生產一種白細胞介素類似物的方法

2023-09-11 12:43:45 3

專利名稱：生產一種白細胞介素類似物的方法
技術領域：
本發明涉及一種人白細胞介素2類似物和利用基因工程技術生產該類似物的方法。
背景技術：
白細胞介素2(也稱T細胞生長因子，本文簡稱IL2)是T細胞在凝集素或同種抗原刺激下產生的一種淋巴因子，IL2可以使T細胞在體外長期生長時保持功能不變。此外IL2促進胸腺細胞有絲分裂，使裸鼠脾細胞重新生成T細胞依賴抗原的抗體(T細胞替換因子)，促進殺傷細胞分化和增殖(殺傷輔助因子)。已經利用IL2克隆出殺傷T細胞克隆、輔助T細胞克隆和自然殺傷細胞克隆。除直接應用與T細胞或自然殺傷細胞克隆外，IL2可以用於某種抗原特異的殺傷T細胞的選擇性生長，例如殺傷T細胞在體外識別一種腫瘤抗原並破壞腫瘤細胞。向動物體內注射利用IL2刺激出的腫瘤特異性殺傷T細胞，可能抑制和防止腫瘤生長。IL2還可以刺激IFNγ生成並激活自然殺傷細胞。
以上實驗數據顯示IL2可作為一種抗腫瘤製劑。IL2可以恢復缺少胸腺功能的裸鼠中輔助T細胞的功能或恢復均一細胞誘導的殺傷T細胞，因此IL2可以用於治療免疫性疾病。
重組人白細胞介素2在臨床上治療癌性胸腹腔積液以及腎癌、黑色素瘤等疾病已經得到應用，隨著應用的深入，逐漸呈現出不足1)劑量偏低，療效不顯著，重組人白細胞介素-2因其疏水性等問題難以製成高劑量製品，造成臨床效果不明顯；2)雜質含量較高，天然hIL-2基因序列所編碼的rhIL-2蛋白一級結構中含三個半胱氨酸(Cys)，分別位於58、105和125位，其中第58和105位Cys的巰基形成的二硫鍵對rIL-2生物學活性至關重要，125Cys的巰基呈游離狀態，很不穩定，在某些情況下可與58或105位的巰基錯配形成雜質，從而使IL-2活性降低，影響用藥效果。
在IL2序列的125位進行胺基酸改造，例如將原來的Cys替換為丙氨酸或絲氨酸，改造後的胺基酸不會與第58或105位Cys錯配，大大降低雜質含量，此類產品已經在臨床上獲得應用。此外，上世紀八十年代協和發酵株式會社公開了在IL2蛋白的第1至第5位胺基酸缺失可以提高IL2的生物活性。因此一種N端缺失並且在第125位突變的白細胞介素2類似物具有更高的生物活性和更低的雜質含量。
通過細菌表達製備白細胞介素2的方法是已知的。常規方法基於蛋白質在大腸桿菌(E.Coli)中表達後以包涵體的形式或直接存在於細胞質中。對於以包涵體形式存在的白細胞介素2，由於蛋白分子不能正確摺疊而沒有生物活性，必須從細胞內分離出包涵體，採用高濃度變性劑溶解包涵體，然後除去變性劑或降低變性劑的濃度，使包涵體蛋白得以復性，再進行離子交換層析、親和層析、反相高效液相層析、分子排阻層析等步驟純化才能獲得可用於臨床的製品。其中包涵體蛋白的復性和純化是整個過程中的核心。
目前重組蛋白生產中普遍存在的問題是(1)復性效率低。傳統的復性方法包括稀釋法和透析法。稀釋復性法對樣品幾十倍，甚至上百倍的稀釋會使樣品的體積急劇增大，給後續的分離純化帶來很大的困難，而且復性過程中需要較大的復性容器。透析法耗時較長，而且要多次更換透析溶液。這兩種方法的共同缺點是蛋白質在復性過程中會發生聚集而產生大量沉澱，復性效率低，通常蛋白質的活性回收率只有5～20％，而且復性後的蛋白質溶液中含有大量的雜蛋白，需要進行進一步的分離純化。(2)生產成本高，設備投資大。由於復性和分離純化分別單獨進行，而且分離純化步驟多，每一步都需要有與之配套的設備，致使設備投資大，生產成本高。隨著生產規模的增加，這種弊端會愈來愈嚴重。
上世紀九十年代初，我國首先有報導將高效疏水相互作用色譜(HPHIC)用於變性蛋白的復性，很好的解決了上述問題，現已成功用於重組人幹擾素γ、重組人粒細胞集落刺激因子、重組牛朊病毒等重組蛋白的純化工藝中。此後，排阻色譜法、離子交換色譜法和親合色譜法也有用於蛋白質的復性和同時純化中。但應用疏水色譜法對白細胞介素2類似物同時進行復性和純化的方法尚未見報導。疏水色譜法應用蛋白質表面某一部分具有疏水性、在高鹽濃度下與凝膠骨架上交聯的丁基、苯基結合的原理。
與傳統的稀釋法及透析法比較，用疏水色譜法進行白細胞介素2類似物復性的優點是①在進樣後可很快除去變性劑；②由於凝膠骨架上疏水基團對變性蛋白質的吸附，可明顯地減少、甚至完全消除復性過程中蛋白質聚集體和沉澱的產生，從而提高蛋白質復性的質量，顯著降低聚體和單體雜質含量；③在蛋白質復性的同時可使目標蛋白質與雜蛋白分離以達到純化的目的，使復性和純化同時進行；④便於回收變性劑，以降低廢水處理成本。簡言之，疏水色譜法復性可以提高白細胞介素2類似物的純度、降低雜質含量，將蛋白復性和純化集成在一步操作完成，縮短了操作步驟和生產時間，減少了設備投資，使生產成本大大降低。

發明內容
本發明的目的是提供一種人白細胞介素2類似物和利用基因工程技術生產該類似物的方法。本發明進一步提供一種應用柱上復性的方法製備白細胞介素2類似物的方法。本發明進一步提供一種純化比活性不低於1×108國際單位/毫克蛋白的白細胞介素2類似物的方法。
具體步驟包括1)合成編碼白細胞介素2類似物核苷酸序列的基因，2)細菌細胞的發酵，3)包涵體的提取和純化，4)疏水色譜法復性和純化包涵體，5)離子交換層析，6)凝膠排阻層析。
本發明不限於使用大腸桿菌，也包括使用能夠表達包涵體形式的異源蛋白的任何原核微生物。
發明詳述表達重組人白細胞介素2類似物的基因利用化學方法合成。將IL2類似物基因片段連接入商業化原核表達質粒中，這些質粒包括但不限於pTrc、pBAD、pTac、pET、pT7、pL等；將重組質粒轉染入宿主菌，這些宿主菌包括但不限於DH5α、JM109、JM103、HB101等。
步驟1發酵本發明方法中進行發酵的菌株在使用之前以冷凍乾燥物形式保存以維持其表達能力。使用時，用適當緩衝溶液溶解後接種於固體培養基上，擴大至所需要量後開始發酵。
發酵條件包括合適的培養基、溫度、pH值、溶解氧等。發酵培養基是商業化且可以有效使用的已知培養基。優選的是含有蛋白腖、酵母提取物、甘油、磷酸緩衝鹽等的混合培養基。培養基中添加一種或幾種抗生素。優選的是50-200μg/ml的氨苄青黴素。發酵溫度是適宜原核微生物生長的30-42℃。本發明中優選的是37℃。發酵期間pH應保持在中性(6.4-7.4)。發酵過程中罐壓為常壓，溶解氧保持在20-60％，優選的是50％。由於在攪拌下進行發酵，優選使用消泡劑。
發酵過程中，隨著微生物生長，培養物的光密度增加。根據光密度可以監測發酵進展程度。通常選擇測量光密度的波長為600nm。本發明的方法中，將微生物培養至對數期時開始誘導表達。通常微生物在這一時期600nm的光密度可達到1以上，本發明中優選的是光密度達到15以上時開始誘導。根據所選用的質粒，誘導的方法包括加入誘導劑或改變培養溫度。誘導時間2-10小時，本發明中優選的是加入誘導劑異丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導3-6小時。
誘導結束後，離心培養物，取細胞進行下列步驟。
步驟2提取和純化包涵體表達的白細胞介素2類似物以不溶解的包涵體的形式存在於細胞質中。因此，本發明提供了細胞裂解、包涵體回收和洗滌。
洗滌細胞並懸浮於適當的緩衝液中，優選含有0.001mol/L乙二胺四乙酸及其鈉鹽(EDTA)和二硫蘇糖醇(DTT)的中性或弱鹼性(pH6.5-9.0)緩衝液。用凍/融、弗氏壓碎器、超聲處理或其它類似已知技術裂解細胞。向裂解後的細胞懸浮液中加入上述緩衝液。低溫(2-10℃)高速(10000-15000rpm)離心10-40分鐘，棄掉上清液，沉澱用上述緩衝液懸浮。重複離心和懸浮步驟。獲得的包涵體用含有DTT的變性劑溶解。本發明中優選的是含有0.001mol/L DTT的8mol/L尿素(pH6.5-9.0)。
步驟3包涵體的復性和純化溶解的包涵體裝入疏水層析柱。可以使用任何商業化的疏水層析介質，只要其容量、填料和流速的特徵類似於Phenyl Sepharose6 Fast Flow層析柱、ButylSepharose4 Fast Flow層析柱、OctyleSepharoe4 Fast Flow層析柱、Macro-PrepMethyl HIC Support層析柱、Macro-Prep t-Butyl HIC Support層析柱等。本發明優選的是Butyl Sepharose4 Fast Flow層析柱。應用含有DTT的變性劑洗滌並平衡該色譜柱，復性是通過降低變性劑的濃度並在適當濃度的氧化劑存在下實現的。本發明中優選的是用5-20倍柱體積的線性梯度由8mol/L尿素-0.001mol/L DTT過渡到2mol/L尿素-0.005mol/L穀胱苷肽，最後用0.1mol/L PBS-2mol/L尿素(pH7.5)洗脫蛋白。通過測定280nm的吸光度來自動監測各物質的洗脫。
步驟4離子交換層析收集富含活性形式的白細胞介素2類似物的來自前面步驟的組分裝入離子交換層析柱上。可以使用任何商業化離子交換層析介質，只要其容量、填料和流速的特徵與本發明所述方法條件相容。本發明中優選的是SP-Sepharose或CM-Sepharose。應用無機鹽等度洗脫可以除去部分雜質並將目的蛋白濃縮。本發明優選的是用0.1-0.3mol/LNaCl洗脫目的蛋白。
步驟5凝膠排阻層析收集富含活性形式的白細胞介素2類似物的來自前面步驟的組分裝入凝膠排阻層析柱上。可以使用任何商業化凝膠排阻層析介質，只要其容量、填料和流速的特徵與本發明所述方法條件相容。本發明中優選的是Sephacyl S-200。應用凝膠排阻的特性可以除去單體或聚體雜質並去除殘餘的有機溶劑或無機鹽。本發明優選的是用0.01mol/L磷酸鹽緩衝液洗脫目的蛋白。
按照上述方法獲得的白細胞介素2類似物大腸桿菌汙染物不高於0.0005％，純度可達到99％以上，比活性可達到1×108國際單位/mg蛋白以上。
具體實施例方式
下面依靠實施例描述本發明，然而，實施例僅僅舉例說明，沒有限制的目的。
實施例1發酵下列步驟涉及發酵和誘導重組白細胞介素2類似物的方法。
材料培養基由下列組成(每1L)蛋白腖12g酵母提取物24g甘油 4mlKH2PO42.31gK2HPO412.54g50％MgSO4.7H2O 4ml純化水加適量至1L。
大腸桿菌菌株是DH5αpETIFN。
接種取一管冷凍乾燥的DH5αpETIFN懸浮於1ml上述培養基中。懸液塗布LB平板，37℃培養35-50小時後接種於含50μg/ml氨苄青黴素的上述培養基中，置搖床100-300轉/分、37℃培養5-10小時，再擴大至接種發酵罐的需要量。
在下列條件下實施發酵培養基上述培養基+50μg/ml氨苄青黴素+10μl/L消泡劑溫度37℃溶解氧50％pH6.4-7.4
誘導在下列條件下實施誘導OD600大於15誘導劑1mM IPTG誘導時間3-6小時誘導期間pH值、溫度和溶解氧與發酵期間相同。
誘導結束後3000g離心20min收集菌體。
實施例2提取和純化包涵體材料裂解液0.05mol/L Tris.HCl-0.001mol/L EDTA-0.001mol/L DTT(pH7.5)變性溶液0.05mol/L Tris.HCl-8mol/L尿素-0.001mol/L DTT(pH7.5)超聲處理裂解細胞。向裂解後的細胞懸浮液中加入裂解液。低溫(2-10℃)高速(14000rpm)離心30分鐘，棄掉上清液，沉澱用裂解液懸浮。重複離心和懸浮步驟3次。獲得的包涵體用變性溶液溶解。
實施例3包涵體的復性和純化材料和參數波長280nm層析介質Butyl Sepharose4 Fast Flow上柱樣品溶解的包涵體，體積不超過柱體積的10倍流速1cm/min緩衝液A0.1mol/L PBS-2mol/L(NH4)2SO4-8mol/L尿素-0.001mol/L DTT(pH7.5)緩衝液B0.1mol/L PBS-2mol/L(NH4)2SO4-2mol/L尿素-0.005mol/L穀胱苷肽(pH7.5)緩衝液C0.1mol/L PBS-2mol/L尿素(pH7.5)溶解的包涵體裝入金屬螯合層析柱。用緩衝液A洗滌並平衡該色譜柱。接著用15倍柱體積的線性梯度由緩衝液A過渡到緩衝液B，最後用緩衝液C洗脫蛋白。通過測定280nm的吸光度來收集洗脫峰。
實施例4離子交換層析材料和參數波長280nm層析介質SP Sepharose上柱樣品前面步驟(實施例3)含活性形式的重組白細胞介素2類似物的洗脫峰流速1cm/min緩衝液A0.02mol/L醋酸鹽緩衝液(pH3.0)緩衝液B0.02mol/L醋酸鹽緩衝液-0.15mol/L NaCl(pH3.0)收集來自前面步驟的洗脫峰裝入離子交換層析柱上。用緩衝液A洗滌並平衡色譜柱，用緩衝液B洗脫目的蛋白。通過測定280nm的吸光度來收集洗脫峰。
實施例5凝膠排阻層析材料和參數波長280nm層析介質Sephcryl S-200上柱樣品前面步驟(實施例4)含活性形式的重組白細胞介素2類似物的洗脫峰流速0.5cm/min緩衝液0.01mol/L PB-0.02％SDS(pH7.5)
收集來自前面步驟的洗脫峰加入SDS溶液至終濃度0.02％並用NaOH調節pH值至7.5，裝入凝膠排阻層析柱上。用緩衝液洗滌並平衡色譜柱後洗脫目的蛋白。通過測定280nm的吸光度來收集洗脫峰。
實施例6汙染物、純度和比活性測定殘餘大腸桿菌蛋白測定用抗大腸桿菌菌體蛋白抗體包被酶標板，封閉後加入樣品和菌體蛋白標準品，37℃孵育2小時，洗板後加入HRP酶聯抗大腸桿菌菌體蛋白抗體，37℃孵育1小時，洗板後加入底物，37℃孵育40分鐘，加入硫酸終止液終止反應，將酶標板放入酶標儀中，選擇492nm波長進行檢測，以標準品濃度A為X值，OD492nm為Y值，輸入回歸方程y＝a+bx中，計算得上述製備的白細胞介素2類似物樣品中菌體蛋白殘留量為0.0003％。
純度測定製備SDS-PAGE電泳膠，分離膠濃度為12.5％，濃縮膠濃度為4.5％。樣品和樣品緩衝液按3∶1的比例混勻後100℃水浴3-5分鐘，向加樣孔中加入樣品10μg。以恆流10mA開始電泳，當溴酚藍染料前沿進入分離膠後將電流調至20mA，直至溴酚藍染料到達分離膠底部。電泳膠進行考馬斯亮藍染色。用掃描儀進行掃描處理，上述製備的白細胞介素2類似物純度為99.6％。
比活性測定在96孔細胞培養板上，每孔加入2倍系列稀釋的白細胞介素2標準品和白細胞介素2類似物樣品50μl。CTLL-2細胞用RPMI1640培養液洗滌3次後配成細胞濃度為6×105個/ml的細胞懸液，加到96孔細胞培養板上，每孔50μl。在含5％CO2的37℃孵箱中培養18-24小時。每孔加入20μl MTT溶液，繼續在含5％CO2的37℃孵箱中培養4-6小時。每孔加入裂解液150μl，在含5％CO2的37℃孵箱中保溫18-24小時。混勻細胞板中的液體，放入酶標儀，以630nm為參比波長，於570nm處測定光吸收度。數據採用電腦程式或四參數回歸計算法進行處理計算樣品活性。按Lowry法測定樣品的蛋白濃度，計算樣品的比活性。上述製備的重組白細胞介素2類似物的比活性1.2×108IU/mg蛋白。
人白細胞介素2類似物胺基酸序列表1 Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp21 Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu41 Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu61 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu81 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu101 Thr Thr Phe Met Cys Glu Thr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg121 Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr。
權利要求
1.一種利用大腸桿菌表達並應用疏水層析純化和生產一種在胺基酸序列上與人白細胞介素2類似的蛋白的方法，包括下列步驟1)化學合成編碼白細胞介素2類似物的核苷酸，2)對含有編碼人白細胞介素2類似物核苷酸序列的大腸桿菌進行發酵，3)提取包涵體，4)應用疏水層析柱進行復性和純化，其特徵在於步驟(4)中包涵體的復性在疏水層析柱上完成並同時實現包涵體純化，並且純化後的蛋白比活性不低於1×108國際單位/毫克蛋白。
2.根據權利要求1，蛋白類似物具有胺基酸序列Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln LeuGlu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile AsnAsn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys PheTyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys LeuGlu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala GlnSer Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn IleAsn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe MetCys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu AsnArg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
3.根據權利要求1，蛋白類似物在大腸桿菌中表達。
4.根據權利要求1，大腸桿菌表達的蛋白類似物用疏水層析進行復性和純化。
5.根據權利要求1、4的方法，其中所述的在疏水層析柱上進行復性的條件是降低變性劑的濃度並添加適當的氧化劑。
6.根據權利要求1、4、5的方法，其中所述的變性劑是尿素，還可以是鹽酸胍、十二烷基硫酸鈉，其中的氧化劑是穀胱苷肽。
7.根據權利要求1，純化後的蛋白類似物的比活性不低於1×108國際單位/毫克蛋白。
全文摘要
一種利用大腸桿菌表達並應用疏水層析純化和生產一種在胺基酸序列上與人白細胞介素2類似的蛋白的方法，純化後的蛋白比活性不低於1×10
文檔編號C07K14/435GK101045923SQ20061004622
公開日2007年10月3日 申請日期2006年3月31日 優先權日2006年3月31日
發明者蘇冬梅, 閻峰, 侯緒鳳 申請人:瀋陽三生製藥有限責任公司