一種細胞因子cDNA重組反轉錄病毒載體的構建方法

2023-09-11 23:46:15

專利名稱：一種細胞因子cDNA重組反轉錄病毒載體的構建方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，更具體地，本發明提供了一種細胞因子cDNA 重組反轉錄病毒載體的構建方法。
背景技術：
原發性胃癌為我國高發的惡性腫瘤。在胃癌治療歷史上，手術切除是主要手
段，但術後常復發。胃癌晚期(m期)患者，常缺乏有效的延長病人生命的治療方 法。若這些胃癌患者經一些有效的輔助治療措施使胃癌腫瘤縮小後，再行切除， 有可能使胃癌治療有一個突破。
90年代新興的腫瘤基因治療已成為腫瘤生物治療的重要措施之一，並被譽 為繼手術、化療和放療之後的另一種具有潛在前途的治療方法。近年來腫瘤基因
治療的研究無論從深度上還是廣度上都取得了很大進展。在獲得美國重組DNA 諮詢委員會(RAC)、 NIH專家委員會和FDA批准的基因治療臨床試驗方案中，以 腫瘤為最多，充分顯示基因治療在腫瘤研究中的迫切性。目前所開展的腫瘤基因 治療中，以腫瘤免疫基因治療的研究為最多。腫瘤細胞耙向的細胞因子基因治療 是以主動免疫治療為基礎，即將細胞因子基因轉導入腫瘤細胞中，以製備出免疫 原性更強的新型瘤苗，並由於細胞因子的持續分泌，從而激發機體產生抗腫瘤免 疫反應，達到治療腫瘤的目的。研究表明，細胞因子基因治療不僅在一定程度上 克服了以往臨床直接應用細胞因子需反覆多次且副作用明顯的缺點，而且也取得 了直接應用所不具有的療效。
白細胞介素-2是由活化T細胞所分泌的一種細胞因子，具有刺激多種免疫 效應細胞活化的作用，包括T細胞、B細胞、NK細胞和巨噬細胞等。在腫瘤免疫 中起到重要作用。十多年前已開始將重組白細胞介素-2應用於臨床惡性腫瘤病 人。這種白細胞介素-2的系統性應用在黑色素瘤及其它一些腫瘤病人中取得一 定的效果，報導有效率為15 20%。這種療法主要是基於白細胞介素-2可使T細胞活化，從而有助於殺傷腫瘤細胞。然而由於白細胞介素-2在血液中的半衰期 較短，而反覆多次大劑量的應用又產生嚴重的毒副作用，因而限制了白細胞介素 -2的臨床應用。
本發明提供了一種細胞因子cDNA重組反轉錄病毒載體的構建方法，為癌 症的治療提供了一種新的治療途徑。

發明內容
本發明提供了一種細胞因子cDNA重組反轉錄病毒載體的構建方法。包括 mRNA的抽提及cDNA的合成、PCR擴增IL-2基因、IL-2 cDNA的克隆、 含IL-2重組逆轉錄病毒載體的組建。
在本發明的第一方面，提供了一種含信號肽的白細胞介素-2 cDNA。 在本發明的第二方面，提供了一種含IL-2重組逆轉錄病毒載體的組建方法。


無。
具體實施例方式
第一步含信號肽的白細胞介素-2 cDNA的製備。
1. PHA剌激的人外周血細胞人外周血用淋巴細胞分離液分離出單 個核細胞，共約lxl(^細胞，經植物血凝素(PHA)l(Vg/ml剌激30小時， 使細胞因子基因表達，以備抽提mRNA。
2. mRNA的抽提及cDNA的合成
(1) mRNA的抽提離心收集細胞，懸浮於1.5mlRNA抽提緩衝液， 用注射器反覆抽打勻漿細胞，然後再補加3ml抽提緩衝液，充分混合，離 心1000 cpm5分鐘，收集上清。取Oligo (dT)-Cellulose Spun Column,混 合內容物，350g離心兩分鐘，棄去柱內液體，取4ml上清上柱，混勻，棄 去液體。然後用高鹽緩衝液洗三遍，低鹽緩衝液洗二遍，最後用經65°C預 熱的洗脫緩衝液洗脫三次，每次用0.25ml，收集洗脫液，然後乙醇沉澱 poly(A)十RNA(mRNA)。(2)cDNA的合成將mRNA溶於20nl ddH20中，65°C10分鐘，置於 冰上備用。在第一條鏈反應混合液內加入lmlDTT和熱變性的RNA， 37 。C保溫1小時，再將此反應液加入第二條鏈反應混合液中，12°C和22" 各保溫1小時，最後加lpl Klenow酶，37°C 30分鐘，65°C10分鐘後再 用酚和氯仿抽提，經Sephacryl S-300柱純化後-20匸保存。
2. PCR擴增IL-2基因取製備好的PBLcDNA10pl，加入5'和3'擴 增引物各lpl( 30pmo1)、 IOX反應緩衝液5^1、 dNTP4pl、加水至50|iil， 94°C 5分鐘變性，力卩Pfu酶1U(2.5U)，進行30個循環反應.(94。C 45"、 55TM5"、 72'C1'20")。反應結束後，將反應產物用等體積苯酚/氯仿抽提一 次，乙醇沉澱。
3. IL-2 cDNA的克隆為了鑑定PCR產物的準確性，須先將產物克 隆入pUC18或pBluescriptDNA， 經DNA序列測定確認為IL-2 cDNA無 誤後再將這一片段回收，並與表達載體重組。故將PCR產物溶於TE，用 適當的限制性內切酶水解後，與用同樣酶水解過的載體DNA重組，轉化 TG1後塗於LB/AP平板，37t:培養過夜。
4. 質粒DNA小量抽提將一個單菌落接入含AP(50iag/ml)的3ml LB 中，37。C培養過夜。將菌液轉移至1.5ml離心管中，5000rpm離心2分鐘， 沉澱菌體。用lOOial溶液I懸浮菌體，再加200lal溶液II ，溫和顛倒混勻， 置於冰上，待溶液澄清後，加入150^1溶液m，充分混勻。15000rpm 10 分鐘離心，收集上清，用等體積苯酚/氯仿/異戊醇抽提一次，加2.5倍乙 醇混勻，沉澱。離心15000rpm 10分鐘，將沉澱用70%乙醇洗一次，水 泵抽乾，最後溶於20^ilTE，用200pg/mlRNase處理1小時，-20°<:存放。
5. 質粒DNA的大量抽提
(1) 接種培養將一個單菌落接種於3mlLB(含AP)中培養至對數晚期 (OD600"0.6)，取500|nl接種入50ml含抗菌素的LB中，同樣培養至對數 晚期，再取15ml接種入含相應抗菌素的1.5LLB中，培養過夜。
(2) 質粒抽提將1.5L培養物離心5500rpml0分鐘，收集菌體。用吸 水紙將離心管壁上殘餘液體擦乾。將菌體懸浮於30ml溶液I中，置室溫中 IO分鐘。加液-體II60ml，混合均勻後置冰上10分鐘。加溶液IIl45ml，置冰浴IO分鐘後，15000rpm離心IO分鐘。紗布過濾後取上清，加等體積異 丙醇沉澱，15000rpm離心10分鐘，用70%乙醇洗一次，真空乾燥。將沉 澱溶於20mlTE，加入等體積5M LiCl沉澱大分子RNA，在水浴中放置 IO分鐘，4°Cl5,000rpm離心10分鐘，取上清，用等體積異丙醇沉澱。離 心，乾燥，溶於5mlTE，加入RNase至200叫/ml， 37°C 30分鐘。加等體 積13%PEG(8000)/1.6M NaCl沉澱DNA，冰浴放30分鐘。離心沉澱，幹 燥後用TE5ml溶解，用苯酚、苯酚/氯仿/異戊醇、氯仿/異戊醇各抽提一 次。最後加1/10體積3MNaAc及2倍乙醇沉澱。-20匸保存。用時再 離心沉澱，溶於TE。
(3) CsCl超離心純化DNA: 如上述鹼法抽提的DNA，經LiCl純 化後，用於CsCl超速離心，按lg/ml的用量，加入固體CsCl， 3(TC溶解。 每10mlDNA加入0.8ml溴乙錠溶液(10mg/ml)， CsC溶液的最終密度是 1.55g/ml，折射率1.3860，溴化乙錠濃度約為704^g /ml。室溫8000rpm 5 分鐘，浮在溶液上的是溴化乙錠和蛋白質形成的複合物。將浮渣下的清亮 溶液用注射器吸入用於超離心的離心管中，用輕石蠟油補滿其餘部分，並 封口。 45000轉/分離心24 48小時(2(TC)。離心完畢，在普通光照下可 見兩條DNA區帶，下部區帶由閉環質粒DNA組成，用針頭插入此帶， 吸出至1.5ml管中，用等體積的經水飽和的正丁醇反覆抽提,直至粉紅色從 水相和有機相中消失。將水相加3倍TE稀釋，加2.5倍無水乙醇沉澱。離 心後用70%乙醇洗一次，抽乾後溶於TE， -2(TC保存。
6. 限制性內切酶反應根據不同的限制性內切酶選擇相匹配的緩衝 液。 一般取0.5 lpg DNA，限制性內切酶 5U，反應體積20jil， 37°C 保溫1 2小時，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳(含溴化乙錠0.5 l叫/ml)鑑定 酶切結果。
7. 凍融法回收酶切片段在紫外燈下將DNA片段從瓊脂糖凝膠中切 下來，加入100nlTE，在乾冰乙醇內凍結後置37°C15分鐘，反覆三次， 15000rpm離心10分鐘後吸出上清，加入1/10體積NaAc和2倍體積乙醇 沉澱，離心收集，沉澱經水泵抽乾後，溶於TE，即可進行連接反應。
8. DNA連接將等克分子數的待連接DNA混合，加入5XT4連接酶緩衝液4ixl，加水至20pl，加入T4DNA連接酶2U， 12。C連接過夜，即可 用於轉化。
9. 重組DNA的轉化
(1) 感受態細胞製備將培養過夜的受體菌250)al接種於50plLB中， 37°C1.5 3小時至對數中期，菌液置冰浴IO分鐘，5000rpm離心5分鐘， 沉澱菌體用1/2體積經預冷的100mM MgCl2懸浮，冰浴20分鐘，4°C 5000rpm離心5分鐘，將菌體懸浮於1/15 1/10體積的100mM CaCl2中， 冰浴中放60分鐘，即可用於轉化。
(2) 重組DNA的轉化將連接過夜的DNA加入lO(Hil感受態細胞， 混勻，冰浴中放置40分鐘，間或輕輕混勻，42'C2分鐘，塗布於含抗菌素 的LB平板上，37°C培養過夜。
10. 雙鏈DNA測序
(1) 雙鏈變性樣品DNA約1.5-2叫，溶於8pl ddH20，加2M NaOH 2pl， 置室溫'10分鐘，力卩3^1 3M NaAc中和，再加7plddH20後，力n 60pl乙醇 沉澱，離心15000rpm IO分鐘，抽乾後溶於10nlddH2O。
(2) 退火反應10pl變性模板，加2pl引物，2pl退火緩衝液，65°C， 5分鐘，緩慢冷卻至室溫。
(3) 延伸反應將退火後的反應液加入lplddH20標記混合物3pl、 T7聚合酶2pl(3U)、和0.5^1同位素(a-32p)標記的dATP，室溫反應5分鐘。
(4) 終止反應取上述反應液4.5^1至預先分裝好的4管分別標記有 G、 A、 T、 C的終止混合物中(各2.5^11)，混勻，37°C 5分鐘，加5|xl終止 液。在電泳上樣前樣品置75 80。C2分鐘變性。
第二步含IL-2重組逆轉錄病毒載體的組建。
將pLXSN用EcoRI和BamHI酶切，與經同樣酶切的IL-2相連接，重組載 體經酶切鑑定後含有正確的插入片段，命名為L(IL-2)SN。
實施例1
mRNA的抽提及cDNA的合成 (1) mRNA的抽提離心收集細胞，懸浮於1.5mlRNA抽提緩衝液，用注射器反覆抽打勻漿細胞，然後再補加3ml抽提緩衝液，充分混合，離 心1000 cpm5分鐘，收集上清。取Oligo (dT)-Cellulose Spun Column,混 合內容物，350g離心兩分鐘，棄去柱內液體，取4ml上清上柱，混勻，棄 去液體。然後用高鹽緩衝液洗三遍，低鹽緩衝液洗二遍，最後用經65°C預 熱的洗脫緩衝液洗脫三次，每次用0.25ml，收集洗脫液，然後乙醇沉澱 poly(A)十RNA(mRNA)。
(2) cDNA的合成將mRNA溶於ddH20中，65°C 10分鐘，置於 冰上備用。在第一條鏈反應混合液內加入lmlDTT和熱變性的RNA， 37 'C保溫1小時，再將此反應液加入第二條鏈反應混合液中，12°C和22°C 各保溫1小時，最後加lpl Klenow酶，37°C 30分鐘，65°C10分鐘後再 用酚和氯仿抽提，經Sephacryl S-300柱純化後-20。C保存。
實施例2 PCR擴增IL-2基因 取製備好的PBLcDNAlO)til，加入5'和3'擴增引物各lpl( 30pmo1)、 IOX反應緩衝液5^1、 dNTP4pl、加水至50|al， 94°C 5分鐘變性，力卩Pfu 酶1U(2.5U)，進行30個循環反應.(94。C 45"、 55。C45"、 72。Cl'20")。反 應結束後，將反應產物用等體積苯酚/氯仿抽提一次，乙醇沉澱。
權利要求
1.細胞因子cDNA重組反轉錄病毒載體的構建方法，其特徵在於，該反轉錄病毒載體cDNA為含信號肽的白細胞介素-2 cDNA。
2. 如權利要求1所述，其特徵在於，該病毒載體為缺陷型逆轉錄病毒載體LXSN。
3. 如權利要求l所述，其特徵在於，含信號肽的白細胞介素-2 cDNA有如下步 驟得到從人外周血分離得到單核細胞，經植物血凝素(PHA)刺激36小時後抽提總 mRNA。在體外合成cDNA，並以此為模板，使用含相應內切酶位點的白細胞介 素-2上下遊引物，以PCR技術擴增出含信號肽的IL-2 cDNA。
4. 如權利要求1所述，其特徵在於，該逆轉錄病毒載體可以用於製備治療用逆 轉錄病毒包裝細胞。
全文摘要
本發明提供了一種細胞因子cDNA重組反轉錄病毒載體的構建方法。從經PHA誘導的人外周血單核細胞中抽提mRNA，在體外合成cDNA，運用聚合酶鏈反應技術克隆了含有信號肽的白細胞介素-2 cDNA，並與缺陷型逆轉錄病毒載體LXSN進行重組，構建了含白細胞介素-2 cDNA的重組逆轉錄病毒載體L(IL-2)SN。
文檔編號C12N15/10GK101555488SQ20081003569
公開日2009年10月14日 申請日期2008年4月7日 優先權日2008年4月7日
發明者錢關祥, 陳詩書 申請人:上海交通大學醫學院;上海新生源醫藥研究有限公司