犬胸腺基質淋巴細胞生成素蛋白及其應用的製作方法

2023-09-19 21:48:50 3

專利名稱：犬胸腺基質淋巴細胞生成素蛋白及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及犬胸腺基質淋巴細胞生成素蛋白(犬「TSLP」)、編碼犬TSLP的核酸分子、載體和宿主細胞，以及製備和使用犬TSLP的方法。
背景技術：
患有反應素介導的疾病,例如特應性疾病的動物,包括人,具有產生涉及免疫球蛋白E(IgE)抗體的速發變態反應的遺傳傾向。由此得到的這些動物的這種表型的表達是由多個遺傳因子促成的。特應性疾病的速發過敏性是由於暴露於特定的過敏原，例如室內塵蟎(Dermatophagoides pteronyssinus)、花粉、黴菌、以及毛屑。不出人意料的是，患有特應性疾病的個體更容易患哮喘、遺傳過敏性皮炎、以及與內部IgE釋放有關的其它疾病。特應性疾病如過敏性皮炎、哮喘等等，也發生於犬類，包括家犬。這些犬一般在I 到3歲之間開始出現特異反應性的徵兆。儘管我們知道其它種類的犬，包括雜交品種，也會出現特異反應性，但由於該病的遺傳特性，許多品種，包括金毛獵犬、許多小獵犬、愛爾蘭長毛獵犬、拉薩獅子犬、斑點犬、鬥牛犬、以及英國古老牧養犬，有更大的傾向出現特異反應性。至少一種特定類型的特異反應性，即遺傳過敏性皮炎的發病率在人和犬中都顯著提高。特異反應性犬通常會摩擦、舔、啃、咬、或抓自己的腳、鼻口部、耳朵、腋窩或腹股溝區域，導致毛髮脫落、皮膚變紅、增厚。在某些情況下，多種皮膚病共同作用導致動物發癢， 而單獨一種過敏症不會導致如此之癢。這些惡化的問題可能是由於空氣傳播的過敏原(花粉等)、食物中的過敏原、以及來自寄生蟲(跳蚤等)的過敏原。皮膚的細菌和/或真菌感染也能加重癢的感覺。一種減輕特異反應性的惱人症狀的簡單方法是避免刺激性的過敏原。遺憾的是， 這種避免通常是不現實的。迄今為止，獸醫師已經通過下列方法治療了犬遺傳過敏性皮炎 口服抗組胺藥、口服或外用皮質類固醇消炎劑、其它免疫系統抑制劑如環孢黴素或他克莫司(tacrolimus)、脂肪酸增補劑、以及過敏原特異性免疫療法(需要注射確定的抗原)。然而，上述療法沒有一種能適用全部病例。此外，這些療法花費昂貴和/或產生顯著的副作用。因此，長期以來需要更安全、更有效、並且更經濟的方法來治療或抑制犬遺傳過敏性皮炎的症狀。哺乳動物的免疫應答基於一系列複雜的細胞相互作用，稱為「免疫網絡」。大多數免疫應答涉及淋巴細胞、巨噬細胞、粒細胞、以及其它細胞的網絡狀相互作用，其中被稱為細胞因子的可溶性蛋白在介導/控制/調節這些細胞相互作用中起關鍵作用。因此，細胞因子和免疫細胞介導導致各種炎症的特定生理機制或通路。過敏性炎症是由於複雜的免疫級聯造成的，其導致T細胞產生源於失調的2型T 輔助淋巴細胞(TH2)的細胞因子，例如白細胞介素4(IL-4)、白細胞介素5 (IL-5)、以及白細胞介素13(IL-13)。這些細胞因子依次觸發了支氣管過度反應、IgE生成、嗜酸性粒細胞增多、以及黏液的產生。(參見 Busse and Lemanske, Tr. (2001) N. Enggl. T. Med. 344 350-62 ；Holgate(2000)Br. Med. J. 320 :231-234 ；以及 Renauld(2001)J. Clin. Pathol. M 577-589)。胸腺基質淋巴細胞生成素蛋白(TSLP)是一種類似白細胞介素7(IL_7)的細胞因子，其最初在小鼠中被鑑定為一種因子支持(i)膜表面具有免疫球蛋白M(IgM)的B細胞的體外發育，(ii)B細胞與T細胞的增殖(Friend等人，1994,Exp Hematology 22 :321-328, Levin等人，1999，J. Immunol 162 =677-683) 現在已知TSLP結合於一種細胞受體，其包含IL-7R-a亞單位和一種稱為TSLP-R的獨有受體亞單位。這種相互作用可在造血細胞， 例如骨髓譜系細胞如單核細胞，或樹突細胞中觸發信號傳導，其經由轉錄活化因子(STAT) 的激活或胸腺和激活可調節趨化因子(TARC)的表達來實現(參見例如共有的美國專利第 6，890，734號，合併到本文中作為參考)。TSLP在小鼠的過敏性疾病如遺傳過敏性皮炎和哮喘的發病機理中也可能起重要作用。舉例來說，在皮膚中特別誘導TSLP基因表達的轉基因小鼠表現出遺傳過敏性皮炎的免疫學和臨床特徵，例如溼疹性損傷，其包括炎性皮膚細胞浸潤、表達皮膚歸巢受體的Th2 ⑶4+T細胞顯著增多、以及IgE血清水平的升高。此外，表達肺特異性TSLP基因的小鼠的肺部表現出哮喘的免疫學和臨床特徵，其包括大量白細胞浸潤、杯狀細胞增生、上皮下纖維化、2型T輔助細胞因子的增多，以及IgE水平的升高。Sims等用表達克隆得到了鼠TSLP的cDNA序列，但是用基於鼠TSLP的雜交探針不能複製人的同源體(Sims等人，2000，J exp Med, 192 =671-680) 0其後，通過詳細的表達序列標籤(EST)分析，人的同源體被鑑定出來。已發現人TSLP的核苷酸序列與對應的小鼠序列只有43%的同源性。因此，需要提供新的且更實用的方法來治療犬特應性疾病，包括遺傳過敏性皮炎及其相關臨床表現。此外，需要分離出導致犬特應性疾病的免疫級聯所涉及的因子，其可能引發上述療法的發展。本文對任何參考文獻的引用不應解釋為承認該參考文獻可作為本申請的「現有技術」。
發明概要本發明提供了新的且更實用的方法來治療犬特應性疾病，包括遺傳過敏性皮炎及其相關臨床表現。相應地，本發明提供了新的分離的和/或重組的胸腺基質淋巴細胞生成素蛋白(TSLP)，其涉及導致特應性疾病的免疫級聯。本發明進一步提供了這些TSLP蛋白的抗原片段。在本發明的某一具體方面，TSLP蛋白為一種犬TSLP蛋白。因此本發明提供了一種TSLP蛋白，其包含一段胺基酸序列，該序列與SEQ ID NO 2的胺基酸序列有80%或更高的同一性，且不包括其28個胺基酸殘基的信號序列，當該蛋白作為疫苗施用於實驗犬時，從接種疫苗的實驗犬取樣的犬血清中可檢測到抗體，該抗體與包含SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的犬TSLP蛋白結合。在一相關實施方式中，所述TSLP 蛋白包含一段胺基酸序列，該序列與SEQ ID NO 2的胺基酸序列有80%或更高的同一性， 且不包括其28個胺基酸殘基的信號序列；並且可與包含SEQ ID NO 2中胺基酸的犬TSLP 的抗體交叉反應。本發明進一步提供了一種TSLP蛋白，其包含一段胺基酸序列，該序列與SEQ ID NO 2的胺基酸序列有80%或更高的同一性(不包括其28個胺基酸殘基的信號序列)，該蛋白與一種表位特異性的犬TSLP單克隆抗體結合。在一更具體的實施方式中，TSLP蛋白包含一段胺基酸序列，該序列與SEQ ID NO 2的胺基酸序列有90%或更高的同一性，不包括其28個胺基酸殘基的信號序列。在另一實施方式中，TSLP蛋白包含一段胺基酸序列，該序列與SEQ ID NO :2的胺基酸序列有95%或更高的同一性，不包括其28個胺基酸殘基的信號序列。在本發明的一特定實施方式中，TSLP蛋白為犬TSLP蛋白，其包含SEQ ID NO :2的胺基酸序列。在另一實施方式中，TSLP蛋白為成年犬TSLP蛋白，其包含SEQ ID NO :2中的胺基酸殘基29-155。本文還提供了本發明的TSLP蛋白的抗原片段。這些抗原片段包括含一個或多個表位的那些片段，所述表位分別由胺基酸序列SEQ ID NOs :8-101定義。在一種具體的實施方式中，本發明的一種抗原片段包含一個或多個表位，其包含一段胺基酸序列，該序列來自SEQ ID NOs :30、31、32和/或34。在另一實施方式中，抗原片段可有一段胺基酸序列，該序列包含在胺基酸序列SEQ ID勵8:30、31、32、和/或34的重疊區內，即 NPPDCLARIERLTLHRIRGCAS(SEQ ID NO :118)。在一種具體的實施方式中，犬TSLP蛋白的一種抗原片段能夠與抗人TSLP的單克隆抗體結合。胺基酸序列NProCLARIERLTLHRIRGCAS(SEQ ID NO 118)的抗原片段的大小在約5個到約21個胺基酸殘基之間。本文還提供了疫苗，這些疫苗可包含有效量的下列各項本發明的任何TSLP蛋白、其一種或多種抗原片段、或者上述全長蛋白與一種或多種上述片段的組合。在一實施方式中，TSLP蛋白為一種犬TSLP蛋白，其包含SEQ ID NO: 2的胺基酸序列。在一具體的實施方式中，一種疫苗包含犬TSLP蛋白的一種或多種抗原片段，該蛋白包含SEQ ID N0:2的胺基酸殘基71-92(本文鑑定為SEQ ID NO :118)中第5到22位鄰接的胺基酸。在此公開了包括表位的上述抗原片段的實例，其包含SEQ ID NO 30,SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID N0:33、或SEQ ID NO :34的胺基酸序列。本發明的所有疫苗可進一步包含藥學上可接受的佐劑。本發明的疫苗可用於誘導抗犬TSLP抗體的方法。一種這樣的方法包括用有效量的疫苗免疫哺乳動物。該方法任選包括一種下調犬體內TSLP活性的方法,和/或一種治療或預防特異反應性犬的過敏症狀的方法，其包括用有效量的疫苗免疫犬。被改善的過敏症狀可包括過敏性皮炎、哮喘等等。本發明的疫苗可通過以下途徑施用肌肉注射、皮下注射、靜脈注射、皮內注射、口服、鼻腔給藥、劃痕法、以及上述方法的組合。本發明進一步提供了一種核酸分子，其編碼本發明的一種TSLP蛋白或者該蛋白的一種抗原片段。在一這樣的實施方式中，所述核酸分子編碼SEQ ID NO :2的胺基酸序列。 在一具體的此類實施方式中，所述核酸分子包含SEQ ID NO :1的核苷酸序列。SEQ ID NO:I的核苷酸序列的下列片段也是本發明的一部分約18個連續核苷酸的片段、約24個連續核苷酸的片段、約36個連續核苷酸的片段、約45個連續核苷酸的片段、約66個連續核苷酸的片段、或更大的片段。本發明了還提供了下列核酸約18個核苷酸、約24個核苷酸、約 36個核苷酸、約45個核苷酸、約66個核苷酸、或更大的核酸,包括編碼全長TSLP蛋白的核酸，其在嚴格的雜交條件下與SEQ ID N0:1雜交。本發明的所有核酸分子及其片段可進一步包含異源核苷酸序列。本發明還提供表達載體，其包括前面所述的核酸分子和/或其片段。另外，本發明提供包含這種表達載體的宿主細胞。宿主細胞可任選為原核或真核宿主細胞。在一實施方式中，原核宿主細胞為大腸桿菌。在一具體的此類實施方式中，所述宿主細胞為包含T7 RNA聚合酶基因的E. coli BL21(DE3)/pLysS，該基因受異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導的 lacUV5啟動子調控。本發明進一步提供重組病毒載體和/或裸DNA載體，其包含上述編碼犬TSLP的核酸分子中的一種，例如SEQ ID NO :1和/或該其片段。這些載體可用於，舉例來說，適合施用於患有遺傳過敏性皮炎的犬的疫苗。本發明還提供了生產本發明的TSLP蛋白的方法。這樣的方法包括在合適的培養基中培養本發明的宿主細胞。該方法可進一步包括從培養的宿主細胞或培養基中分離和/ 或提純TSLP蛋白的步驟。分離和/或提純所得到的蛋白也是本發明的一部分。由本發明的疫苗在雜交瘤體系中誘導產生的抗TSLP抗體也是本發明的一部分。 在一此類實施方式中應用哺乳動物雜交瘤體系。在一具體的實施方式中，抗體被分離和/ 或提純。所述抗體可以是多克隆或單克隆的。根據本發明，在非犬物種中誘導產生的單克隆抗體可任選進行犬源化改造，從而在給實驗犬注射時儘量降低抗原性。在某些優選實施方式中，本發明的任何抗體的結合區可任選轉換為(例如通過裂解)比原抗體小的結合片段，和/或成為一種重組Fv、Fab、以及F(ab' )2結合蛋白。本發明還包括源於抗體的治療用蛋白，其包含天然重鏈抗體(例如NANOBODIES )所獨有的結構和功能特性。另外，本發明還包括具有TSLP高親和性和低免疫原性的抗體替代物(例如從TSLP受體的結合區製備的高親合性多聚體)。這些新的抗犬TSLP抗體及高親合性多聚體可方便地用於治療特異反應性犬的過敏症狀的方法，該方法通過施用有效量的抗犬TSLP抗體進行治療。本發明還提供疫苗，其包含有效量的非TSLP免疫原，該免疫原與有效量的下列各項組合本發明的TSLP蛋白、該蛋白的一個或多個抗原片段、或者全長蛋白與一個或多個上述片段的組合。在一具體的此類實施方式中，TSLP蛋白為一種犬TSLP蛋白。在一更具體的實施方式中，犬TSLP蛋白包含SEQ ID NO :2的胺基酸序列。本發明另外提供診斷方法，這些方法應用新的犬TSLP蛋白、該蛋白的片段、和/或犬TSLP及其片段誘導產生的抗體。在一實施方式中，本發明提供診斷犬遺傳過敏性皮炎的方法，其包括犬表皮樣品的取樣，以及在表皮樣品中檢測犬TSLP蛋白的存在。通過參考以下附圖
和詳述部分，可以更好地了解本發明的上述方面和其它方面。附圖簡述圖I所示為十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，所分析蛋白來源於表達犬TSLP蛋白的無真核細胞的蛋白合成系統。第I道蛋白分子量標準；第2道 全蛋白；第3道可溶性蛋白；第4道不可溶蛋白。TSLP蛋白條帶以箭頭標示。
圖2A所示為蛋白質印跡(Western blot)分析,所分析蛋白來源於表達犬TSLP蛋白的無真核細胞的蛋白合成系統。該蛋白與購自Invitrogen公司的Anti-His (C Term)/AP Ab反應。第I道蛋白質分子量標準；第2道全蛋白；第3道可溶性蛋白；第4道不可溶蛋白。犬TSLP蛋白在全蛋白和不可溶蛋白中檢出(如fif頭所不)。圖2B所示為蛋白質印跡(Western blot)分析,所分析蛋白來源於表達犬TSLP蛋白的無真核細胞的蛋白合成系統。該蛋白與人TSLP特異性的大鼠單克隆抗體反應。第I 道蛋白質分子量標準；第2道全蛋白；第3道可溶性蛋白；第4道不可溶蛋白。犬TSLP 蛋白在全蛋白和不可溶蛋白中檢出(如fii頭所不)。圖3A所示為來源於大腸桿菌(E. coli)宿主細胞的TSLP的表達與純化，並且顯示了存在於可溶性E. coli餾分的一個61kd條帶，這表示犬TSLP與穀胱甘肽S轉移酶(GST) 融合蛋白以及一個6組氨酸標籤的融合。「M」表示蛋白質分子量標準(在圖3A-3D中相同)。第I道和第2道為包含質粒1265-93B的E. coli B121 (DE3)pLysS的可溶性餾分，分別沒有進行和進行了 IPTG誘導。箭頭標示了 GST-TSLP-His融合蛋白條帶(在圖3A-3D中相同)。圖3B顯示GST-TSLP-His標籤融合蛋白可用穀胱甘肽瓊脂糖4B樹脂純化。第I 到3道表示穀胱甘肽瓊脂糖4B樹脂的不同洗脫餾分。圖3C顯示B道的融合蛋白可用鎳-次氨基三乙酸(Ni-NTA)樹脂進一步純化。本圖所示為穀胱甘肽瓊脂糖4B樹脂純化後的GST-TSLP-His融合蛋白用Ni-NTA樹脂的再次純化。第I道為流穿液，第2道為Ni-NTA樹脂的洗脫液。圖3D所示為GST-TSLP-His融合蛋白的蛋白質印跡(Western blot),證實了該融合蛋白可被一種抗GST抗體(GE Health Care公司商品編號27457701)識別。圖4所示為損傷皮膚組織的石蠟包埋塊切片的異硫氰酸螢光素(FITC)染色，樣品取自被診斷為遺傳過敏性皮炎的10197號犬。所述切片與兔抗人TSLP多克隆抗體反應，該反應用鏈黴親和素-FITC(異硫氰酸螢光素)顯影。螢光強度(照亮區)顯示組織中出現兔抗人TSLP多克隆抗體與TSLP的結合。圖5A所示為損傷皮膚組織的石蠟包埋塊切片的免疫過氧化物酶染色，樣品取自一隻被診斷為遺傳過敏性皮炎的犬。在此切片中，皮膚標本的表皮層有一大鼠抗人TSLP單克隆抗體導致的瀰漫染色(暗區)。圖5B所示為一對照切片。該切片來源於損傷皮膚組織的石蠟包埋塊，樣品取自一隻被診斷為遺傳過敏性皮炎的犬，只用磷酸緩衝液對照處理過。圖6所示為犬TSLP蛋白與大鼠抗人TSLP單克隆抗體的表位圖。需特別注意的峰來自第22-26號表位(SEQ ID NOs 29-33)。表位22-26還進行了 N端修飾(55號及以上各峰)，以證實結合表位不需要N端胺基酸殘基。圖7所示為犬TSLP表位25 (SEQ ID NO 32)與人的同源體(SEQ ID NO 3)的多肽序列比較。圖8A所示為犬TSLP基因的DNA序列(SEQ ID NO : I)。圖8B所示為預測的由圖8A所示DNA序列表達的TSLP多肽(SEQ ID NO :2)。星號標註了起始信號序列(胺基酸殘基1-28)的N末端，下劃線標註的胺基酸殘基71-92 (SEQ ID NO 118)表示一個域，從該域中確定了表2中相互重疊的表位22-26。
發明詳述遺傳過敏性皮炎(「AD」)是一種Th2介導的過敏性炎性疾病。該病在病人和病犬中顯示出很多類似的臨床特徵。考慮到涉及皮膚損傷的細胞類型和細胞因子，犬AD的免疫發病機理很可能與人AD類似。TARC配體(CCL22)與Th2淋巴細胞上選擇性表達的CC趨化因子受體4 (CCR4)的結合可誘導這些細胞向過敏性損傷選擇性遷移。已有報導TARC及其受體CCR4在犬AD皮膚損傷中上調。既然TSLP是人TARC的強力誘導劑，我們假設TSLP可能在犬AD損傷中存在。 因此在AD病犬的損傷皮膚上測試了抗人TSLP抗體。如圖4所示，這些皮膚樣品的免疫組織化學證實了損傷中存在與抗人TSLP抗體反應的抗原。然而，鼠和人TSLP基因的犬直向同源基因的鑑定工作特別困難，其原因如本文所公開的，在於哺乳動物中各物種的TSLP的核酸及胺基酸序列有高度差異。用本發明的一種TSLP和/或其一種或多種抗原片段免疫家犬,可降低內源TSLP 的活性水平，並因此減輕、消除、和/或預防被免疫犬的一種或多種特應性症狀，例如哮喘和/或遺傳過敏性皮炎出現的症狀。另外，犬TSLP蛋白可用作誘發抗犬TSLP抗體的抗原， 這些抗體可用作家犬或其它哺乳動物的研究和/或診斷試劑。或者，在特定情況下，犬TSLP 蛋白和/或編碼犬TSLP的核酸可上調免疫損傷犬的免疫系統因子，例如通過造血細胞中 STAT的活化或TARC的表達。為了更全面地了解本發明，提供以下定義。為描述方便而使用的單數術語絕非有意如此限制。因此，舉例來說，提及一種組合物包含「一種多肽」，包括提及一種或多種這樣的多肽。本文中使用的術語「大概」可與術語 「大約」互換使用，表示數值與所述數值相差百分之二十以內，即一種包含「大概」 50個胺基酸殘基的多肽可包含40到60個胺基酸殘基。術語「結合組合物」係指與犬TSLP特異性結合的分子，例如在抗體-抗原反應中。 特異性的內涵可大可小，例如僅限於一具體的實施方式、或限於相關的一組實施方式，例如犬TSLP和/或犬抗體。本文中使用的「犬」一詞包括所有家犬，拉丁名Canis lupus familiaris或Canis familiaris,除非另有說明。本文中使用的術語「多肽」可與術語「蛋白」和「肽」互換使用，係指包含2個或多個胺基酸由肽鍵連接而成的聚合體。本文中使用的「多肽」一詞包括一種重要的片段或部分，並包含一段延長的胺基酸殘基，其包含至少約8個胺基酸，通常至少約12個胺基酸，一般至少約16個胺基酸，優選至少約20個胺基酸，在特別優選的實施方式中，至少約30個胺基酸，例如35、40、45、50個等等。這種片段可在幾乎所有位置上有開始和/或結束的末端， 例如開始於胺基酸殘基1、2、3等等，結束於155、154、153等等，包括所有實用的組合。多肽可任選缺少由基因或mRNA編碼的某些胺基酸殘基。舉例來說，基因或mRNA 可編碼多肽N端的胺基酸殘基序列(即信號序列)，該序列被切除掉，因此不是最終蛋白的一部分。本文中如果一段胺基酸序列與另一段胺基酸序列完全相同，則這兩段胺基酸序列 100% 「同源」，和/或僅因下文定義的中性或保守替換而不同。因此，如果一段胺基酸序列與另一端胺基酸序列約80%相同，則這兩段胺基酸序列約80% 「同源」，和/或僅因中性或保守替換而不同。序列中的胺基酸殘基通常可被功能相同的胺基酸殘基替換，導致保守的胺基酸替換。這種改變定義了本文中使用的術語「保守替換」。舉例來說，序列中的一個或多個胺基酸殘基可被另一個具有同樣極性、相同功能的胺基酸替換，導致沉默改變。序列中胺基酸的替換者可選自該胺基酸所屬種類中的其它成員。舉例來說，非極性(疏水)胺基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、和甲硫氨酸。含有芳香環結構的胺基酸有苯丙氨酸、色氨酸、和酪氨酸。中性極性的胺基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬醯胺、和穀氨醯胺。帶正電荷(鹼性)的胺基酸包括精氨酸、賴氨酸、 和組氨酸。帶負電荷(酸性)的胺基酸包括天冬氨酸和穀氨酸。這種改變不會影響聚丙烯醯胺凝膠電泳測定的表觀分子量或者等電點。特別優選的保守替換有賴氨酸替換精氨酸及相反，如此可保留一個正電荷；穀氨酸替換天冬氨酸及相反，如此可保留一個負電荷；絲氨酸替換蘇氨酸，如此可保留一個自由羥基；以及穀氨醯胺替換天冬醯胺，如此可保留一個自由氨基。胺基酸也可分為下述類似組(1)脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、和蘇氨酸；(2)穀氨醯胺、天冬醯胺、穀氨酸、天冬氨酸；(3)組氨酸、賴氨酸、和精氨酸；(4)半胱氨酸；(5)纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸；以及(6)苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸。在一相關的實施方式中，兩種高度同源的DNA序列可通過其自身同源性或其所編碼胺基酸的同源性進行鑑定。這種序列比較可用序列資料庫的標準軟體進行。在一具體的實施方式中，兩種高度同源的DNA序列編碼的胺基酸序列有約80%的同一性，優選有約 90%的同一性，更優選有約95%的同一性。更具體地所，兩種高度同源的胺基酸序列有約 80 %的同一性，優選約90 %的同一性，更優選約95 %的同一性。如本文中使用的，確定蛋白和DNA序列的同一性百分比可使用軟體鑑定，例如 Accelrys 公司(Burlington, Massachusetts)出售的 MacVector v9,和 Clustal W 算法, 應用默認的排列參數和默認的同一性參數。參見Thompson,等人.1994. Nucleic Acids Res. 22 :4673_4680。用於Dos、Macintosh、和Unix平臺的Clustalff可從例如歐洲分子生物學實驗室(EMBLI)、歐洲生物信息學研究所免費下載。本下載連結位於http://www. ebi. ac. uk/clustalw/。這些和其它可用的程序還可以使用相同的或相似的默認參數來確定序列相似性。「多核苷酸」或「核酸分子」係指包含核苷酸的分子，其包括但不限於RNA、cDNA、基因組DNA、甚至人工DNA序列。包括任何本領域已知的DNA和RNA的鹼基類似物的核酸分子也可包含在上述術語中。本發明提供了可與編碼本發明的TSLP蛋白的核苷酸序列雜交的核酸。當在合適的溫度和溶液離子強度條件下，該核酸分子的單鏈形式可與另一核酸分子退火，一核酸分子「可雜交」於另一核酸分子，例如cDNA、基因組DNA、或RNA，[參見Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A laboratory Manual,第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor L. I. (2000)]。高度嚴格的雜交條件對應於最高的Tm，例如50%甲醯胺、5X或6X SSC0雜交需要包含互補序列的兩種核酸，雖然依賴於雜交的嚴格性，鹼基錯配仍然可能。合適的核酸雜交嚴格性依賴於核酸的長度和互補的程度，本領域熟知的變量。兩種核苷酸序列的相似度或同源性越高，包含這些序列的核酸的雜交體的Tm值越高。核酸雜交的相對穩定性(相當於較高的Tm)以下述順序遞減RNA RNA, DNA RNA, DNA :DNA。對於長度超過100個核苷酸的雜交體，已經得到計算 Tm 的公式(equations for calculating Tm have been derived strength)[參見 Sambrook and Russell,Molecular Cloning,A laboratory Manual,第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor L. I. (2000)]。對於較短核酸即寡核苷酸的雜交，錯配的位置更為重要，而寡核苷酸的長度決定了其特異性。可雜交的核酸的最小長度優選為至少約12個核苷酸；更優選至少約18個核苷酸； 甚至更優選長度為至少約24個核苷酸；最優選至少約36個核苷酸。在一特定的實施方式中，「標準雜交條件」 一詞係指Tm 55°C，並應用上述條件。在另一特定的實施方式中，嚴格的條件係指雜交和洗滌條件中分別為Tm 65°C。DNA 「編碼序列」或者某具體蛋白或多肽的「編碼序列」，係指在合適的調控因子控制下，可在體內或體外轉錄並翻譯生成多肽的DNA序列。編碼序列的範圍由位於5』端的起始密碼子和位於3』端的翻譯終止密碼子確定。 編碼序列可以包括但不限於原核序列、真核mRNA的cDNA、真核(例如哺乳動物)DNA的基因組DNA序列、甚至合成DNA序列。轉錄終止序列通常位於編碼序列的3』端。「可操作的連接」係指多因子的排列，其中各組分被配置以執行其正常功能。因此， 可操作地與編碼序列連接的調控因子能夠影響編碼序列的表達。調控因子並不需要與編碼序列相連續，只要它們起指示其表達的功能。因此，舉例來說，未翻譯的已轉錄序列可以存在於啟動子和編碼序列之間，此時啟動子仍可被認為與編碼序列「可操作地連接」。本文中使用的「異源核苷酸序列」係指一種核苷酸序列，其通過重組方法添加至本發明的核苷酸序列，從而形成非自然界天然形成的核酸。這種核酸可編碼融合(例如嵌合) 蛋白。因此異源核苷酸序列可編碼包含調控和/或結構特性的多肽和或/蛋白。在另一此類實施方式中，所述異源核苷酸序列可編碼蛋白或多肽，其可作為在重組核酸表達後可檢測本發明的核苷酸序列編碼的蛋白或多肽的工具。在另一實施方式中，所述異源核苷酸序列可作為檢測本發明的核苷酸序列的工具。異源核苷酸序列可包含非編碼序列，其包括限制性酶切位點、調控位點、啟動子等等。本文中使用的術語「融合蛋白」和「融合肽」可互換使用並包含下列各詞「嵌合蛋白和/或嵌合肽」、以及融合「內含肽蛋白/肽」。融合蛋白包含本發明的一種犬TSLP蛋白的至少一部分，其通過肽鍵與另一蛋白的至少一部分連接，例如非犬TSLP蛋白的至少一部分，和/或包含犬TSLP蛋白的兩個或多個非連續部分的組合，例如表位，其在犬TSLP多肽中並不天然地處於相鄰位置(例如，一種10個胺基酸殘基的融合肽，其包含由肽鍵連接的 SEQ ID NO :2的胺基酸殘基71-75和101-105)。在優選的實施方式中，犬TSLP蛋白的各部分是有功能的，例如保持抗原性。融合蛋白還可包含標記蛋白、或有助於本發明的犬TSLP 蛋白的分離和/或純化的蛋白(例如FLAG標籤，參見下述實施例)、和/或抗原性。非犬 TSLP序列可以氨基端或羧基端與犬TSLP序列連接。編碼本發明的融合蛋白的重組DNA分子，舉例來說，可包含編碼非犬TSLP蛋白的至少一部分的一段序列，其插入犬TSLP編碼序列中，並可進一步編碼特定的蛋白酶，例如凝血酶或Xa因子的酶切位點,該位點優選位於或接近於犬TSLP序列和非犬TSLP序列的結合部。在一特定的實施方式中，融合蛋白在原核細胞中表達。通過使用與犬TSLP融合的蛋白和/或標籤特異性的親和柱，這種融合蛋白可用於分離本發明的犬TSLP(參見下述實施例)。純化的犬TSLP，舉例來說，可通過使用蛋白水解酶或上述酶切位點從融合蛋白中釋放出來。「載體」或「複製載體」為一種複製子，例如質粒、病毒、噬菌體、或粘粒，另一 DNA片段可附加或整合其中，以進行附加片段的複製。所述術語還包括一種複製子，其包括所整合或附加的感興趣DNA片段。本發明中可使用的載體包括細菌質粒、病毒、噬菌體、可整合的DNA片段、以及其它可幫助核酸分子整合進宿主基因組的載體。質粒是最普遍使用的載體，但是所有其它具有同等功能的或本領域已知的載體都適用於本發明。[參見例如Pouwels等人，Cloning Vectors A Laboratory Manual, 1985 及其補充，Elsevier, N. Y.,以及 Rodriguez 等人 (eds. ), Vectors A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses,1988, Buttersworth, Boston, MA.]當DNA和載體末端都包含合適的限制性酶切位點時，編碼新的犬TSLP蛋白的DNA 可以容易地插入載體。如果不能做到，可能需要修飾DNA和/或載體的末端，方法為消化掉限制性內切酶裂解產生的單鏈DNA突出端以產生鈍末端，或者用合適的DNA聚合酶填補單鏈末端以達到同樣的結果。或者，例如通過在末端上連接核苷酸序列(連接子)來產生所需位點。這種連接子可包含特定的確定所需限制性酶切位點的寡核苷酸序列。限制性酶切位點還可通過聚合酶鏈反應(PCR)產生。參見，例如Saiki等人，Science 239 :487 (1988)。 如果需要，裂解過的載體和DNA片段也可用同聚物加尾修飾。本發明中使用的重組表達載體一般為自我複製的DNA或RNA結構，其包含編碼本發明的犬TSLP蛋白和/或其抗原片段的核酸，該核酸通常可操作地與合適的基因調控因子連接，這些因子能在合適的宿主細胞中調控核酸的表達。基因調控因子可包括原核啟動子系統或真核啟動子表達控制系統，一般包括轉錄啟動子、可選的控制轉錄開始的操縱子、提高mRNA表達水平的轉錄增強子、編碼合適的核糖體結合位點的序列、以及終止轉錄和翻譯的序列。表達載體還可包含複製起點，其允許載體獨立於宿主細胞進行複製。編碼新的犬TSLP蛋白的核酸表達可通過常規方法在原核或真核細胞中進行。「宿主細胞」係指臨時性或永久性包含或能夠包含、並表達外源核酸分子的細胞。 當這種外源DNA已被引入細胞膜內，則該細胞已被外源DNA「轉化」。外源DNA可整合或不整合(共價結合)入構成細胞基因組的染色體DNA。舉例來說，在原核生物和酵母中，所述外源DNA可保持在游離因子上，例如質粒。對真核細胞來說，穩定的轉化細胞是其中外源DNA 整合到染色體中，因此可以通過染色體複製遺傳到子細胞中的細胞。這種穩定性表現在真核細胞可以建立細胞系或克隆的能力，其包含一群含有外源DNA的子細胞。原核生物包括革蘭氏陰性和陽性生物，例如E. coli和枯草桿菌(B. subtilis)。真核細胞包括來源於動物細胞的已建立的組織培養細胞系，可來自非哺乳動物如昆蟲細胞和鳥類，和來自哺乳動物如人、靈長動物、以及齧齒動物。原核宿主-載體系統包括用於很多不同物種的多種載體。用於擴增DNA的載體包括pBR322及其多種衍生物，或pET42b (+)表達載體(Novagen)。通常使用的原核表達調控序列包含啟動子，其包括源自β_內醯胺酶 (β -lactamase)和乳糖啟動子系統的啟動子[Chang 等人，Nature, 198 :1056 (1977)],例如pUC系列，源自色氨酸(trp)啟動子系統的啟動子[Goeddel等人，Nucleic Acids Res. 8 :4057 (1980)]，例如 pBR322-trp，源自 lambda PL 啟動子系統的啟動子[Shimatake 等人，Nature, 292 128 (1981) ], lam bda-pP或pR啟動子(pOTS),阿拉伯糖誘導的啟動子 (InVitrogen)，tac 啟動子[De Boer 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 292 128 (1983)]， Ipp啟動子(PIN系列)；或者雜交啟動子，例如ptac(pDR540)。許多包含這種調控序列的其它表達載體是本領域已知的，並有商業出售。[也參見Brosius等人，"Expression Vectors Employing Lambda-, trp-,lac-, and Ipp-derived Promoters" , in Rodriguez and Denhardt(eds. ) Vectors A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, 1988, Buttersworth, Boston, pp. 205-236]。適用於E. coli的等效的載體，其可用於其它原核生物，也可用來表達本發明的 TSLP蛋白。酵母以及高等真核組織培養細胞也能用作重組生產的宿主，用來生產新的犬TSLP 蛋白、和/或抗犬TSLP抗體、和/或這些抗體的片段。雖然可以使用任何高等真核組織培養細胞系，包括昆蟲杆狀病毒表達系統，但哺乳動物細胞是優選的。此類細胞的轉化或轉染以及增殖已經成為常規例行程序。有用的細胞系實例包括人子宮頸癌傳代細胞(HeLa細胞)、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系、幼大鼠腎(BRK)細胞系、昆蟲細胞系(例如SF9)，鳥類細胞系(例如 DF-11)、Madin-darby 牛腎(MDBK)細胞、Madin-Darby 犬腎(MDCK)細胞系、非洲綠猴腎異倍體細胞(Veix)細胞)、HEK-293細胞系以及猴(COS)細胞系。用於此類細胞系的表達載體通常包括,舉例來說,複製起點、啟動子、翻譯起始點、 RNA剪切位點(如果使用基因組DNA)、多腺苷酸位點、以及轉錄終止點。這些載體通常還包含選擇基因或擴增基因。合適的表達載體可以是包含啟動子的質粒、病毒、或逆轉錄病毒， 其啟動子來源於，例如腺病毒、SV40、細小病毒、牛痘病毒、或巨細胞病毒。合適的表達載體的典型實例包括pCR 3.1、pCDNAl、pCD [Okayama 等人，Mol. Cell Biol. 5 :1136 (1985)]、
pMClneo Poly-A[Thomas 等人，Cell 51 :503 (1987) ]、pUC19、pREP8、pSVSP0RT 及其衍生物、 以及杆狀病毒載體，例如pAC 373或pAC 610。表達以後，新的犬TSLP可根據本領域的標準程序進行純化，包括硫酸銨沉澱、 親和柱、柱色譜等等(參見 R. Scopes, Protein Purification, Springer—Verlag, N. Y. (1982))。藥用中優選的是至少約90%到95%同質化的幾乎完全純的組合物，最優選的是98%到99%或更高的同質化。純化可以是部分的，或直至所需的同質化。如果犬TSLP 用於治療，該蛋白幾乎完全不能含有內毒素。用結合抗TSLP抗體的純化柱或結合TSLP受體的純化柱選擇性純化表達的TSLP，是獲取高純度犬TSLP蛋白的可用策略。純化的方法本領域熟知。舉例來說，純化核酸可用沉澱、色譜、超速離心以及其它方法。純化蛋白和多肽以及肽可用多種方法，其包括但不限於，製備圓盤凝膠電泳、等電子聚焦、高效液相色譜(HPLC)、反向HPLC、凝膠過濾、離子交換與分配色譜、沉澱與鹽析色譜、 提取與反流分布。在某些方面，優選在重組系統中生產多肽，使蛋白包含有助於純化的額外序列標籤，例如但不限於，多組氨酸序列、或特異性與抗體結合的序列，例如FLAG 和 GST0如此則多肽可在合適的固相基質上用色譜從宿主細胞的粗裂解液中純化。或者，多肽的抗體或其結合片段可用作純化試劑。溶劑和電解質通常為用來保持生物活性的生物相容緩衝液，並通常近似於生理水溶劑。通常溶劑的PH為中性，通常在5到10之間，優選約7. 5。某些情況下，要加入一種或多種去汙劑，通常是溫和的不導致變性的，例如CHS (膽甾醇半琥珀酸酯)或CHAPS (3-[ (3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸)，或者濃度足夠低以免嚴重影響所述蛋白的結構或生理特性。在其它情況下，強烈的表面活性劑可用來進行強烈變性。另一選擇是，來源於E. coli或其它細菌的異源功能蛋白可通過強變性劑增溶和隨後重新摺疊的方法從包涵體中分離。本領域已知的變性劑包括，簡單舉例來說，尿素、硫氰酸鉀、鹽酸胍(「GuHCl」)、碘酸鉀、和/或碘化鈉，以及這些試劑的組合。優選GuHCl被用作還原劑,例如濃度約6到8M，在鹼性條件下，例如約pH8。或者使用另一種還原劑，二硫蘇糖醇(「DTT」)，可以單獨使用或與GuHCl組合使用。如果使用DTT，其濃度範圍，簡單舉例來說，從約50mM到約O. 5mM DTT。本領域已熟知，在增溶步驟中必須有還原劑來切斷或變性二硫鍵。一種典型的還原緩衝液為0. IM Tris (三羥甲基氨基甲烷)pH8.0，6M胍，2mM EDTA (乙二胺四乙酸)，和O. 3M DTE ( 二硫赤蘚醇)。通常在氧化劑存在下將變性與還原的蛋白稀釋(例如100倍)到重新摺疊緩衝液可完成復性。可以使用任何合適的本領域已知的氧化劑，只要其允許理想產量的正確摺疊。舉例來說，還原和氧化形式的低分子量硫醇試劑可以進行氧化和重新摺疊，如Saxena， 等人，1970，Biochemistry 9 =5015-5021中所述，該文合併到本文中作為參考，並特別如 Buchner，等人(引文同上)所述。通常將變性與還原的蛋白稀釋(例如100倍)到重新摺疊緩衝液可完成復性。一種典型的重新摺疊緩衝液為Tris HCl IOOmM, pH 10. 0,25mM EDTA, NaCl O. 1M, GSSG 551mg/L，O. 5M精氨酸。GSSG為氧化形式的穀胱甘肽。多肽的大小和結構通常應處於相當穩定的狀態，並且通常不處於變性的狀態。多肽可與其它多肽在四級結構中結合，例如可增加溶解度，或與脂類或去汙劑結合。幾乎完全純，例如描述蛋白的上下文中，通常表示該蛋白不含其它汙染的蛋白、核酸、或其它源於有機物來源的其它生物製品。純度可通過標準方法測定，通常依據重量，普通的至少約40%純，一般至少約50%純，經常至少60%純，通常至少80%純，優選至少90% 純，在最優選的實施方式中至少95%純。通常添加載體或賦形劑。純度可通過下列方法評估色譜、凝膠電泳、免疫測定、成分分析、生物測定、以及其它本領域已知的方法。從功能方面看，根據本發明的分離的犬TSLP蛋白與其它物質充分分離，包括前體犬TSLP蛋白和/或成熟的犬TSLP蛋白，因此能夠誘發犬TSLP蛋白特異性的免疫應答。多肽或片段的可溶性取決於環境和多肽本身。很多參數影響多肽可溶性，包括溫度、電解質環境、多肽大小和分子特性、以及溶劑的性質。通常所用多肽的溫度在約4°C到約 65°C之間。一般溫度高於約18°C。進行診斷時，溫度一般為室溫或更高，但是低於方法中各成分的變性溫度。進行治療時，溫度一般為體溫，通常約36°C到40°C (例如狗約39°C)，在某些情況下溫度可能在原位或體外升高或降低。本文中使用的一種具體蛋白的「抗原片段」一詞，係指該蛋白的一種片段(包括僅比全長蛋白少一個胺基酸的大片段)，其具有抗原性，即能夠特異性地與免疫系統的抗原識別分子反應，例如免疫球蛋白(抗體)或T細胞抗原受體。舉例來說，本發明的犬TSLP的抗原片段是犬TSLP的具有抗原性的片段。只要這種片段與用於免疫的載體分子結合後能用來產生TSLP蛋白的抗體，其不須具有自身免疫原性，即在沒有載體的情況下誘發免疫應答。
在一具體的實施方式中，犬TSLP的抗原片段包含5到150個胺基酸殘基。在一具體的實施方式中，犬TSLP的抗原片段包含多於120個胺基酸殘基。在另一實施方式中，犬 TSLP的抗原片段包含10到120個胺基酸殘基。在另一實施方式中，犬TSLP的抗原片段包含20到100個胺基酸殘基。在另一實施方式中，犬TSLP的抗原片段包含25到75個氨基
酸殘基。犬TSLP的抗原片段可從重組來源、天然來源中分離的蛋白、或化學合成得到。此外，抗原片段可從下列途徑得到犬TSLP或其片段的水解消化、重組表達、或者從頭產生， 例如通過肽合成。疫苗本發明進一步提供了疫苗，這些疫苗包含有效量的下列各項本發明的TSLP蛋白、該蛋白的一種或多種抗原片段、或者上述全長蛋白與一種或多種上述片段的組合。舉例來說，犬TSLP蛋白和/或其片段，如下述表2中所列舉，可整合進任何蛋白或肽相容的疫苗組合物。此類疫苗組合物是本領域熟知的，可以但並不必須包括，例如生理上適合的緩衝液和生理鹽水等等，以及藥學上可接受的佐劑，例如GARBOPOL 或Enmlsigen 必要時，疫苗組合物可用來在實驗犬體內誘導內源性抗TSLP抗體，例如為了治療與實驗犬體內TSLP活性下調有關的疾病或病症的臨床症狀。另外，或與之相關的，本發明的疫苗也可用來誘發篩選和/或鑑定犬TSLP的抗血清，例如作為鑑定過量表達TSLP犬的試劑盒的成分。如下述表2中公開的TSLP肽及其變體可用作免疫原，可單獨或以多種組合使用。 此類肽可通過化學或重組DNA技術任選互相連接和/或與作為載體的大蛋白連接。載體可增強作為免疫應答目標的宿主動物對多肽的識別，並增加TSLP多肽的免疫原性。很多載體是本領域已知的，包括破傷風類毒素或無毒的破傷風毒素C片段、白喉類毒素、PhoP蛋白、 鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)、β牛乳糖、源於I型牛皰疹病毒(BHV-I)的gD蛋白、源於狂犬病毒的G蛋白、源於犬瘟熱病毒的F蛋白、以及合成載體，例如用已知的「通用」 T細胞表位聚合而成的載體。使用已知的算法，可用作免疫原的TSLP多肽可從下述表2中的多肽及其變體中選擇出來，這些算法評估如下特性天然TSLP蛋白的表面可達性、親水性、原子遷移率、以及抗原性。表2中多肽及其變體的表位也可基於其與下列抗體的反應活性進行選擇與天然 TSLP蛋白反應的抗體、特別是能夠中和TSLP生物活性的抗體。此類抗原可包括用標準肽合成技術從本文所公開的序列中製備的合成肽，和/或或者從重組或天然TSLP蛋白得到的片段。本發明的藥學上可接受的佐劑可從多種來源獲得，其包括天然來源、重組來源和/ 或化學合成等等。作為佐劑的化合物實例包括但不限於，鋁化合物、可代謝和不可代謝的油、嵌段共聚物、ISCOMj S (免疫刺激複合物)、維生素和礦物質(包括但不限於維生素E、 維生素A、硒、以及維生素B12)、和Quil A (皂苷)、弗氏完全佐劑、以CARBOPOL 商標出售的丙烯酸與聚烯基醚或二乙烯基乙二醇交聯的聚合物(例如CARBOPOL 941)、以及在水乳膠中均勻分散的微米級油滴(例如以商標Emulsigen 出售的)。另外一些佐劑的實施例有時候特指免疫刺激物，其包括細菌或真菌細胞壁成分(例如脂多糖、脂蛋白、糖蛋白、胞壁肽、β-I，3/1，6-葡聚糖)、源於植物的多種複合糖(例如多聚糖、乙醯化甘露聚糖)、源於動物的多種蛋白和多肽(例如激素、細胞因子、共刺激因子)、以及源於病毒和其它來源的新核酸分子(例如雙鏈RNA、CpG)。另外，上述各項的各種組合可提供佐劑作用， 因此可構成本發明的佐劑。本發明的疫苗可通過以下任何途徑施用肌肉注射、皮下注射、靜脈注射、皮內注射、口服、鼻腔給藥、以及上述方法的組合。抗體本發明還包括與新的犬TSLP蛋白特異性結合的多克隆和單克隆(mAb)抗體。如本文中使用的，「抗體」一詞係指免疫球蛋白和/或其片段。天然存在的免疫球蛋白包含實質上由免疫球蛋白基因編碼的一個或多個多肽。已知的免疫球蛋白基因包括kappa、 lambda、alpha、gamma、delta、epsilon和mu恆定區基因，以及大量免疫球蛋白可變區基因。根據本發明的抗體也包含抗體片段，即抗原結合片段，例如Fv、Fa、和F(ab' )2，改造的單鏈結合蛋白，參考 Huston 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，85，5879-5883 (1988) 和Bird等人，Science，242，423-426(1988)(合併到本文中作為參考)，以及雙功能雜交抗體(參考 Lanzavecchia 等人，Eur. J. Immunol. 17,105 (1987))。參見 Hood 等人， Immunology,Benjamin,N. Y. ,2nd ed. (1984),Harlow and Lane,Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)和 Hunkapiller and Hood, Nature,323,
15-16(1986)，全部合併到本文中作為參考。舉例來說，以標準方法用新的犬TSLP蛋白免疫的動物中產生的血清可直接使用， 也可用標準方法從血清中分離出IgG組分，例如用血漿去除術或採用IgG特異性吸附劑的吸附色譜，例如固定化蛋白A或蛋白G。或者，可製備單克隆抗體，和任選源於此類單抗的抗原結合片段或重組結合蛋白。此類單抗或其片段可用本領域已知的方法或者直接修飾來分別進行人源化或犬源化。如本文中使用的，一種「表位特異性的」犬TSLP抗體是一種抗犬TSLP的一種片段的抗體，該抗體包含一種表位，其包含一個或多個下列5胺基酸序列SEQ ID NO 30,SEQ ID NO 3USEQ ID NO 32,SEQ ID NO :33 和 SEQ ID NO :34 ;該抗體進一步結合一種蛋白，其包含SEQ ID NO :2的胺基酸序列，和/或一種蛋白，其包含SEQ ID NO :2的胺基酸序列，但不包括28個胺基酸殘基的信號序列。在一具體的實施方式中，表位特異性的犬TSLP抗體是一種單克隆抗體。選擇性結合本發明的犬TSLP蛋白的產自雜交瘤的單抗是用熟知的技術生產的。通常所述過程涉及永久細胞系與生產所需抗體的B淋巴細胞的融合。或者，也可使用產生永久抗體生產細胞系的非融合技術，例如病毒誘導轉化[Casali等，Science 234 476 (1986)]。永久細胞系通常轉化哺乳動物細胞，尤其是嚙齒類、牛、和人源的骨髓瘤細胞。 出於方便和可用性考慮，最經常使用的是大鼠和小鼠的骨髓瘤細胞。從注射抗原的哺乳動物中獲得生產抗體的淋巴細胞的技術是熟知的。如果使用人源細胞通常使用外周血淋巴細胞(PBLs)，或者使用非人哺乳動物來源的脾或淋巴結細胞。 宿主動物被注射多劑量的純化的抗原(人細胞在體外致敏)，則該動物可產生所需的生產抗體細胞，以供收穫用於與永久細胞系的融合。融合技術也是在本領域熟知的，通常涉及將細胞與融合劑混合，例如聚乙二醇。雜交瘤用標準程序選擇，例如HAT (次黃嘌呤-氨喋呤-胸腺嘧啶脫氧核苷)選擇。分泌所需抗體的雜交瘤用標準免疫分析選擇，例如蛋白印跡法、ELISA(酶聯免疫吸附法)、RIA(放射性免疫分析)等等。抗體用標準蛋白純化技術從培養基中回收[Tijssen， Practice and Theory of Enzyme Immunoassays(Elsevier, Amsterdam,1985)]。很多參考文獻可對應用上述技術提供指導[Kohler等人，Hybridoma Techniques(Cold Spring Harbor Laboratory, New York,1980) ；Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays(Elsevier, Amsterdam,1985) ;CampbelI, Monoclonal Antibody Technology(Elsevier, Amsterdam,1984) ；Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies !Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982)]。單克隆抗體還可用熟知的噬菌體文庫系統生產。[參見Huse，等人，Science 246:1275(1989)； Ward,等人，Nature, 341 :544 (1989)]。如此生產的抗體，無論多克隆還是單克隆，可被用於，例如用熟知的方法以固定形式結合於固體載體，通過免疫親和色譜純化犬TSLP蛋白。未標記的或用標準方法標記的抗犬TSLP蛋白的抗體也可用作定性或定量檢測犬 TSLP蛋白的免疫分析的基礎。具體使用的標記物取決於免疫分析的類型。可使用標記物的實例包括但不限於，放射性同位素標記，例如32P、125I、3H、和14C ;螢光標記，例如螢光素以及衍生物、若丹明及其衍生物、丹醯和傘形酮；化學發光劑，例如蟲螢光素和鄰苯二甲醯肼； 以及酶，例如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、溶菌酶、和6-磷酸葡萄糖脫氫酶。抗體可用上述標記物通過已知方法標記。舉例來說，用螢光劑、化學發光劑、或酶標記抗體時可使用偶聯劑，例如乙醛、碳二亞胺、雙馬來醯亞胺、亞氨酸酯、琥珀醯亞胺、 雙重氮化聯苯胺等等。涉及的常規方法本領域熟知，如下所述，考例如Immunoassay A Practical Guide, 1987, Chan (Ed. )，Academic Press, Inc.，Orlando, FL.。此類免疫分析可在，例如，受體純化所得餾分中應用。本發明的抗體還可用於鑑定在表達克隆系統中表達犬TSLP蛋白的特定cDNA克隆。受體配基結合位點特異性的中和抗體還可用作阻斷或下調犬TSLP蛋白功能的拮抗劑 (抑制劑)。此類中和抗體可通過常規實驗容易地鑑定。犬TSLP蛋白活性的拮抗可用完整的抗體分子、或熟知的抗原結合片段如Fab、Fc、 F (ab) 2、和Fv片段完成。此類片段的定義如上文所述，或參考例如Klein, Immunology (John Wiley, New York,1982) ；Parham, Chapter 14, in Weir, ed. Immunochemistry, 第 4 版·(Blackwell Scientific Publishers, Oxford, 1986)。抗體片段的使用和生產在下列文獻描述例如Fab片段[Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985) ], Fv 片段[Hochman 等人，Biochemistry 12 1130 (1973) ;Sharon 等人，Biochemistry 15 1591 (1976) ;Ehrlich 等人,美國專利第 4, 355, 023號]，以及抗體半分子(Auditore-Hargreaves,美國專利第4, 470, 925號)。進一步描述基於已知的抗體重鏈和輕鏈可變區序列製備重組Fv片段的方法，例如Moore等人 (U. S. Patent No. 4, 642, 334)和 Pliickthun [Bio/Technology 9 :545 (1991)]。或者，也可用標準方法化學合成。本發明還包含多克隆和單克隆抗獨特型抗體，其用上述抗體作為抗原來生產。這些抗體的作用在於其可以模擬配基的結構。產自非犬哺乳動物或非犬雜交瘤系統的抗體可任選進行改造，以使其在注射給犬時幾乎無抗原性，即其可犬源化。改造產自動物的單克隆抗體以使其在治療施用給人時降低免疫原性(人源化)的方法已被積極探索，並在很多文獻中描述[例如Antibody Engineering A practical Guide. Carl A. K. Borrebaeck ed. ff. H. Freeman and Company, 1992 ；Reichman, L.等人，"Reshaping human antibodies for therapy" , Nature 332 323-327 (1988)]。或者，產自非犬哺乳動物的單克隆抗體，例如小鼠單克隆抗體，可與犬抗體或其序列產生嵌合抗體，其對受體宿主來說，比標準鼠單克隆抗體的免疫原性降低。參見例如，美國專利第5，593,861號，「犬-小鼠異源雜交瘤和編碼犬免疫球蛋白恆定區的基因片段」，合併到本文中作為參考。另外，Wasserman和 Capra[Biochem. .16 :3160 (1977)]石角定了犬 IgM 和犬 IgA 重鏈可變區的胺基酸序列。他們進一步確定了犬IgA kappa輕鏈的胺基酸序列[Wasserman and Capra, Immunochem. .15 :303 (1978) ]。McCumber 和 Capra [Mol. Immunol. .16 :565 (1979)]公開了犬mu鏈的胺基酸全序列。Tang等人[Vet. Immunology Immunopathology 80 :259 (2001) I 公開了一種犬IgG-A gamma鏈cDNA和4種犬IgG-A gamma鏈蛋白序列。Tang等人(引文同上)進一步描述了犬脾cDNA文庫的PCR擴增，其使用了根據人、小鼠、豬、和牛IgG保守區設計的變性寡核苷酸引物。此外，Krah等人(美國專利公開號20040181039，公開於2004 年9月16日，合併到本文中作為參考)詳細描述了非犬抗體犬源化的一種過程。犬TSLP基因的分離A.初步嘗試鑑定犬TSLP的初步嘗試基於克隆的人和小鼠cDNA序列與大鼠、黑猩猩、和恆河猴 cDNA序列的序列比較，這些序列從BLAT (公共基因組資料庫，加利福尼亞大學聖克魯茲分校)收集。黑猩猩TSLP與人TSLP在胺基酸水平上100%相同，而恆河猴TSLP在成熟蛋白上與人TSLP超過90%同源性(12/151胺基酸殘基差異)。然而，人和非人靈長類動物TSLP 蛋白和cDNA序列與鼠TSLP序列有很大差異。人和小鼠TSLP cDNA序列只有43%同源性， 不能通過這些物種之間的低嚴格性跨種雜交進行克隆。此外，與小鼠TSLP比較，大鼠TSLP 序列在成熟蛋白的胺基酸序列中有39/121差異，提示甚至在近緣的鼠類物種之間，TSLP序列也有顯著差異。遺憾的是，如本文所公開的，犬TSLP序列也與所有這些不同的鼠類和相似的靈長類序列有差異。因此，通過低嚴格性跨種雜交獲得犬TSLP是不成功的。實際上，根據人、小鼠、大鼠、和猴序列信息設計的嘗試用巢式PCR策略克隆犬TSLP直向同源基因的引物沒能確定甚至一條與犬TSLP對應的條帶。B.成功分離犬TSLP基因用人TSLP序列搜索可供收集的犬基因組資料庫(源於全基因組鳥槍測序；由加利福尼亞大學聖克魯茲分校提供給公眾)部分確定了犬TSLP外顯子I和4。簡單地說，在此初步搜索中確定了多個顯著序列同源性的搜索結果(參加下述「搜索結果」1-6)。其序列被集中並用作查詢條件來延伸和組裝犬TSLP基因的部分電子序列。搜索結果I評分=60.8 字節(146)，期望值=le_08同一性=33/58(56%)，陽性=39/58(67% )，缺口 = 1/58(1% )Query 7 LYVLSVS-FRKIFILQLVGLVLTYDFTNCDFEKIKAAYLSTISKDLITYMSGTKSTEF 63
L+SVS FRKIF+LQLVGLVLTY+F +CDFEKI+ Y I+L YM G FSbjct 26 LIICSVSVFRKIFVLQLVGLVLTYNFIDCDFEKIRWKYQEVIYQALEKYMDGVSE * TF 199SEQ ID NO :102 :人 TSLPSEQ ID NO 103 > gi | 36323560 | gb | AACNO10632090. I 家犬ctgl9866851299046，全基因組鳥槍序列長度=1007搜索結果2評分=59.7 字節(143)，期望值=3e_08同一性=30/42(71%)，陽性=33/42(78% )框=-IQuery :117 QINATQAMKKRRKRKVTTNKCLEQVSQLQGLffRRFNRPLLKQ 158(SEQ ID NO:
104)QIN TQA KKR+KR VTTNKC EQV +L GLWRRF+R KQSbjct 588 QINNTQAKKKRKKRGVTTNKCREQVAHLIGLWRRFSRIS * KQ 463(SEQ ID NO:
105)SEQ ID NO :104 :人 TSLPSEQ ID NO :105 > gi | 36314527 | gb | AACN010674832. I 家犬ctgl9866851282529，全基因組鳥槍序列長度=963搜索結果3評分=42.O 字節(97)，期望值=O. 006同一性=21/44(47% )，陽性=27/44(61% )框=-2Query 76 LTEIQSLTFNPTAGCASLAKEMFAMKTKAALAIWCPGYSETQIN 119(SEQ ID NO:
106)L I+LT+GCAS A+E FA T AALA CPGY+ ++Sbjct :369 LARIERLTLHRIRGCASGAREAFAEGTVAALAAECPGYAAAPVS 238(SEQ ID NO: 107)SEQ ID NO :106 :人 TSLPSEQ ID NO 107 > gi | 36442813 | gb | AACNOl 1084208. I 家犬ctgl9866851499233，全基因組鳥槍序列長度=370搜索結果4評分=38.9 字節(89)，期望值=O. 047同一性=15/32(46%)，陽性=22/32(68% )閱讀框=+1Query :87 TAGCASLAKEMFAMKTKAALAIWCPGYSETQI 118(SEQ ID NO :108)T GC AKE A+ AL++WCPG+++TQ+Sbjct 178 TPGCGICAKEAAALGffFCALSVffCPGffAQTQV 273(SEQ ID NO :109)SEQ ID NO :108 :人 TSLPSEQ ID NO 109 > gi | 36211043 | gb |AACN010354273. I 家犬
ctgl9866851087147，全基因組鳥槍序列長度=1369搜索結果5評分=42.O 字節(97)，期望值=O. 006同一性=21/44(47% )，陽性=27/44(61% )閱讀框=-2Query 76 LTEIQSLTFNPTAGCASLAKEMFAMKTKAALAIWCPGYSETQIN 119(SEQ ID NO: 110)L I+ LT+ GCAS A+E FA T AALA CPGY+ ++Sbjct :369 LARIERLTLHRIRGCASGAREAEAEGTVAALAAECPGYAAAPVS 238(SEQ ID NO: 111)SEQ ID NO :110 :人 TSLPSEQ ID NO 111 > gi | 36211043 | gb |AACN010354273. I 家犬ctgl9866851087147，全基因組鳥槍序列長度=1369搜索結果6評分=38.9 字節(89)，期望值=O. 047同一性=15/32(46%)，陽性=22/32(68% )框=+1Query 87 TAGCASLAKEMFAMKTKAALAIWCPGYSETQI 118(SEQ ID NO :112)T GC AKE A+ AL++WCPG+++TQ+Sbjct :178 TPGCGICAKEAAALGffFCALSVffCPGffAQTQV 273(SEQ ID NO :113)SEQ ID NO :112 :人 TSLPSEQ ID NO 113 > gi | 36211043 | gb |AACN010354273. I 家犬ctgl9866851087147，全基因組鳥槍序列長度=1369這個電子構建的序列與人、猴、大鼠、和小鼠TSLP的比較顯示保守的內含子/外顯子邊界和基本的序列同一性，確定此序列為犬TSLP直向同源基因的一部分。基於此發現隨後設計PCR引物並用於擴增該基因的缺失部分。通過雙重巢式PCR從犬活化的外周血單核細胞(PBMC) cDNA文庫中獲得2個部分重疊的克隆。通過巢式PCR獲得完整犬TSLP cDNA 的進一步嘗試或向5』或3』端延伸序列的嘗試都沒有成功。然而，用這些克隆中的延伸序列信息在犬全基因組鳥槍序列數據(加利福尼亞大學聖克魯茲分校)中進行反覆的資料庫搜索，結合從此資料庫中人工組裝原始DNA序列，得到電子組裝的全長犬TSLP cDNA。在體外用DNA合成儀合成此cDNA序列的實際克隆。綜上所述，用現有的和最新的分子克隆技術不可能直接從人、小鼠、大鼠、或猴序列中得到犬TSLP序列。只有用收集的人、小鼠、大鼠、和非人靈長類(NHP)TSLP基因進行複雜的反覆的資料庫搜索，利用基因組資料庫中的內含子/外顯子邊界分配和序列同一性， 結合分子PCR克隆技術，才能確定編碼犬TSLP的基因。一旦得到，所述犬TSLP與成熟的人TSLP蛋白的胺基酸序列相比較有58/132的差異(61%同一性)，與成熟的小鼠TSLP蛋白的胺基酸序列相比較有83/129的差異(33%同一性)(參見下述)。家犬與人TSLP成熟蛋白序列比較
。交叉吸附、去除、或其它方法可提供確定選擇性的製劑，例如獨有的或共有的物種特異性。這可作為鑑定多組抗原的測試的基礎。另外，本發明的抗體，包括抗原結合片段，可作為強力拮抗劑，其與抗原結合併抑制可能誘發生物應答的功能性結合，例如與受體的結合。另外，上述抗體可直接或通過連接劑間接與藥物或其它治療劑結合，並可能影響藥物靶向。源於本文公開的序列的合成肽與載體蛋白結合可用作免疫原。在任何情況下，抗原片段可與其它物質結合，特別是多肽，成為融合的或共價結合的多肽可用作免疫原。抗原及其片段可融合或與多種免疫原共價結合，例如鑰孔蟲戚血藍蛋白、牛血清白蛋白、破傷風類毒素等等。製備多克隆抗血清的方法參見MicrobioloRy,Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969 Landsteiner(1962)Specificity of SeroloRical Reactions,Dover Publications, New York ；ffilliams,等人(1967)Methods in Tmmunology and Tmmunochemistry,第 I 卷，Academic Press, New York ；和 Harlow and Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, CSH Press, NY。在某些情況下，需要從多種哺乳動物宿主，例如小鼠、嚙齒類、靈長類、人等，製備單克隆抗體。製備此類單克隆抗體的技術描述可在下列文獻中發現，例如Stites，等人(編輯)Basic and Clinical TmMinoIogv(第4版)，Lange Medical Publications,Los Altos, Calif.及其所引用的文獻；Harlow and Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, CSH Press Goding (1986)Monoclonal Antibodies Principles and Practice (第 2 版)， Academic Press,New York ;特別是Kohler and Milstein(1975) ,Nature 256 :495-497,其討論了一種生產單克隆抗體的方法。其它適合的技術涉及淋巴細胞在體外接觸抗原性多肽或者噬菌體或其它類似載體中抗體文庫的一部分。[參見Huse,等人(1989)「Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda,，，Science 246 1275-1281 ;和Ward，等人(1989) Nature 341 :544-546.]。本發明的多肽和抗體可直接使用或修飾後使用，包括嵌合、犬源化、和/或人源化抗體。 通常本發明的多肽和抗體通過連接提供可檢測信號的其它物質進行標記。可通過共價或非共價結合完成這種連接。大量標記物和結合技術已經熟知並在科學和專利文獻中被廣泛報導。合適的標記物包括放射性核素、酶、底物、輔因子、抑制劑、螢光基、化學發光基、磁性粒子等等。指導使用此類標記物的專利包括美國專利第3，817，837,3, 850，752、 3，939，350,3, 996，345,4, 277，437,4, 275，149、和 4，366，241 號。還有，重組或嵌合免疫球蛋白可以生產，參見Cabilly,美國專利第4，816，567號；Moore,等人，美國專利第 4，642，334 號；和 Queen,等人(1989) Proc. Nat' I Acad. Sci. USA 86 10029-10033 ;或在轉基因小鼠中產生，參見Mendez，等人(1997) Nature Genetics 1^:146-156。上述文獻合併到本文中作為參考。本發明的抗體也可用於分離蛋白的親和色譜。將抗體連接到固體載體上以製備色譜柱(參見例如Wilchek等人(1984)Meth. Enzymol. IM :3-55)。或者，與固體載體結合的抗原可用於純化相應的抗體。各種犬TSLP的抗體也可用於產生抗獨特型抗體。這將有助於檢測或診斷與各個抗原表達有關的多種免疫疾病。RNA 抑制在生產犬TSLP的細胞中幹擾編碼犬TSLP的RNA是另一種抑制TSLP生物活性的方法，可治療很多與TSLP相關的疾病，例如遺傳過敏性皮炎。為此目的，化學合成的或在合適的運輸載體，例如質粒或病毒載體中克隆的雙鏈RNA分子可被引入活躍生產TSLP mRNA 的細胞，其目的是降低編碼TSLP的內源mRNA水平。上述RNA分子進入之後(在外源進入的分子或者質粒或病毒載體進入細胞之後的RNA轉錄的情況下)，被3型核糖核酸酶蛋白的裂解活性處理成短核苷酸片段，稱為小分子幹擾核糖核酸(SiRNA)。上述SiRNA片段被整合進包含核酸酶的多蛋白複合物，稱為RISC (RNA誘導的沉默複合物)，其活化是由於siRNA 雙螺旋被RNA螺旋酶的活性解旋。此時單鏈的siRNA引導RISC複合物到其靶mRNA，然後該 mRNA被裂解並隨後被RISC的核酸內切活性降解。
更具體地，包含TSLP基因或其片段的質粒被克隆進任何一種商業出售的真核質粒，其中TSLP基因或其片段的轉錄由合適的啟動子驅動，例如CMV或SV40啟動子。純化的質粒DNA(I-IOOug)被注射到皮膚損傷處或遺傳過敏性皮炎特有的環繞皮膚損傷的區域。 質粒DNA的注射可重複多次，其頻率應足以引起TSLP mRNA顯著減少。這種減少可通過以下途徑評估注射區域的皮膚活體組織檢查、和測定TSLP mRNA水平，例如定量PCR方法。下列本發明的實施例提供了本發明的進一步了解，絕非意圖限制本發明的有效範圍。
實施例實施例I犬TSLP DNA和蛋白序列通過在電子資料庫中反覆的數據挖掘和分子生物學方法鑑定了一種表達犬TSLP 的犬基因，如上詳述。結果犬TSLP基因序列如圖8A(SEQ ID NO :I)所示，表達TSLP蛋白的預測蛋白如圖 8B(SEQ ID N02)所示。圖8B(SEQ ID NO 2)中標註星號的胺基酸殘基1_28表示信號序列，胺基酸殘基29-155表示成熟蛋白。實施例2犬TSLP的克隆與表達編碼犬TSLP的DNA如本文所述鑑定，並用本領域的標準方法克隆進一種供體載體 pD0NR221 (Invitrogen Gateway System)。在合作研究機構DNA 2. O中進行基因組裝並克隆進供體載體，從而構建一種質粒，稱為PD0NR221. G03276,其包含已鑑定的基因組犬TSLP 基因。使用2種引物從pD0NR221. G03276中PCR擴增編碼成熟(即不含信號序列)犬TSLP 蛋白的DNA，其中引物分別含有Nco I和EcoR V位點引物#1 :5』 AATAATCCATGGCATACAATTTCATTGACTGTGAC-3』 (SEQ ID NO 4);和#2 :5，-AAAATAGATATCTGAAATGCGACTGAAACGACG-3』 (SEQ ID NO 5).Nco I 和 EcoR V 消化後，PCR 產物插入到載體 pIVEX I. 3 WG(Roche Applied Sciences，商品編號3728803)的Nco I和Sma I位點。由此產生了一種質粒，其包含編碼C 端融合6個組氨酸殘基出組氨酸標籤)的成熟犬TSLP的基因。包含正確插入序列的質粒命名為1265-93. D質粒。1265-93. D質粒用於表達TSLP，使用的設備為RTS Proteomaster Instrument (Roche Applied Sciences,商品編號3064859),根據製造商的建議操作。如圖 I所示，在第2道和第4道有明顯的16kDa條帶(箭頭所示)。蛋白質印跡實驗(圖2A和圖2B)顯示此條帶與抗組氨酸標籤抗體(圖2A)和特異性抗人TSLP的大鼠單克隆抗體(圖 2B)特異性反應。實施例3從宿主細胞中生產犬TSLP為在E. coli中表達重組TSLP蛋白，PCR擴增了編碼cTSLP的核苷酸序列(即缺少編碼信號序列的核苷酸)，其中模板為質粒1265-66C,正向引物和反向引物分別含有NcoI和Hind III位點:正向引物5』 -AATAATCCATGGCATACAATTTCATTGACTGTGAC-3』 (SEQ ID NO 6)反向引物5，-ACATAAAAGCTTTGAAATGCGACTGAAACGACG-3』 (SEQ ID NO 7)NcoI 和 Hind III 消化後,PCR產物插入到 pET42b (+)表達載體(Novagen)的 NcoI/ HindIII位點。此過程產生一種質粒，其編碼N端融合GST標籤和C端融合6組氨酸標籤的成熟cTSLP。包含正確插入序列的質粒命名為1265-93B。GST-TSLP-His融合蛋白的表達在E. coli BL21(DE3)/pLysS中進行，其包含T7 RNA聚合酶基因，該基因受異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導的lacUV5啟動子調控。含有質粒1265-93B的E. coli細胞在30°C生長，直到O. D. 600達到O. 6，再加入O. 5mM IPTG誘導蛋白表達，並進一步30°C孵育2小時。 SDS-PAGE顯示在可溶性E. coli餾分中有正確大小(約61kDa)的蛋白條帶(箭頭所示) (圖3A)。蛋白質印跡顯示表達的蛋白與抗GST抗體反應(圖3D)。GST-TSLP-His蛋白可用穀胱甘肽瓊脂糖4B樹脂純化(圖3B)。用Ni-NTA樹脂再次純化後，大部分GST-TSLP蛋白包含在純化柱流穿液中(圖3C)。實施例4犬TSLP的免疫螢光檢測使用抗人TSLP蛋白的兔多克隆抗體，通過免疫組織化學(「IHC」)測定了犬TSLP 蛋白在犬皮膚和扁桃體組織中的表達。免疫組織化學在石蠟包埋組織塊上進行，樣品取自注射鹽水的正常犬皮膚，以及經診斷患有多種皮膚病的患犬皮膚，所患皮膚病包括遺傳過敏性皮炎、皮膚紅斑狼瘡、多形紅斑、和交界型大皰性表皮鬆解症。另外，在兩隻犬的冷凍扁桃體組織中測定了 TSLP蛋白表達。通過IHC測定TSLP表達的程序如下所述I.製備切片I.包埋皮膚樣品的石蠟塊切片成5-7微米厚度並置於載玻片上，載玻片已用多聚 L-賴氨酸處理以促進粘合。2.切片用二甲苯去除石蠟，用一系列乙醇溶液再水化。3.抗體恢復在檸檬酸鹽緩衝液中進行[IOmM檸檬酸鈉，其中含有O. 5ml/升 Tween-20，用實驗室微波爐處理25分鐘，達到99-100°C ]。此為恢復組織切片在石蠟包埋過程中被掩蓋的抗原性的過程。II.免疫染色I.切片在磷酸緩衝液(PBS)稀釋的10%正常驢血清中室溫孵育I小時以降低抗體的非特異性結合。2.小心去除多餘血清，切片用PBS稀釋的兔抗體(I 100)覆蓋，在潮溼箱中室溫孵育I小時或4°C孵育過夜。3.切片在PBS中漂洗2次，每次5分鐘，其間小心搖動。4.小心去除多餘PBS，切片用PBS I 5000稀釋的生物素標記的驢抗兔IgG抗體
覆蓋，在潮溼箱中室溫處理30分鐘。5.切片在PBS中漂洗2次，每次5分鐘，其間小心搖動。6.去除多餘的PBS，切片在5微克/ml鏈黴親和素-異硫氰酸螢光素(鏈黴親和素-FITC)結合的PBS中室溫孵育30分鐘。7.切片在PBS中漂洗2次，每次5分鐘，小心搖動。8.切片用蘇木精復染色2-3分鐘。9.在螢光顯微鏡下檢查切片。10.拍照合適的圖像。11.實驗對照包括不加一級抗TSLP抗體、或用普通兔抗體替換一級抗TSLP抗體。以下表I總結了 IHC實驗結果表I_兔抗人TSLP的免疫組織化學實施於石蠟包埋皮膚組織塊，樣品取自多種皮膚病的患犬
權利要求
1.抗犬胸腺基質淋巴細胞生成素蛋白(TSLP)抗體，其在哺乳動物或哺乳動物雜交瘤體系中被組合物誘導產生，所述組合物包含TSLP或其抗原片段，其中所述TSLP蛋白包含一段胺基酸序列，該序列與SEQ ID NO 2的胺基酸序列有90%或更高的同一性，不包括其28 個胺基酸殘基信號。
2.根據權利要求I所述的抗犬TSLP抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
3.根據權利要求2所述的抗犬TSLP抗體，其中所述單克隆抗體是犬源化的。
4.抗犬胸腺基質淋巴細胞生成素蛋白(TSLP)抗體，其在哺乳動物或哺乳動物雜交瘤體系中被組合物誘導產生，所述組合物包含融合蛋白；其中所述融合蛋白包含TSLP或其抗原片段；並且其中所述TSLP蛋白包含一段胺基酸序列，該序列與SEQ ID NO: 2的胺基酸序列有90% 或更高的同一性，不包括其28個胺基酸殘基信號。
5.根據權利要求4所述的抗犬TSLP抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
6.根據權利要求5所述的抗犬TSLP抗體，其中所述單克隆抗體是犬源化的。
7.根據權利要求I所述的抗犬TSLP抗體在製備用於治療特異反應性犬的過敏症狀的藥物中的應用。
8.根據權利要求2所述的抗犬TSLP抗體在製備用於治療特異反應性犬的過敏症狀的藥物中的應用。
9.根據權利要求3所述的抗犬TSLP抗體在製備用於治療特異反應性犬的過敏症狀的藥物中的應用。
10.根據權利要求4所述的抗犬TSLP抗體在製備用於治療特異反應性犬的過敏症狀的藥物中的應用。
11.根據權利要求5所述的抗犬TSLP抗體在製備用於治療特異反應性犬的過敏症狀的藥物中的應用。
12.根據權利要求6所述的抗犬TSLP抗體在製備用於治療特異反應性犬的過敏症狀的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種犬TSLP蛋白和編碼該蛋白的核酸。本發明也公開了該蛋白的包含犬TSLP蛋白特異性表位的肽片段。犬TSLP蛋白和相關肽片段可用作免疫分析的抗原，也可用作誘導抗TSLP抗體的疫苗。本發明進一步公開了製備和使用犬TSLP基因、犬TSLP蛋白、以及相關肽片段的方法。
文檔編號C07K16/24GK102584998SQ20121004432
公開日2012年7月18日 申請日期2007年12月11日 優先權日2006年12月14日
發明者D·M·戈曼, J·D·馬特森, M·A·莫西, R·德瓦爾馬萊菲特 申請人:先靈-普勞有限公司