一種新的研究腸道免疫穩態的動物模型的製作方法
2023-09-12 03:18:10 1
專利名稱：一種新的研究腸道免疫穩態的動物模型的製作方法
技術領域：
本發明通過基因條件剔除技術建立一種新的研究腸道免疫穩態的動物模型，屬於生物技術領域。
背景技術：
人類的腸道是ー個重要的免疫器官，包含多種免疫相關細胞，在維持全身免疫穩態中發揮重要作用。消化道在日常生活中受到外界免疫原的持續刺激，以及各種共生菌的抗原刺激，但能通過特定的機制維持ー種免疫抑制的狀態，從而形成一個特別的免疫耐受的微環境，稱為腸道的免疫穩態。腸道上皮層不僅形成一個阻礙病原侵入的物理屏障，同時也包含特異的天然及獲得性免疫系統。保持免疫的非活化狀態，需要對腸道內免疫細胞和上皮滲透性的正確調控。特定的淋巴結構，如小腸中派伊爾氏結和結腸中分立淋巴結節等，對腸腔中抗原進行篩選和分析，從而調節上皮中M細胞的分泌功能最終調節免疫能力。腸道免疫疾病是ー個綜合的多種發病機制導致的疾病，對腸道免疫的擾亂可導致各種形式的免疫疾病，如潰瘍性結腸炎，克羅恩氏病，炎性小腸炎等，並且與結腸癌的早期分化有較高的相關性。確定的原因始終是不明了的，腸上皮的滲透性増加可能具有一定的作用。同時，腸道內淋巴小節增生也是ー種較為罕見的腸道免疫紊亂形式，表現為黏膜層及黏膜下層的大量的淋巴細胞浸潤，形成堅實的淋巴增生聚集，包含不同大小的生發中心，以B細胞為主要細胞類型。腸道淋巴結節增生的病理原因也並不明確，可能與細菌的持續感染有關。
最近其它類型的細胞也被證明可參與調節腸道免疫，如基質細胞對於T細胞腸道歸巢具有重要的調節作用，結腸肌成纖維細胞也具有抗原呈遞功能，這些發現提示腸道免疫的調節是ー個多種細胞參與的複雜生物過程。平滑肌是普遍存在於全身多種組織中的細胞類型，對消化道、膀胱、血管等組織具有維持形態、收縮蠕動等物理功能，同時在生理及病理條件下也具有重要的分泌能力，可參與調節炎症、動脈硬化等病理過程，是細胞因子、血小板因子等多種因子的不可或缺的來源。腸道平滑肌對腸道免疫的調控作用的了解並不充分，因此更多的深入研究是十分必要的。PTEN是ー個脂酶、蛋白酶雙功能酶，通過直接調節PIP3並負調控PI3k/Akt/mT0R信號通路，調節細胞的増殖和凋亡，從而達到其重要的抑癌功能。在腸道免疫調節的研究中，大部分都集中在對腸淋巴細胞和上皮細胞的功能上，對平滑肌的關注相對較少，而我們在平滑肌細胞中特異性剔除PTEN後發現該小鼠自發產生腸道淋巴結節增生及全身免疫活化的表型，說明平滑肌也是重要的參與調節腸道免疫的細胞類型，同時PTEN對調節腸道免疫的信號通路也具有直接而必需的調控作用。通過對下遊基因的研究，我們推測PTEN下遊重要的調節腸道免疫的因子是單核細胞趨化蛋白-1 (MCP-1)，PTEN缺失的平滑肌細胞中MCP-1的表達量增加，從而導致T淋巴細胞活化增生。該小鼠模型不僅一定程度上掲示了平滑肌調節腸道免疫的作用機制，更成功地模擬了人類中結腸淋巴小結增生的病理現象，是穩定可靠的動物模型，可用於對免疫抑制類藥物功能的研究。
發明內容
本發明的目的是提供人類腸淋巴細胞小結增生的可能機制機理，對病理研究提供分子基礎。本發明的另ー個目的是提供一種穩定可靠的小鼠模型，成功模擬人類病理過程。本發明的有益效果本發明利用基因剔除技術，發現平滑肌細胞在腸道免疫穩態的調節中具有重要作用，得到模擬人類病理過程的工具小鼠，可用於不同類型的免疫抑制類藥物研究，開拓了病理分析和藥物篩選的道路。
圖1為小鼠平滑肌細胞特異剔除PTEN基因的基因型鑑定結果。圖2為PTEN基因剔除後腸道淋巴結節增生過程。圖3為PTEN基因剔除後淋巴結節內淋巴細胞的具體構成類型。圖4為PTEN基因剔除後腸道炎性細胞浸潤增加，腸上皮細胞滲透性増加圖5為PTEN基因剔除後分子水平的具體變化。
具體實施方式
·小鼠的飼養和繁育PTEN條件錨定小鼠及a-SMA-Cre轉基因小鼠由中國軍事醫學科學院楊曉研究員惠贈。C57BL/6J購自Jackson實驗室(美國)，飼養在AAALAC認證的SPF級的動物房裡，動物房位於南京大學模式動物研究所。所有的小鼠操作均嚴格按照「 Principles oflaboratoryanimal care」 (美國國立衛生院發行號85-23,1985修訂版；http://grantsl.nih.gov/grants/olaw/references/phspol.htm)和『『the careand use oflaboratory animals」(美國國家研究理事會，1996).並得到了模式動物研究所動物管理委員會的批准和監瞀。實施例一我們通過多聚鏈式擴增反應(PCR)技術對條件剔除小鼠進行基因型鑑定，在平滑肌細胞裂解提取得到的基因組DNA中特異地擴增出PTEN剔除後條帶，所使用的PCR引物序列為PTENdeleted :5，-ACTATTGAACAGAATCAACCC-3，，5，-GTCACCAGGATGCTTCTGAC-3，；。同時對小鼠鼠尾基因組DNA進行PCR鑑定以確定基因型，使用擴增引物為PTENflox :5』 -ACTCCCACCAATGAACAAAC-3』，5』 -CTCCTCTACTCCATTCTTCCC-3』 ；a-SMA-Cre 5，-AGCCTGTGACACTCCCGCTCTT-3 』，5 』 -ACGCCTGGCGATCCCTGAAC-3，。使用該方法可得到純合條件剔除，雜合條件剔除及野生型小鼠。使用純合條件剔除和野生型小鼠作為實驗組和對照組。實施例ニ小鼠結腸組織的組織學研究。分別取I月齡，2月齡和5月齡的小鼠，用4%多聚甲醛固定從肛門向上的約2cm結腸組織，進行大體形態學分析，然後石蠟包埋切片，進行HE染色。對直接冰凍包埋的結腸組織進行冰凍切片，然後用不同抗體進行免疫螢光研究。結果顯示腸道增生的淋巴結節主要組成細胞類型為B細胞，周圍由少量T細胞及單核細胞圍繞，同時含有不止ー個增大的生發中心。其中⑶3，B220,⑶Ilc抗體購自eBioscience公司，PNA 購自 Sigma-Aldrich 公司。實施例三使用QPCR技術對結腸全組織及分離的結腸黏膜肌層進行分子水平的分析。將每個基因型的I個月大的小鼠各6隻斷頸處死，取肛門向上的約2cm結腸組織，在磷酸鹽緩衝液(PBS)中洗去食物殘渣，置於RNA iso中勻漿，提取RNA，將各lug RNA反轉成cDNA，然後real-timePCR反應，結果見圖5.分離結腸黏膜肌層(含有黏膜下小動脈)步驟為，將洗浄的結腸組織在PBS中用手術刀片小心地刮去平滑肌層，然後在5mM EDTA/HBSS中於37攝氏度水浴振蕩消化，共3次毎次30分鐘，將上皮組織消化除去，剩下的為黏膜肌層，提取RNA及real-timePCR過程與全結腸相同。反轉錄使用TAKARA單鏈反轉試劑盒，使用ABI7300進行real-time PCR反應。使用的引物序列均為5』向3』
權利要求
1.一種基於基因重組技術產生PTEN在平滑肌內特異性剔除研究小鼠腸道免疫穩態的方法，包括如下步驟 步驟一、通過轉基因技術產生平滑肌細胞特異性的Cre轉基因工具鼠，在平滑肌特異性基因a-SMA的啟動子後接入Cre重組酶序列，並通過原核注射產生過表達的轉基因小鼠，可以介導條件錨定小鼠在平滑肌細胞中產生特異性的條件剔除。
步驟二、通過交配手段獲得平滑肌細胞特異剔除PTEN基因的條件剔除小鼠。
2.基於權利要求1所述的基於基因重組技術產生PTEN在平滑肌內特異性剔除研究小鼠腸道免疫穩態的方法，其特徵在於該小鼠表現出早期發生的腸道免疫激活表型，並導致全身免疫活化反應。
3.基於權利要求1所述的基於基因重組技術產生PTEN在平滑肌內特異性剔除研究小鼠腸道免疫穩態的方法，其特徵在於所述小鼠的基因型包括純合剔除，雜合剔除與野生型。
4.基於權利要求1和2所述的基於基因重組技術產生PTEN在平滑肌內特異性剔除研究小鼠腸道免疫穩態的方法，在研究人類腸道免疫紊亂中的應用。
5.基於權利要求1和2所述的基於基因重組技術產生PTEN在平滑肌內特異性剔除研究小鼠腸道免疫穩態的方法，在篩選針對腸道免疫紊亂中靶向藥物的作用。
全文摘要
本發明涉及獲得平滑肌特異性剔除PTEN基因產生小鼠模型及該小鼠自發產生腸道淋巴細胞活化並模擬人類結腸淋巴結節增生病理表現兩個方面的應用，屬於生物技術領域。該方法包括如下步驟通過交配獲得平滑肌細胞特異性剔除PTEN基因的突變小鼠，該小鼠產生突變表型之後對其進行檢測和鑑定，通過組織學手段確定其淋巴結節增生的具體細胞構成，並找到一定的分子基礎，得出PTEN基因在平滑肌細胞中剔除可導致結腸免疫紊亂，炎性細胞浸潤，黏膜滲透性增加等病理表現，這一過程可能是通過調控MCP-1基因來完成的這一結論。該小鼠模型可用於進一步研究平滑肌細胞在結腸免疫中的作用以及對免疫抑制藥物的篩選。
文檔編號C12N15/09GK103045584SQ20111030773
公開日2013年4月17日 申請日期2011年10月12日 優先權日2011年10月12日
發明者齊心, 顧鵬宇, 周玥, 高翔 申請人:南京大學