一種快速高效篩選l-精氨酸高產菌株的方法

2023-09-19 20:53:45 1

專利名稱：一種快速高效篩選l-精氨酸高產菌株的方法
技術領域：
本發明涉及一種基於L-精氨酸缺陷型菌株，快速高效篩選L-精氨酸高產菌株的方法，屬於工業微生物育種技術領域。
背景技術：
L-精氨酸是人體和動物體內的半必需鹼性胺基酸，是合成蛋白質肌酸的重要原料，也是生物體尿素循環的一種重要中間代謝產物，因此在醫藥和食品工業中具有廣泛用途。發酵法生產L-精氨酸是目前商業化生產比較有效和經濟的方法，而優良的L-精氨酸高產菌株是發酵生產L-精氨酸的關鍵。目前L-精氨酸高產菌株的選育主要是通過傳統的誘變育種和現代基因工程育種獲得，其中基因工程育種因其目的性強，工作量小而倍受研究者們青睞，而誘變育種獲得的菌種生產性能往往較穩定，因此仍在生產實踐中廣泛運用。生產實踐中還發現，產L-精氨酸菌種在保存傳代過程中，生產性能會逐漸衰退，產酸和轉化率會不斷下降，因此必須定期進行復壯，即從衰退的菌株中，通過分離、純化篩選出未衰退的菌株，這樣才能保持菌株的高產性能，不斷滿足生產需要。無論是用傳統誘變、用現代基因工程手段對現有L-精氨酸高產菌株的改造，還是高產菌株的復壯，都需要從眾多的單菌株中挑選出高產菌株。所以，高產L-精氨酸菌株的選育工作在L-精氨酸的發酵生產中必不可少。傳統的L-精氨酸高產菌株的篩選主要是通過篩選抗L-精氨酸結構類似物菌株，抗結構類似物抗性強的菌株其產量相應就會較高。但是，由於L-精氨酸的結構類似物種類較多且價格昂貴，因此使得篩選工作強度大、效率低且成本較高。本發明從另一角度出發，建立了一種快速高效篩選L-精氨酸高產菌株的平板顯色法。微生物中從L-穀氨酸合成L-精氨酸有3條途徑線性途徑、循環途徑及新發現的利用氨甲醯基轉移酶進行L-精氨酸生物合成的新途徑，大腸桿菌及古細菌主要以線性途徑合成L-精氨酸，而釀酒酵母、穀氨酸棒桿菌、假單胞菌等微生物則以循環途徑合成L-精氨酸，圖1。大腸桿菌中，L-精氨酸合成途徑中的N-乙醯穀氨酸激酶argB恰好位於精氨酸琥珀酸酶argH的上遊，本發明通過敲除argH基因獲得L-精氨酸缺陷型大腸桿菌，以 E. coli BL21基因組DNA為模板PCR獲得argBH基因片段，在argH內部插入卡那黴素抗性基因(Kan)，實現對argH的敲除從而獲得該酶缺失的L-精氨酸缺陷型大腸桿菌。將L-精氨酸缺陷型菌株作為L-精氨酸分泌的指示菌通過交互共養法以TTC為顯色劑實現鈍齒棒桿菌胞外精氨酸濃度高低的定性篩選，在平板上初篩出合成L-精氨酸能力高或分泌性能較優型菌株，進而再通過搖瓶發酵復篩，該方法大大提高了菌種選育中的篩選效率而且節約了成本。因此，本發明對篩選高產L-精氨酸菌株有著積極的作用。

發明內容
本發明的目的是提供一種基於大腸桿菌L-精氨酸缺陷型菌株，快速高效篩選 L-精氨酸高產菌株的方法。
本發明的技術方案首先構建大腸桿菌BL21L-精氨酸缺陷型菌株，應用該菌株平板顯色法篩選L-精氨酸高產菌株。大腸桿菌BL21L-精氨酸缺陷型菌株構建方法如下(l)argBH 的擴增以 E.coli BL21 基因組 DNA 為樽板，用引物P15』-CGCGAATTCATG AATCCATTAATTATCAAACTGG-3，(EcoR I)、P25，CGCGTCGACTTACCCTAACCGAGC CTGC-3，(Sal I) 擴增argBH基因，擴增循環條件94°C預變性5min，94°C變性40s，56°C退火90s，72°C延伸 90s, 35個循環。(2)質粒pMD-18T-argBH: :Kan的構建PCR獲得的argBH基因片段電泳膠回收後與pMD-18T載體16°C過夜連接，轉化E. coli JM109,挑取陽性轉化子並驗證獲得E. coli JM109 (pMD-18T-argBH)。將T-Kan用EcoRV酶切後膠回收其中大小約為1. 4kb的包含Kan 抗性基因的片段，並將其與同樣用EcoRV酶切後的T-argBH進行連接(EcoRV位點位於argH 內部)，轉化E. coli JM109，挑取陽性轉化子並驗證獲得E. coli JM109 (T-argBH: :Kan)。(3)Ε. coliBL21精氨酸缺陷型菌株的獲得將質粒T-argBH: :Kan以EcoRI、XhoI 酶切，膠回收得到argBH: :Kan片段。熱擊轉化E.coli BL21，卡那黴素抗性平板上篩選陽性轉化子。將得到的陽性轉化予分別點種於基本培養基(MM)平板和補充培養基(SM)平板對比培養，在匪平板上無法生長，在添加了 L-精氨酸的SM平板上正常生長的初步認為是 L-精氨酸缺陷菌株。提取轉化子的染色體DNA，用argBH基因的引物擴增argBH: :Kan，驗證陽性轉化子。由此獲得E.coli BL21L-精氨酸缺陷型菌株。快速篩選高產L-精氨酸菌株平板顯色法的建立所述的快速篩選平板顯色法用到的基本培養基(g/L):葡萄糖10，(NH4)2S043, KH2PO4I, MgSO4 · 7H20 0. 5，FeSO4 · 7H20 0. 02，MnSO4 · H2O 0. 02，瓊脂 20，生物素 8 X 10_5，硫胺素 2X1(T4，L-組氨酸 5X1(T4。pH 7. O 7. 2，1 X IO5Pa 滅菌 20min。所述的快速篩選平板顯色法用到的補充培養基(g/L)基本培養基中以20mg/L添加 L-精氨酸，pH 7. O 7. 2，1 X IO5Pa 滅菌 20min。所述的快速篩選平板顯色法用到的篩選培養基基本培養基中以IO5個/mL細胞濃度混入E. coli BL21L-精氨酸缺陷型菌株。所述的快速篩選平板顯色法是在基本培養基中以IO5個/mL細胞濃度混入E. coli BL21L-精氨酸缺陷型菌株製成篩選平板，將本實驗室保藏L-精氨酸產量不等的4株鈍齒棒桿菌以相同量點種至篩選平板，30°C培養5-7d，於超淨工作檯均勻噴灑無菌lyg/mL TTC 溶液(膜過濾除菌)，37°C放置l_2h，觀察平板上顯色情況。快速篩選高產L-精氨酸菌株平板顯色法的應用基本培養基中以IO5個/mL細胞濃度混入E. coli BL21L-精氨酸缺陷型菌株製成篩選平板，將待篩選的菌株製成一定濃度的菌懸液，10倍系列稀釋塗布於該平板上，30°C培養5-7d，於超淨工作檯均勻噴灑無菌1 μ g/mL TTC溶液(膜過濾除菌)，37°C放置l_2h，觀察平板上顯色情況。本發明的有益效果傳統的L-精氨酸高產菌株的篩選方法是篩選抗L-精氨酸結構類似物菌株，本發明根據高產L-精氨酸菌株特點，利用L-精氨酸缺陷型菌株與L-精氨酸生產菌株之間的交互供養，以TTC為顯色劑，間接直觀、快速篩選出L-精氨酸高產菌株， 大大提高了篩選工作效率並且節約了成本。


圖 1 質粒 pMD-18T_argBH: :Kan 的構建圖2微生物L-精氨酸的合成途徑圖 3a argBH 基因的擴增 1 XDNA/Hindlll ；2 :argBH gene. 3b T-EcargBH :Kan 酶切驗 iiE 1. DL2000 ；2. T-EcargBH: Kan/EcoRI+Sal I ；3. T-EcargBH/EcoRV ； 4. T-EcargBH: :Kan/EcoRV ；5. T-EcargBH: :Kan/EcoRI ；6. λ DNA/HindIII圖4argBH基因敲除轉化子的PCR鑑定1 5 argBH PCR of 1 5transformants6 7 :kan PCRof 1 2transformants ；8 λ HindIII Marker圖5L-精氨酸產量不等的4株鈍齒棒桿菌缺陷型菌株平板顯色法結果
具體實施例方式實施例1 卡那黴素抗性基因(Kan)插入大腸桿菌BL21L-精氨酸合成途徑中精氨酸琥珀酸酶基因內部實現敲除目的獲得缺陷型菌株argBH的擴增及質粒pMD_18T_argBH: :Kan的構建根據GeneBank中公布的argBH 序列設計 PCR 獲得 argBH 的引物 P15，-CGCGAATTCATGAATCCATTAATTATCAAACTGG-3> (EcoR I)P25' CGCGTCGAC TTACCCTAACCGAGCCTGC-3，(Sal I)。以 Ε· coli BL21 基因組 DNA 為模板，用引物Pl、P2擴增argBH基因，擴增循環條件94°C預變性5min，94°C變性40s, 56°C 退火90s，72°C延伸90s，35個循環，擴增產物通過0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖3a所示，可以看出在2. 2kb處有一明亮的帶，這與argBH基因預期大小一致。PCR獲得的argBH 基因片段電泳膠回收後與PMD-18T載體16°C過夜連接，轉化E. coli JM109，得到E. coli JM109 (pMD-18T-argBH)。重組質粒 pMD_18T_argBH 用 EcoRV 酶切，線性化後膠回收 4. 7kb 的T-argBH片段，將T-Kan用EcoRV酶切後膠回收其中大小約為1. 4kb的包含Kan抗性基因的片段，並將其與同樣用EcoRV酶切後的T-argBH進行連接，得到T-argBH: :Kan，酶切驗證結果見圖北，可以看到，第三泳道質粒T-EcargBH以EcoRV酶切釋放4. 7kb大小的片段， 表明T-EcargBH構建成功，第二泳道質粒T-EcargBH: :Kan以EcoRI、Sail雙切釋放3. 4kb 和2. 7kb大小的片段，第四泳道T-EcargBH: :Kan以EcoRV酶切釋放4. 7kb和1. 4kb大小的片段，表明T-EcargBH: :Kan構建成功。E. coli BL21精氨酸缺陷型菌株的獲得將質粒T-argBH:: Kan以EcoRI、BioI酶切，膠回收得到argBH: :Kan片段。熱擊轉化E.coli BL21，卡那黴素抗性平板上篩選陽性轉化子。將得到的陽性轉化予分別點種於基本培養基(MM)平板和補充培養基(SM)平板對比培養，在MM平板上無法生長，在添加了 L-精氨酸的SM平板上正常生長的初步認為是 L-精氨酸缺陷菌株。提取轉化子的染色體DNA，用argBH基因的引物擴增argBH: :Kan，驗證陽性轉化子，驗證結果如圖4所示陽性轉化子的原argBH基因被含有Kan片段長度大約為 3. 4kb的argBH: Kan替換，而原始對照菌株argBH基因長度約2. 21Λ，兩者相差約1. 21Λ。說明陽性轉化子已經成功的用argBH: :Kan片段替換了原argBH基因，達到了對argH基因敲除的目的。實施例2 利用L-精氨酸缺陷型大腸桿菌，以TTC為顯色劑，快速篩選高產L-精氨酸菌株平板顯色法的建立基本培養基中以IO5個/mL細胞濃度混入E. coli BL21L-精氨酸缺陷型菌株製成篩選平板，將本實驗室保藏L-精氨酸產量不等的4株鈍齒棒桿菌以相同量點種至篩選平板，30°C培養5-7d，於超淨工作檯均勻噴灑無菌lyg/mL TTC溶液(膜過濾除菌)，37°C放置l_2h，觀察平板上顯色情況。如圖5所示，實驗結果表明紅色圈大小與菌株L-精氨酸產量呈正比，表明此方法用於篩選高產L-精氨酸突變株有效可行。實施例3 快速篩選高產L-精氨酸菌株平板顯色法的應用基本培養基中以IO5個/mL細胞濃度混入E. coli BL21L-精氨酸缺陷型菌株製成篩選平板，將待篩選的菌株製成一定濃度的菌懸液，10倍系列稀釋塗布於該平板上，30°C培養5-7d，於超淨工作檯均勻噴灑無菌1 μ g/mL TTC溶液(膜過濾除菌)，37°C放置l_2h，觀察菌株生長情況。
權利要求
1.一種快速高效篩選L-精氨酸高產菌株的方法，其特徵在於構建一株大腸桿菌 BL21L-精氨酸缺陷型菌株將其作為L-精氨酸分泌的指示菌，指示L-精氨酸生產菌株胞外L-精氨酸多少，初篩出L-精氨酸高產菌株。
2.權利要求1所述的大腸桿菌BL21L-精氨酸缺陷型菌株構建方法如下在大腸桿菌中，L-精氨酸合成途徑中的N-乙醯穀氨酸激酶argB恰好位於精氨酸琥珀酸酶argH的上遊，以下簡稱argBH。以E.coli BL21基因組DNA為模板擴增argBH基因，在 argH內部插入卡那黴素抗性基因(Kan)，實現對argH的敲除從而獲得該酶缺失的L-精氨酸缺陷型大腸桿菌。
3.權利要求1所述的快速篩選高產L-精氨酸菌株平板顯色法的建立方法如下 將權利要求1所述的L-精氨酸缺陷型菌株作為L-精氨酸分泌的指示菌通過交互共養法以活細胞指示劑TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)為顯色劑實現鈍齒棒桿菌胞外精氨酸濃度高低的定性篩選，在平板上篩選出合成L-精氨酸能力高或分泌性能較優型菌株。
全文摘要
本發明公開了一種快速高效篩選L-精氨酸高產菌株的方法，屬於工業微生物育種技術領域。傳統的L-精氨酸高產菌株的篩選方法是通過篩選抗L-精氨酸結構類似物的菌株。本發明構建了一株大腸桿菌L-精氨酸缺陷型菌株作為L-精氨酸分泌的指示菌，TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)是一種活細胞指示劑，它能被活細胞產生的還原氫還原成紅色。將上述L-精氨酸缺陷型菌株作為L-精氨酸分泌的指示菌通過交互共養法以TTC為顯色劑實現L-精氨酸生產菌株胞外L-精氨酸濃度高低的定性篩選，在平板上初篩出合成L-精氨酸能力高或分泌性能較優型菌株，該方法大大提高了菌種選育中的篩選效率而且節約了成本。
文檔編號C12N15/70GK102367468SQ20111028981
公開日2012年3月7日 申請日期2011年9月28日 優先權日2011年9月28日
發明者徐美娟, 楊娟, 竇文芳, 許正宏, 饒志明 申請人:江南大學