一種表面修飾c8烷基鏈的磁性碳球及其製備方法和應用的製作方法
2023-09-11 22:26:25 1
專利名稱：一種表面修飾c8烷基鏈的磁性碳球及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於無機材料和分析技術領域，具體涉及一種表面修飾烷基鏈的磁性碳球及其 製備方法和應用。
背景技術：
眾所周知，蛋白質組成具有多樣性和可變性，即在同一物種的不同細胞中或同一細胞 在不同時期，其蛋白質組成都是在不斷變化的，造成蛋白質組成異常複雜。同時由於蛋白 質存在翻譯後修飾，所以一個mRNA往往對應多個蛋白質，也就是說，蛋白質的數量遠遠 多於基因的數量，蛋白質在大小、相對豐度、酸鹼度和疏水性方面差異很大，僅在相對豐 度上，高豐度蛋白質與低豐度蛋白質相差六個數量級甚至更高；而且，由於蛋白質無法像 DNA—樣被"擴增"，這些都造成許多含量低的蛋白質在大規模的檢測中很難被檢測到。低 豐度蛋白的分析與鑑定是蛋白質組學研究的重點和難點內容之一。在生物體中承擔重要生 命活動的蛋白往往都是低豐度蛋白，然而其極低的含量給後續的分析和檢測帶來困難，限 制了人們對它們的研究和認識。因此要從分子水平上，深入研究生命過程的規律，探索生 命現象的奧秘，必須對一些具有重要生理功能的低豐度蛋白質進行分析監測，這對目前的 分析技術和手段不能不說是一個嚴峻的挑戰[1-2]。
低豐度蛋白的有效濃縮是實現其準確分析和鑑定的重要條件之一。實際上在蛋白質組. 學研究過程中許多方面都涉及到樣品的有效富集，以膠內酶解樣品的分析為例酶解肽段 提取液的體積太大，在質譜分析前必須濃縮[3]。目前最常用的樣品濃縮方法有溶劑蒸發法 和色譜濃縮法。溶劑蒸發法費時費力，在乾燥過程中容器表面的吸附會造成大量的肽段損 失，同時無機鹽等雜質也會被濃縮，影響質譜鑑定的靈敏度[4]。色譜濃縮法是利用樣品與 吸附劑之間的色譜相互作用對樣品進行濃縮，吸附劑一般是採用烷基鏈修飾的矽膠。該方 法能實現在對樣品進行有效濃縮的同時，去除樣品中的鹽分和其他雜質。尤其是在液相色 譜與質譜聯用時，為了防止樣品中的鹽分等雜質進入質譜影響信號檢測，都是採用了在分 離柱前連接一根短小的反相預柱，以實現對樣品濃縮和除鹽的效果。被人們廣泛採用的進 行樣品除鹽濃縮的商品化產品Zip-tip和Zip-plate,也都是基於色譜濃縮法的原理。分別是在 槍頭管尖或是九十六孔板孔的底部填充少許反相填料，操作相對繁瑣；且由於填料很少， 因此能富集濃縮的樣品量很有限。近年來，納米材料以其發展快速和應用潛力而被越來越 多地應用於在蛋白質組學分析中。楊艽原教授小組等成功地將沸石納米粒子應用於痕量肽 段的富集[5-7]，但是該方法需要高速離心分離樣品和沸石混合物，操作相對^^、。因此發 展一種簡單便捷而又有效的分離富集蛋白和肽段的方法成為蛋白質組學研究的一個重要 方面。
磁性聚合物微球[8-13]以其易於表面修飾、溶液分散性好以及靈敏的磁場感應性為其 應用於蛋白質組學分析中痕量肽段的分離富集方面提供了可能。本發明合成了四氧化三鐵 磁性聚合物微球，進而合成了新型的表面修飾C8烷基鏈的磁性碳球聚合材料。利用該磁 性聚合物材料作為吸附劑，進行痕量多肽/蛋白的分離富集以及MALDI-TOF/MS直接分析 並初步應用於實際蛋白酶解液中多肽的富集。從而簡化了低濃度多肽的分析測定程序，解 決了痕量樣品的分析困難；也為磁性聚合物微球的應用開闢了新的途徑。
發明內容
本發明的目的在於提供一種操作簡單、效率高、效果好，能對多肽進行富集的表面修 飾烷基鏈的磁性碳球及其製備方法和應用。
本發明提供的表面修飾垸基鏈的磁性碳球，由下述方法製備獲得先採用水熱法合成 四氧化三鐵磁性納米粒子，然後與葡萄糖反應，再與氯化二甲基辛基矽烷反應，對其表面
進行化學修飾，生成表面修飾C8烷基鏈的磁性碳球，其結構如圖10所示。
圖中，1表示四氧化三鐵磁性納米粒子核，其粒徑為30 500nrn; 2表示碳層，厚度為
10 100nrn;外層為C8烷基鏈，磁性碳球的粒徑為40~600nm。
上述表面修飾C8垸基鏈的磁性碳球的製備方法的具體步驟如下 (1)用水熱法合成Fe304超順磁性納米粒子採用1.0—5.0克FeCb'6H20為原料，以 20—80mL乙二醇為分散體系，添加2-6克無水乙酸鈉，反應溫度為1卯一210'C,反應時 間為6—18小時，生成磁性納米粒子,其粒徑是30—500nm;
(2) 對Fe304超順磁性納米粒子進行表面處理將由步驟(l)製得的Fe304納米粒子反覆 用去離子水洗滌，以除去水溶性雜質，然後將其分散在0.1M HN03水溶液中，超聲5-15 min。 用磁鐵分離除去淺黃色清液(四氧化三鐵粒子表面部分被溶解所致)後，再用去離子水分 散，用磁鐵分離的方法分離。
(3) 水熱法合成Fe304/C複合微球取經過步驟(2)表面處理的磁性Fe304納米粒子 0.5-2g，分散到50-200mL濃度為0.5M的葡萄糖水溶液中，反應溫度為190—210。C，反應 時間為2 — 10小時，生成磁性納米粒子,用磁鐵收集，得到所需複合微球，其粒徑是50-700 nm。
(4) 表面修飾將0.01-0.02 g步驟(3)製得的乾燥好的複合微球加入1.0-2.0 g無水吡啶 中，超聲分散，然後加入0.2-1.4 g氯化二甲基辛基矽烷，室溫機械攪拌12-24 h。用乙醇 和水反覆洗滌，再真空乾燥即得經表面修飾的C8烷基鏈的磁性碳球。
本發明合成的表面修飾C8烷基鏈的磁性碳球，合成方法簡單有效並具有很好的磁場
感應性，該微球可作為一種吸附劑進行痕量多肽的分離富集以及MALDI-TOF/MS直接分 析，例如，可對生物體中具有的多肽段進行富集，使用時可直接將該C8烷基鏈修飾的磁 性碳球放入肽段中，無需特殊處理，肽段絡合到磁性納米材料上後，無需離心分離，採用 簡單磁場作用即可實現肽段的富集。
本發明提出的表面修飾C8烷基鏈的磁性碳球為生物體中低豐度蛋白、肽段的富集提 供了新的方法，並擴展了磁性納米材料的實際應用，在生物分析研究等領域有良好的實用 價值和應用前景。
圖1為水熱法合成的Fe304磁性納米粒子的透射電鏡圖(a)和Fe304/C磁性碳球透射電 鏡圖(b)。可見磁性碳球納米粒子表面包覆了一層均勻的碳層。
圖2為是合成的表面鍵合上C8垸基鏈的磁性碳球掃描電鏡圖。可見表面修飾C8烷 基鏈的磁性碳球皆具有很好的均一性。
圖3磁性碳球的磁滯回線圖。可見包覆C後的磁性納米粒子具有很好的超順磁性。
圖4為磁性Fe304納米粒子，磁性碳球以及進行矽烷偶聯劑修飾後的傅立葉變換紅外 表徵圖。將三者的紅外圖譜比較可見，經過表面修飾後我們成功製備了表面修飾C8烷基 鏈的磁性碳球。
圖5為實施例5中用於標準肽段分離富集的質譜鑑定結果。 圖6為實施例5中用於標準蛋白分離富集的質譜鑑定結果。 圖7為實施例5中用於混合肽段分離富集的質譜鑑定結果。 圖8為實施例5中用於鹽溶液中肽段分離富集的質譜鑑定結果。 圖9為實施例3中用於膠上蛋白酶解液富集的質譜鑑定結果。 圖10為表面修飾C8烷基鏈的磁性碳球的結構圖示。
具體實施例方式
實施例是對本發明所提供的超順磁性的表面修飾C8烷基鏈的磁性碳球材料進行低豐 度肽段的分離富集分析過程的進一步說明。 實施例1，表面修飾C8烷基鏈的磁性碳球的合成
表面修飾C8烷基鏈的磁性碳球材料的合成共分為三步。
首先，採用水熱法合成氨基四氧化三鐵磁性納米粒子1.0gFeCly6H20溶於30mL乙 二醇中，磁力攪拌0.5 h得到黃色透明溶液。然後加入4.0 g無水NaAc,磁力攪拌0.5 h 後，得到褐黃色透明溶液。將所得溶液轉入200 mL的Teflon-lined不鏽鋼反應釜中。放
於烘箱，200 。C，放置12小時。待冷卻至室溫，將產物反覆用去-離子水洗滌5'次，以除去 醋酸鈉和乙二醇等水溶性雜質，最後將產物50 。C真空乾燥備用。
其次，水熱法合成Fe304@C複合微球先將如上水熱法合成的Fe304超順磁性納米粒 子進行表面處理用去離子水反覆洗滌，以除去水溶性雜質，然後將其分散在0.1MHNO3 水溶液中，超聲5-15min。用磁鐵分離除去淺黃色清液(四氧化三鐵粒子表面部分被溶解 所致)後，再用去離子水分散，磁鐵分離的方法洗兩遍。取經過表面處理的磁性Fe304納 米粒子0.5-2g，分散到50-200mL濃度為0.5M的葡萄糖水溶液中，反應溫度為190—210 'C，反應時間為2 — 10小時，生成磁性納米粒子,用磁鐵收集，得到所需複合微球。將複合 微球反覆用乙醇，水洗滌，出去雜質，50。C真空乾燥。
最後，取0.01g乾燥好的磁性碳球超聲分散在1.0g無水吡啶中，超聲分散後加入0.2 g氯化二甲基辛基矽烷，室溫機械攪拌12 h。用乙醇和水反覆洗滌，60 。C真空乾燥24 h 得最終產物。
實施例2，表面修飾C8烷基鏈的磁性碳球用於肽段富集
G)蛋白溶液酶解
取1.0mg蛋白樣品，包括牛血清白蛋白(BSA)、細胞色素C (Cytochrome C)、馬心 肌蛋白(Myoglobin)、雞蛋白蛋白(Ovalbumin)、牛(3-酪蛋白((3-casein)以及牛奶中提取 的酪蛋白(Casein)，分別溶於1.0 mL水中，加熱變性後，往溶液中加入碳酸氫銨溶液調 節體系PH約為8，以1:50 (酶和蛋白之間的質量比)加入25嗎胰蛋白酶。在37°C的溫 度下，酶解12小時後終止酶解，酶解液置於-80°C冰箱冷凍待用。
(2) 標準肽段的分離富集
將10 inL濃度為5 mg mL—1的磁性材料分散液分別加入到400 pL濃度為5 fmol pL'1 標準肽段水溶液中，室溫，振蕩10min。在外加磁場作用下去除上清後，用純水反覆清洗 三次；然後加入2)aL50。/。(v/v)乙腈水溶液，將0.5 pL含有被富集肽段和磁性微球的混合 液點到靶板上，待幹後進行MALDI-TOFMS分析。質譜鑑定結果見圖5。
(3) 標準蛋白的分離富集
將10 pL濃度為5 mg mL"的磁性材料分散液分別加入到400 pL濃度為5 fmol ^L—' 標準蛋白水溶液中，室溫，振蕩10min。在外加磁場作用下去除上清後，用純水反覆清洗 三次；然後加入2(aL50。/。(v/v)乙腈水溶液，將0.5 )aL含有被富集蛋白和磁性微球的混合 液點到靶板上，待幹後進行MALDI-TOFMS分析。質譜鑑定結果見圖6。
(4) 混合肽段的分離富集
將10 濃度為5 mg mL—1的磁性材料分散液分別加入到400 濃度為5 fmol
ML"BSA酶解後的水溶液中，室溫，振蕩10min。在外加磁場作用下去除上清後，用純水 反覆清洗三次；然後加入2 ptL 50% (v/v)乙腈水溶液，將0.5 含有被富集肽段和磁性微 球的混合液點到靶板上，待幹後進行MALDI-TOFMS分析。質譜鑑定結果見圖7。
(5) 鹽溶液中肽段的分離富集
將10 pL濃度為5 mg mL—1的磁性材料分散液分別加入到400 含濃度為5 fmol |iL—^SA酶解肽段和100mM尿素的混合水溶液中，室溫，振蕩10 min。在外加磁場作用 下去除上清後，用純水反覆清洗三次；然後加入2!aL50。/。(v/v)乙腈水溶液，將0.5 含 有被富集肽段和磁性微球的混合液點到靶板上，待幹後進行MALDI-TOF MS分析。質譜 鑑定結果見圖8。
(6) MALDI-TOF-MS的檢測
取0.5uL富集有肽段/蛋白的磁性微球分散液或是肽段洗脫液點於MALDI靶板上， 然後再點上0.5 [xL CHCA (5mg/mL;溶於50% (v/v)乙腈和0.1% (v/v) TFA中)。待靶板上 的點樣液乾燥、結晶後，將靶板放進質譜儀，進行MALDI-TOF質譜測定。MALDI-TOF MS 質譜實驗在4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystems)上完成；雷射器為Nd-YAG激 光，波長355 nm，雷射脈衝頻率200 Hz;加速電壓20 kV，正離子模式。肽段鑑定採用 反射模式條件下檢測；蛋白鑑定採用線性模式條件下檢測。
實施例3表面修飾C8垸基鏈的Fe304⑨Si02磁性材料用於膠上蛋白酶解液的富集
首先，提取人晶狀體中的蛋白，從中取150mg蛋白經二維凝膠電泳分離，選取濃度較 小的膠點進行膠上酶解，得到約400pL的酶解液，-20°C保存備用。將10 pL濃度為5 mg ml/1 的磁性材料分散液分別加入到200 nL上述酶解液中，室溫，振蕩10min。在外加磁場作 用下去除上清後，用純水反覆清洗三次；然後加入2^iL50。/。(Wv)乙腈水溶液，將0.5 含 有被富集肽段和磁性微球的混合液點到靶板上，待幹後進行MALDI-TOF MS分析。質譜 鑑定的結果見圖9。
權利要求
1、一種表面修飾C8烷基鏈的磁性碳球，其特徵在於由下述方法製備獲得先採用水熱法合成四氧化三鐵磁性納米材料，然後與葡萄糖反應，繼而再與氯化二甲基辛基矽烷反應，對其表面進行化學修飾，生成表面修飾C8烷基鏈的磁性碳球，該磁性碳球的核為四氧化三鐵磁性納米粒子，粒徑為30～500nm，核外面為碳層，碳層厚度為10～100nm，外層為C8烷基鏈，磁性碳球的粒徑為50～700nm。
2、 一種如權利要求所述的表面修飾C8烷基鏈的磁性碳球的製備方法，其特徵在於具體步驟如下(1)用水熱法合成Fe304超順磁性納米粒子採用1.0 — 5.0克FeCly6H20為原料，以 20—80mL乙二醇為分散體系，添加2-6克無水乙酸鈉，反應溫度為190—21(TC，反應時 間為6—18小時，生成磁性納米粒子，其粒徑是30—500 nm;(2) 對Fe304超順磁性納米粒子進行表面處理:將由步驟(l)製得的Fe304納米粒子反覆 用去離子水洗滌，以除去水溶性雜質，然後將其分散在0.1M HN03水溶液中，超聲5-15 miin; 用磁鐵分離除去淺黃色清液後，再用去離子水分散，磁鐵分離的方法洗分離；(3) 水熱法合成Fe304@C複合微球取經過步驟(2)表面處理的磁性Fe304納米粒子 0.5-2g，分散到50-200mL濃度為0.5M的葡萄糖水溶液中，反應溫度為190—21(TC，反應 時間為2 — 10小時，生成磁性納米粒子,用磁鐵收集，得到所需複合微球，其粒徑是50-700 nm;(4) 表面修飾將0.01-0.02 g由步驟(3)製得的乾燥的複合微球加入1.0-2.0 g無水吡錠: 中，超聲分散，然後加入0.2-1.4g氯化二甲基辛基矽烷，室溫攪拌12-24h;用乙醇和水反 復洗漆，再真空乾燥，即得經表面修飾的C8垸基鏈的磁性聚合碳球。
3、 一種如權利要求所述的表面修飾C8烷基鏈的磁性碳球作為吸附劑，在對痕量多 肽、蛋白分離富集中的應用。
全文摘要
本發明屬於無機材料和分析技術領域，具體涉及一種表面修飾C8烷基鏈的磁性碳球及其製備方法和應用。該磁性碳球是先合成磁性四氧化三鐵的納米材料，然後合成具有核殼結構的Fe3O4@碳磁性微球材料，進而採用C8對其進行表面化學修飾而獲得。該固定C1-C8的磁性納米粒子作為微吸附劑，比表面積大，可用於生物樣品中肽段的富集，方法簡單有效。該材料在蛋白組學等領域有良好的實用價值和應用前景。
文檔編號C07K1/14GK101343083SQ200810037449
公開日2009年1月14日 申請日期2008年5月15日 優先權日2008年5月15日
發明者鄧春暉, 陳和美 申請人:復旦大學