便改變對特定目標受體的親和性。
因此，本發明的一個方面涉及細胞因子，其在一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個或所有十二個這些位置被突變。優選地，這種細胞因子是TNF配體家族的成員。更優選地，這種細胞因子是TRAIL(本文中SEQ ID NO1)。在此給出的TRAIL蛋白質中對胺基酸位置和具體TRIAL突變體的所有參考指的是在SEQ ID NO1中給出的胺基酸序列。優選地，改變TRAIL序列以便改變對DR4(TRAIL-R1)或DR5(TRAIL-R2)受體的親和性和/或選擇性。
對於TRAIL中突變合適殘基的實例是下列位置131、269、130、160、218、220、149、155、214、195、191和267。
本領域技術人員鑑定的其它β片層多聚體細胞因子中的等價殘基(當通過肉眼或藉助於分子模型比較晶體結構信息時)可以被突變，優選所述細胞因子是TNF家族的細胞因子。
優選用特定類型的殘基在以上位置進行等價替換。例如，在位置131優選的突變是突變為Arg。在位置269優選的突變是突變為His、Lys或Arg。在位置130優選的突變是突變為Glu。在位置160優選的突變是突變為Lys和Met。在位置218優選的突變是突變為Arg、Tyr、Glu、Phe、Lys或His。在位置220優選的突變是突變為Met和His。在位置149優選的突變是突變為Asp或His。在位置155優選的突變是突變為Met。在位置214優選的突變是突變為Arg。在位置195優選的突變是突變為Arg。在位置191優選的突變是突變為Glu。在位置267優選的突變是突變為Arg。
在TRAIL蛋白質中，優選的突變是G131R、D269H、D269K、D269R、R130E、G160K、D218R、G160M、D218Y、D218E、D218K、D218H、I220M、I220H、R149D、R149H、D218F、E155M、T214R、E195R、R191E和D267R。特別優選的TRAIL突變體是G160M、D269H、D218Y、R130E和I220M。具體而言，優選G160M、D269H、D269K、D269R、T214R和E195R突變體，因為這些在此顯示具有對死亡受體5具有出色的選擇性。
在TRAIL中鑑定的在DR4和DR5(TRAIL-R2)之間無區別的、對受體結合關鍵的一些殘基，已經被鑑定為Ile 220、Arg 149、Glu 155、Gly 160和Asp 218。I220H和I220M兩種突變體都大大提高DR4結合，但對DR5結合沒有影響。R149D突變體降低對DR4和DR5兩種受體的結合，而R149H和D218R突變體對這些受體的任何一個的結合都沒有影響。E155突變體大大降低對DR4和DR5兩種受體的結合；D218F和D218Y突變體也降低親和性，儘管程度較小。此外，D218Y突變體表明對DR5親和性降低比對DR4親和性的降低大。而野生型TRAIL對DR5的親和性比對DR4的親和性高，這種優先權在該突變體中喪失，D218Y突變的整體影響是將選擇性轉向DR4(TRAIL-R1)。同樣地，D218K、D218R、D218E和D218H突變體對DR4(TRAIL-R1)具有較高選擇性。
已經顯示，同一位置上不同的胺基酸替換對受體結合可以有不同的影響。由於在DR4(TRAIL-R1)和DR5(TRAIL-R2)之間受體結合親和性的不同的降低，對受體選擇性關鍵的一些位置被鑑定為Arg130、Gly131和Asp269。R130E和G131R突變體降低與DR4的結合但僅輕微降低與DR5的結合。相反，D269H突變體大大降低與DR4的結合。初步實驗顯示D269H突變體對與DR5結合沒有可觀察到的影響，儘管新近的實驗證實這個突變體事實上顯著增加與DR5的結合。變體D269K和D269R也表現同樣的受體結合優先性。
技術讀者能夠鑑定其它β片層多聚體細胞因子蛋白質中的等價位置，例如，使用多重比對程序或人工檢查相關序列或結構。
優選地，提高對DR4(TRAIL-R1)和DR5(TRAIL-R2)受體的親和性超過對誘餌受體DcR1(TRAIL-R3)和DcR2(TRAIL-R4)的親和性。更優選地，提高對DR5(TRAIL-R2)受體的親和性超過對DR4(TRAIL-R1)的親和性。作為替代，提高對DR4(TRAIL-R1)受體的親和性超過對DR5(TRAIL-R2)的親和性。
可以將上述突變導入全長細胞因子序列。然而，優選地將上述突變導入β片層多聚體細胞因子的可溶形式中。對於TRAIL蛋白質，優選的可以導入這些突變的可溶性模板包含胺基酸114-281。其它細胞因子的等價可溶性形式對技術讀者是清楚的。然而，技術讀者將理解，這個模板中的變體很有可能保留這種可溶形式的特性並顯示生物活性，如果包括多肽序列中這些邊界C末端和/或N末端的另外殘基的話。例如，可以在這些邊界的C端和/或N端或兩端，包括來自野生型細胞因子序列或來自同源序列的另外1、2、3、4、5、10、20或甚至30或更多胺基酸殘基，而對多肽序列正確摺疊和展示生物活性的能力沒有損害。相似地，這個模板的截短變體，其中可以在C端或N端的任意一端或兩端刪除一個或幾個胺基酸殘基(例如，1、2、3、4、5、10或更多)，而不損害生物活性。
技術讀者將理解，可以組合在此描述的改變多聚體β片層細胞因子分子的方法。具體而言，組合選擇性/特異性突變以得到具有增強的選擇性的變體。例如，具有改變的選擇性/特異性的變體可以與具有增加的選擇性/特異性的變體組合。優選地，組合的突變的位置離彼此足夠遠以便它們不會產生可預測的相互作用。同樣地，兩種突變可以獨立的方式對選擇性有貢獻。
本發明的具體方面包括受體選擇性/特異性突變的這種組合及其編碼的變體。這種分子的實例包括D269H、E195R、T214R、D267R、D269K、D269R和R191E選擇性/特異性突變體的一個或多個的組合，這些突變得到具有增強選擇性/特異性的變體。尤其優選的實例是R191E突變與D267R突變的組合得到R191ED267R變體。
為了舉例說明上述方法已經應用於原型實例，TRAIL。這個實例只用於舉例說明而不以任何方式限制。相對於與受體DR5(TRAIL-R2)的結合，為了提高與受體DR4(TRAIL-R1)的結合，已經設計了TRAIL的新型突變體。與野生型細胞因子所用濃度相比，這種選擇性/特異性將允許給予更低濃度的變體，例如在用作治療劑的情況下。
技術讀者將理解，為了穩定化多聚體β片層細胞因子分子，和為了改變多聚體β片層細胞因子分子的選擇性，可以組合使用在此描述的方法。
具體而言，可以製造上述穩定性變體之間的組合，得到具有增強的穩定性和改變的選擇性/特異性的變體。本發明的具體方面包括穩定的和受體選擇/特異性的細胞因子分子的這種組合。這種分子的實例包括TRAIL M1、M2、M3和C1突變體的任一個，與一個或多個下列選擇性/特異性突變體的組合D269H、E195R、T214R、D269HE195R、D269HT214R、D269K、D269R、R191ED267R、G160M、D218Y、D218H、D218K、D218R、R130E和I220M，由此得到具有增強的穩定性和改變的選擇性/降異性的變體。特別優選的實例是選擇性和穩定性變體D269HM1，當與野生型TRAIL比較時，其具有對DR5(TRAIL-R2)增加的選擇性/特異性和增加的穩定性。
常規的實驗方法可以用於補充上面列出的大量計算機方法。例如，一旦已經鑑定胺基酸替換，應該用定點突變經實驗產生這些替換，隨後測試其穩定性或選擇性/特異性和生物活性的保持。鑑定出的分子可以用分子進化的常規技術進一步突變，以開發更特異性的治療前導分子。在分子進化情況下，一個特別有用的技術是噬菌體展示，當其與有效的生物淘洗策略結合時、和當與合理設計方法整合時，應該導致新治療劑的快速分子進化。
本發明也提供編碼上述突變體β片層細胞因子的純化核酸分子。本發明的進一步方面包括包含這種核酸分子的載體，如表達載體，以及用這些載體轉化的宿主細胞。
進一步的方面，本發明提供β片層多聚體細胞因子，其序列已經由根據上述本發明的任一方面的方法而被改變，或編碼這種分子的核酸分子，或包含所述核酸分子的載體，用於與細胞因子相關的疾病的治療或診斷。本發明的這個方面包括治療這種疾病的方法，其中包括向患者給予治療可接受量的上述細胞因子、核酸或載體。這種分子也可以用於診斷，例如，通過評價所述患者的組織中基因或蛋白質(例如過表達受體)的表達或活性水平，並將所述表達或活性水平與對照水平比較，其中與所述對照水平不同的水平即是疾病的指徵。
本發明的進一步方面可以包括藥物組合物，其包含上述突變體細胞因子、核酸或載體，以及藥物可接受的載體。
本發明的進一步方面可以包含轉基因或敲除非人類動物，其已經被轉化而表達上述突變體細胞因子。這種轉基因動物提供對研究疾病有用的模型並也可以被用在鑑定治療或診斷疾病有效的化合物的篩選方法中。
重要的是，產生突變體細胞因子分子如上述那些，允許設計篩選方法，所述篩選方法能夠鑑定對治療和/或診斷與這些細胞因子相關疾病有效的化合物。這些分子的相互作用結構域具有內在傾向，即啟動與調節疾病如癌症和慢性疾病包括自身免疫病相關的信號通路，並且這是藥物設計的起點。本發明的一個方面包括這種篩選方法。
本發明的各種方面和實施方案將以實施例的方式更詳細的描述。應該知道，可以對細節進行修改而不偏離本發明的範圍。


圖1.A)TRAIL三聚體複合物的側視圖，以紅色、蘭色和綠色示出三種單體。B)同一複合物但沿著縱向軸的俯視圖，描繪了用於設計的不同組。用MOLMOL產生結構圖(Koradi et al.，J.Mol.Graph.14，51-32(1996))。
圖2.野生型TRAIL(實心環)、M1(實心框)和M2(空心環)與DR5(TRAIL-R2)(…)和DR4(TRAIL-R1)(—)受體的結合。
圖3.野生型TRAIL(實心環)、M1(實心框)、M2(空心環)、M3(空心框)和C1(實心三角)的熱變性譜。
圖4.野生型TRAIL(實心環)、M1(實心框)、M2(空心環)、M3(空心框)和C1(實心三角)在73℃60分鐘時的穩定性。
圖5.野生型TRAIL、M1、M3和C1(從左到右)在73℃培養60分鐘期間的剩餘生物活性。
圖6.A)野生型TRAIL和M1之間、包圍殘基194和196的局部環境的比較。B)野生型TRAIL和M2之間的比較。兩個相鄰單體的骨架分別是綠色和蘭色，DR5(TRAIL-R2)受體的骨架是灰色。用綠色虛線表示氫鍵相互作用。
圖7.作為DR5(TRAIL-R2)結合一部分的受體結合。
圖8.作為DR4(TRAIL-R1)結合一部分的受體結合。
圖9.D269H的細胞毒能力—膜聯蛋白V染色。
圖10.測試D269H突變體的TRAIL受體特異性殺傷—膜聯蛋白V染色。
圖11.通過D269H的DR5(TRAIL-R2)選擇性殺傷—膜聯蛋白V染色。
圖12.D269H和TRAIL具有類似的細胞毒能力。A，用TRAIL和D269H處理2小時的細胞；B，處理3小時的細胞(B)。圖表代表兩次獨立實驗。
圖13.中和DR5，而不是DR4能阻斷由D269H誘導的細胞死亡。
圖14.純化野生型TRAIL(wt1)和多種純化突變體在60nM濃度下與DR4(TRAIL-R1)Fc和DR5(TRAIL-R2)Fc的受體結合。
圖15.AB與DR5(TRAIL-R2)Fc的結合；CD與DR4(TRAIL-R1)Fc的結合。野生型TRAIL框(空心)；D269H環(實心)；D269HT214R三角(上和空心)；D269K菱形(實心)；D269R菱形(空心)；D269HE195R三角(下和空心)。
圖16.A野生型TRAIL(wt)和R191ED267R與DR5(TRAIL-R2)Fc的結合；B野生型TRAIL(wt)和R191ED267R與DR4(TRAIL-R1)Fc的結合；CD218Y與DR4(TRAIL-R1)Fc和DR5(TRAIL-R2)Fc的結合。
圖17.競爭ELISA。AB用DR5(TRAIL-R2)Fc滴定(阻斷)；CD用DR4(TRAIL-R1)Fc滴定(阻斷)。野生型TRAIL框(空心)；D269H環(實心)；D269HT214R三角(上和空心)；D269K菱形(實心)；D269R菱形(空心)；D269HE195R三角(下和空心)。
圖18.A野生型TRAIL和D269H與DcR1(TRAIL-R3)Fc的受體結合；B競爭ELISA。用DcR1(TRAIL-R3)Fc滴定。野生型TRAIL框(空心)；D269H環(實心)；D269HT214R三角(上和空心)；D269HE195R三角(下和空心)。
圖19.A用野生型TRAIL和D269H、D269HE195R和D269HT214R突變體誘導Colo205細胞中的凋亡，並用中和性抗-DR4和抗-DR5抗體阻斷凋亡。B用野生型TRAIL和D269H、D269HE195R和D269HT214R突變體誘導ML-1細胞中的凋亡，並通過加入中和性抗-DR4和抗-DR5抗體阻斷凋亡。
圖20.A由兩個單體單元形成的TRAIL受體結合界面的側視圖(第三個單體，不參與這個受體結合界面，在這兩個單體後面；受體在它們前面結合。它們已經被除去以獲得更好的界面視圖)。用範德華半徑突出表示的TRAIL殘基是選用於計算機突變掃描的殘基。B在第269位單個突變的TRAIL受體結合親和性中最顯著的預測轉變，加入D269E作為對比。C在第218位單個突變的TRAIL受體結合親和性中最顯著的預測轉變。D在第214位單個突變的TRAIL受體結合親和性中的預測轉變。(B-D用PERLA和Fold-X計算預測轉移)。
圖21.A野生型TRAIL(wt)和D269HM1與DR5(TRAIL-R2)Fc的結合；B野生型TRAIL(wt)和D269HM1與DR4(TRAIL-R1)Fc的結合。C野生型TRAIL(wt)和D269HM1在73℃保溫50分鐘的剩餘生物活性。生物活性相對於0分鐘時的觀察值來計算。
實施例1穩定性TRAIL蛋白質方法除非具體說明所有試劑是分析級。異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)、氨苄青黴素和二硫蘇糖醇(DTT)來自Duchefa。色譜柱和介質來自AmershamBiosciences。使用的限制酶購買自England Biolabs。
所有其它化學品來自Sigma。
突變體的計算機設計別處可以得到蛋白質設計算法PERLA的詳細描述(Lacroix，E.Protein designacomputer based approach，Ph.D.thesis.(U.Libre de Bruxelles，1999))(http://ProtcinDesign.EMBL-Heidelberg.DE)並且其用途之前也已經描述了(見，例如Ventura et al.，Nat.Struct.Biol.9，485-493(2002)。就寡聚蛋白質如TRAIL來說，用PERLA設計蛋白質需要下列步驟首先，必須如上所述鑑定和選擇可以與鄰近單體建立特異性相互作用的單體的殘基。其次，必須鑑定接觸候選突變的殘基的側鏈，以允許側鏈活動，這對適應由算法導入的新殘基是必要的。考慮Ca-Ca距離和Ca-Cβ矢量之間的角，基於幾何方法，PERLA自動選擇這些殘基。第三，該算法將胺基酸庫放置在每個位置上，所述胺基酸庫選自在TNF配體家族的多序列比對中的一組天然存在的胺基酸，並排除那些與剩餘部分的結構不相容的側鏈構象和胺基酸。第四，研究所有可能的成對相互作用以去除那些不太有利的組合。最後，輸出對應於最好計算結果的序列和PDB座標(依照能量)。將包含突變的所得數據文件進行能量最小化，此處使用在Swiss-PdbViewer v3.7b2中執行的GROMOS 43B1(Guex Peitsch；Electrophoresis 18，2714-2723(1997))，並用FOLD-X(http://fold-x.embl-heidelberg.de)評價。然後將模型的最後能量與參考、野生型結構比較並表達為？？G(kcal mol-1)。
克隆和PCR使用NcoI和BamHI限制位點，將對應於人可溶TRAIL(aa 114-281)的cDNA克隆在pET15B(Novagen)中。因此除去編碼His-標籤和蛋白酶識別位點的N末端序列。使用快速改變方法(Stratagene)或修飾的大引物方法(Picard et al.，NucleicAcids Res.22，2587-2591(1994))通過PCR構建突變體。使用的聚合酶是Stratagene提供的Pfu Turbo。純化的致突變寡核苷酸來自Invitrogen。通過DNA測序證實突變的導入。
野生型TRAIL和突變體的表達和純化將野生型TRAIL和TRAIL突變體的構建體轉化入大腸桿菌BL21(DE3)(Invitrogen)。使用4×LB培養基、1％(w/v)葡萄糖、100μg/ml氨苄青黴素和另外的微量元素，在7.5l的發酵罐(Applicon)中以5l的批量生長野生型TRAIL和M1。培養物在37℃、30％的氧氣飽和度生長至中對數期，隨後用1mM IPTG誘導。加入ZnSO4至濃度為100μM來加速三聚體形成。溫度降至28℃，培養物生長至穩定期。使用相似的方案，以1l規模在250rpm下在搖瓶中生長其它突變體。當培養物達到OD6000.5時誘導蛋白質表達並持續誘導5個小時。在這種情況下，使用的培養基是沒有加入微量元素的2×LB培養基。
將分離的沉澱重新懸浮於3倍體積的提取緩衝液(PBS pH8，10％(v/v)甘油，7mM β-巰基乙醇)中。使用超聲處理破碎細胞並在40,000g下離心使提取液澄清。隨後，將上清液加載到負載鎳的IMAC Sepharose fast-flow柱上並按Hymowitz所述(Hymowitz et al.，Biochemistry 39，633-640(2000))並做以下修改來純化野生型TRAIL和TRAIL突變體所有緩衝液中使用10％(v/v)甘油和最低濃度100mMNaCl。這防止了純化過程中的聚集。IMAC分離步驟之後，在所有緩衝液中加入20μMZnSO4和5mM DTT(代替β-巰基乙醇)。最後，包括用Hiload Superdex75柱的凝膠過濾步驟。純化蛋白質的純度超過98％，使用膠體考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE凝膠確定。純化蛋白質溶液在液氮中急速冷凍並儲存在-80℃。
CD光譜將CD光譜記錄在配備PFD350S Pelticr溫度控制單元(Jasco Inc.)的JascoJ-715CD分光光度計(Jasco Inc.)上。使用光程0.2cm的長方形石英比色皿。對PBSpH7.3透析蛋白質樣品並將最終濃度調至100μg/ml。使用0.2nm步長和1nm帶寬在25℃下記錄250-205nm之間的波長光譜。在222nm使用40℃/h的掃描速率進行25-98℃的溫度掃描。熱衰變測量在73℃222nm下進行一個小時。
TRAIL突變體的體外生物活性使用活力測試法根據製造商說明(Celltiter Aqueous One，Promega)測定野生型TRAIL和TRAIL突變體的生物活性。Colo205人結腸癌細胞(ATCC號CCL-222)在RPMI 1640 Glutamax中培養，培養基中含有10％熱滅活的胎牛血清和100單位/ml青黴素-鏈黴素。所有試劑由Invitrogen提供。用細胞培養基製備野生型TRAIL和TRAIL突變體的濃度系列。將每種稀釋度50μl加入96孔組織培養微量板(Greiner)中並加入100μl細胞懸液，達到最終細胞數為1×104細胞/孔。混合物在含5％CO2的溼潤氣氛下37℃培養16小時。隨後，加入20μl MTS試劑。培養30分鐘後通過測量490nm吸光度測定細胞活力。
受體結合使用基於表面等離子體共振的生物傳感器Biacore 3000(Biacore AB，Uppsala，Sweden)在25℃下進行結合實驗。重組受體從RD systems(RD systems，Minneapolis，MN，USA)定購。根據製造商說明書按照標準的胺偶聯操作將受體固定在Biacore CM5傳感器晶片的傳感器表面上。同時在同樣條件下但不注射受體來製備參考平面並用作校正設備和緩衝液人為假象的空白。以2μg/ml的濃度和20μl/min的流速注射兩倍的純化野生型TRAIL和TRAIL突變體。實時監測配體與受體的結合。使用3M乙酸鈉pH5.2注射再生受體/傳感器表面。
計算機篩選為了增加生物活性三聚體的穩定性，已經設計了TRAIL的新型突變體。預測基於如上所述的自動化計算機算法，PERLA。簡而言之，該程序實行嚴格的反向摺疊用來自旋轉異構體庫的胺基酸側鏈修飾固定的骨架結構。蛋白質結構中的張力鬆弛通過產生亞旋轉異構體實現。評分函數的多數項相對於參考狀態進行平衡，以模擬變性蛋白質。側鏈構象異構體利用平均場理論加權並最終產生具有建模結構(PDB坐標)的候選序列。建模結構的能量評價用修改版(Schymkowitz，J.，Borg，J.，Rousseau，F. Serrano，L，″manuscript in preparation″)的FOLD-X進行，在(http://fold-x.embl-heidelberg.de)上可以獲得。FOLD-X的力場模塊評價蛋白質的結構性質，例如它的原子接觸圖、它的原子和殘基的可接近性和骨架二面角，以及蛋白質的H-鍵網絡和靜電網絡。也要考慮到水分子對與蛋白質形成兩個或多個H-鍵的貢獻。隨後FOLD-X著手計算所有的力場組分極性和疏水溶劑化能量、範德華相互作用、範德華衝突(clash)、H-鍵能量、靜電、和主鏈與側鏈熵。
選擇模板序列選定的模板是1DU3(Cha et al.，J.Biol.Chem.275，31171-31177(2000))。解析度為2.2的晶體結構包含與DR5(TRAIL-R2)受體的外結構域複合的人TRAIL的三聚體結構。所述TRAIL單體缺少外部、柔性環(130-146)，不參與受體結合或單體-單體相互作用。因此，為了使分子完整，利用1D4V(2.2)(Mongkolsapaya et al.，Nat.Struct.Biol.6，1048-1053(1999))的結構為該環建模，1D4V結構是與DR5(TRAIL-R2)受體複合的單體TRAIL結構，其中有所述環的原子座標。最後，通過從PDB文件中除去受體分子來分離TRAIL分子。
突變體的計算機設計肉眼觀察分離的單體、單體-單體界面和TRAIL的中心核顯示一些作為產生突變的潛在候選物的幾個殘基。從這個清單中排除高度保守的疏水殘基，以及參與受體結合的殘基。這些殘基不能在不破壞與受體相互作用的條件下被突變。然而，一個TRAIL變體(M2)顯示了穩定性的明顯增長但包含參與受體結合的殘基，它被保留進行隨後的實驗分析。
通過研究屬於TNF配體家族的蛋白質的多序列比對中天然存在的胺基酸，可以簡化每個位置的序列空間搜索，由此降低了計算時間並其後集中於非保守殘基。使用蛋白質合理設計和力場算法(PERLA、FOLD-X)可以鑑定與TRAIL穩定性具有潛在關聯的一系列突變體序列。選擇四組殘基進行設計(圖1b和表1)(1)單體表面的非保守殘基(『單體』組)，(2)接近於兩個單體之間界面附近位置的非保守殘基(『二聚體』組)，(3)沿著中心三聚體軸的非保守殘基(『三聚體』組)和(4)混雜組(『混雜』組)。如前所述應用自動化的計算機算法PERLA(Angrand et al.，Biomol.Eng 18，125-134(2001))。將胺基酸替換導入處於與剩餘結構相容構象(側鏈旋轉異構體)的非保守殘基位置。隨後，組合有利的突變並依據自由能(kcal mol-1)評估，並排除不利的組合(例如高範德華衝突)。輸出序列和坐標並依據自由能用FOLD-X排序，如果需要，隨後重新導入設計算法進行第2、第3或第4輪設計。表1總結了經計算機測試增加TRAIL穩定性的突變體的列表。經理論能量計算後直接將這些預測中的一些排除，而不進行進一步實驗分析。
結果被測試突變體的描述對預測的突變體進行能量最小化並隨後用FOLD-X分析。得到的能量值與野生型結構的能量值比較並用於區分選擇物。突變體的選擇是基於相對於野生型TRAIL在自由能上的改進(表2)。在單體組中，選擇M1(E194I、I196S)是因為與野生型TRAIL相比有很大的能量改進(ΔΔG＝-9.7 kcal mol-1單體-1)。除了在晶體結構中存在顯著的範德華衝突(～5 kcal mol-1單體-1)外，所述範德華衝突經突變被除去，這個高能量值是由於被研究的是三聚體這一事實。突變位於連接C和D反平行β鏈的外環中(CD環)，代號根據Eck命名(Eck et al.，J.Biol.Chem.267，2119-2122(1992))。由於Glu 194被疏水基團(Trp 231、Phe 192、Ala 235)包圍並且羧基基團未被補償，可以解釋預測M1穩定性的增加。通過用中等大小的疏水殘基代替帶電殘基，Glu 194突變為Ile糾正這種情況。相反地，Ile 196被極性殘基(Asn 202、Lys 233)包圍並且非常接近骨架，由此導致可能的範德華衝突。突變為Ser避免了衝突並且允許與Asn 202形成氫鍵，其位於CD環的相反部分(圖6a)。兩種突變改進了極性溶劑化能量，還改善了側鏈和骨架熵。
在二聚體組中(表2)，M2(D203I、Q205M、Y237F)的設計導致產生疏水簇，以穩定一個單體的殘基203和205(D鏈)和相鄰單體的殘基237(F鏈)之間的相互作用。Gln 205和Tyr 237共同形成了分子間氫鍵，Asp 203指向單體-單體界面中的間隙。突變為Ile(203)、Met(205)和Phe(237)破壞Q205-Y237氫鍵，但是促進這些殘基的緊密包裝，改進範德華相互作用、整個TRAIL分子的疏水和極性溶劑化能量，而沒有進一步增加範德華衝突(圖6b)。儘管FOLD-X預測M2對DR5(TRAIL-R2)受體的親和性比對野生型TRAIL的親和性低(ΔΔG結合＝7.3kcal mol-1單體-1)，這種突變體被保留作為評估程序準確性的對照。
M3的殘基225(S225A)屬於『混雜組』，位於E鏈，並且以單體形式暴露於溶劑。然而，三聚體化以後，這個位置被掩埋在小袋中，使氫鍵供體Ser的側鏈未補償。突變為Ala後，除了側鏈熵以外，對於極性和疏水溶劑化能量，模型的能量優於野生型TRAIL。
三聚體組突變體(M4)的Arg 227殘基位於E鏈中，等距離地位於沿著TRAIL三聚體的縱向軸的中心相對的位置。三個精氨酸被疏水(Ile242)、極性(Ser241、Ser225)和芳香族(Tyr 240、Tyr243)殘基包圍。這些酪氨酸指導羥基遠離Arg 227，因此產生相當疏水的腔。高濃度的正電荷顯然不能很好的補償，因為它只與骨架形成氫鍵(Ser 241的羰基)。因此，這些位置突變為Met可以幫助適應疏水環境，同時降低由於未補償的正電荷產生的單體排斥。
突變體的突變產生和純化選擇最高排位的突變體M1和M2以及M3和M4進行進一步的實驗分析(表2)。也構建結合M1和M3突變的突變體(C1)。所有設計的TRAIL突變體在大腸桿菌中表達並成功純化至蛋白質產量～0.7-2mg/l。遠紫外CD波長譜指示，所有突變體正確摺疊，具有含β片層的蛋白質的特徵，這與野生型TRAIL的特徵類似。凝膠過濾和動態光散射測量顯示所有突變體蛋白質溶液包含單一分子種類，和三聚體寡聚狀態一致。野生型TRAIL和M1的分析超速離心確證了這個發現(數據未示出)。
設計突變體的體外生物活性和結合使用Colo205人結腸癌細胞系和基於MTT的活力測試，體外評價TRAIL突變體的生物活性。使用野生型TRAIL或TRAIL突變體濃度相對於對照的增加測量活力的降低。M1、M3和C1顯示與野生型TRAIL相當的生物活性(ED50～5ng/ml)，而M2顯示幾乎低一個數量級的生物活性(ED50～5ng/ml)。野生型TRAIL和TRAIL突變體與死亡受體DR4(TRAIL-R1)和DR5(TRAIL-R2)的實時結合，使用表面等離子體共振用Biacore 3000儀器評價。M1、M3和C1的感應圖(Sensograms)與野生型TRAIL的相同。相反，儘管M2顯示與兩種受體相似水平的結合，但與野生型TRAIL的感應圖比較時，M2卻表現為隔斷率增加(圖2)。
熱解摺疊通過測量加熱時222nm下摩爾橢圓率的變化來監測野生型TRAIL或TRAIL突變體的熱解摺疊。圖3顯示野生型TRAIL或TRAIL突變體的熱誘導的變化。TRAIL顯示在大約70℃開始解摺疊，轉變中點為77℃。然而，TRAIL突變體顯示在更高溫度時開始解摺疊並具有更高的轉變中點(圖3)。對於M1，解摺疊開始於大約76℃，轉變中點為85℃。M2的解摺疊在大約74℃開始。M3表現野生型TRAIL和M1之間的中間值，在73℃開始解摺疊，轉變溫度為80℃。突變體C1代表M1和M3突變的組合，顯示了與M1相當的值。然而，屬於三聚體組的突變體(M4)顯示了比野生型TRAIL大約小3℃的實驗確定的穩定性，因此是不連續的。對於M2約72℃的摩爾橢圓率的初步增加是由於遠紫外光譜的整體變化，這反映出喪失了起始材料的結構特性(數據未示出)。冷卻以後所有蛋白質溶液都是渾濁的，顯示了不可逆轉的聚集，因此不能導出熱力學參數。在增加的溫度下進行的遠和近紫外波長CD掃描證實了上述發現(數據未示出)。
加速熱穩定性研究為了測試TRAIL和TRAIL突變體隨著時間的穩定性，進行加速熱穩定性測量。選擇73℃的溫度測量1個小時時間範圍內對穩定性的影響。在此溫度下野生型TRAIL開始解摺疊，突變體仍然正確摺疊(圖3)。與熱解摺疊測量中具有相同濃度的蛋白質溶液在73℃保溫1小時，測量222nm下摩爾橢圓率的改變(圖4)。野生型TRAIL的橢圓率從開始就降低，得到半衰期大約13分鐘。M1、M2和C1突變體的信號基本保持恆定，指示熱穩定性增加。M3顯示約24分鐘的半衰期。然而，這些測量不指示TRAIL分子的生物活性三聚體結構，而只能指示單體單元的二級結構。為了監測具有不變生物活性的突變體(M1、M3和C1)在升高溫度下伴隨生物活性的增加，具有與熱解摺疊測量中使用的相同濃度的蛋白質溶液在73℃保溫，每隔一小時取一次樣品。隨後將樣品稀釋於組織培養基中並加到Colo205細胞中，使得最終濃度為100ng/ml。隔夜培養後使用MTT測試法測量細胞的活力。野生型TRAIL在培養20分鐘後顯示生物活性降低，而M1和C1在73℃培養1小時後保留全部生物活性(圖5)。M3顯示了介於野生型TRAIL和其它突變體之間的中等生物活性。因此，用CD測量的突變體熱穩定性的增加可以與更穩定的生物活性三聚體分子相關聯。
討論以前其他人已經應用計算機工程化技術來提高α-螺旋蛋白質或單體β-片層分子的熱穩定性。然而，經常使用少於100個胺基酸的單體蛋白質作為靶。據我們所知，這份報告是將大三聚體全-β-片層蛋白質經計算機重新設計為更熱穩定變體的第一個實例。顯著地是，它顯示出從小蛋白質設計和工程中了解到的原理也能應用於大多聚體蛋白質複合物。
如果與TNF配體家族的一些成員相比較，野生型TRAIL(114-281)分子具有相對高的熱穩定性。例如，人類腫瘤壞死因子α(TNF-α)用圓二色譜(CD)測量具有65℃的表觀Tm(Narhi et al.，Biochemistry 35，11447-11453(1996))，CD40L受體結合結構域用差示掃描量熱法(DSC)測量具有60℃的表觀Tm(Morris et al.，J.Biol.Chem.274，418-423(1999))。在平行研究中，我們可以用CD證明，RANKL比TRAIL更熱穩定，具有比野生型TRAIL高5℃的表觀Tm，由此證實了另一項研究(Willardet al.，Protein Expr.Purif20，48-57(2000))。在此研究中，通過使用計算機工程，我們調查了TRAIL的熱穩定性進一步增加的可能性，作為全-β-片層蛋白質的模型。
通過使用組合策略，使用TNF配體家族比對信息和自動化計算機設計算法，我們成功地將β-片層蛋白質的熱穩定性擴展了超過5℃。由於解摺疊反應的不可逆性，表觀Tm不是穩定性增加的理想指標。因此，從功能的角度來看，研究蛋白質在高溫下變性需要的時間並將這與對生物活性的影響相關聯也是有意義的。加速熱穩定性研究顯示，用CD光譜測量(圖4)的突變體熱穩定性增加可以與整體結構特徵的保持相關聯，這種保持突出顯示為通過在實驗的時間範圍期間M1的持久生物活性(圖5)。當測量在73℃保溫1小時的野生型TRAIL和TRAIL突變體的剩餘生物活性時，儘管野生型TRAIL在～20分鐘之後全部熱滅活，突變體明顯具有相對於野生型TRAIL提高的穩定性(圖5)。因此，在此情況下，在73℃測量野生型TRAIL和M1的穩定性是在更相關溫度如37℃或室溫下M1穩定性增加的指標。儘管本研究中沒有測試，已經顯示對某些有治療興趣的蛋白質，提高熱穩定性也可以是提高體內半衰期的指標(Luo et al.，Protein Sci.11，1218-1226(2002)；Filikov et al.，Protein Sci.11，1452-1461(2002))。目前我們正進行研究來對我們的突變體證實這一點。
為了將設計集中在非保守殘基位置，使用比對信息是有利的。理由是，保守殘基通常有充分理由保留在家族中，並且有可能任何突變將降低蛋白質穩定性(Serranoet al.，J.Mol.Biol.233，305-312(1993)；Steipe et al.，J.Mol.Biol.240，188-192(1994))。另一方面，具有高序列變異性的區域對突變是有耐受性的，並預期能在這些區域發現穩定蛋白質的變體(Serrano et al.，J.Mol.Biol.233，305-312(1993))。為了實現我們重新設計β-片層蛋白質TRAIL、並產生具有最小數目突變的穩定變體的目標，因此，從預測/優化策略中大量排除形成三聚體界面的保守殘基。由此產生一種方法，主要集中在提高單體穩定性(鏈內穩定；單體組)或改進單體-單體接觸(鏈間穩定；二聚體組)。見表1。
與我們的預測相一致，M1、M2、M3和C1顯示熱穩定性增加(表2；圖3-5)。在M1、M2和M3設計中使用不同的基本原理。M1顯示了鏈內穩定作用的實施例。每個TRAIL單體表面的柔性CD環的穩定化導致整個三聚體的穩定性增加。這個環不直接參與受體結合，在未複合的野生型TRAIL結構中是無序的(Cha et al.，Immunity.11，253-261(1999)；Hymowitz et al.，Biochemistry 39，633-640(2000))，但在與DR5(TRAIL-R2)結合時變成有序的(Mongkolsapaya et al.，Nat.Struct.Biol.6，1048-1053(1999)；Hymowitz et al.，Mol.Cell 4，563-571(1999)；Cha et al.，J.Biol.Chem.275，31171-31177(2000))。然而，M2舉例說明了兩個相鄰單體之間相互作用即鏈間穩定作用的優化。M4顯示了通過除去埋入的不滿意的氫鍵供體來穩定化三聚體分子。與我們的預期相反，組合突變體，C1(M1和M3組合)不導致明顯累加的熱穩定性。這可能由於在殘基194和196周圍局部解摺疊的影響，其可能比殘基225周圍的局部解摺疊的影響更佔優勢。儘管預測的相對於野生型TRAIL的自由能改變(-9.1kcal mol-1單體-1)對M4是有利的，實驗確定的穩定性比野生型TRAIL少約3℃。這可能是由於，除了與骨架形成氫鍵以外，三個中心精氨酸將水捕獲在三聚體的中心核內。從而形成水橋以補償正電荷，這導致三聚體的進一步穩定。推測突變Arg 227 Met穩定性較低，因為骨架的羰基未被補償並使三聚體去穩定。
熱穩定性增加不影響M1、M3和C1的生物活性。M2比野生型TRAIL更穩定，但Gln 205和DR5(TRAIL-R2)受體的Arg 154之間靜電相互作用的形成被阻止(圖6b)。這導致當與野生型TRAIL(5ng/ml)比較時生物活性隨後降低10倍(50ng/ml)，如FOLD-X預測的(ΔΔG結合＝7.3kcal mol-1單體-1)。我們的發現證實了早期研究顯示的這些位置的丙氨酸突變體降低生物活性(Hymowitz et al.，Biochemistry 39，633-640(2000))。用表面等離子體共振分析與DR4(TRAIL-R1)和DR5(TRAIL-R2)受體的結合，顯示出M2隔斷率增加，由此指示了在與野生型TRAIL和M1比較時對兩種受體較低的親和性(圖2)。由於配體-受體結合位點通常是「高能量區」，預期M2突變可穩定TRAIL分子。因此，可以將它認為是在進化中通過喪失功能來平衡可能增加穩定性的實例。
經常地，其它計算機重新設計研究將熱穩定性改進限制在分子核心(Malakauskas Mayo，Nat.Struct.Biol.5，470-475(1998)；Luo et al.，Protein Sci.11，1218-1226(2002)；Filikov et al.，Protein Sci.11，1452-1461(2002))。在此我們表明，計算機重新設計技術也可以涉及鏈間界面和分子的表面殘基，以便成功地穩定結構。
在鏈內(單體)組、鏈間(二聚體)組和混雜組中PERLA/FOLD-X的執行是成功的。相應於這些設計的實驗數據顯示，這些組內的所有變體比野生型TRAIL更穩定。明顯的是，我們可以證明，穩定單一單體中的CD環導致整個三聚體分子的穩定(圖6a)。
我們的研究已經顯示計算機重新設計更熱穩定的多聚體全β-片層蛋白質是可以實現的。因此，作為改進蛋白質特性的工具，蛋白質計算機重新設計是對其它蛋白質工程方法例如定向進化或高通量實驗方法的有價值補充。由於我們的研究中使用的計算機方法是基於一般物理原理，我們的發現可以進一步應用於設計具有提高熱穩定性的其它TNF配體家族成員。
實施例2對DR4(TRAIL-R1)或DR5(TRAIL-R2)受體具有選擇性的TRAIL變體方法除非具體說明所有試劑是分析級。異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)、氨苄青黴素和二硫蘇糖醇(DTT)來自Duchefa。色譜柱和介質來自AmershamBiosciences。使用的限制酶購買自England Biolabs。所有其它化學品來自Sigma。
計算機設計突變體使用蛋白質設計算法的計算機設計，PERLA和FOLD-X已經在上面描述。與之相似，所得的包含突變的PDB文件使用如Swiss-PdbViewer v3.7b2中執行的GROMOS 43B1進行能量最小化，並用FOLD-X(http://fold-x.embl-heidelberg.de)評估。來自與不同受體相互作用的TRAIL突變體設計的最終相互作用能量與參考(與它的四個膜受體複合的野生型TRAIL)進行比較，並表達為ΔΔG(kcal mol-1)。
計算機篩選為了使選擇性/特異性轉向它的不同膜受體(DR4(TRAIL-R1)、DR5(TRAIL-R2)、DcR1(TRAIL-R3)和DcR2(TRAIL-R4))，已經設計了TRAIL的新突變體。這些受體已經被描述Pan et al.，Science.1997 Apr 4；276(5309)111-3(DR4)；Screaton et al.，Curr Biol.1997 Sep 1；7(9)693-6(DR5)；Degli-Esposti et al.，JExp Med.1997 Oct 6；186(7)1165-70(DcRI(TRAIL-R3))和Marsters et al.，CurrBiol.1997 Dec 1；7(12)1003-6(DcR2(TRAIL-R4))。
設計是基於自動化的計算機算法，如上述PERLA。簡而言之，該程序實行嚴格的反向摺疊用來自旋轉異構體庫的胺基酸側鏈修飾固定的骨架結構。蛋白質結構中的張力鬆弛通過產生亞旋轉異構體實現。評分函數的多數項相對於參考狀態進行平衡，以模擬變性蛋白質。側鏈構象異構體利用平均場理論加權並最終產生具有建模結構(PDB坐標)的候選序列。建模結構的能量評價用修改版(Schymkowitz，J.，Borg，J.，Rousseau，F. Serrano，L，″manuscript in preparation″)的FOLD-X進行，在(http://fold-x.embl-heidelberg.de)上可以獲得。FOLD-X的力場模塊評價蛋白質的結構性質，例如它的原子接觸圖、它的原子和殘基的可接近性和骨架二面角，以及蛋白質的H-鍵網絡和靜電網絡。也要考慮到水分子對與蛋白質形成兩個或多個H-鍵的貢獻。隨後FOLD-X著手計算所有的力場組分極性和疏水溶劑化能量、範德華相互作用、範德華衝突(clash)、H-鍵能量、靜電、和主鏈與側鏈熵。
選擇模板序列模板選自Protein Data Bank，PDB標識符是1DU3。這是與DR5(TRAIL-R2)受體的外結構域複合的人TRAIL的三聚體結構的解析度為2.2的晶體結構。在此結構中TRAIL單體缺少外部、柔性環(殘基130-146)，不參與受體結合。因此，為了使分子完整，利用1D4V(2.2)的結構為該環建模，1D4V是與DR5(TRAIL-R2)受體複合的單體TRAIL，其中有該環的原子座標。
建立TRAIL未結晶受體的模型使用「如何進行同源性建模網絡界面」來獲得(在http://www.cmbi.kun.nl/gv/servers/WIWWWI/)可得到三種其它TRAIL成員受體(DR4(TRAIL-R1)、DcR1(TRAIL-R3)和DcR2(TRAIL-R4))的模型。然後，通過將它們的骨架原子放置於受體DR5(TRAIL-R2)的相同原子處可以生成與這三種受體複合的TRAIL的pdb文件。最後，從生成的PDB文件中除去模板受體DR5(TRAIL-R2)。
建立TRAIL和建模受體之間相互作用的模型TRAIL和三種建模受體之間存在的相互作用的合理設計按照下列方式進行首先，研究受體與TRAIL結合的界面，尋找旋轉異構體置換的目標胺基酸。選定的側鏈與潛在相互作用的TRAIL足夠物理接近。從這種旋轉異構體置換中排除具有受體DR5(TRAIL-R2)的保守殘基。其次，PERLA進行旋轉異構體搜索以尋找更好的側鏈構象，目的在於為TRAIL與這些受體的預期相互作用建立模型。最後，整體觀察研究TRAIL與不同受體的結合界面並改變一些旋轉異構體。
突變體的計算機設計只有位於受體結合界面的TRAIL胺基酸被考慮作為計算機突變研究的潛在候選物。從這個清單中排除與四種不同受體中保守胺基酸相互作用或與受體骨架相互作用的殘基。使用蛋白質合理設計和力場算法(PERLA、FOLD-X)允許鑑定與TRAIL選擇性/特異性具有潛在相關性的一系列突變體序列。
如前所述應用自動化的計算機算法PERLA。將所有可能的胺基酸替換(排除甘氨酸、脯氨酸和半胱氨酸)以與其餘部分結構相容的構象(側鏈旋轉異構體)導入預先選定的殘基位置。隨後，根據自由能(kcal mol-1)評價有利的突變，排除不利的突變(例如高範德華衝突)。得到序列和坐標的輸出並根據自由能使用FOLD-X排序。這些預測中一些可以在理論能量計算之後直接被排除，而不經進一步的實驗分析。
克隆和PCR使用NcoI和BamHI限制位點，將對應於人可溶TRAIL(aa 114-281)的cDNA克隆在pET15B(Novagen)中。因此除去編碼His-標籤和蛋白酶識別位點的N末端序列。使用快速改變方法(Stratagene)或修飾的大引物方法(Picard et al.，NucleicAcids Res.22，2587-2591(1994))通過PCR構建突變體。使用的聚合酶是Stratagene提供的Pfu Turbo。純化的致突變寡核苷酸來自Invitrogen。通過DNA測序證實突變的導入。
篩選選擇性突變體將TRAIL突變體的構建體轉化入大腸桿菌BL21(DE3)(Invitrogen)。突變體和野生型TRAIL在10ml規模用2×LB培養基生長。培養物在37℃和250rpm下生長至OD6000.5，隨後用1mM IPTG誘導蛋白質表達。加入濃度為100μM的ZnSO4來促進三聚體形成。溫度降至28℃，並繼續誘導5個小時。離心收集細胞。將沉澱重懸於原始體積25％的提取緩衝液(PBS pH7.3，10％(v/v)甘油和Complete蛋白酶抑制劑混合物)中。用超聲處理破碎細胞並在20,000g下離心使提取液澄清。使用SDS-PAGE評價TRAIL突變體蛋白質表達。隨後，將表達良好的突變體的澄清提取液以1∶50在HBS-EP緩衝液中稀釋。將兩倍的野生型TRAIL和TRAIL突變體的這些稀釋液以流速50μl/min注射到Biacore 2000。使用Biacore CM5傳感器晶片，晶片上包被TRAIL受體DR4(TRAIL-R1)、DR5(TRAIL-R2)和DcR1(TRAIL-R3)、以及作為對照表面的RANK(受體)。實時監測配體與受體的結合。使用3M乙酸鈉pH5.2注射再生受體/傳感器表面。計算分別相對於DR4(TRAIL-R1)或DR5(TRAIL-R2)結合的與不同受體結合的比率。選擇與野生型TRAIL比較具有不同結合譜的突變體進行隨後的分析。
野生型TRAIL和突變體的表達和純化以1l規模在250rpm和37℃下在搖瓶中生長選定的突變體。當培養物達到OD6000.5時用1mM IPTG誘導蛋白質表達，加入100μM濃度的ZnSO4。溫度降至28℃，並繼續誘導5個小時。將分離的沉澱重新懸浮於3倍體積的提取緩衝液(PBS pH8，10％(v/v)甘油，7mM β-巰基乙醇)中。使用超聲處理破碎細胞並在40,000g下離心使提取液澄清。隨後，將上清液加載到負載鎳的IMAC Sepharose fast-flow柱上並按Hymowitz所述(Hymowitz et al.，Biochemistry 39，633-640(2000))並做以下修改來純化野生型TRAIL和TRAIL突變體所有緩衝液中使用10％(v/v)甘油和最低濃度100mM NaCl。這防止了純化過程中的聚集。IMAC分離步驟之後，在所有緩衝液中加入20μM ZnSO4和5mM DTT(代替β-巰基乙醇)。最後，包括用HiloadSuperdex75柱的凝膠過濾步驟。純化蛋白質的純度超過98％，使用膠體考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE凝膠確定。純化蛋白質溶液在液氮中急速冷凍並儲存在-80℃。
篩選選擇性突變體用表面等離子體共振和Biacore 2000儀器評價16種表達突變體的提取液與DR4(TRAIL-R1)、DR5(TRAIL-R2)和DcR1(TRAIL-R3)受體的結合。因為野生型TRAIL不與小鼠RANK結合，監測與小鼠RANK(受體)的結合作為對照。也注射不含過表達質粒的BL21(DE3)培養物的對照提取液和含超表達SH3結構域質粒的BL21(DE3)培養物的對照提取液。沒有觀察到這些提取物的結合。計算DR4(TRAIL-R1)、DcR1(TRAIL-R3)或RANK(受體)結合相對於DR5(TRAIL-R2)受體結合的比率(圖7)和DR5(TRAIL-R2)、DcR1(TRAIL-R3)或RANK(受體)結合相對於DR4(TRAIL-R1)受體結合的比率(圖8)。將獲得的TRAIL選擇性突變體結合的比率值和獲得的野生型TRAIL結合的比率進行比較。也觀察研究對於on rate和隔斷率(off rate)改變的受體結合曲線，並與野生型TRAIL的on rate和隔斷率(off rate)進行比較。
兩種突變體，D269H和G160M，與DR4(TRAIL-R1)的結合降低但與DR5(TRAIL-R2)受體的結合不變(對DR5(TRAIL-R2)具有「選擇性」)，選擇它們做進一步分析。我們已經顯示了D269H w.r.t. DR4的隔斷率增加，但是這並不代表我們已經觀察到與DR5的結合增加。我們目前的數據強烈暗示我們已經將該突變體的結合導向DR5，因此它對DR5受體更有選擇性/特異性。當然可以在選定選擇性變體之後改進親和性。I220M和E195R(未示出)也被選擇，因為它們也表現與DR4(TRAIL-R1)的結合降低和與DR5(TRAIL-R2)受體的結合增加。然而，影響小於前兩種突變體。選擇D218Y做進一步分析，因為與野生型TRAIL比較它表現與DR4(TRAIL-R1)受體結合的更小優先性。選擇R130E是由於它表現出與DcR1(TRAIL-R3)受體結合中有些降低(對DcR1(TRAIL-R3)更小的「選擇性」)。
測定受體結合純化突變體R130E、G160M、D218Y、I220M和D269H。使用表面等離子體共振在具有上述傳感器晶片的Biacore 3000上實時評定純化突變體的結合。將突變體和純化的野生型TRAIL以17.3、34.5、69、138和276nM的濃度系列在流速70μl/min下注射。在37℃下進行測量以對增加的Koff和解離監測20分鐘。使用測量的Kon和Koff速率計算突變體對相應受體的表觀Kd值。使用全面擬合方法和1∶1朗格繆爾相互作用模型。發現Kon和Koff的二相性行為。計算初步表觀Kd值並在表3中示出。
TRAIL突變體D269H的體外研究實驗條件細胞系和處理Colo205結腸癌細胞在加溼培養箱中、37℃、5％CO2環境中維持於RPMI1640培養基、10％FCS、1％青黴素、1％鏈黴素中。總是在加入TRAIL之前1小時加入TRAIL受體抑制劑(中和抗體)。在實驗前一天將Colo205細胞以105細胞/ml接種到24孔板中，用增加濃度的抗DR4和抗DR5中和抗體處理1ml/孔1小時。將20ng/ml D269H加入細胞中並培養2小時30分鐘。處理後，輕輕地刮下細胞並離心沉澱。
膜聯蛋白V染色收穫並離心收集對照和處理Colo205細胞，在膜聯蛋白V培養緩衝液中洗滌一次並重懸於400μl新鮮培養緩衝液中。將1μl膜聯蛋白V加入樣品，在室溫下培養10分鐘，立即在FACSCalibur流式細胞儀(Beckton Dickinson)上測量，結果表達為膜聯蛋白V陽性細胞的％。
Caspase測試在實驗前一天將Colo205細胞以200.000細胞/ml、3ml/孔鋪板到6孔板中。在加入TRAIL(10ng/ml)之前1小時將R2C16(100ng/ml和500ng/ml)、抗DR4(TRAIL-R1)和抗DR5(TRAIL-R2)中和抗體(Alexis)(200ng/ml)加入培養基。在用TRAIL處理2小時後收集細胞進行Caspase活性測試。
沉澱細胞，在冰冷的PBS中洗滌兩次，重新懸浮在50ml PBS中，速凍2×25ml細胞懸液。使用螢光標記的DEVD-MCA(對Caspase-3和Caspase-7樣活性)、或IETD-MCA(對Caspase-8)四肽測量Caspase酶活性。以60秒間隔在25個循環中動態測量由釋放MCA引起的螢光強度。酶活性計算為每1mg總蛋白質每分鐘釋放的nmolMCA。
MTT測試將Colo205細胞以200.000細胞/ml、100μl/孔接種到96孔細胞板上。每個處理重複三次。24小時處理之後將500μg/ml MTT染料加入孔中並在37℃培養3小時。終止反應並通過加入溶於50％二甲基甲醯胺中的100μl 20％SDS終止反應並溶解甲(月替)(formazan)沉澱。
結果為了分析D269H的凋亡誘導能力，用增大濃度的TRAIL(aa 114-281)或D269H處理TRAIL敏感的Colo205結腸癌細胞2和3小時。用凋亡細胞的膜聯蛋白V標記監測誘導的細胞死亡水平。
我們的結果(見圖9、10和11)表明，兩種配體在Colo205細胞中具有相近的死亡誘導能力。因此，在D269H中設計的突變不明顯地降低其細胞毒能力(圖12)。
為了檢查哪個TRAIL受體更多參與D269H誘導的死亡，用D269H處理Colo205細胞之前1小時，給予增加量的中和性抗DR4或抗DR5抗體。抗DR4抗體的存在沒有阻止D269H誘導的死亡。另一方面，最低濃度(200ng/ml)的抗DR5抗體已經幾乎完全阻止細胞死亡(圖13)。這些結果提示D269H誘導的細胞死亡主要通過連接TRAIL受體2(DR5)。將需要對不同細胞系的類似研究以證實這種影響不是細胞類型特異性的，這些正在進行中。
實施例3受體特異性TRAIL變體通過SPR分析結合使用基於表面等離子體共振的生物傳感器Biacore 3000(Biacore AB，Uppsala，Sweden)在37℃下進行結合實驗。重組受體從RD systems(RD systems，Minneapolis，MN，USA)定購。根據製造商說明書按照標準的胺偶聯操作將DR4、DR5和RANK受體固定在Biacore CM5傳感器晶片的傳感器表面上。在～600-800RU水平包被受體。250nM-0.1nM濃度範圍的三倍的純化野生型TRAIL和TRAIL突變體在70μl/min流速和37℃下注射。在注射之間使用30μl 3M乙酸鈉pH5.2再生受體/傳感器表面。
如實施例2所述純化突變體R130E、G160M、D218Y、I220M、D269H、D269K、D269R、D269HT214R、D269HE195R和R191ED267R。使用表面等離子體共振實時評價純化突變體與固定化TRAIL-R1、TRAIL-R2和TRAIL-R3 Fc受體的結合。最初，在60nM濃度分析突變體和純化的野生型TRAIL(圖14)。隨後，在0.1-250nM濃度範圍記錄到變體的結合曲線表現出TRAIL-R1(DR4)/TRAIL-R2(DR5)結合比率的顯著變化。也發現包含D269H/R/K替換的所有變體都是TRAIL-R2Fc選擇性的。相對於野生型TRAIL，變體D269H/R/K和D269HE195R表現出對TRAIL-R2Fc的結合提高了＞10倍，對TRAIL-R1 Fc的結合降低了＞15倍(圖15a、b、c和d)。D269HT214R變體具有與D269H單一突變體與TRAIL-R2 Fc結合相似的提高，然而沒有發現對TRAIL-R1 Fc的可觀察的結合(圖15a和c)。也發現變體R191ED267R對TRAIL-R2的選擇性；它表現對TRAIL-R2 Fc的結合降低但對TRAIL-R1 Fc的結合完全消失(圖16a和b)。當與野生型TRAIL比較時，D269H與誘餌TRAIL-R3Fc受體的結合降低～10倍(圖18a)。
設計突變D218Y來產生DR4(TRAIL-R1)特異性TRAIL變體。儘管野生型TRAIL對DR5的親和性比對DR4高，這種優先性在突變體中喪失(圖16c)。
實施例4對DR5選擇性的TRAIL變體競爭ELISA為了評定在其它TRAIL受體存在下TRAIL-R2(DR5)選擇性突變體對TRAIL-R2受體的選擇性，進行競爭ELISA實驗。將Nunc Maxisorb板在2小時期間在0.1M碳酸鈉/碳酸氫鈉緩衝液pH8.6中用TRAIL-R2-Fc(100ng/孔)包被，隨後用2％BSA封閉剩餘的結合位點1小時。用TBST(TBS-0.5％Tween-20pH7.5)洗滌6次之後，將預保溫(30分鐘)的可溶性TRAIL-R1(DR4)、TRAIL-R2(DR5)或TRAIL-R3 Fc(0-500ng/孔)的系列稀釋液和10ng/孔純化rTRAIL或突變體(如實施例2所述純化)加入孔中並在RT保溫1小時。用TBST洗滌6次之後，加入抗TRAIL抗體(RD system)的1∶200稀釋液並在RT保溫1小時；用TBST洗滌6次之後，隨後與辣根過氧化物酶偶聯豬抗山羊抗體的1∶25000稀釋液一起保溫。用TBST洗滌6次之後，加入100μl 1-step Turbo TMB溶液(Pierce)並在～15分鐘後用100μl 1M硫酸終止反應。在酶標儀(Thermolab system)上測量450nm光吸收。對於野生型TRAIL或突變體與固定化TRAIL-R2 Fc的結合，以在0ng/孔可溶性受體下作為100％，相對於0ng/孔可溶性受體計算其它濃度的可溶性受體的結合。
增加濃度的可溶性TRAIL-R1 Fc或TRAIL-R2 Fc都可以與固定化TRAIL-R2Fc競爭與野生型TRAIL的結合。相反，可溶性TRAIL-R1 Fc不能與固定化TRAIL-R2 Fc競爭與TRAIL-R2選擇性變體的結合(圖17a、b、c和d)。然而，可溶性TRAIL-R2 Fc能夠與固定化TRAIL-R2 Fc競爭結合。與增加濃度的TRAIL-R3 Fc的預培養不影響TRAIL-R2選擇性變體與固定化TRAIL-R2 Fc結合。相反，當與最高濃度的TRAIL-R3 Fc預培養時，野生型TRAIL顯示與固定化TRAIL-R2的結合降低10-15％(圖18b)。TRAIL-R3 Fc和TRAIL-R2 Fc之間競爭野生型TRAIL結合的水平的差異是由於野生型TRAIL對兩種受體＞100倍的親和性差異，分別是200nM和＜2nM(Truneh et al.，J.Biol.Chem.275，23319-23325(2000))。
實施例5DR5-選擇性突變體的其它體外研究為了評定DR5(TRAIL-R2)選擇性突變體的生物活性，使用對DR5-受體介導的誘導凋亡敏感的細胞系(Colo205)和對DR4調節的誘導凋亡敏感的細胞系，進行基於膜聯蛋白V的凋亡測試。
細胞系和處理Colo205結腸癌細胞和ML-1骨髓白血病細胞在加溼培養箱中、37℃、5％CO2環境中維持於RPMI1640培養基、10％FCS、1％青黴素、1％鏈黴素中。總是在加入TRAIL之前1小時加入TRAIL受體抑制劑(中和抗體)。在實驗前一天將Colo205細胞以2×105細胞/ml接種到24孔板(0.5ml/孔)中。用1μg/ml抗-DR4和/或抗DR5中和抗體處理Colo205細胞1小時。將20ng/ml野生型TRAIL、D269H、D269HE195R或50ng/ml D269HT214R加入細胞並培養2小時30分鐘。在TRAIL處理前1小時用1μg/ml抗-DR4和/或抗DR5中和抗體處理ML-1細胞。向細胞中加入100ng/ml野生型TRAIL、D269H、D269HE195R或D269HT214R並培養12小時。
膜聯蛋白V染色收穫並離心收集對照和處理的Colo205細胞和ML-1細胞，在膜聯蛋白V培養緩衝液中洗滌一次並重懸於400μl新鮮培養緩衝液中。將3μl膜聯蛋白V(IQCorporation)加入樣品，在室溫下培養10分鐘，立即在FACSCalibur流式細胞儀(Beckton Dickinson)上測量，結果表達為膜聯蛋白V陽性細胞的％。
MTT測試將Colo205細胞以2×105細胞/ml(100μl/孔)接種到96孔細胞板上。每個處理重複三次。24小時處理之後將500μg/ml MTT染料加入孔中並在37℃培養3小時。終止反應並通過加入溶於50％二甲基甲醯胺中的100μl 20％SDS終止反應並溶解甲(月替)(formazan)沉澱。
結果MTT測試顯示野生型TRAIL和D269H、D269HE195R和D269HT214R(如實施例1和2所述純化)具有生物活性並能在Colo205細胞中誘導細胞死亡(數據未示出)。為了分析野生型TRAIL、D269H、D269HE195R和D269HT214R的特異性凋亡誘導能力，用20ng/ml純化的野生型TRAIL或D269H、D269HE195R或D269HT214R處理TRAIL敏感的Colo205結腸癌細胞2.5小時。用凋亡細胞的膜聯蛋白V標記監測誘導的細胞死亡水平。
我們的結果表明，所述配體在Colo205細胞中具有與野生型TRAIL相近的死亡誘導能力。因此，在D269H、D269HE195R和D269HT214R中設計的突變不明顯地降低其細胞毒能力。
為了檢查哪個TRAIL受體更多參與野生型TRAIL、D269H、D269HE195R或D269HT214R誘導的死亡，用野生型或突變體處理Colo205細胞之前1小時，給予1μg/ml中和性抗DR4或抗DR5抗體。抗DR4抗體的存在沒有阻止D269H、D269HE195R或D269HT214R誘導的死亡。另一方面，1μg/ml的抗DR5抗體可以顯著減少細胞死亡量。相反，抗-DR4和抗-DR5抗體兩者都能顯著地減少由野生型TRAIL在Colo205細胞中誘導的細胞死亡量。這些結果提示D269H、D269HE195R和D269HT214R誘導細胞死亡主要通過連接TRAIL受體2(DR5)。
發現TRAIL受體誘導的ML-1骨髓瘤細胞的凋亡主要由DR4(TRAIL-R1)受體調節。只有抗-DR4抗體能夠顯著地減少這些細胞中野生型TRAIL介導的細胞死亡。加入抗-DR5對野生型TRAIL介導的細胞死亡沒有顯著影響。突變體D269H、D269HE195R和D269HT214R不能在該細胞系中誘導與野生型TRAIL相近水平的凋亡。突變體D269H、D269HE195R和D269HT214R不能通過連接DR4(TRAIL-R1)誘導細胞死亡。
總之，由Colo205和ML-1細胞系獲得的結果顯示，D269H、D269HE195R和D269HT214R的生物活性主要指向DR5(TRAIL-R2)受體。
實施例6第二輪設計使用從第一代產生受體選擇性TRAIL突變體獲得的體外和體內結果，改進DR4受體同源性模型，並用實施例2所述方法為受體選擇性篩選TRAIL中另外的胺基酸殘基位置，從而獲得具有改進的受體選擇特性的突變體。圖20A描繪了使用PERLA/FOLD-X在第一和第二輪計算機突變分析中使用的殘基(用範德華半徑突出)。
發現第一輪設計的突變體D269H對DR5選擇性是關鍵的。此外，對第269位天冬氨酸進行第二輪計算機突變分析。從這第二輪中，除了D269H之外，D269K和D269R被預測其受體選擇性轉向DR5(TRAIL-R2)(圖20B)。(負ΔΔG值指示提高的結合，正ΔΔG值指示降低的受體結合。)從與DR5(TRAIL-R2)複合的TRAIL的晶體結構，殘基269似乎沒有與DR5的任何直接相互作用，然而，用賴氨酸、組氨酸或精氨酸替換這個殘基大大降低了與除DR5以外所有受體的結合。
這可以解釋，因為在受體DR4、DcR1、DcR2上位置120中存在保守的賴氨酸。根據我們的模型，這個賴氨酸不與TRAIL發生任何相互作用，但是與受體界面足夠接近以至於具有範德華衝突，或至少，排斥性靜電相互作用，本文還描述TRAIL的第269位的胺基酸替換。
這個設計數據與實驗性受體結合研究和競爭ELISA具有關聯性(見實施例3和4)。
預測殘基218對轉移選擇性朝向DR4(TRAIL-R1)很重要。第一輪設計的突變體D218Y證實了選擇性朝向DR4的這種轉移。此外，對第218位天冬氨酸進行第二輪計算機突變分析。從這第二輪中，除了D218Y之外，預測D218K、D218R和尤其D218H轉移受體選擇性朝向DR4(TRAIL-R1)(圖20C)。(負ΔΔG值指示改進的結合，正ΔΔG值指示降低的受體結合。)殘基位置214和DR5選擇性。由精氨酸替換TRAIL的第214位蘇氨酸，預測轉移選擇性朝向DR5(圖20d)。測試這種突變與已經測試的突變D269H的組合，以達到更清楚的選擇性。這已經被實驗證實。D269HT214R顯示了改進的朝向DR5(TRAIL-R2)的結合，並完全消除了DR4(TRAIL-R1)結合(實施例3和4)。
為了選擇性朝向DR5第214位和269位突變體的組合。我們已經顯示了D269H、D269K、D269R和T214R-D269H的實驗表徵。在突變的位置彼此足夠遠使得它們彼此不發生任何不可預測的相互作用的情況下，可以期望，至少可以假設，朝向選擇性的突變的累加作用。第214位和269位就是這種情況，它們彼此相距大約20。因此，使用來自突變體D269H和T214R-D269H的數據，我們可以預期，兩種突變以獨立的方式有助於選擇性，由此我們考慮突變體T214R是對DR5有選擇性的。
第269位選擇性的推測的結構基礎前面已經解釋過。在第269位中三種不同替換在選擇性上具有或多或少相似的轉移，這種事實可能意味著，達到這種選擇性是由於依賴於胺基酸大小和/或電荷的衝突和/或靜電排斥。因此，觀察了突變體T214R-D269H的結果以後，我們可以假定，T214R與D269R或D269K的組合對選擇性有相似的影響。PERLA/FOLD-X計算指示，這些突變事實上具有相似的影響。
實施例7穩定性和選擇性突變體的組合可以製造上述穩定性變體和選擇性變體之間的組合，從而得到具有增強的穩定性和改變的選擇性/特異性的變體。TRAIL M1和C1突變體(穩定性突變體)的組合，組合一個或多個D269H、D269HE195R、D269HT214R、D269K、D269R和R191ED267R突變體(選擇性突變體)，如實施例1和2所述構建和純化這些組合。如實施例1、2和3所述測試突變體的受體結合與生物活性。野生型TRAIL和D269HM1之間的比較給作實例。用表面等離子體共振實時評定純化的野生型TRAIL和D269HM1與固定化TRAIL-R1和TRAIL-R2 Fc受體的結合。在0.1-250nM的濃度範圍記錄了結合曲線。相對於野生型TRAIL，變體D269HM1顯示與RAIL-R2 Fc結合＞8倍的提高和與TRAIL-R1 Fc結合＞8倍的降低(圖21a和b)。
為了監測突變體在升高溫度下生物活性的增加，將濃度為100μg/ml的蛋白質溶液在73℃保溫，每1小時取一次樣品。隨後稀釋樣品在組織培養基中並加入Colo205細胞中，使得最終濃度為100ng/ml。隔夜培養之後，使用MTT測試法測量細胞的活力。野生型TRAIL僅在保溫10分鐘後就顯示了明顯的生物活性降低，而D269HM1在73℃保溫50分鐘後保留了全部生物活性(圖21c)。


表3DR4(TRAIL-R1)和DR5(TRAIL-R2)受體的表觀Kd值

表4為DR4和DR5之間無區別的受體結合而鑑定的關鍵殘基

表5為選擇性鑑定的關鍵殘基

表6TNF配體-受體家族及其與自身免疫疾病的關係

MS，多發性硬化；RA，類風溼性關節炎；SLE，系統性紅斑狼瘡；SS，斯耶格倫綜合症；EAE，實驗性自身免疫性腦脊髓炎；IBD，炎性腸病。
TRAIL-特異性序列SEQ ID NO1(TRAIL胺基酸序列)MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGSEQ ID NO2(TRAIL核苷酸序列)CCTCACTGACTATAAAAGAATAGAGAAGGAAGGGCTTCAGTGACCGGCTGCCTGGCTGACTTACAGCAGTCAGACTCTGACAGGATCATGGCTATGATGGAGGTCCAGGGGGGACCCAGCCTGGGACAGACCTGCGTGCTGATCGTGATCTTCACAGTGCTCCTGCAGTCTCTCTGTGTGGCTGTAACTTACGTGTACTTTACCAACGAGCTGAAGCAGATGCAGGACAAGTACTCCAAAAGTGGCATTGCTTGTTTCTTAAAAGAAGATGACAGTTATTGGGACCCCAATGACGAAGAGAGTATGAACAGCCCCTGCTGGCAAGTCAAGTGGCAACTCCGTCAGCTCGTTAGAAAGATGATTTTGAGAACCTCTGAGGAAACCATTTCTACAGTTCAAGAAAAGCAACAAAATATTTCTCCCCTAGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGAGTAGCAGCTCACATAACTGGGACCAGAGGAAGAAGCAACACATTGTCTTCTCCAAACTCCAAGAATGAAAAGGCTCTGGGCCGCAAAATAAACTCCTGGGAATCATCAAGGAGTGGGCATTCATTCCTGAGCAACTTGCACTTGAGGAATGGTGAACTGGTCATCCATGAAAAAGGGTTTTACTACATCTATTCCCAAACATACTTTCGATTTCAGGAGGAAATAAAAGAAAACACAAAGAACGACAAACAAATGGTCCAATATATTTACAAATACACAAGTTATCCTGACCCTATATTGTTGATGAAAAGTGCTAGAAATAGTTGTTGGTCTAAAGATGCAGAATATGGACTCTATTCCATCTATCAAGGGGGAATATTTGAGCTTAAGGAAAATGACAGAATTTTTGTTTCTGTAACAAATGAGCACTTGATAGACATGGACCATGAAGCCAGTTTTTTCGGGGCCTTTTTAGTTGGCTAACTGACCTGGAAAGAAAAAGCAATAACCTCAAAGTGACTATTCAGTTTTCAGGATGATACACTATGAAGATGTTTCAAAAAATCTGACCAAAACAAACAAACAGAAAACAGAAAACAAAAAAACCTCTATGCAATCTGAGTAGAGCAGCCACAACCAAAAAATTCTACAACACACACTGTTCTGAAAGTGACTCACTTATCCCAAGAAAATGAAATTGCTGAAAGATCTTTCAGGACTCTACCTCATATCAGTTTGCTAGCAGAAATCTAGAAGACTGTCAGCTTCCAAACATTAATGCAATGGTTAACATCTTCTGTCTTTATAATCTACTCCTTGTAAAGACTGTAGAAGAAAGCGCAACAATCCATCTCTCAAGTAGTGTATCACAGTAGTAGCCTCCAGGTTTCCTTAAGGGACAACATCCTTAAGTCAAAAGAGAGAAGAGGCACCACTAAAAGA
TCGCAGTTTGCCTGGTGCAGTGGCTCACACCTGTAATCCCAACATTTTGGGAACCCAAGGTGGGTAGATCACGAGATCAAGAGATCAAGACCATAGTGACCAACATAGTGAAACCCCATCTCTACTGAAAGTGCAAAAATTAGCTGGGTGTGTTGGCACATGCCTGTAGTCCCAGCTACTTGAGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGTTTGAACCCGGGAGGCAGAGGTTGCAGTGTGGTGAGATCATGCCACTACACTCCAGCCTGGCGACAGAGCGAGACTTGGTTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTTCAGTAAGTACGTGTTATTTTTTTTCAATAAAATTCTATTACAGTATGTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA
權利要求書(按照條約第19條的修改)1.β片層多聚體細胞因子，其序列已經通過突變所述多聚體細胞因子蛋白質的單體組分中的殘基而被改變，以便相對於野生型未突變單體成分來改善所述單體的或所述多聚體複合物的自由能，使得比野生型、未改變的細胞因子蛋白質更穩定，其中所述突變的殘基在所述細胞因子家族的同源性成員之間是非保守的。
2.根據權利要求1的細胞因子，其是TNF配體家族的成員。
3.根據權利要求2的細胞因子，其是TRAIL。
4.根據權利要求3的細胞因子，其在分子的可溶性C-端部分被突變。
5.根據前面任一項權利要求的細胞因子，其在一個或多個以下位置被突變a)所述多聚體細胞因子的單體組分表面的非保守殘基；b)接近於所述多聚體細胞因子的兩個單體組分之間界面的非保守殘基；c)對於三聚體細胞因子，沿著中心三聚體軸的非保守殘基；d)混雜的殘基，其突變是在能量方面有利的。
6.根據權利要求5的細胞因子，其在連接C和D反平行β鏈的外部環(CD環)內被突變，符號根據Eck命名(Eck et al.，J.Biol.Chem.267，2119-2122(1992)。
7.根據權利要求5a)部分的細胞因子，其在第194位和第196位的一個或兩個位置被突變。
8.根據權利要求7的細胞因子，其是包含突變E194I和/或I196S的TRAIL突變體。
9.根據權利要求5b)部分的細胞因子，其在以下一個或多個位置突變125、163、185、187、232、234、237、203、205、239、241、271、274。
10.根據權利要求9的細胞因子，其是包含突變D203I、Q205M和Y237F中一個或多個的TRAIL突變體。
11.根據權利要求5c)部分的細胞因子，其在第227、230和240位的一個或多個位置被突變。
12.根據權利要求11的細胞因子，其是包含突變R227M的TRAIL突變體。
13.根據權利要求11的細胞因子，其是包含突變C230S和Y240F的TRAIL突變體。
14.根據權利要求5d)部分的細胞因子，其在第123、272、225、280、163、123和208位的一個或多個位置被突變。
15.根據權利要求14的細胞因子，其是包含突變S225A的TRAIL突變體。
16.在權利要求5的a)至d)部分列出的超過一個位置被突變的細胞因子。
17.根據權利要求16的細胞因子，其是包含突變E194I、I196S和S225A的TRAIL突變體。
18.根據權利要求1-17中任一項的細胞因子，其中所述突變被導入所述細胞因子的可溶性形式。
19.根據權利要求18的細胞因子，其是包含殘基114-281的TRAIL突變體。
20.對目標受體具有選擇性的β片層多聚體細胞因子，其中所述細胞因子中位於受體結合界面的一個或多個胺基酸被替換為置換殘基，所述置換殘基包含預測與所述目標受體在結合界面配合的胺基酸側鏈構象，以便提供所述細胞因子蛋白質增加對該目標受體的結合親合性利選擇性/特異性，前提是這些不是與所述細胞因子蛋白質結合的受體中保守胺基酸相互作用的殘基。
21.根據權利要求20的β片層多聚體細胞因子，其對特定目標受體具有改變的親合性。
22.對兩個或多個目標受體具有選擇性的β片層多聚體細胞因子，其中對第一個目標受體的選擇性是通過將所述細胞因子中一個或多個胺基酸替換為置換殘基而實現，以便降低對一個或多個不同目標受體的親合性，前提是這些不是與所述細胞因子蛋白質結合的受體中保守胺基酸相互作用的殘基。
23.根據權利要求21或22的細胞因子，其在所述細胞因子中的第131、269、130、160、218、220、149、155、214、195、191和267位的一個或多個位置被突變。
24.根據權利要求20-23中任一項的細胞因子，其是TNF配體家族的成員。
25.根據權利要求24的細胞因子，其是TRAIL。
26.根據權利要求25的細胞因子，其對DR5(TRAIL-R2)或DR4(TRAIL-R1)具有超過誘餌受體DcR1(TRAIL-R3)和DcR2(TRAIL-R4)的優異選擇性。
27.根據權利要求25的細胞因子，其對死亡受體5(TRAIL-R2)具有超過對死亡受體4(TRAIL-R1)選擇性的優異選擇性。
28.根據權利要求26或27的細胞因子，其包含以下一個或多個突變G131R、D269H、D269K、D269R、R130E、G160K、D218R、G160M、I220M、I220H、R149D、R149H、E155M、T214R、E195R、R191E和D267R。
29.根據權利要求28的細胞因子，其包含突變G160M或D269H。
30.根據權利要求28的細胞因子，其包含突變D269H和T214R。
31.根據權利要求28的細胞因子，其包含突變D269H和E195R。
32.根據權利要求28的細胞因子，其包含突變R191E和D267R。
33.根據權利要求25的細胞因子，其對死亡受體4(TRAIL-R1)具有超過對死亡受體5(TRAIL-R2)選擇性的優異選擇性。
34.根據權利要求33的細胞因子，其包含突變D218Y、D218E、D218K、D218H和D218F中的一個或多個。
35.對目標受體具有選擇性的β片層多聚體細胞因子，其序列通過以下方式已經被改變a)突變所述多聚體細胞因子蛋白質的單體組分中的殘基，以便相對於野生型未突變的單體組分改善所述單體或所述多聚體複合物的自由能，其中所述突變殘基在該細胞因子家族的同源性成員之間是非保守的，以使比野生型、未改變的細胞因子蛋白質更穩定，和b)將所述細胞因子的位於受體結合界面的一個或多個胺基酸替換為置換殘基，所述置換殘基包含預測與所述目標受體在結合界面配合的胺基酸側鏈構象，以便提供所述細胞因子蛋白質增加對該目標受體的結合親合性和選擇性/特異性，前提是這些不是與所述細胞因子蛋白質結合的受體中保守胺基酸相互作用的殘基，
以便提供具有增強的穩定性和對目標受體具有增加的結合親合性和選擇性/特異性的變體。
36.對目標受體具有選擇性的β片層多聚體細胞因子，其序列通過下面方式改變a)突變所述多聚體細胞因子蛋白質的單體組分中的殘基，以便相對於野生型未突變的單體組分改善所述單體或所述多聚體複合物的自由能，其中所述突變殘基在該細胞因子家族的同源性成員之間是非保守的，以使比野生型、未改變的細胞因子蛋白質更穩定，和b)將所述細胞因子中一個或多個胺基酸替換為置換殘基，以便降低對一個或多個不同目標受體的親合性，前提是這些不是與所述細胞因子蛋白質結合的受體中保守胺基酸相互作用的殘基，以便提供具有增強的穩定性和對目標受體具有選擇性/特異性的變體。
37.根據權利要求35或36的細胞因子，其是TNF配體家族的成員。
38.根據權利要求37的細胞因子，其是TRAIL。
39.根據權利要求38的細胞因子，其包含突變D269H和T214R。
40.根據權利要求38的細胞因子，其包含突變D269H、E194I和I196S。
41.穩定β片層多聚體細胞因子的計算機執行方法，包括下列步驟突變所述多聚體細胞因子蛋白質的單體組分中的殘基，以便相對於野生型未突變的單體組分改善所述單體或所述多聚體複合物的自由能；其中所述突變殘基在該細胞因子家族的同源性成員之間是非保守的。
42.根據權利要求41的方法，其中被突變的非保守殘基在所述多聚體細胞因子蛋白質的單體組分的表面。
43.根據權利要求41的方法，其中被突變的非保守殘基在接近於所述細胞因子蛋白質的兩個單體組分之間界面的位置附近。
44.根據權利要求41的方法，其中在三聚體細胞因子蛋白質中，被突變的非保守殘基在沿著所述多聚體蛋白質的中心三聚體軸的位置。
45.根據權利要求41-44中任一項的方法，其中超過一個非保守殘基被突變。
46.根據前面任一項權利要求的方法，其中非保守殘基使用計算機執行的比對算法來鑑定。
47.根據權利要求64的方法，其中在突變候選物和同一蛋白質家族的其它成員之間的比對中，保守殘基是在家族的至少50％成員之間共有的殘基。
48.根據前面任一項權利要求的方法，其中蛋白質設計算法用於幫助鑑定用於突變的候選殘基。
49.根據權利要求48的方法，其中所述方法執行涉及下列步驟的能量運算a)鑑定能與相鄰單體建立特異性相互作用的單體的殘基；b)鑑定與突變候選殘基接觸的側鏈；c)在每個殘基位置放置集合中每個胺基酸，所述集合選自在同一蛋白質家族成員的多序列比對中一組天然存在的胺基酸，並且排除與所述結構的其餘部分不相容的任何側鏈構象和胺基酸；d)研究所有可能的成對相互作用以去除那些不利的組合。
50.根據權利要求49的方法，其中所述能量計算用計算機進行，考慮所述結構的性質，包括它的原子接觸圖、它的原子和殘基的可接近性和骨架二面角，以及蛋白質的H-鍵網絡和靜電網絡、水分子對與蛋白質形成兩個或多個H-鍵的貢獻、極性和疏水溶劑化能量、範德華相互作用、範德華衝突、H-鍵能量、靜電、和主鏈與側鏈熵。
51.根據權利要求50的方法，其中所述方法輸出與最佳計算方案對應的序列和/或PDB坐標。
52.根據權利要求51的方法，其中包含突變的序列和/或PDB坐標被能量最小化，並且根據ΔΔG(kcal mol-1)將最終預測的能量與參考、野生型結構相比較。
53.改變β片層多聚體細胞因子對目標受體的選擇性的方法，該方法包括a)鑑定所述細胞因子中位於受體結合界面的胺基酸作為突變候選；b)排除與所述細胞因子蛋白質結合的受體中保守胺基酸相互作用的殘基；
c)排除與受體骨架相互作用的殘基；d)將所述細胞因子蛋白質中一個或多個胺基酸的每個替換為置換殘基，所述置換殘基包含預測與所述目標受體在結合界面配合的胺基酸側鏈構象，以便提供所述細胞因子蛋白質增加對該目標受體的結合親合性和選擇性/特異性。
54.β片層多聚體細胞因子，其序列已經用根據權利要求53的方法被改變，以便改變它對特定目標受體的親合性。
55.根據權利要求54的細胞因子，其在第131、269、130、160、218、220、149、155、214、195、191和267位的一個或多個位置被突變。
56.根據權利要求52或53，其是TNF配體家族的成員。
57.根據權利要求54的細胞因子，其是TRAIL。
58.根據權利要求57的細胞因子，其對DR5(TRAIL-R2)或DR4(TRAIL-R1)具有超過誘餌受體DcR1(TRAIL-R3)和DcR2(TRAIL-R4)的優異選擇性。
59.根據權利要求57的細胞因子，其對死亡受體5(TRAIL-R2)具有超過對死亡受體4(TRAIL-R1)選擇性的優異選擇性。
60.根據權利要求58或59的細胞因子，其包含突變G131R、D269H、D269K、D269R、R130E、G160K、D218R、G160M、D218Y、D218E、D218K、D218H、I220M、I220H、R149D、R149H、D218F、E155M、T214R、E195R、R191E和D267R的一個或多個。
61.根據權利要求60的細胞因子，其包含突變G160M或D269H。
62.獲得β片層多聚體細胞因子的變體的方法，所述變體具有增強的穩定性和對目標受體增加的結合親合性和選擇性/特異性，包括下列步驟a)突變所述多聚體細胞因子蛋白質的單體組分中的殘基，以便相對於野生型未突變的單體組分改善所述單體或所述多聚體複合物的自由能，其中所述突變殘基在該細胞因子家族的同源性成員之間是非保守的，和b)鑑定所述細胞因子中位於受體結合界面的胺基酸作為突變候選，排除與所述細胞因子蛋白質結合的受體中保守胺基酸相互作用的殘基，排除與受體骨架相互作用的殘基，和將所述細胞因子蛋白質中一個或多個胺基酸的每個替換為置換殘基，所述置換殘基包含預測與所述目標受體在結合界面配合的胺基酸側鏈構象。
63.治療癌症的方法，通過將癌細胞暴露於DR4特異性TRAIL變體以及合併細胞毒治療如電離輻射和化學治療。
64.治療癌症的方法，通過將癌細胞暴露於DR5特異性TRAIL變體以及合併細胞毒治療如電離輻射和化學治療。
65.DR4特異性TRAIL變體在製造治療癌症的藥物中的用途，其中給予所述藥物以及合併細胞毒治療如電離輻射和化學治療。
66.DR5特異性TRAIL變體在製造治療癌症的藥物中的用途，其中給予所述藥物以及合併細胞毒治療如電離輻射和化學治療。
權利要求
1.β片層多聚體細胞因子，其序列已經通過突變所述多聚體細胞因子蛋白質的單體組分中的殘基而被改變，以便相對於野生型未突變單體成分來改善所述單體的或所述多聚體複合物的自由能，使得比野生型、未改變的細胞因子蛋白質更穩定，其中所述突變的殘基在所述細胞因子家族的同源性成員之間是非保守的。
2.根據權利要求1的細胞因子，其是TNF配體家族的成員。
3.根據權利要求2的細胞因子，其是TRAIL。
4.根據權利要求3的細胞因子，其在分子的可溶性C-端部分被突變。
5.根據前面任一項權利要求的細胞因子，其在一個或多個以下位置被突變a)所述多聚體細胞因子的單體組分表面的非保守殘基；b)接近於所述多聚體細胞因子的兩個單體組分之間界面的非保守殘基；c)對於三聚體細胞因子，沿著中心三聚體軸的非保守殘基；d)混雜的殘基，其突變是在能量方面有利的。
6.根據權利要求5的細胞因子，其在連接C和D反平行β鏈的外部環(CD環)內被突變，符號根據Eck命名(Eck et al.，J.Biol.Chem.267，2119-2122(1992)。
7.根據權利要求5a)部分的細胞因子，其在第194位和第196位的一個或兩個位置被突變。
8.根據權利要求7的細胞因子，其是包含突變E194I和/或I196S的TRAIL突變體。
9.根據權利要求5b)部分的細胞因子，其在以下一個或多個位置突變125、163、185、187、232、234、237、203、205、239、241、271、274。
10.根據權利要求9的細胞因子，其是包含突變D203I、Q205M和Y237F中一個或多個的TRAIL突變體。
11.根據權利要求5c)部分的細胞因子，其在第227、230和240位的一個或多個位置被突變。
12.根據權利要求11的細胞因子，其是包含突變R227M的TRAIL突變體。
13.根據權利要求11的細胞因子，其是包含突變C230S和Y240F的TRAIL突變體。
14.根據權利要求5d)部分的細胞因子，其在第123、272、225、280、163、123和208位的一個或多個位置被突變。
15.根據權利要求14的細胞因子，其是包含突變S225A的TRAIL突變體。
16.在權利要求5的a)至d)部分列出的超過一個位置被突變的細胞因子。
17.根據權利要求16的細胞因子，其是包含突變E194I、I196S和S225A的TRAIL突變體。
18.根據權利要求1-17中任一項的細胞因子，其中所述突變被導入所述細胞因子的可溶性形式。
19.根據權利要求18的細胞因子，其是包含殘基114-281的TRAIL突變體。
20.對目標受體具有選擇性的β片層多聚體細胞因子，其中所述細胞因子中位於受體結合界面的一個或多個胺基酸被替換為置換殘基，所述置換殘基包含預測與所述目標受體在結合界面配合的胺基酸側鏈構象，以便提供所述細胞因子蛋白質增加對該目標受體的結合親合性和選擇性/特異性，前提是這些不是與所述細胞因子蛋白質結合的受體中保守胺基酸相互作用的殘基。
21.根據權利要求20的β片層多聚體細胞因子，其對特定目標受體具有改變的親合性。
22.對兩個或多個目標受體具有選擇性的β片層多聚體細胞因子，其中對第一個目標受體的選擇性是通過將所述細胞因子中一個或多個胺基酸替換為置換殘基而實現，以便降低對一個或多個不同目標受體的親合性，前提是這些不是與所述細胞因子蛋白質結合的受體中保守胺基酸相互作用的殘基。
23.根據權利要求21或22的細胞因子，其在所述細胞因子中的第131、269、130、160、218、220、149、155、214、195、191和267位的一個或多個位置被突變。
24.根據權利要求20-23中任一項的細胞因子，其是TNF配體家族的成員。
25.根據權利要求24的細胞因子，其是TRAIL。
26.根據權利要求25的細胞因子，其對DR5(TRAIL-R2)或DR4(TRAIL-R1)具有超過誘餌受體DcR1(TRAIL-R3)和DcR2(TRAIL-R4)的優異選擇性。
27.根據權利要求25的細胞因子，其對死亡受體5(TRAIL-R2)具有超過對死亡受體4(TRAIL-R1)選擇性的優異選擇性。
28.根據權利要求27的細胞因子，其包含以下一個或多個突變G131R、D269H、D269K、D269R、R130E、G160K、D218R、G160M、I220M、I220H、R149D、R149H、E155M、T214R、E195R、R191E和D267R。
29.根據權利要求27的細胞因子，其包含突變G160M或D269H。
30.根據權利要求27的細胞因子，其包含突變D269H和T214R。
31.根據權利要求27的細胞因子，其包含突變D269H和E195R。
32.根據權利要求27的細胞因子，其包含突變R191E和D267R。
33.根據權利要求25的細胞因子，其對死亡受體4(TRAIL-R1)具有超過對死亡受體5(TRAIL-R2)選擇性的優異選擇性。
34.根據權利要求33的細胞因子，其包含突變D218Y、D218E、D218K、D218H和D218F中的一個或多個。
35.對目標受體具有選擇性的β片層多聚體細胞因子，其序列通過以下方式已經被改變a)突變所述多聚體細胞因子蛋白質的單體組分中的殘基，以便相對於野生型未突變的單體組分改善所述單體或所述多聚體複合物的自由能，其中所述突變殘基在該細胞因子家族的同源性成員之間是非保守的，以使比野生型、未改變的細胞因子蛋白質更穩定，和b)將所述細胞因子的位於受體結合界面的一個或多個胺基酸替換為置換殘基，所述置換殘基包含預測與所述目標受體在結合界面配合的胺基酸側鏈構象，以便提供所述細胞因子蛋白質增加對該目標受體的結合親合性和選擇性/特異性，前提是這些不是與所述細胞因子蛋白質結合的受體中保守胺基酸相互作用的殘基，以便提供具有增強的穩定性和對目標受體具有增加的結合親合性和選擇性/特異性的變體。
36.對目標受體具有選擇性的β片層多聚體細胞因子，其序列通過下面方式改變a)突變所述多聚體細胞因子蛋白質的單體組分中的殘基，以便相對於野生型未突變的單體組分改善所述單體或所述多聚體複合物的自由能，其中所述突變殘基在該細胞因子家族的同源性成員之間是非保守的，以使比野生型、未改變的細胞因子蛋白質更穩定，和b)將所述細胞因子中一個或多個胺基酸替換為置換殘基，以便降低對一個或多個不同目標受體的親合性，前提是這些不是與所述細胞因子蛋白質結合的受體中保守胺基酸相互作用的殘基，以便提供具有增強的穩定性和對目標受體具有選擇性/特異性的變體。
37.根據權利要求35或36的細胞因子，其是TNF配體家族的成員。
38.根據權利要求37的細胞因子，其是TRAIL。
39.根據權利要求38的細胞因子，其包含突變D269H和T214R。
40.根據權利要求38的細胞因子，其包含突變D269H、E194I和I196S。
41.穩定β片層多聚體細胞因子的計算機執行方法，包括下列步驟突變所述多聚體細胞因子蛋白質的單體組分中的殘基，以便相對於野生型未突變的單體組分改善所述單體或所述多聚體複合物的自由能；其中所述突變殘基在該細胞因子家族的同源性成員之間是非保守的。
42.根據權利要求41的方法，其中被突變的非保守殘基在所述多聚體細胞因子蛋白質的單體組分的表面。
43.根據權利要求41的方法，其中被突變的非保守殘基在接近於所述細胞因子蛋白質的兩個單體組分之間界面的位置附近。
44.根據權利要求41的方法，其中在三聚體細胞因子蛋白質中，被突變的非保守殘基在沿著所述多聚體蛋白質的中心三聚體軸的位置。
45.根據權利要求41-44中任一項的方法，其中超過一個非保守殘基被突變。
46.根據前面任一項權利要求的方法，其中非保守殘基使用計算機執行的比對算法來鑑定。
47.根據權利要求64的方法，其中在突變候選物和同一蛋白質家族的其它成員之間的比對中，保守殘基是在家族的至少50％成員之間共有的殘基。
48.根據前面任一項權利要求的方法，其中蛋白質設計算法用於幫助鑑定用於突變的候選殘基。
49.根據權利要求48的方法，其中所述方法執行涉及下列步驟的能量運算a)鑑定能與相鄰單體建立特異性相互作用的單體的殘基；b)鑑定與突變候選殘基接觸的側鏈；c)在每個殘基位置放置集合中每個胺基酸，所述集合選自在同一蛋白質家族成員的多序列比對中一組天然存在的胺基酸，並且排除與所述結構的其餘部分不相容的任何側鏈構象和胺基酸；d)研究所有可能的成對相互作用以去除那些不利的組合。
50.根據權利要求49的方法，其中所述能量計算用計算機進行，考慮所述結構的性質，包括它的原子接觸圖、它的原子和殘基的可接近性和骨架二面角，以及蛋白質的H-鍵網絡和靜電網絡、水分子對與蛋白質形成兩個或多個H-鍵的貢獻、極性和疏水溶劑化能量、範德華相互作用、範德華衝突、H-鍵能量、靜電、和主鏈與側鏈熵。
51.根據權利要求50的方法，其中所述方法輸出與最佳計算方案對應的序列和/或PDB坐標。
52.根據權利要求51的方法，其中包含突變的序列和/或PDB坐標被能量最小化，並且根據ΔΔG(kcal mol-1)將最終預測的能量與參考、野生型結構相比較。
53.改變β片層多聚體細胞因子對目標受體的選擇性的方法，該方法包括a)鑑定所述細胞因子中位於受體結合界面的胺基酸作為突變候選；b)排除與所述細胞因子蛋白質結合的受體中保守胺基酸相互作用的殘基；c)排除與受體骨架相互作用的殘基；d)將所述細胞因子蛋白質中一個或多個胺基酸的每個替換為置換殘基，所述置換殘基包含預測與所述目標受體在結合界面配合的胺基酸側鏈構象，以便提供所述細胞因子蛋白質增加對該目標受體的結合親合性和選擇性/特異性。
54.β片層多聚體細胞因子，其序列已經用根據權利要求53的方法被改變，以便改變它對特定目標受體的親合性。
55.根據權利要求54的細胞因子，其在第131、269、130、160、218、220、149、155、214、195、191和267位的一個或多個位置被突變。
56.根據權利要求52或53，其是TNF配體家族的成員。
57.根據權利要求54的細胞因子，其是TRAIL。
58.根據權利要求57的細胞因子，其對DR5(TRAIL-R2)或DR4(TRAIL-R1)具有超過誘餌受體DcR1(TRAIL-R3)和DcR2(TRAIL-R4)的優異選擇性。
59.根據權利要求57的細胞因子，其對死亡受體5(TRAIL-R2)具有超過對死亡受體4(TRAIL-R1)選擇性的優異選擇性。
60.根據權利要求58的細胞因子，其包含突變G131R、D269H、D269K、D269R、R130E、G160K、D218R、G160M、D218Y、D218E、D218K、D218H、I220M、I220H、R149D、R149H、D218F、E155M、T214R、E195R、R191E和D267R的一個或多個。
61.根據權利要求60的細胞因子，其包含突變G160M或D269H。
62.獲得β片層多聚體細胞因子的變體的方法，所述變體具有增強的穩定性和對目標受體增加的結合親合性和選擇性/特異性，包括下列步驟a)突變所述多聚體細胞因子蛋白質的單體組分中的殘基，以便相對於野生型未突變的單體組分改善所述單體或所述多聚體複合物的自由能，其中所述突變殘基在該細胞因子家族的同源性成員之間是非保守的，和b)鑑定所述細胞因子中位於受體結合界面的胺基酸作為突變候選，排除與所述細胞因子蛋白質結合的受體中保守胺基酸相互作用的殘基，排除與受體骨架相互作用的殘基，和將所述細胞因子蛋白質中一個或多個胺基酸的每個替換為置換殘基，所述置換殘基包含預測與所述目標受體在結合界面配合的胺基酸側鏈構象。
全文摘要
本發明涉及蛋白質尤其是細胞因子設計的新方法。這些方法可以穩定細胞因子，並修飾它們對各自受體的選擇性/特異性。本發明還涉及已經由本發明方法設計的各種修飾蛋白質。
文檔編號G06F19/22GK1926152SQ200480040734
公開日2007年3月7日 申請日期2004年12月6日 優先權日2003年12月5日
發明者維森特·R·圖爾, 阿伯特·馬蒂納斯·萬·德·斯洛特, 瑪格麗塔·M·馬拉利, 羅伯特·H·庫爾, 埃瓦·E·塞蓋茲迪, 阿夫申·薩馬利, 格雷戈裡奧·費爾南德斯－巴列斯特, 路易斯·塞拉諾, 威廉默斯·J·夸克斯 申請人:格羅寧根大學, 歐洲分子生物學實驗室, 愛爾蘭國立大學