以少量精細胞對哺乳動物進行有性別選擇的授精的製作方法

2023-09-11 16:30:55 5

專利名稱：：以少量精細胞對哺乳動物進行有性別選擇的授精的製作方法
技術領域：
：本發明涉及哺乳動物後代的性別選擇。特別涉及低劑量人工授精和為繁殖所需性別的動物後代而增加產卵的方面。特別是本發明涉及無論使用何種分類技術，用低劑量實現性別選擇的人工授精、涉及為性別選擇經流式細胞計數術分類精子和低劑量人工授精系統，以及增加排卵結果的技術等。
背景技術：
：長期以來，人們一直希望能夠選擇動物後代的性別。除了明顯的心理因素，當考慮到諸如牛的食用動物以及戰利品動物，如馬等類似動物時，實際的哺乳動物後代性別選擇具有明顯的經濟學價值。由於存在這種巨大的需求，為獲得性別選定的後代人們進行了各種大量的努力。似乎最可能實現所需結果的工作集中在授精前分類和選擇X和Y精子。嘗試分類X和Y精子所面臨的一個挑戰是精子的數量很大。在自然授精中，有些動物種類產生數十億的精子；在人工授精中雖然使用精子較少些，但仍然需很大數目。例如，人工授精技術通常使用1千萬至5億個精子(取決於物種)。因此即使在人工授精環境中也需要極大數目的精子。已嘗試了許多方法來實現分離攜帶X-和Y-染色體的精子。這些方法包括諸如在美國專利號4276139中公開的磁性分離技術，在美國專利號5514537中公開的柱式(columnar)分離技術，在美國專利號3894529，再審專利號32350，美國專利號4092229，4067965和4155831中討論的重量分析技術。在US4083957中公開了對電學特性進行分析的嘗試，在美國專利號4225405，4698142和4749458中討論了結合電學和重力特性的分析。在美國專利號4009260和4339434中顯示了嘗試分析精子活力。諸如在美國專利號4511661和4999283(涉及單克隆抗體)和美國專利號5021244，5346990，5439362和5660997(涉及膜蛋白)，和美國專利號3687803，4191749，4448767，和4680258(涉及抗體)中顯示的化學技術，以及在美國專利號4085205中顯示的添加血清成分。儘管似乎提供了具有較高效力的各種技術，但事實上目前沒有一種技術達到性別預選所需的水平。然而，不論最終使用何種分離技術，自然存在的大量精子的競爭性結合和分離攜帶X—和Y—染色體的精子的研究使開發以少量精子實現授精成為可能。目前，用於實現分離攜帶X—和Y—染色體的精子的定量技術包括通過流式細胞計數術逐個辨別和分離精子。該技術隨著技術進步和發現攜帶X—和Y—染色體的精子對不同的染色劑吸收顯示出其可能性。這一點以前在美國專利號4362246中進行了討論且通過LawrenceJohnson在美國專利號4135759中公開的技術進行了重要的闡述。Johnson的這種利用流式細胞計數術分離攜帶X—和Y—染色體的精子的技術非常重要和先進，因為它首次使分離該精細胞在商業上成為可能。儘管仍然是實驗性的，但通過高速流式細胞計數器，如Cytomation公司生產的MoFk^流式細胞計數器已顯著增強了這種分離的效果且已在包括美國專利號5150313，5602039，5602349和5643796以及國際PCT專利申請W096/12171的各種其它專利中進行了討論。儘管利用Cytomation公司生產的MoFk^細胞計數器極大地增加了速率，且儘管這種速率增加與常用的高數量的精細胞特別相關，但仍然存在一些問題。用MoFl滻流式細胞計數器儘管幾乎可使速率增加10倍，但許多情況下需要越來越短的分類時間。首先，已發現作為實際問題，精子是時間關鍵性細胞。如果它們較長時間未用將失去效力。其次，收集、分類和授精的計時使速度在商業上有高度的重要性。因此，精細胞和該方法對時間要求的特性使速度成為實現高效率和成功率的至關重要因素。從實踐上到理論上還存在其它的問題。在實踐方面，需要使用廉價的可大量使用的物質獲得性別分類的精子樣品。在費用方面，還需要能以儘可能有效的勞動實現分類(以及收集和授精)。因此，為了該領域成功商業生產，可能僅提高效率的改進仍然是有意義的。關於實際費用，是整個方法實踐中最為棘手和敏感的方面。為此，需要簡化過程使其程序儘可能粗略，以便操作錯誤或技巧的影響不大。結合這些情況更加需要用較小量的精子進行授精。除了該方法的精密性外，己知精子本身是極其脆弱的細胞。儘管初看起來認為容易理解，但事實上該細胞的敏感性還沒有被充分認識。一般在流式細胞計數術進行中，大多數分類的細胞或顆粒通常呈球形而且能經受各種物理方法處理。但精細胞卻不是這樣。事實上，正如本發明所公開的，採用通常的流式細胞計數術的方法對於在某些應用中進行精細胞的細胞計數術分類是不可行的。細胞的稀釋、流式細胞計數儀需要逐個分離和鑑別細胞以及典型的流式細胞計數術在本身施加於被分類的細胞或其它物質的壓力均可改變其敏感性。這也說明精細胞的特性，因為看起來即使精細胞通過流式細胞計數器並被分類時沒有肉眼可辨別的副作用，但事實上這些細胞本身已經接受了壓力，使它們在授精過程中沒有達到最佳狀況。因此，這些因素的相互作用對於精細胞分類並最終用於人工授精產生了一些特有的問題。儘管Johnson的專利和有關技術取得了巨大的進展，但仍然存在另一問題，即用性別選擇的精子實現低劑量授精非常困難，無論使用何種分離技術。儘管有人曾經進行過低劑量授精，但似乎更多的是在理論上或實驗室中而不是用於實踐中或商業應用中。據此，不僅需要實現低劑量授精，同時要達到與目前不選擇性別的，高劑量人工授精同樣的受孕成功率。因此，本發明人在性別選擇和低劑量人工授精兩方面所取得的進展首次使商業應用成為可能。同樣，儘管Johnson的專利和有關技術取得了巨大的進展，但仍然面臨另一問題，即高成功率的人工授精受眾多因素相互影響，具有統計學特性。因此，建議的解決辦法在某種程度上可能涉及結合一些因素，在非常精確的統計學研究中顯示出某因素單獨存在或者與其它因素結合是必須的。這一決定進一步結合如下事實，即，該結果本身可隨物種而改變且由於在起初不可能有足夠多的數據進行試驗和統計學取樣的事實而難以確定。由於這些原因，本發明還涉及結合多種因素，這些單獨或結合的因素對特定的應用提供了合適的解決方法。因此認為本說明書是非常廣義的，可實現所公開的技術的各種組合和滲透。可能存在與其它因素的未知協同效應。這些因素可包括在分類中，或者存在於流式細胞計數器內，或在收集步驟及授精步驟中所涉及。目前，研究主要在牛類中進行，然而，並不認為這些技術將局限於這類物種，因為這項技術只與精細胞相關。除了精細胞外，該技術可應用於其它敏感細胞的分類或在細胞進行分類時使流式細胞計數術造成的壓力的影響減到最小。令人感興趣的是，當本發明採用的方法使分類的影響或對精細胞的壓力最小化時，其他人實際上通過增加壓力和對速度的需要及其它這種操作似乎採用的步驟偏離了這一方向。實質上，低劑量授精和高速處理的方式可能以單獨或者互相聯繫的方式造成互相限制的問題。因此，儘管對高速度、低劑量選擇性別的授精早有需要，而且認為技術不令人滿意，且儘管實現的技術和環境早己可獲得，但在本發明前這些技術的一些進展或者其組合被本領域的技術人員明顯的忽略了。也許在某種程度上他們沒有意識到這個問題涉及到多因素相互作用以及本領域涉及的細胞類型(精細胞或者也許是物種特異性精細胞)特有的必要性。有趣的是，正如本文中列舉以前的工作所顯示的，儘管進行了大量嘗試，但顯然其它人不理解這個領域固有的問題，如低劑量、選擇性別的授精等。也許他們假定，由於自然交配也許涉及幾十億精子，因此用少4個數量級的數目可能對於實現人工授精產生實質性的限制。因此，在某種程度上偏離本發明技術方向的實際做法可能並不奇怪。由於本發明的結果表明選擇性別、低劑量的人工授精的成功率與不選擇性別的，高劑量的人工授精相當，因此，也許該結果在一定程度上會被認為是意想不到的。更令人驚奇的是，本發明的技術和進展事實上均達到了所示的重大結果。儘管每個技術單獨看來不值得注意，但事實上，這些細微的改進導致在義的進展，無論是單獨的改進還是與其它微小的改進相結合。因此，本發明前的技術，對實現低劑量、選擇性別的人工授精的成功率不可能達到在商業應用時所必需的操作或簡化程序的水平。然而，除了實現在商業水平上的低劑量、選擇性別的人工授精外，本發明還公開了這樣的技術，該技術允許實現改進效果且因此有利於所需最終結果，即，在商業基礎上的低劑量、選擇性別的人工授精。
發明內容因此，本發明要求在商業水平上實現低劑量授精和預定哺乳動物性別的結果。本發明還提供了改進的外鞘液和收集系統，用於通過流式細胞計數器分離技術分類精細胞以確定其性別。在這種分離技術中，用於流式細胞計數器的典型外鞘溶液被分類時對精細胞的壓力最小化的液體取代。而且，改進了收集系統使精細胞受到的物理和化學壓力最小。本發明提供了多種技術和物質，但正如本領域的技術人員容易理解的，可根據物種，分離技術，目的和在具體處理應用中涉及的其它參數可使用各種組合和變換方式，使技術達到最優化。本發明的目的僅僅是實現用低劑量進行選擇性別的授精，並在現實的商業環境下進行。還有一個目的是實現更好地分類諸如精細胞等物質。一個相關的目的是使分類功能本身對細胞或其它可能被分類的敏感性物質的影響減到最小。對於流式細胞計數分類技術，一個特別的目的是減小外鞘液對細胞的影響並有效提供使細胞耐受各種壓力的外鞘液。一個類似的目的是提供特別適用於一般精細胞的物質和技術，並適用於牛精細胞及馬精細胞，還適用於將精細胞分離成攜帶X—或Y—染色體的成分。相似的一個目的是將收集期(分類後)對細胞的影響，特別是對已進行性別分類的精細胞受到的理化影響減至最小。因此，本發明的一個目的是獲得儘可能未受影響的分類結果。本發明的另一目的是實現低劑量的，分類的授精，其水平和成功率與典型的不選擇性別的高劑量的人工授精相當。圍繞這一目的，一個目8標是提供一個用於人工授精的總體系統，它能以商業上實際的方式達到該目的。因此，最小化對精細胞的壓力或潛在損傷的前期目標是重要的。以既提供高速度，又具有低分類壓力的方式進行分類也是一個重要的目標，特別適用於以低劑量的精細胞分類。提供對精子繁殖力無負面影響且適用於人工授精的外鞘液和其它液體，也是一個重要的目標。本發明的說明書的其它部分和權利要求書公開了本發明進一步的目的。圖1是用於本發明的流式細胞計數分離技術的分類器系統。圖2是典型的流式細胞計數器自由降落區的液流細胞圖。圖3是粗略顯示本發明結果差別的示意圖。圖4是在收集區域收集的已被分類的細胞流。具體實施例方式可見，本發明的基本概念可以結合併以各種方式體現。本發明僅僅涉及商業上實用的低劑量、選擇性別的授精及其結果。對於流式細胞計數分離技術，本發明還涉及改進的流式細胞計數器系統以及用於產生性別特異性精子樣品的系統，該樣品可用於人工授精並以這種技術繁殖動物。本發明包括在商業條件下也可獲得高成功率的總方法。而且，該技術是以通用的方式公開的，只要理解了其基本原則，可將其用於特定系統。儘管公開了裝置的改進，但應理解這些改進不僅完成某些工作，而且裝置可進行改變並以多種方式組合。重要的是，本說明書包括上述全部內容的各個方面。如上所述，基本目的是分離攜帶X—染色體的精子與攜帶Y—染色體的精子。這通過分離兩類精子以便分別進行包裝和處理來實現。目前，這種分離優選通過使用流式細胞計數術進行。一般來說，流式細胞計數術是一種人們熟知的技術，其基本概念在Cytomation公司的許多專利，如美國專利和以前列出的其它文獻中均有公開。這裡引用各專利和參考文獻以供參考；因此，本領域的技術人員容易理解其所涉及的基本原理。基本上，流式細胞計數術包括分類物質，例如細胞，通過某種細胞源提供給流式細胞計數器。圖1是該儀器示意圖。該流式細胞計數器包括細胞源(O，用於產生或提供細胞或其它類型的物質供流式細胞計數器分析。細胞儲存在噴嘴(2)內，以便細胞可被外鞘液(3)包圍。外鞘液(3)通常由某種外鞘液源(4)供應，以便細胞源(1)供應細胞時，噴嘴(2)同時供應外鞘液(3)。以這種方式很容易理解外鞘液(3)如何形成圍繞細胞的外鞘液體。由於以一定的壓力給流式細胞計數器供應各種液體，因此它們流出噴嘴(2)並在噴嘴口(5)噴出。經過提供某種類型的振蕩器(6)可在噴嘴(2)內形成壓力波且在噴嘴口(5)處將液體傳遞出噴嘴(2)，其中該振蕩器可通過振動控制器(19)極精確地控制。由于振蕩器(6)作用於外鞘液(3)，最終流出噴嘴口(5)的液流(7)均勻地形成液滴(8)。由於細胞被外鞘液環繞，液滴(8)可含有分離的單獨的細胞或其它物質。由於液滴(8)—般含有分離的細胞，流式細胞計數器根據是否含有某種細胞對液滴進行鑑定和分離。這通過細胞傳感系統(9)實現。細胞傳感系統至少包括某種類型的傳感器(10)，它對各液滴(8)內的細胞發生反應，在LarryJohnson的初期工作，即美國專利5135759中已進行了詳細的討論。正如Johnson的專利對精細胞的描述，細胞傳感系統(9)根據一種特定染色劑相對存在或不存在可產生反應。這種染色劑可被某些刺激劑激活，如雷射激發器(11)。儘管各類精細胞均被該染色劑染色，但X—染色體和Y—染色體的不同長度使得染色的程度不同。因此，根據精細胞的染色程度，通過它們不同的發射水平可以區分攜帶X—染色體的精子和攜帶Y—染色體的精子。為了實現用流式細胞計數器分離技術最終分離出合適的細胞，傳感器(10)接受的信號提供給某種類型的分類器區別系統(12),該系統極迅速地作出判斷並根據液滴(8)內是否存在所需細胞而對各液滴(8)有區別地充電。分類器區別系統(12)以這種方式作用於靜電偏轉板(13)，根據液滴中是否含有合適的細胞或其它物質來偏轉液滴(8)。結果，流10式細胞計數器通過使細胞落入一個或多個收集器(14)中來分類細胞。因此，通過檢測細胞或其它物質的某種特性，流式細胞計數器可根據具體特徵區分細胞且將它們放入合適的收集器(14)中。在目前用於分類精子的系統中，攜帶X—染色體的精子的液滴被充正電且因此偏向一方，攜帶Y—染色體的精子的液滴被充負電且因此偏向另一邊，廢液流(未分類的細胞)未充電且因此以不偏轉的液流收集進吸管等裝置中。參照圖2，可更進一步了解該方法。如該圖所示，由於有振蕩器(6)(圖2中未顯示)，噴嘴(2)噴出液流(7)形成液滴(8)。由於細胞源(1)(圖2未顯示)可供應根據Johnson技術染色的精細胞(15)，傳感器(10)測定到不同的經雷射激發器(11)產生的光刺激，這樣，當液滴(8)從液流(7)中分離時，流式細胞計數器就能控制每個液滴(8)存在或不存在電荷。根據其內容物分出帶正電，帶負電和不帶電的液滴(8)。如圖2所示，某些液滴顯示為偏轉的液滴(16)。這些偏轉的液滴(16)含某種性別的精細胞(15)。然後將它們儲存在合適的收集器(14)中備用。對於精細胞分類應用特別重要的流式細胞計數術的一個方面是流式細胞計數器的高速運轉。Cytomation公司商標為MoFl滻的流式細胞計數器取得了特別的進展。這些流式細胞計數器顯著增加了分類速度且因此使得流式細胞計數術在精細胞分類的商業應用中(以及其它商業應用)成為可能。流式細胞計數器實現了高速分類，即速度比未用流式細胞計數器時顯著增高。尤其是，Cytomation公司的MoFlo⑧流式細胞計數器使用的振蕩器頻率約大於5千赫茲，更具體地說可在10—30或甚至在50千赫茲的範圍內運轉。因此以極高的頻率形成液滴且被外鞘液包圍的細胞可非常迅速地從噴嘴(2)噴出。選擇組成流式細胞計數器系統的每一部件如噴嘴(2)，振蕩器(6)以產生高速細胞分類器。高速細胞分類器應用於分類精細胞細胞時，可實現大約每秒500次分類以上的分類速率。事實上，通過高速細胞分類器已實現了1000至1200次的分類速率。重要的是，應理解"高速"是一個相對的術語，隨著流式細胞計數術的發展和實際應用，"高"是可變的或保持不變的。每種定義的一般原則是，當對特定的細胞，如精細胞進行分類時，分類是以流式細胞計數器的參數和物理性質對細胞本身有意義的速率進行的。用流式細胞計數器分離技術分類精細胞時起作用的高速分類的一個方面是在流式細胞計數器內精細胞所受到的壓力。例如，當高速運轉時，流式細胞計數器可以每平方英寸50磅、60磅，甚至更高的壓力運轉。這樣的壓力認為是高的，因為對被分類的細胞可產生影響。對於這一方面本發明的關鍵技術在於特定細胞的壓力閾值是決定的因素。而且，隨著獲得進一步的知識，將表明壓力閾值是綜合效應的函數如特定物種或對細胞進行的特定的預處理或後處理。關鍵是事實上細胞所受的壓力改變了其活力和達到所需結果的能力。對於壓力，當對精細胞施加更高壓力時，可能導致流式細胞計數器分類細胞的效果下降。本發明使這些壓力降到最小，從而得到了下文中提到的更高的效率和更低的劑量。考慮到細胞的壓力方面，本發明以使壓力最小化的方式進行。可在整個周期中或在收集、分類甚至給動物授精的過程中的任意時間點這些壓力可被最小化。重要的是，在流式細胞計數器內處理細胞而產生的壓力對於這種應用似乎是明顯的。在本發明的一個實施方案中，特別選擇了外鞘液使其與分類前後的兩種細胞液體環境(或之一)的壓力一致。儘管可自然調節分類前或者分類後的液體，但在本發明的一個實施方案中調節外鞘液(3)，使對細胞產生的壓力比以前產生的明顯更小。在一個方面，本發明的意義在於它將全部注意力從對流式細胞計數器操作轉移到處理和轉移細胞本身的壓力上。例如，儘管已知使用具有合適pH值或滲透壓的液體，但本發明認識到可能存在對細胞反應過強的化學成分。可根據細胞或甚至在細胞處理前自然改變這些反應過強的化學成分。重要的是，目前對於精細胞，似乎某些代謝的化學成分，如擰檬酸鹽可防止對細胞產生異常高的壓力。因此，反應過強的化學成分可定義為在其功能性環境中和隨後存在的處理技術中對細胞存在特定反應的成分。對於精細胞，似乎代謝成分，特別是檸檬酸鹽對牛精細胞的穩定性和HEPES緩衝液對馬精細胞的穩定性非常重要。因此，本發明通過選擇操作類型或者選擇使細胞經歷的變化最小的物質，使細胞的改變最小。根據本發明的一個實施方案選擇一種物質使外鞘液在化學上協調使引起的變化最小。因此，經過選擇合適的外鞘液，不僅流式細胞計數術的參數中，而且細胞參數的本身均改善了細胞的變化和分類的總體結果。圖3中概念性地顯示了這一點。圖3顯示了存在於該方法的各個時期的一些化學因素類型(例如擰檬酸鹽或其它因素)，例如，顯示的四個時期代表流式細胞計數術分離技術所顯示的下列時期，但不受其限制I期代表細胞源(i)內存在的細胞，n期表示在外鞘液環境中分類時存在的細胞，m期表示分類後收集的細胞，iv表示分類後在儲存培養基中重建的細胞。現有技術所表示的這四個時期可以經歷區別極大的化學因素環境。然而，如圖所示，在本發明中細胞經歷了極小的變化，最顯著的是沒有i和n期之間經歷的溶液或液滴。這是選擇合適的外鞘液的結果。因此，由於使用了合適的外鞘液，本發明的細胞受到的壓力更低。對於該現象可能存在的一個潛在的普遍性是某些化學成分比其它成分具有更高的敏感性。儘管根據精子的種類、操作方式，甚至是細胞的類型這種敏感性可自然變化，但用於所需目的(本文是人工授精)時細胞的活力改變極大，這種改變可以是自然的或者由於分類引起或兩者都有，因此，細胞對該化學成分表現出敏感性。通過選擇某些代謝的化學成分，最顯著的是擰檬酸鹽或檸檬酸循環中的化學物質，可出現極大的改進。因此，在牛精子應用中，選擇並調配外鞘液(3)使其含有大約2.9%的擰檬酸鈉成分。具體地說，2.9%的檸檬酸鈉溶液製備方法如下1、將29.0克檸檬酸鈉二水合物(Na3C6H507'2H20)放入1000ml燒瓶中；a將檸檬酸鈉溶於3/4體積的水中，然後加水至總體積；2、加入去離子水或純淨水至1000ml終體積；3、轉移到瓶中並在151bs壓力下高壓滅菌(245°F)至少30分鐘；a在使溶液最少蒸發的條件下進行高壓滅菌(未密閉時)；b注意使水不沸騰掉；4、在室溫下慢慢冷卻；5、在5"C的冷環境中密封儲存；另外，對於外鞘溶液，可過濾檸檬酸鈉溶液。6、採用無菌技術用0.22微米濾器過濾。有趣的是，對於馬精細胞，上述溶液不合適。另外，己發現對於馬精細胞，HEPES緩衝培養基，如HEPES牛配子培養基，特別是以前由J丄Parrish為應用於牛而製備的HBGM3較合適。該培養基在文章"用肝素保存牛精子"，生殖生物學38，1171(1988)中進行了討論，本文作為參考文獻引用。這不僅是令人驚奇的，因為它與用於牛精子的物質不是相同的物質類型，而且實際上該緩衝液最初是為應用於牛而研製的。因此，用在馬精子中，選擇的外鞘液含有HEPES緩衝液。該溶液在室溫下PH值約7.54(39。C時pH-7.4)，其成分如下化學物質乾重(e/500ml)CaCl20.145KC120.115MgCl2.6H200.004NaH2P04.H20O扁NaCl2.525丙酮酸鈉0.011乳酸(60%)1.84mlHEPES4.765NaHC030.420BSA(V部分)3.0可對本發明造成影響的另一方面是所用的細胞可能具有異常敏感性。一種考慮是，這可能是由於精細胞是一類不能修復的細胞。即，它們沒有自我修復能力，因此，處理時它們可能需要比流式細胞計數器或其它處理裝置處理一般細胞時更敏感。因此，當流式細胞計數器或其它分離裝置建立精細胞源時，應當進行改進。精細胞這類細胞特有的另一潛在的相關方面是其DNA不能修復、不能複製且不能轉錄。上述每一種因素都可能起作用或單獨或同時造成影響。因此，本發明的技術可應用於所有配子細胞或甚至是病毒及類似的不能修復、不能翻譯、不能轉錄的細胞。用流式細胞計數器處理重要方面是分類後應採用適當的化學和物理方法處理細胞。如圖4所示，液滴(8)內的細胞進入收集器(14)時，重要的是收集器的容器大小要適當，以避免細胞和容器本身之間的影響。儘管已知將起始收集器液體(17)放入容器的底部，收集細胞時就不會衝撞容器的底部，但也可使用簡單地加寬容器的方法起到這種作用，因為這樣可以改變液流出現及細胞衝擊容器時不可避免出現的飛濺。這樣就起到了緩衝的作用，可以恰當地處理細胞，因為細胞對機械衝擊十分脆弱，即它們受衝擊易破裂或損傷。因此，當細胞計數器細胞源分離出細胞時，若被分類的細胞物事性質脆弱，重要的是提供某種緩衝因素，如加寬的收集管，其開口(18)寬敞以避免容器壁與細胞接觸。這樣，收集管的管壁不會靠的太近，被分類的細胞與管壁之間就不會存在任何明顯接觸。所以，除了要有收集器液體(17)夕卜，還可以用粗的收集管。也許僅僅提供寬開口的容器用作收集器的部件就已足夠。用於高速分類精細胞時，已發現開口內徑至少15毫米的容器是足夠的。特別是在該應用中使用14mlFalcon收集管時，發現該收集器(14)對細胞具有最小的物理損傷。應注意即使是14mlFalcon收集管可能也不是最佳的。具體地說，據認為設計適合液流幾何形狀的收集容器(即"液流適配容器")可能是最佳的。這種液流適配容器可具有任一或全部下列特徵相對較寬的噴嘴口，橢圓性的噴嘴口，高與寬的比率比現有技術的更小，成一定角度或與液流方向協調，例如側壁與下落的液流平行等。還需要提供一種支架部件，如可動部件或類似於滾珠軸承的工具等，可以使收集管變化方向適於收集所需的下落的液流。另外，這類容器，例如，其中的收集管(以"Falcon-型"收集管為例)不僅要求有一定寬度，而且對製成收集管的材料也有要求(如用不粘附細胞的聚苯乙烯)等。(已知14mlFalcon收集管用該材料)。因此，該容器和其收集液對減小細胞的物理損傷也起到了緩衝作用，其大小也有利於收集足夠的精子而無明顯的稀釋效應。收集液(17)的另一作用是減小對細胞的化學壓力。由於分類前和15分類後給細胞提供營養是重要的，因此可選擇同等營養水平的收集液使分類前和分類後的營養平衡。對於牛精子，使用含2%卵黃的卵黃檸檬酸鹽作為營養成分，已發現使用6%的卵黃檸檬酸(即在檸檬酸鹽溶液中有6%的卵黃含量)效果很好。這是因為細胞分類前後體積不同。收集器液體(17)開始(分類前)體積約為2ml。細胞分類後可增加大約2倍的體積(最終是起始體積的3倍)，溶液中卵黃檸檬酸鹽極少(由於阻塞流式細胞計數器的其它原因)。因此，卵黃檸檬酸鹽含量水平的最終結果相當於起始結果，即按體積在檸檬酸鹽溶液中有2%的卵黃含量。因此選擇收集液(17)的最佳營養成分應與起始的營養成分或其它液體環境平衡。這種方式使細胞分類的時間最短，液體成分改變最小。自然，這種液體環境可在流式細胞計數器內提供或在分類前提供給細胞，重要的是使細胞在其生命周期中任意時間所受的壓力都最小。而且，由於可改變化學物質的起始含量(例如，可增大或減小檸檬酸鹽中的卵黃含量百分數)，同樣也可改變起始收集液環境或體積使最終結果相同。因此，在開始分類前，收集器液體為含6%的卵黃的檸檬酸鹽溶液，分類後，含有性別特異性精子的收集器液體是含2%卵黃的檸檬酸鹽溶液，與起始營養成分含量相當。應注意由於其它原因後來的使用中可將這些精細胞在有20%卵黃含量的檸檬酸鹽溶液中處理，但這些改變並不對細胞產生壓力，因為它們僅僅是總體授精過程的一個已知部分。本領域的技術人員容易理解可自然改變該含量，20%的卵黃檸檬酸鹽緩衝液的組成如下；I最終組成80%檸檬酸鈉溶液(72mM)20%(體積/體積)卵黃II製備l升溶液A擰檬酸鈉溶液1將29.0克檸檬酸鈉二水合物(Na3C6H507'2H20)放入1000ml燒瓶中。2加入去離子水或純淨水至1000ml終體積。3轉移到瓶中並在151bs壓力下高壓滅菌(245°F)至少30分鐘a在使溶液最小蒸發的條件下(覆蓋不嚴時)進行高壓滅菌；b注意使水不沸騰掉。4在室溫下慢慢冷卻。5在5'C的冷環境中密封儲存。B雞蛋的準備1採購新鮮雞蛋。2洗去雞蛋的髒物(不用過多去汙劑)並漂洗。3將雞蛋浸入70%乙醇中2—5分鐘。4取出雞蛋晾乾(或擦乾)，置於乾淨的毛巾上。C製備擴充液l使用無菌，乾淨的玻璃製品。2A—組分(無甘油組分)a將800ml2.9%檸檬酸鈉溶液放入1000ml量筒中。b擴充液無甘油組分(A—組分)的抗生素含量為i泰樂菌素二100ng/mlii慶大黴素^500嗎/mliii林可黴素一奇黴素-300/600iag/mlc加入200mlD部分新製備的卵黃i徹底混合d這樣提供了以2.9%檸檬酸鈉，20%卵黃和抗生素為基礎的A一組分擴充液，(已知抗生素濃度對牛精子無毒性)。e擴充液可在5'C儲存過夜。f第二天傾析上清液(800ml以上)。g第二天用前加溫到37'C。D向緩衝溶液中加入卵黃，可使用下列程序。l洗滌雞蛋並使其乾燥(見上面B)。2打開雞蛋並用卵黃分離器分離卵黃和蛋清。或者，可在兩個打開的半殼中來回傾倒卵黃。不要使卵黃周圍的膜破裂。3將卵黃放在15cm的無菌濾紙上。174將濾紙片放到含有緩衝液的量筒上並擠壓卵黃(使膜破裂)使卵黃過濾進量筒中。一般一個雞蛋可獲得大約12—15ml卵黃。可在本發明的各種因素中互相影響的另一方面是使用低劑量的精子進行人工授精等。在RupertRAmman和GeorgeE.Seidel，Jr.,Colorado聯合大學出版社(1982)的"哺乳動物精子分類的前景"中可發現關於選擇性別的人工授精的其它背景。正如所述，自然授精涉及的精子數為幾十億。目前典型的人工授精，牛用幾百萬的精子進行，馬用幾億精子進行。術語"低劑量"指進行授精比典型的人工授精所用的精子劑量不足其一半，甚至不足其10%的數目。因此，"低劑量"是根據典型的人工授精劑量對比，或者也可以看作是絕對數目小。目前牛的劑量是1百萬到1千萬精子，低劑量可認為是絕對數目大約500,000精子或者低至300,000精子甚至更低。事實上，通過應用本發明的技術，以IOO，OOO和250,000個精子進行的人工授精已顯示出成功率較高(懷孕率分別為41%和50%)，正如48Theriogenology1255(1997)文章"用極低數目的非冷凍的及選擇性別的精子對小母牛進行子宮角授精"所示。由於精細胞似乎顯示出對稀釋有敏感性，這些結果特別顯示了本發明的各種技術互相依賴於使用低劑量的精子樣品。絕對數目根據不同物種，對於馬，只需約不足二千五百萬、或一千萬、或五百萬，甚至一百萬個精子，這被認為是低劑量方法。另外一個重要方面是用本發明的技術選擇性別的精子被用於人工授精系統。因此對於流式細胞計數技術，當收集器(14)用於提供人工授精的精子時，本發明的技術特別適用。而且可將人工授精用途與在低劑量環境中的用途結合起來產生使本發明的各種技術非常協調的協同效應。自然，選擇性別的精子不僅在人工授精方式中應用而且在其它技術，例如體外授精等中應用。用流式細胞計數術或其它分離技術收集、分類和最終給動物授精的方法包括各種步驟。給牛授精時，首先用人工陰道收集牛的精液，每毫升大約15億個精子。用分光光度計檢査乾淨的精液以測定濃度並通過顯微鏡檢評估以保證滿足合適的遊動性和活力標準。然後加入抗生素。每次射精產生大約60-70%活躍精子,的起始樣品。用某種類型的TALP(tyrode白蛋白乳酸丙酮酸)稀釋可得到約1億/ml操作濃度的精子數(用於流式分析)。TALP不僅給精細胞提供營養，而且可使它們在染色步驟中高度活化。在某些物種，如馬精液中，染色前可進行離心。根據復染或單染方法進行染色，後者是Johnson的專利和有關技術的主題。也可調配擴充液以形成合適的營養環境同時進行染色。在牛應用中，可在染色後立即在檸檬酸鹽溶液中加入大約20%的卵黃成分。而且，在精細胞染色中，己發現使用較高的染色量可達到比預期更好的結果。高濃度染色包括使用數十微摩爾濃度的染色劑，如在下面實施例中所討論的，使用了濃度為38微摩爾的Hoechst33342染色劑。加入染色劑後，培養一段時間，如在34。C下培養1小時以加速染色劑吸收，濃度為每毫升大約1億個精細胞。然後進行過濾以去掉精細胞團塊，隨後進行稀釋或擴充到每毫升大約1億個精細胞的所需分類濃度。然後用上述各種技術進行分類，在收集期回收精細胞。如上所述，收集可產生大約含2%卵黃檸檬酸鹽的樣品(對於牛物種)。離心將樣品濃縮到每毫升大約3-5百萬個精細胞，之後去掉外鞘液和保護液。然後用20%卵黃檸檬酸鹽或康奈爾通用擴充液(CornellUniversalExtender,縮寫為CUE)等進行最終擴充。康奈爾通用擴充液每1000ml具有如下組成14.5g二水檸檬酸鈉2.1gNaHC030.4gKCl3.0g葡萄糖9.37g甘氨酸0.87g檸檬酸對於20%的卵黃組合物，可使用800mlCUE和大約200ml卵黃。最後這次擴充後，得到每毫升3—5百萬個精子(牛)。然後冷卻該樣品以減緩精子的代謝，使其可較長期限內使用。在馬物種中，可在輸卵管中或按本領域的技術人員均理解的其它授精方法使用該樣品。在牛精子中，該樣品可被再稀釋一次至所需劑量濃度。已發現，稀釋可對精細胞活力造成影響，因此可用較少量樣品授精，以避免過分稀釋。目前不論使用何種分離技術，可獲得每0.184ml約300,000個精子的低劑量。而且，需要維持大約5%的精漿濃度，目前已滿足了該要求。然後可將精細胞樣品放在細管中用於人工授精和運輸給待授精的奶牛或小母牛。為了實現便利的定時人工授精，可使用已知技術同步小母牛或奶牛的發情期，例如根據本領域眾所周知的技術使用前列腺素F2oc。這種物質特別有價值，已報導它能有效增強母牛的生育力，文章"前列腺素F2oc——種奶牛的生殖藥物？"Theriogenology，18，245(1982)在此所為參考。儘管最近的研究結果未強調這一理論，但本發明證實在選擇性別的低劑量授精情況下特別有價值。對於牛，通過使用胚胎移植裝置將精細胞深深地植入子宮角內可實現人工授精。授精時間可不在典型用於人工授精的峰值時間進行，而晚一些進行，如晚12小時後進行，因為選擇性別的人工授精可能在稍晚發生。也可使用胚胎移植裝置，因為子宮壁對這種低劑量、選擇性別的授精具有較高的敏感性。還可以結合該技術實現高效繁殖。特別是，現在發明的允許高速分類和選擇性別的胚胎低劑量授精的方法也可用於超排卵的動物。使用超排卵藥物或任何其它技術可實現超排卵。超排卵藥物可直接或間接作用，例如，通過反應鏈實現高於正常產卵。精子與超排卵結合是令人驚奇的，因為以前認為超排卵阻礙了該結合。在超排卵牛中精子傳輸受到影響，因此，對動物進行人工授精往往需要進行多次和/或用成倍的劑量。另外，以前確定精子性別的過程相對較慢；因此，測定用超排卵藥物(如FSH即卵泡剌激素)處理的母牛一次人工受精後的受精率是有意義的，所用的精子是上述新技術的組合而得到的性別選擇的未冷凍的精子，總數僅600，000個。例如，用如下標準方法使12個Angus雜種小母牛超排卵:在發情期第9天和第12天之間以半天的間隔肌肉內注射6，6，4，4，2，2，2和2mgFSH;第6和第7次FSH注射時同時肌肉內注射25和12.5mg前列腺素F—2oc。繁殖力未知的公牛精子用Hoechst33342染色然後用MoFlo流式細胞計數器/分類器分類每秒產生每種性別700—800活精子。平均分類純度為所需性別的89%。經過650g離心10分鐘將分類的精子濃縮到203.36xl(^個精子/ml，冷卻到5°C，並儲存4小時。然後將184ul裝入0.25ml塑料細管中；使用自動側向開口的胚胎移植鞘在發情後20—24小時將一半的劑量注入各子宮角中。發情期後7或16天以標準的非外科手術方法收集胚胎。在第7天和第16天之間收集的結果相似，分類的X—及Y—精子數量也相似。從9隻小母牛回收胚胎。有52個正常發育的胚胎(平均，4.3±5.3個/供體)，13個發育延緩的胚胎和31個未受精的卵。使用Y一染色體特異性的DNA序列的引物經PCR測定46個胚胎的性別；43個(93%)為所需性別。儘管該研究只用了少量動物，令人驚奇的是，對排卵過多的小母牛僅用總數為600，000個(活的)選擇性別的未冷凍精子授精，得到與常規方法相似的結果。也可對上述方法進行改變，包括通過非流式細胞計數術方法分類精子，以其它方式實現超排卵，以其它方式增加受精等，但不限於這些方法。而且，根據DNA成分確定精子性別的準確性，高速流式細胞計數器/細胞分類器，以及以低於500,000個的總精子數授精母牛而不影響其繁殖力的方法使得幾年內確定牲畜性別的活精液在產業上成為可能。以>85%的精確率選擇性別的精子將具有非常廣闊的應用前景。也許最明顯的是為得到雌性後代，給一種牛(既產奶又產肉型)授精，為得到肉用雄性牛，使另一種牛(既產奶又產肉型)繁殖出完全不同的公牛類型。上述的一種極重要的牛是用攜帶X—染色體的精子授精母牛產生雌性牛犢，其難產發生率比雄性牛犢低，主要因為其體積較小。而且，母牛犢出生率的數量優勢證明了雄性年輕種奶牛的效率更高。具有85%以上的母奶牛也使經營奶牛成為可能。因為奶牛在其壽命中平均繁殖不超過兩隻存活牛犢，這是具有吸引力的，因為減少了與妊娠和分娩有關的問題。經營單一性別的肉牛繁殖系統也將成為可能，每隻雌性牛用於繁殖並在2至3歲間屠宰，因此，在該系統中大量的營養用於肉牛生長，較少量用於維持種群。性別選擇的精液可用於體外授精和對超排卵的奶牛用於胚胎移植。常常是某一種性別的牛犢比另一種性別的更有價值，儘管己有準確定胚胎性別的方法，但既費時，且產生了半數是性別價值不高的胚胎。據推測如果選擇性別附加的費用較低且生育力受到的影響很小，精確選擇性別的精液將廣泛用於牛的人工授精。隨著性別選擇的精液的出現，人工授精的肉牛會大量增加。令人感興趣的是，不在通常植入子宮體內進行授精，而是在子宮角內深處授精可獲得更好的結果。還有，由此進一步研究的樣品顯示在子宮角內深處同側和對側授精沒有區別。用胚胎移植設備可很好地放入子宮角。由於在同側和對側授精的結果沒有明顯差異，因此本發明人提出在雙側都可進行人工授精，不必去鑑別合適的子宮角。進行人工授精當然希望繁殖出所需性別的動物。根據上述方法通過使用選擇性別的精液就可以達到此目的。還應理解本發明的技術還可應用於其它技術，例如，腹腔鏡授精，輸卵管授精等。下面的實驗作為實施例。儘管此處未全部描述本發明的每個方面，但通過介紹本發明不同方面的內容，確實顯示出效果改進，而且，一些實驗小結已寫入參考文獻"用極少量的未冷凍且選擇性別的精細胞對小母牛進行子宮角授精"中。該文章歸納的一些數據表明了本發明的效果。關於實驗，如下所述，用選擇性別的、未冷凍的精細胞進行的人工授精具有較高的成功率實施例1用25毫克前列腺素F—2cx以12天的間隔給月齡13—14，中等大小的Angus母牛用藥，使其同步發情，並且在觀察到出現發情期後6—26小時授精。將從3個14_26個月齡的公牛新收集的精液加入到38微摩爾/升的Hoechst33342中，在TALP培養基中以75xl(^個精子/毫升在34°C溫育1小時。使用在50psi下操作的MoFlo⑧流動細胞計/細胞分類儀，並且用2.9%檸檬酸鈉作為外鞘液，在來自150mW下以351和364納米的雷射激發的落射螢光的基礎上分類性染色體而分類精子。以約500個活精子/秒的速度收集帶X染色體的精子(經再分類超聲波處理的精子等分試樣證實，純度約90%)至2毫升含100微升CornellUniversalExtender(CUE)和20%卵黃的Eppendorf管。將收集的精子以600xg離心10分鐘，並且在CUE中再懸浮到1.63xl0S活精子/毫升。對於液體精液性別未分類的對照，將Hoechst33342染色的精子用外鞘液稀釋到9><106個能動精子/劑量)，在35i:解凍30秒，並且授精到子宮體中。2個授精者輪流用3隻公牛精液進行操作，對於性別選擇的精液和兩種對照精液以3:2:2母牛數的比例授精。在授精後31—34天用超聲波確定受孕，在64—67天可分辯出胎牛性別時進一步證實。數據表示在表中。tableseeoriginaldocumentpage23a、b間具有顯著性差異(P0.1)。性別選擇和冷凍對照組中的受孕數在64—67天時各減少了一個；在性別選擇組中19個胎牛中有18個是雌性(95%)，而對照組中30個胎牛中僅有20個是雌性(67%)。液體精液對照組懷孕率與含有高50多倍能動精子(總精子超過120倍)的冷凍精液對照組有實質上相同的懷孕率，證明了在子宮角中低劑量授精的效率。利用流式細胞計技術和人工授精，我們已經明顯改變了牛的性別比例。同樣，用來進行性別選擇的非冷凍精細胞進行了實驗，報導如下實施例2實驗目的是在理想的實地條件下，確定用極低數目的冷凍精子對母牛授精時的受孕率。將生殖力高於平均數的三隻Holstein公牛的精液加入勻槳的牛奶、7。/^的甘油(CSS)擴充液中，再加5%的同源精液漿液中擴充，製成每0.25毫升French細管中含2xl05、5xl05、或1(^106(對照)總精子的三種授精樣品，然後在流動的液氮蒸發器中冷凍。在37'C水中解凍精液20秒。利用25毫克前列腺素F—2—a(Lutalyse⑧)在12天的間隔注射月齡13—15，體重350—450公斤的Holstein母牛兩次，在檢測到發情後12或24小時，利用胚移植細管槍和側開口的鞘授精，將一半精液深入到每個子宮角中。在5個月中重複實驗5次，在兩個授精技術人員交替進行。孕育的環境溫度往往是一IO到一20。C，所以必須小心保持授精儀器溫暖。在發情後40—44天超聲波檢測到能成活的胎牛確定受孕，在發情後55—62天進一步確認，在這段時間202個受孕數少了4個。55一62天時每次授精2xl05，5xlS和10xl06個總精子的受孕比例是55/103(53%),71/101(70%)，和72/102(71%)(P<106個總精子的精液作對照。將擴充完全的精液裝入改進的0.25毫升塑料French細管，可每次釋放出0.1或0.25毫升授精劑量。將精液冷卻到5t:，在收集後26—27小時使用。每次25毫克前列腺素F—2a(Lutalyse⑧)以12天的間隔注射月齡13—15，體重350—450公斤的Holstein小母牛，用胚移植細管槍和側開口鞘在檢測到發情後24小時在一側子宮角授精。授精在與發情後12小時超聲波確定的最大卵泡同側；在發情後7—9天超聲波檢測到黃體證實了排卵的一側。在發情後42—45天超聲波檢測到胎牛確定懷孕。實驗重複了四次，由三個授精技術人員輪流進行。在225個小母牛中有205個準確地確定了排卵側(91%);驚人的是，同側和對側授精懷孕的比例幾乎相同。對於lxl05，2.5xl05禾卩2.5x106個精子/授精(PX).l)懷孕比例是38/93(41%)，45/87(52°/。)，和25/45(56%)。不同技術人員操作，母牛懷孕比例有明顯的差異(P0.05)，但在用不同公牛精液沒有差異。用上述方法，減少每次授精的精子數，使用流式細胞計數儀分類的精子用於商業是可能的。從上述各種實驗可以看出，實施結論根據實地結果統計得出。因此還可設計一些實驗方案，對上述實驗方案進行適當的綜合與限制。這樣，可以使各種影響因素起到進一步協同作用。例如，可以研究染色劑和與雷射激髮結合的染色劑的影響。本發明申請所討論的只是基本的說明。讀者應理解特定的實驗並不能清楚敘述所有可能實施的方案，本發明這些實驗包含了許多可以替代的情況。本申請也沒有完全解釋本發明的全部性質，不可能明確顯示每個特徵或要素如何代表了更廣的功能範圍或多種可替代或作用相同的要素。實際上，這些都包含在本發明中。在本發明著重敘述某設備時，該設備的每個部件都包含著一種功能。有關設備的權利要求不僅包括設備本身，也包括方法、步驟以說明本發明及每個部件的功能。說明及術語都不限於權利的範圍，應理解在未脫離本發明的精神下可作各種改變，這些改變都包含在說明書中，仍落入本發明的範圍。本發明公開的範圍既包括了直接的實施例，大量可替代的隱含的實施方案，也包括了方法和步驟等。此外，本發明中的每一部分也可用多種方法去實現。應理解為包括每種改變，任一設備方案的改變、方法的改變，或這些要素中的任一改變。尤其是，在本發明公開的申請文件中，每項內容都可以用意義相同的儀器術語或方法術語表示，即使僅有功能或結果相同。這種意義相同，範圍寬甚至更概括的術語應認為包含於說明書中每項內容中。在本發明所包括的廣義的範圍中需要明確之處，可以替換這些術語。應該理解，一切行動都可以用完成這個行動的手段或引起這個行動產生的因素來表示。同樣，所公開的每項實際內容應理解為包括了該實際內容所導致產生的行動。例如，公開了"收集器"，應該理解為包括了"收集"這個行為，無論文中是否已直接討論過這種行為。反之，如果僅公開了"收集"，應理解為也公開了"收集器"。這種變化和可替代的術語應理解為已清楚的包括在說明書中。另外，應該理解，除了最初提出的權利要求，權利要求可擴展為更廣泛的範圍，至少i)如本文公開和敘述的裝置，ii)公開和敘述的有關方法，iii)與每個裝置和方法相似的、相同的和暗含變化的裝置、方法，iv)完成公開和敘述的每個功能的那些可取代的設計，V)隱含了完成公開和敘述的每個功能的那些可取代的設計和方法，Vi)分開和獨立的發明所示的每個特徵，組成和步驟，和vii)上面每項的各種結合和變換。為有助於理解本發明，各種公開的參考文獻可能是有幫助的。這些參考文獻在下面列出了，並且引入本文作為參考；但是，在敘述與這些發明的專利不一致的情況下，可以認為這些陳述明顯不出自該申請人。可能有幫助的參考文獻包括美國專利5660997;5589457;5514537;5439362;5346990;5135759;5021244;4999283;4749458;4688142;4680258;4511661;4448767;4362246;4339434;4276139;4225405;4192749;4155831;4092229;4085205;4083957;4067965;4009260;3894529;3687806;RE32350。有幫助的參考文獻可以包括下面出版物"利用非常少的非冷凍精子授精Holstein小母牛"G.E.Seidel,Jr.，C.H.Allen,Z,Brink,J.K.Graham，和M.B.Cattell，克羅拉多州立大學，FortCollins,大西洋育種公司，Lancaster,PA.,DUODairy,Loveland，CO.1995年7月；"用X禾口Y小牛精子人工授精"，G.E.Seidel，Jr.,L.A.Johnson,C.A.Allen,G.R.Welch,M.D.Holland，Z.Brink和M.B.Cattell,動物繁殖和生物技術實驗室，克羅拉多州立大學，FortCollins,CO;Germplasm和種質和配子生理學實驗室，ARS，USDA，Beltsville，MD;大西洋育種公司，Lancaster,PA;DUODiary,Loveland，CO，USA1996年1月；"利用非常少的冷凍精子授精小母牛"G.E.Seidel，Jr.，C.H.Allen,Z.Brink，M.D.Holland，M.B.Cattell,克羅拉多州立大學，FortCollins,大西洋育27種公司，Lancaster,PA，DUODairy,Loveland，CO，1996年7月；"利用流式細胞計分類和未分類的精液低劑量子宮內授精繁殖山羊"，D.G.Cran，W.A.C.McKelvey,M.E.King，D.F.Dolman,T.G.McEvoy，P,J.Broadbent禾卩J.J.Robinson,Mastercalf,Craibstone，Bucksburn，Aberdeen,AB219TN，UKScottish農業學院，Craibstone，Bucksburn，Aberdeen。AB219YA，UK，獸類遺傳學，第267頁；"利用非常少的非冷凍和性別選擇的精子子宮角授精小母牛"，G.E.Seidel,Jr.,C.H.Allen，L.A.Johnson,M.D.Holland,Z.Brink，GR.Welch,J.K.Graham和M.B.Cattell，克羅拉多州立大學動物繁殖和生物技術實驗室，大西洋育種公司，Lancaster,PA17601,種質和配子生理學實驗室ARS，USDA，Beltsville，MD20705,DUODiary,Loveland,CO80538,獸類遺傳學48:1255—1264，1997;"利用Hepqrin的是小牛精子獲能"，J丄Parrish,J.Susko-Parrish,M.A.Winer，和N丄.First,威斯康星大學肉類和動物科學系，麥迪生，WI53706,繁殖生物學38，117_1180(1988);"前列腺素F2a——種乳牛的繁殖藥物？"，K.L.Macmillan和A.M.Day,Ruakura動物研究站，PrivateBag，Hamilton，紐西蘭，獸類遺傳學，1982年9月，18巻，第3期，245—253頁；"選擇性別的哺乳動物精子的遠景"，克羅拉多聯合大學出版社，克羅拉多州立大學，獸醫和生物醫學科學動物繁殖實驗學院，FortCollins,CO,80523RupertP.Amann和GeorgeE.Seidel，Jr.，編輯，1982年；"卵黃擰檬酸鹽和牛奶擴充液對冷藏公牛精子的染色質結構和存活率的影響"，乳品科學雜誌74:3836，D,S.Karabinus和D.P.Evenson和M.T.Kaproth;"在流動細胞計分類細胞過程中測定公羊和公豬精子"，Reprod.DomAnim32:251;"利用限量pLH補充的純化pFSH進行山羊超排卵"，獸類學，43:797，M.A.Nowshari，J.RBeckers和W.Holtz;"綜述在哺乳動物中預選擇性別"，Dtsch.tierarztl.Wschr.103:285，L.A.Johnson。在整個說明書中，除非本文需要，詞"含有"或"包括"、"包含"，將理解為包括所述的部分或整體，或包括了幾個部分、幾個整體的組合，但並不表示排斥任何其它部分、整體或部分、整體的組合。權利要求1.為分類所需的細胞改進的流式細胞計數儀系統，包括a.提供流式細胞計數儀分析細胞的一種細胞源；b.為所述細胞創造一種外鞘液環境的外鞘液源，含有hepes緩衝培養基；c.一個噴嘴，進入所述外鞘液環境的所述細胞可以通過其噴出；d.一個振蕩器，當所述外鞘液通過所述噴嘴時作用於該外鞘液；e.一個能夠作用於所述精子細胞的精子細胞識別系統；f.一個可以分出所需特性細胞的分類區別系統；g.放置具有所需特性細胞的收集器。2.權利要求1所述的為分類所需細胞改進的流式細胞計數儀系統，其中所述的細胞源包括馬精子細胞。3.權利要求1所述的為分類所需細胞改進的流式細胞計數儀系統，其中所述的細胞源包括對其液體環境中的化學成分高敏感的細胞。4.權利要求1所述的為分類所需細胞改進的流式細胞計數儀系統，其中所述的收集器用於供應低劑量的精子。5.權利要求4所述的為分類所需細胞改進的流式細胞計數儀系統，其中所述的噴嘴、振蕩器、細胞識別系統和分類區別系統是流式細胞計數儀系統的組件，其中所述流式細胞計數儀系統包括一個高速細胞分類器。6.根據權利要求1所述的系統產生的性別分類的精子樣品。7.根據權利要求6所述的性別分類的精子樣品，其中所述的收集器用於供應低劑量的精子。8.根據權利要求6所述的性別分類的精子樣品，其中所述的噴嘴、振蕩器、細胞識別系統和分類區別系統是流式細胞計數儀系統的組件，其中所述流式細胞計數儀系統包括一個高速細胞分類器。9.使用根據權利要求1所述的系統產生的性別分類的精子樣品繁殖的哺乳動物。10.權利要求9所述的哺乳動物，其中所述哺乳動物通過使用低劑量的精子繁殖。11.權利要求9所述的哺乳動物，其中所述的噴嘴、振蕩器、細胞識別系統和分類區別系統是流式細胞計數儀系統的組件，其中所述流式細胞計數儀系統包括一個高速細胞分類器。12.為分類所需的細胞改進的流式細胞計數儀系統，包括a.提供流式細胞計數儀分析細胞的一種細胞源；b.為所述細胞創造一種外鞘液環境的外鞘液源，包括一種含有hepes緩衝培養基的溶液；c.一個噴嘴，進入所述外鞘液環境的所述細胞可以通過其噴出；d.—個振蕩器，當所述外鞘液通過所述噴嘴時作用於該外鞘液；e.—個能夠對所述細胞起反應的細胞識別系統；f.一個可以分出所需特性細胞的分類區別系統；g.放置已分類的具有所需特性細胞的收集器。13.為分類所需的細胞改進的流式細胞計數儀系統，包括a.提供一種供流式細胞計數儀分析馬精子細胞的細胞源；b.為所述細胞創造一種外鞘液環境的化學協調的外鞘液源，含有hepes緩衝培養基；c.一個噴嘴，進入所述外鞘液環境的所述細胞可以通過其噴出；d.—個振蕩器，當所述外鞘液通過所述噴嘴時作用於該外鞘液；e.—個能夠對所述細胞起反應的細胞識別系統；f.一個可以分出所需特性細胞的分類區別系統；g.收集具有所需特性細胞的收集器，該收集器內有一種含hepes緩衝培養基的收集液，用於提供低於1000萬精子的劑量。其中所述的噴嘴、振蕩器、細胞識別系統和分類區別系統是流式細胞計數儀系統的組件，該系統以每秒至少500個的速度分類所述待分析的細胞，並以每平方英寸至少50磅的壓力進行操作。全文摘要本發明提供一種以少量精細胞對哺乳動物進行有性別選擇的授精技術，特別是以商業上可實施的方式並用以前認為在商業上不可能實現的精子劑量進行人工授精，繁殖性別選擇的哺乳動物後代。本發明通過採用精子性別選擇的分類技術，還實現了超數排卵、產生多個胚胎以得到選擇性別的胚胎。本發明的授精技術結合了包括改進外鞘液的技術和其它使精細胞壓力最小化的技術，改進了精子收集系統和收集技術，實現了精子樣品及其所繁殖的動物在商業上的應用。文檔編號G01N15/14GK101504407SQ20081012806公開日2009年8月12日申請日期1998年12月31日優先權日1997年12月31日發明者麗沙·赫裡克夫,喬治·E·賽德,約翰·申克申請人:Xy公司;科羅拉多州州立大學研究基金會