一種檢測α-珠蛋白基因缺失的螢光定量PCR試劑盒的製作方法

2023-09-19 13:59:35 2

專利名稱：一種檢測α-珠蛋白基因缺失的螢光定量PCR試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物化學領域，具體涉及包含核酸的測定或檢驗方法的試劑。
背景技術：
人類α-珠蛋白基因簇位於16號染色體上，有ζ、α 、α2三個功能基因，表達 相應的ζ和α珠蛋白鏈，再與相應的β珠蛋白鏈結合，形成ζ 2 γ2(胚胎期血紅蛋白Hb Portland)和α 2 β 2 (成人血紅蛋HbA)。正常情況下，人類珠蛋白基因所表達的α類和 β類珠蛋白鏈比例適當，形成具有功能的血紅蛋白四聚體。當α珠蛋白基因缺陷，導致α 鏈合成減少而β鏈相對過剩，即可導致α-地中海貧血疾病。地中海貧血(簡稱「地貧」) 是全球最常見、對人類健康影響最大的單基因遺傳病之一，主要集中在地中海沿岸國家、東 南亞、少數非洲地區和我國南方，保守估計全世界攜帶者近2億人。臨床上常見α-地貧和 β-地貧。但α-地貧的人群攜帶率遠高於β-地貧。此病無有效治療手段，應用相應分析 技術通過人群篩查及產前診斷阻止重症患兒出生是國內外公認的首選預防措施。導致α 鏈合成減少的基因缺陷主要是α珠蛋白基因缺失，其缺失數目是α-地貧臨床表現及分型 的依據。正常個體為2個α 和2個α 2珠蛋白基因，其中缺失1個為靜止型，缺失2個 為標準型，缺失3為HbH病，4個均缺失的為Hb Bart' s胎兒水腫症候群。在α-珠蛋白基因缺失型分子診斷和產前診斷的臨床實踐中，採用相應的技術方 法，分析是否存在某種缺失類型而間接推導α珠蛋白基因的缺失情況。檢測技術發展歷程 中，準確性高但操作繁瑣、費時費力的Southern雜交技術，不適合常規檢測，目前實驗室已 基本不用。隨著上世紀80年代末PCR技術的發明，此技術很快被應用於α-地貧基因缺失 分子診斷。在缺失區域兩側設計一對引物，正常情況下兩引物間片段很長不屬於PCR有效 擴增範圍，而當缺失時距離變短則能擴增出特異性的擴增產物，此即目前常規使用的跨越 裂點PCR技術(也稱裂口 PCR，gap-PCR)。以PCR技術的高靈敏性及相對易操作特點，結合 當時為數很少的幾種已知缺失類型，gap-PCR分子診斷方法尚能基本滿足需求。隨著α-地 貧分子機制及分子流行病學的研究與發展，新的缺失類型陸續發現，目前缺失種類已超過 30種。並且，α珠蛋白基因簇具有高GC含量及高度同源的結構特徵，加上各缺失類型的缺 失範圍不相同、缺失長度不一，有的缺失類型斷裂點不明，這也就意味著目前的gap-PCR方 法，必須採用不同的檢測體系和檢測條件，逐一對各種缺失類型分別進行分析，以確定受檢 者是否有基因缺失及缺失類型。另外，PCR技術具有高靈敏性，極微量的外源汙染，尤其是 產前診斷中的母源性汙染，就能導致基於gap-PCR方法定性分析的假陽性診斷結果，造成 嚴重後果。總的來說，目前常規使用的gap-PCR方法，檢測成本高、工作量大、操作繁瑣、檢 測通量小，難以實現自動化和標準化，且存在難以解決的假陰性及假陽性技術瓶頸，不能滿 足當前缺失型α-地貧的大規模人群篩查和臨床常規分子診斷需要。針對gap-PCR應用於α -珠蛋白基因缺失分子診斷上的局限，近年來對gap-PCR 方法進行改進。例如多重gap-PCR方法，即在同一 PCR反應體系裡加上兩對以上特異性引 物，同時檢測幾種已知缺失類型，但由於各缺失類型的缺失範圍與長度不同，各自的PCR體系及擴增條件也就不同，所以多重gap-PCR也只是局限於極少的、PCR擴增體系與條件基本 相同的缺失類型；也有學者報導應用DHPLC(變性高效液相色譜)作為後PCR產物分析處理 方式，對-α 3 7和-α 4 2等缺失類型進行分子診斷，以提高檢測通量；還有報導以熔鏈分析 作為gap-PCR產物分析處理方式，檢測SEA和THAIL兩種缺失類型。最近，有報導應用實時 螢光PCR對SEA和/或Hb Bart' s胎兒水腫症候群進行分子診斷，其擴增與檢測一次性閉 管完成，無凝膠電泳等後PCR處理，雖然只局限於某一種缺失類型的檢測，但其具有操作相 對簡單、可實現標準化及大規模檢測等技術優勢。總的來說，一些分子生物學新技術，已相 繼應用到缺失型α-地貧的分子診斷中，在方法學上雖然有一定進展，但基本上都屬於針 對各種缺失類型進行定性分析的方法學改進，仍存在假陰性與假陽性等技術瓶頸，其操作 可行性、檢測通量等方面不能滿足當前大規模人群篩查及常規檢測的需要。隨著目前以降低地貧患兒出生率為目標的預防計劃與措施的相繼實施，以及地貧 分子機制及分子流行病學的深入研究，準確可靠、簡單實用、能實現自動化和標準化、適合 大規模人群篩查和常規分子診斷的高通量檢測技術與方法，是這些項目實施的技術支撐條 件，更是當前地中海貧血遺分子診斷的迫切需要。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種檢測α -珠蛋白基因缺失的螢光定量PCR試 劑盒，該試劑盒可以直接定量檢測α珠蛋白基因簇中ζ、α 1、α 2三個功能基因的拷貝數 以及拷貝數的變化。為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是一種檢測α -珠蛋白基因缺失的螢光定量PCR試劑盒，該試劑盒包括擴增引物和 螢光探針，其特徵在於，所述的擴增引物為，一對特異性擴增ζ珠蛋白的引物、一對特異性 擴增α 1珠蛋白的引物、一對特異性擴增α 2珠蛋白的引物和一對特異性擴增β-Actin基 因的引物；所述的螢光探針為，特異性檢測ζ珠蛋白的螢光探針、特異性檢測α 1珠蛋白的 螢光探針、特異性檢測α 2珠蛋白的螢光探針和特異性檢測β-Actin基因的螢光探針，其 中，(1)所述的一對特異性擴增α1珠蛋白的引物中，上遊引物序列為5，-CGTCGTGTACTTGTGTGATGGTTAGA-3，(SEQ NO. 1)， 下遊引物序列為5，-CGTCGTAAACAGGTAAACAAAGCAATAG-3，(SEQ NO. 2)；(2)所述的一對特異性擴增α2珠蛋白的引物中，上遊引物序列為5'-GTCGTGTACAACTTCCTATTCTCAGTG-3，(SEQ NO. 3)， 下遊引物序列為5，-CGTCGGGAAGACTTGCTAGGTAAATACT-3，(SEQ NO. 4)；(3)所述的一對特異性擴增ζ珠蛋白的引物中，上遊引物序列為5'CCGTCCAGGAGGCTGCTTACT-3，(SEQ NO. 5)， 下遊引物序列為5，-GGTGCTCCTTATTCATTTCAGAATCAC-3，(SEQ N0. 6)；(4)所述的一對特異性擴增β-Actin基因的引物中，上遊引物序列為5』-GGTCCCTACTGTGCACCTACTTAATACAC-3，(SEQ Ν0. 7)， 下遊引物序列為5，-GCTGACACTGGCTCGTGTGAC-3，(SEQ N0. 8)；(5)所述的特異性檢測α1珠蛋白的螢光探針為
5，-FAM-CTGCCTACCTCCCAGAGGAGGTTGAATGC-BHQ1-3，(SEQ NO. 9)；(6)所述的特異性檢測α 2珠蛋白的螢光探針為5』 -HEX-TCTCCCCTGCATCCCTTTCAGC-BHQ1-3，(SEQ NO. 10)；(7)所述的特異性檢測ζ珠蛋白的螢光探針為5' -Cy5-CCCTGCTCCTCTGGTTTCCCC-BHQ2-3，(SEQ NO. 11)；(8)所述的特異性檢測β -Actin基因的螢光探針為5，-R0X-CAAGGCCGCTTTACACCAGCCT-BHQ2-3，(SEQ NO. 12)。本發明所述的擴增引物和螢光探針可以由本領域常用的方法合成。本發明所述的螢光探針中，FAM指羧基螢光素，HEX指六氯-6-甲基螢光素，ROX指 羧基-X-羅丹明，CY5是指花青染料分子5，BHQl和BHQ2是指螢光淬滅基團。本發明所述的螢光定量PCR試劑盒還包括多重PCR常用試劑，如，DNA聚合酶、 200ng/ul正常基因型對照gDNA標本、二氯化鎂和dNIPs等，其中DNA聚合酶為Ex Taq0 DNA 聚合酶、二氯化鎂和dNIPs由寶生物(TaKaRa)大連有限公司提供。本發明中，ζ、α 1、α2珠蛋白基因為目的基因，i3-Actin(i3肌動蛋白基因)為參 比基因。所有目的基因和參比基因擴增子DNA序列長度為70-120bp、GC含量40% -65%, 無連續的5個G或C(參見

圖1)。本發明所述的試劑盒的使用方法為(1)反應體系為表1 本發明試劑盒PCR反應體系
權利要求
1. 一種檢測α-珠蛋白基因缺失的螢光定量PCR試劑盒，該試劑盒包括擴增引物和熒 光探針，其特徵在於，所述的擴增引物為，一對特異性擴增ζ珠蛋白的引物、一對特異性擴 增α 珠蛋白的引物、一對特異性擴增α 2珠蛋白的引物和一對特異性擴增β-Actin基因 的引物；所述的螢光探針為，特異性檢測ζ珠蛋白的螢光探針、特異性檢測α 1珠蛋白的熒 光探針、特異性檢測α 2珠蛋白的螢光探針和特異性檢測β-Actin基因的螢光探針，其中，(1)所述的一對特異性擴增α1珠蛋白的引物中，上遊引物序列為5，-CGTCGTGTACTTGTGTGATGGTTAGA-3，(SEQ NO. 1)， 下遊引物序列為5，-CGTCGTAAACAGGTAAACAAAGCAATAG-3，(SEQ NO. 2)；(2)所述的一對特異性擴增α2珠蛋白的引物中，上遊引物序列為5，-CGTCGTGTACAACTTCCTATTCTCAGTG-3，(SEQ NO. 3)， 下遊引物序列為5，-CGTCGGGAAGACTTGCTAGGTAAATACT-3，(SEQ NO. 4)；(3)所述的一對特異性擴增ζ珠蛋白的引物中，上遊引物序列為5，-CCGTCCAGGAGGCTGCTTACT-3，(SEQ NO. 5)， 下遊引物序列為5，-GGTGCTCCTTATTCATTTCAGAATCAC-3，(SEQ NO. 6)；(4)所述的一對特異性擴增β-Actin基因的引物中，上遊引物序列為5』 -GGTCCCTACTGTGCACCTACTTAATACAC-3，(SEQ NO. 7)， 下遊引物序列為5，-GCTGACACTGGCTCGTGTGAC-3，(SEQ NO. 8)；(5)所述的特異性檢測α1珠蛋白的螢光探針為.5』 -FAM-CTGCCTACCTCCCAGAGGAGGTTGAATGC-BHQ1-3』 (SEQ NO. 9)；(6)所述的特異性檢測α2珠蛋白的螢光探針為.5』 -HEX-TCTCCCCTGCATCCCTTTCAGC-BHQ1-3，(SEQ NO. 10)；(7)所述的特異性檢測ζ珠蛋白的螢光探針為.5，-Cy5-CCCTGCTCCTCTGGTTTCCCC-BHQ2-3，(SEQ NO. 11)；(8)所述的特異性檢測β-Actin基因的螢光探針為.5，-R0X-CAAGGCCGCTTTACACCAGCCT-BHQ2-3，(SEQ NO. 1 。2、根據權利要求 1 所述的 螢光定量PCR試劑盒，其特徵在於該試劑盒還包括I^remix ExTaqTM、二氯化鎂和dNTPS。
全文摘要
本發明屬於生物化學領域，提供一種檢測α-珠蛋白基因缺失的螢光定量PCR試劑盒，該試劑盒由一對特異性擴增ζ珠蛋白的引物、一對特異性擴增α1珠蛋白的引物、一對特異性擴增α2珠蛋白的引物、一對特異性擴增β-Actin基因的引物、特異性檢測ζ珠蛋白的螢光探針物、特異性檢測α1珠蛋白的螢光探針、特異性檢測α2珠蛋白的螢光探針、特異性檢測β-Actin基因的螢光探針和DNA聚合酶等組成。該試劑盒對檢測缺失型α-地中海貧血具有良好的敏感性和準確性，重複性和穩定性很好，完全適用於缺失型α-地中海貧血的臨床檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102146476SQ201110081598
公開日2011年8月10日 申請日期2011年4月1日 優先權日2011年4月1日
發明者周萬軍, 徐湘民, 熊符, 趙鎮 申請人:南方醫科大學