檢測變應原蛋白質的方法

2023-08-13 23:03:21 1

專利名稱：檢測變應原蛋白質的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測蛋白質的方法，特別涉及一種檢測變應原蛋白質的方法。
背景技術：
變應原蛋白質廣泛存在於我們的生活環境中。變應原蛋白質顯示導致食物變態反應、家塵變態反應、花粉病等的有害作用，並且有時誘導例如過敏反應的致命症狀。為了說明變態反應的發作機制並開發一種針對變態反應的保護性方法，廣泛地篩選變應原蛋白質是一個重要目標。
作為常規的篩選變應原蛋白質的方法，利用一種基於免疫印跡法的檢測方法，它包括將蛋白質轉移到膜如硝化纖維類或PVDF上、讓蛋白質與變態反應病人血清中的IgE抗體反應以及隨後檢測結合到蛋白質上的抗體(例如，Weiss，W.等，Electrophoresis，18，826-833(1977))。當利用這種方法時，以極小量存在的變應原蛋白質在轉移到膜上後容易損失，表明一些重要的變應原蛋白質可能被忽略並且仍然未得到檢測。因此，需要一種不需任何印跡法檢測變應原蛋白質的方法。
同時，作為一種檢測蛋白質的一般方法，常規地使用一種包括將含有蛋白質的樣品進行二維電泳(O』Farrell，P.H.等，Journal ofBiological Chemistry，250，4007-4021(1975))並且通過利用例如銀染、染料染色(考馬斯染色)、負染色或螢光染色的染色凝膠來顯現蛋白質的方法。
另外，還使用一種已知的方法，它包括預先將樣品中的蛋白質還原、利用monobromobimane將蛋白質進行螢光標記、將經標記的蛋白質進行二維電泳以及顯現螢光信號，由此以高度靈敏性檢測蛋白質(Urwin，V.E.，和Jackson，P.，Anal.Biochem.209，57-62(1993))。
但是，沒有能夠以高度靈敏性檢測變應原蛋白質的已知方法。

發明內容
本申請要求日本專利申請號2002-236048的優先權，本文引入它的說明書/附圖中的內容。
本發明的一個目的是提供一種以高度靈敏性檢測具有二硫鍵的蛋白質或變應原蛋白質的方法。
作為實現以上目的的透徹研究的結果，我們已開發了一種通過保護侍測樣品中的蛋白質的游離SH基、斷裂蛋白質的二硫鍵以暴露形成該鍵的SH基以及隨後檢測暴露的SH基，來檢測具有二硫鍵的蛋白質的方法。
基於這些結果完成的本發明如下[1]一種檢測具有二硫鍵的蛋白質的方法，包括通過化學修飾保護待測樣品中蛋白質的游離SH基；斷裂游離SH基受保護的蛋白質的二硫鍵以暴露SH基；以及檢測暴露的SH基。
在本方法中，優選通過將暴露的SH基與一種SH基標記物質反應以及檢測經標記的SH基來檢測暴露的SH基。在這種情況中，優選在檢測經標記的SH基之前，通過二維電泳分離待測樣品中的蛋白質。
在本方法中，特別優選用碘乙醯胺的烷基化作用來化學修飾游離SH基並使用monobromobimane作為一種SH基標記物質。
一種檢測變應原蛋白質的方法，該方法利用根據上面[1]的檢測具有二硫鍵的蛋白質的方法。
待測樣品的優選的例子包括來自禾本科植物種子、花粉、蟎和屋塵的蛋白質提取物。
一種檢測具有二硫鍵的蛋白質或變應原蛋白質的試劑盒，包含一種SH基保護劑和一種SH基檢測物質。
一種檢測具有二硫鍵的蛋白質或變應原蛋白質的試劑盒，包含碘乙醯胺和monobromobimane。
和[4]的試劑盒可以進一步包含一種還原劑。
本發明的方法一般能夠通過，但不限於，例如下列(A)到(C)的步驟來實施。

圖1以示意圖表示這些步驟。
(A)將待測樣品中的蛋白質與一種SH基保護劑反應的步驟。在該步驟中，蛋白質的游離SH基經化學修飾從而失去其反應性並進入一種被保護的狀態(圖1[A])。
(B)將游離SH基受保護的蛋白質與一種還原劑反應的步驟。因而，蛋白質的二硫鍵(在圖1中表示為「S-S」)得到斷裂，並且形成二硫鍵的SH基隨後被暴露(圖1[B])。
(C)將具有暴露的SH基的蛋白質與SH基標記物質反應的步驟，從而僅標記蛋白質的這種暴露的SH基(圖1[C])。隨後，通過檢測經標記的SH基，檢測具有暴露的SH基的蛋白質。以這種方式檢測的蛋白質鑑定為具有二硫鍵的蛋白質。
根據本發明的方法，能夠以高度靈敏性特定地檢測具有二硫鍵的蛋白質。而且，當將這種檢測具有二硫鍵的蛋白質的方法應用於檢測一種變應原蛋白質時，待測樣品中的變應原蛋白質能夠進行有效地檢測。根據本發明的檢測變應原蛋白質的方法，通過常規篩選變應原蛋白質的方法難以檢測的以極小量存在的變應原蛋白質也能夠以高度的靈敏性進行檢測。
本發明詳述如下。
1.本文所用的基本術語的定義在本說明書中，下列術語根據如下定義的意思進行使用。
(1)「蛋白質」理論上意指一種通過胺基酸之間的縮合而產生的多肽鏈或肽鏈。但是，本發明中的「蛋白質」不但包括簡單的蛋白質，由它通過水解僅產生胺基酸，也包括綴合的蛋白質，由它通過水解產生胺基酸和除了胺基酸之外的有機物(例如，核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白和色蛋白)，和可誘導蛋白質(例如，明膠、蛋白腖和 )。可以對這些蛋白質進行進一步酶學地和化學地修飾。
(2)「具有二硫鍵的蛋白質」意指一種蛋白質，其中在蛋白質分子內或蛋白質分子間於非還原條件下形成一個二硫鍵。該二硫鍵可以是一個在蛋白質中體內形成的二硫鍵或者可以是一個並非在體內形成的二硫鍵。
(3)「變應原」意指一種引發人或哺乳動物中變態反應的抗原性物質。「變應原蛋白質」意指一種能夠引發人或哺乳動物中變態反應的蛋白質(即，一種作用為變應原的蛋白質)。一種變應原蛋白質可以是由一個基因通過轉錄和翻譯產生的生長蛋白質或其一個片段。此外，一種物質的「變應原性」意指誘導人或哺乳動物中變態反應的能力。
(4)「SH基」意指一種蛋白質的硫氫基。通常，這種基團也可以稱為硫羥基或巰基。
2.檢測具有二硫鍵的蛋白質的方法(1)待測樣品在本說明書中，將本發明的方法對其進行應用的蛋白質稱為「待測樣品」。作為一種待測樣品，只要它被懷疑含有具有二硫鍵的蛋白質或變應原蛋白質，任何樣品都能夠使用。待測樣品可以包含一種蛋白質或幾種蛋白質。待測樣品也可以包含未分離的蛋白質或預先分離的蛋白質。待測樣品可以僅由預先分離的蛋白質組成。
待測樣品的例子包括食物、藥物、醫學材料、化妝品、紡織品、建築材料、環境檢測樣品(例如，空氣、水和土壤樣品)、植物樣品、動物樣品、變應原候選物、已知的變應原、已知的變應原蛋白質和研究樣品(例如，預期其中具有二硫鍵形成的蛋白質)。具體的樣品包括但不限於由例如魚、肉、乳產品(例如，奶、酸牛乳和乾酪)、含蛋產品(例如，蛋黃醬、蛋糕和雞蛋面)、預製食物、調味料、香料、營養補充物、毛產品、羽產品、家塵、蟎(例如，粉塵蟎(Dermatophagoides farinae)和屋塵蟎(Dermatophagoidespteronyssinus))、花粉(例如，香柏花粉和豚草花粉)、食物變應原(例如，禾本科植物如水稻和小麥的種子、蕎麥、大豆、清蛋白和奶)、來自動物(例如，狗、貓、小鼠、大鼠、馬和牛)的變應原、來自植物(例如，花生和漆樹)的變應原、昆蟲變應原、寄生蟲變應原或黴菌變應原製備的蛋白質提取物。另外的待測樣品的例子包括純化的蛋白質如卵清蛋白、卵類粘蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白、蟎抗原(例如，粉塵蟎抗原)、牛血清清蛋白、胰蛋白酶/澱粉酶抑制物、谷蛋白、α-球蛋白、大豆球蛋白、分離的天然蛋白質、重組蛋白質、具有改變的天然胺基酸序列的蛋白質、合成的蛋白質和變應原候選蛋白質。這些待測樣品可以單獨使用或可以進行結合併用於一個單一的樣品中。
(2)待測樣品中蛋白質的游離SH基的保護在本方法中，首先通過化學修飾保護包含在以上2-(1)小節中所述的待測樣品中的蛋白質的游離SH基，從而引發游離SH基喪失它們的反應性。本說明書的「游離SH基」意指一種蛋白質中的SH基，它在能夠形成二硫鍵的條件下(例如，非還原性條件如中性或酸性條件)不參與二硫鍵。
在本發明的方法中，為了保護包含在待測樣品中的蛋白質的游離SH基，將一種SH基保護劑加入到待測樣品中並使其與蛋白質反應。當加入SH基保護劑時的反應條件沒有特別限制，只要它們是非還原性條件。優選將條件調整至適於使用SH基保護劑的條件。
在本發明的方法中，當在二硫鍵的斷裂後檢測SH基時，以保護游離SH基起始使得可以只檢測形成二硫鍵的SH基而不會檢測到這類游離SH基。
在本說明書中，通過化學修飾保護蛋白質的游離SH基，從而避免相對於游離SH基的反應的物質稱為「SH基保護劑」。由這樣的SH基保護劑引發的「化學修飾游離SH基」的具體的例子包括硫醇鹽的形成、烷基化作用、和伴隨著SH基的二硫化物交換的氧化作用。
在本發明中，作為一種SH基保護劑，能夠使用如上所述任何化學修飾SH基以保護它們的物質。具體的SH基保護劑的例子包括SH試劑，它用作蛋白質中SH基的保護性修飾劑，以及與蛋白質中的SH基反應以抑制反應性的SH封閉試劑。
具體的SH基保護劑的例子包括，但不限於在下面(1)到(4)中所述的那些(1)一種硫醇鹽形成劑，如重金屬(例如，汞、銀、鎘、鉛或銅)和重金屬化合物(例如，對汞基苯甲酸(PMB)、對氯汞苯甲酸(PCMB)、對汞基苯磺酸(PMBS)、乙酸苯汞(PMA)、二乙汞、4-氯汞-4』-二甲氨基苯、4-氯汞苯偶氮基-β-萘酚、薩利甘酸、S-汞丹磺醯基染料)；(2)一種烷基化劑如滷代烷(例如，碘乙酸或碘乙醯胺)和順丁烯二醯亞胺衍生物(例如，N-乙基順丁烯二醯亞胺(NEM))；(3)一種氧化劑如5，5』-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB，Ellman氏試劑)，4，4-二硫吡啶，2，2』(4，4』)-聯吡啶二硫化物、連四硫酸(或連四硫酸鹽)、四硝基甲烷、2，6-二氯苯靛酚(DCIP)或氧化型穀胱甘肽；和(4)三氧化二砷和亞砷酸鹽本發明的SH基保護劑優選不幹擾針對二硫鍵的還原作用。在游離SH基的保護之後和二硫鍵的還原處理之前，在使用一種可能干擾還原作用的SH基保護劑情況下，優選例如通過脫鹽將殘餘的SH基保護劑從待測樣品中去除。
作為在本發明中的SH基保護劑，優選使用一種烷基化劑，特別優選使用碘乙醯胺(IAA)。
(3)二硫鍵的斷裂隨後將蛋白質的二硫鍵斷裂，從而暴露形成二硫鍵的SH基。優選通過利用一種還原劑還原二硫鍵來進行二硫鍵的斷裂。為了使用一種還原劑斷裂二硫鍵，根據以上2-(2)小節中所述的對待測樣品中蛋白質的游離SH基進行保護，隨後引發蛋白質與還原劑反應。還原劑可以在蛋白質的游離SH基和SH基保護劑之間的反應之後加入到待測樣品中。但是，只要蛋白質在該蛋白質的自由基保護之後與還原劑反應，就可以在蛋白質的游離SH基與SH基保護劑的反應之前或同時向待測樣品加入還原劑。例如，通過與SH基保護劑一起向待測樣品加入封閉於可溶性膠囊中的還原劑，游離SH基用一種SH基保護劑加以保護並且隨後蛋白質的二硫鍵被從溶解的膠囊中釋放到反應溶液中的還原劑所斷裂。
作為一種在本發明中用於斷裂二硫鍵的「還原劑」，可以使用任何能夠斷裂蛋白質二硫鍵的物質從而將SH基進行暴露。還原劑的具體例子包括但不限於二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)、穀胱甘肽、硫氧還蛋白、穀胱甘肽還原酶、巰基乙醇、三丁基膦、NaBH4、NADPH、巰基乙酸和NO(一氧化氮)。
(4)暴露的SH基的檢測隨後，檢測由二硫鍵的斷裂所暴露的SH基。可以利用一種已知的能夠用作檢測或量化SH基的方法進行暴露SH基的檢測。
例如，通過一種已知的利用一種SH試劑檢測SH基的方法，能夠檢測和/或量化暴露的SH基。這種檢測SH基的方法的例子包括電流滴定法，該方法利用暴露的SH基與一種為SH試劑的硫醇鹽形成劑的硫醇鹽的形成，以及一種量化SH基的方法，該方法包括將對汞基苯甲酸(PMB)、N-乙基順丁烯二醯亞胺(NEM)、5，5』-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)等與暴露的SH基反應以及測量由此得到的產物的吸光度。另一個優選使用的SH試劑的例子是4』，4』-雙(二甲氨基)二苯基甲醇。
在另一個實施方案中，能夠通過將一種SH基結合物質(例如，一種能夠結合到SH基上的固相)與具有暴露的SH基的蛋白質反應並且隨後檢測已結合到蛋白質上的SH基結合物質而對暴露的SH基進行檢測和/或量化。或者，也能夠通過分離已結合到SH基結合物質上的蛋白質並且檢測該蛋白質對具有暴露的SH基的蛋白質進行檢測和/或量化。例如，暴露的SH基選擇性地結合到能夠結合到SH基上的固相(例如，珠、濾器、膜或柱)，只有已結合到固相上的蛋白質從待測樣品中得到分離，並且隨後可以對分離的蛋白質進行檢測。能夠結合到SH基上的固相的具體例子包括穀胱甘肽柱(由Pharmacia Corponation製造的穀胱甘肽瓊脂糖凝膠柱)以及具有導入其中的順丁烯二醯亞胺基的磁珠。通過本方法，測量SH基結合物質與蛋白質的結合引起的質量的增加，並且隨後能夠基於增強的量進行蛋白質二硫鍵的量化以及二硫鍵位點的測定。
作為另一個例子，能夠通過將SH基標記物質與具有暴露的SH基的蛋白質進行反應以及隨後檢測經標記的SH基而對暴露的SH基進行檢測和/或量化。如本文所用的，「標記」包括但不限於螢光標記、放射性同位素標記、抗體標記以及酶標記。
當使用一種SH基標記物質時，依賴於標記的類型來確定檢測標記的方法。當標記為螢光標記時，可以通過例如用螢光檢測器檢測從標記的蛋白質發出的螢光來檢測來目標記的信號，所述蛋白質用紫外光進行照射。螢光信號能夠通過利用分光光度計基於相應於螢光波長的吸光度測量螢光量而進行檢測。由於螢光在量上一般是高的，所以能夠基於定量測定的螢光值(測量值)檢測二硫鍵的數量或二硫鍵位點。另外，當標記為放射性同位素標記時，能夠通過利用液體閃爍計數儀等測量放射性而檢測標記的信號。或者，通過放射自顯影進行顯現，並隨後對放射性進行檢測以檢測標記的信號。當標記為抗體標記時，例如，能夠通過將一種特異於用作標記的抗體的抗原與該抗體反應對標記進行檢測。另外，當標記為酶標記時，能夠通過加入一種酶的底物與酶反應，以及隨後檢測源自酶反應的顯色反應、螢光反應等而對標記進行檢測。當使用非螢光性標記時，在檢測後對標記的信號量進行定量地測定從而能夠由測量值估計二硫鍵的數量或結合位點。
在本發明的方法中，SH基的螢光標記試劑能夠適當地用作SH基標記物質。具體的SH基標記物質的例子包括但不限於monobromobimane、苯並呋咱(benzofurazan)(苯並二唑)衍生物(例如，4-氟-7-氨磺醯苯並呋咱(ABD-F))、氮丙啶如丹磺醯氮丙啶、乙酸螢光素汞(FMA)、S-汞-N-丹磺醯基染料(MDC)、N-(碘乙醯基氨基乙基)-5-萘胺-磺酸(1，5-I-AEANS)及其1，8-異構體、4-氯-7-硝基苯並呋咱(4-氯-7-硝基苯並-2-氧雜-1，3-二唑)(NBD-Cl)，和具有導入其中的螢光基團(例如，2-苯基苯並咪唑、螢光素、各種羅丹明以及花青染料)的N-取代順丁烯二醯亞胺(例如，N-(7-二甲氨基-4-甲基coumarynyl)順丁烯二醯亞胺(DACM)，N-[4-(6-二甲氨基-2-苯並呋喃基)苯基]順丁烯二醯亞胺，和花青染料-順丁烯二醯亞胺)。
在本說明書中，能夠用作檢測和量化SH基的物質，如上述的SH試劑、SH基結合物質以及SH基標記物質稱作「SH基檢測物質」。
用於本發明的方法中的SH基檢測物質可以是能夠用作在以上2-(2)小節中所述的SH基保護劑的任何物質。但是，在本發明的方法中，優選在單一檢測系統中使用彼此不同的SH基保護劑和SH基檢測物質。而且，例如，為了特異性地檢測暴露的SH基，優選通過使用非螢光試劑作為SH基保護劑以及一種螢光試劑作為SH基檢測物質，利用SH基檢測物質進行檢測而不必檢測SH基保護劑的保護性修飾。
在本發明的方法中，能夠特別優選使用的SH基保護劑和SH基檢測物質的結合是作為SH基保護劑的碘乙醯胺和作為SH基檢測物質的monobromobimane的結合。
可以在加入還原劑的同時、之前或之後；或在加入SH基保護劑的同時、之前或之後向待測樣品中加入一種SH基檢測物質，只要在蛋白質的SH基如上所述被暴露後引起SH基檢測物質與蛋白質的反應。一個這種情況的例子是SH基檢測物質包含在可溶性膠囊等中，將這種SH基檢測物質與一種SH基保護劑一起加入到待測樣品中以便SH基保護劑化學修飾游離SH基，隨後SH基檢測物質釋放到反應溶液中。在這種情況中，可以使用包含於單個膠囊中的SH基檢測物質和還原劑，或包含在分離的膠囊中的SH基檢測物質和還原劑，或單獨包含在一膠囊中的SH基檢測物質。在本說明書中，向待測樣品中「加入」一種SH基檢測物質的含義不僅包括將SH基檢測物質混合入待測樣品中，也包括將SH基檢測物質與處於其它各種狀態的待測樣品相接觸。例如，「加入」的含義包括，當SH基檢測物質為能夠結合到SH上的固相物質時，將SH基檢測物質置於待測樣品中或將待測樣品應用於SH基檢測物質之上。
用於本發明的SH基檢測物質優選是一種物質，它與暴露SH基的反應不受其與SH基保護劑和/或還原劑共存的幹擾。但是，當使用一種SH基檢測物質，它與SH基的反應受其與SH基保護劑和/或還原劑共存的幹擾時，通過在加入SH基檢測物質之前的脫鹽、蛋白質分離等來去除SH基保護劑和/或還原劑。此外，如果必要，本發明的SH基檢測物質可以與輔助劑如著色底物一起加入。
在本發明的方法中，使用SH基檢測物質檢測暴露的SH基可以通過普通方法進行。當使用這種SH基檢測物質檢測暴露的SH基時，暴露的SH基被引發與SH基檢測物質反應，隨後能夠對含有多種蛋白質的待測樣品直接進行檢測。但是，在暴露的SH基與SH基檢測物質的反應之後，可以通過一種常規公知的蛋白質分離方法預先分離待測樣品，隨後可以檢測暴露的SH基。例如，可以通過一種本領域技術人員所公知的方法，如一維電泳、二維電泳、高效液相層析(HPLC)、柱層析或質譜分析法對以上待測樣品中的蛋白質進行分離。在通過將待測樣品進行電泳的蛋白質分離之後，可以在電泳凝膠上進行檢測。在通過將待測樣品進行高效液相層析(HPLC)的蛋白質分離之後，可以在洗脫的分子量級分中進行檢測。在本發明的方法中，特別優選通過二維電泳分離蛋白質，及隨後對其進行檢測。在應用二維電泳時，有一個益處即不僅蛋白質以高解析度和高準確度得以分離，隨後的對於一個待測樣品的檢測也能夠在一個單一的檢測中完成。
在另一實施方案中，如果游離SH基檢測物質以及暴露的SH基可以使用一種SH基檢測物質進行檢測，優選在檢測暴露的SH基之前將待測樣品中的蛋白質與游離SH基檢測物質分離。這種情況的一個例子是發射標記信號的SH基標記物質自身用作SH基標記物質，如具有導入其中的螢光素作為螢光基團的順丁烯二醯亞胺試劑。而且，當將一種本身為非螢光性的但其通過與SH基反應產生的衍生物為螢光性的物質(例如，具有導入其中作為螢光基團的2-苯基苯並咪唑的N-取代順丁烯二醯亞胺)用作SH基檢測物質時，能夠選擇性地檢測經標記的SH基而不必從游離SH基檢測物質中分離蛋白質。
在另一個實施方案中，例如，對吸光度進行測量從而檢測和量化暴露的SH基，所述吸光度出現在280nm附近，相應於具有由二硫蘇糖醇和二硫鍵之間的反應產生的分子內S-S鍵的環狀結構，此時將二硫蘇糖醇用作還原劑以斷裂二硫鍵。以這種技術，也能夠通過檢測或量化由二硫鍵的還原反應產生的產物對暴露的SH基進行檢測。
根據本發明的方法，具有二硫鍵的蛋白質能夠通過如上所述對暴露的SH基進行檢測而得以鑑定。當通過本發明的方法從待測樣品中檢測暴露的SH基時，待測樣品包含具有二硫鍵的蛋白質。而且，當在每種由電泳等分離的蛋白質中均檢測到暴露的SH基時，該蛋白質具有二硫鍵。
3.具有二硫鍵的蛋白質的分離和鑑定隨後，能夠從待測樣品中分離具有二硫鍵的蛋白質，在所述樣品中已檢測到暴露的SH基。可以通過本領域技術人員公知的方法分離蛋白質。例如，當已對電泳凝膠檢測暴露的SH基時，其中在該凝膠中分離了待測樣品中的蛋白質，將其中檢測到暴露的SH基的凝膠的每個有關斑點部分切出，隨後從凝膠中提取蛋白質。例如，當對一個通過HPLC分離待測樣品中的蛋白質所獲得的分子量級分進行暴露的SH基的檢測時，如果必要，通過一種純化技術如層析將包含在該級分中的蛋白質進行進一步的純化。如果包含在該級分中的蛋白質得到充分純化，該級分可以直接用作一種包含分離的蛋白質的溶液。或者，也可以通過使用本文中所用的標記抗體對以上待測樣品或以上級分進行親和柱純化而將靶蛋白質分離。此外，當，例如，使用一種能夠結合到SH基上的固相物質作為SH基檢測物質時，暴露的SH基將選擇性結合到能夠結合到SH基上的固相(例如，珠、濾器、膜或柱)上，且具有SH基的蛋白質利用該結合從待測樣品中進行分離，隨後將具有SH基的蛋白質從固相上離解出來，從而獲得具有二硫鍵的蛋白質。如果必要，由此得到的蛋白質也能夠由一種純化技術如層析通過進一步的分離和純化而分離成每一種蛋白質級分。通過以上分離步驟，能夠分離具有二硫鍵的蛋白質，也能夠測定待測樣品中的蛋白質的分子量、含量等。
在本發明的方法中，如上所述分離的蛋白質也能夠通過進一步的特徵描述進行鑑定。在本發明中「鑑定蛋白質」意為將蛋白質分類成已知蛋白質的蛋白質組或屬於與已知蛋白質相同類別的蛋白質組。
在本發明中，為了鑑定分離的蛋白質，對蛋白質進行特徵描述，並且將由此揭示的特徵與已知蛋白質的特徵進行比較從而發現在該蛋白質與已知蛋白質之間的共同特徵。在本發明中「共同特徵」意為與那些已知蛋白質的特徵相同的或具有大部分共同性的特徵。例如，如果一種特徵涉及胺基酸序列，那麼在這種情況下「共同特徵」會包括具有相同的胺基酸序列或具有與用作比較的蛋白質共享高度同源性的胺基酸序列。另外，在本發明中「特徵描述」意為基於電泳結果、部分或完整胺基酸序列的測定、一個編碼該蛋白質的基因或cDNA序列的檢索和測定、該蛋白質的質譜分析等對一種分離的蛋白質進行該蛋白質的分子量和/或等電點等的確定。為了測定胺基酸序列，優選使用肽酶等部分降解蛋白質並隨後通過對每一片段運用Edman降解法而測定內部胺基酸序列。同時，存在多個包含蛋白質的這種特徵的資料庫(例如，GenBank，PIR，PRF，EMBL，SwissProt和PDBSTR)。通過在這些資料庫中檢索本發明中分離的蛋白質的特徵，能夠從資料庫中提取已知的與其具有共同特徵的蛋白質。當一種具有與本發明所分離的蛋白質的特徵相同的特徵的已知蛋白質從這些資料庫中提取出來時，分離的蛋白質被鑑定為該已知蛋白質。當一種具有與本發明所分離的蛋白質的特徵相似的特徵的已知蛋白質從這些資料庫中提取出來時，分離的蛋白質被分類為與該已知蛋白質相同類別的蛋白質。
如上所述，能夠對在本發明中分離的具有二硫鍵的蛋白質進行鑑定。
4.利用檢測具有二硫鍵蛋白質的方法的另一個實施方案在本發明中，通過利用上述檢測具有二硫鍵的蛋白質的方法，能夠顯示包含在待測樣品中的純化的特異性蛋白質的二硫鍵形成的存在或缺失以及二硫鍵形成位點。
近年來，利用遺傳重組技術的蛋白質生產正在積極地進行中。關於利用遺傳重組技術的蛋白質生產，一種利用大腸桿菌(Escherichiacoli)作為宿主細胞的方法是普遍性的。但是，由於已知二硫鍵在大腸桿菌中生產的蛋白質中不正確地形成，所以根據情況使用其它培養細胞，如昆蟲細胞來生產重組蛋白質。蛋白質中的二硫鍵很大程度上參與這類蛋白質的三維結構形成並對蛋白質活性的保持具有重大影響。因而，在利用重組方法的蛋白質生產過程中，確認相應於生產的重組蛋白質的天然蛋白質是否具有二硫鍵以及鑑定天然蛋白質的二硫鍵的形成位點對於重組蛋白質的生產是重要的。因此，使用本發明的檢測具有二硫鍵的蛋白質的方法對天然蛋白質的二硫鍵分析，能夠在重組蛋白質的生產中有用。
5.檢測變應原蛋白質的方法如在下面實施例中所示，通過以上方法檢測的具有二硫鍵的蛋白質被揭示為變應原蛋白質。因此，根據本發明，能夠利用上面檢測具有二硫鍵的蛋白質的方法對待測樣品中的變應原蛋白質進行檢測。能夠通過一種本發明的檢測變應原蛋白質的方法檢測的變應原蛋白質也與二硫鍵涉及蛋白質的變應原性的報告相一致(例如，Huby，R.D.等，Toxicological Sciences 55，235-246)。與通過使用IgE抗體的免疫印跡方法進行的常規檢測方法相比，本發明的檢測變應原蛋白質的方法高度靈敏。
本發明的檢測變應原蛋白質的方法可以與以上那些檢測具有二硫鍵的蛋白質的方法相似的方法實施。具體地該方法可以通過下列步驟a)到c)進行a)通過化學修飾保護蛋白質的游離SH基；b)斷裂游離SH基受保護的蛋白質的二硫鍵以暴露形成二硫鍵的SH基；和c)檢測暴露的SH基，其中具有暴露的SH基的蛋白質鑑定為一種變應原蛋白質。
適於應用本發明的檢測變應原蛋白質的方法檢測變應原蛋白質的待測樣品與那些有關以上檢測具有二硫鍵的蛋白質的方法所述的樣品相似。更加優選使用一種懷疑含有變應原蛋白質的蛋白質樣品作為待測樣品。特別優選使用的待測樣品的例子包括來自禾本科植物的種子、家塵、花粉、蟎等的蛋白質提取物。
為了進行本發明的檢測變應原蛋白質的方法，特別優選的具體方法如下(1)向待測樣品中加入一種非螢光試劑碘乙醯胺；(2)另外加入二硫蘇糖醇作為還原劑；(3)另外加入螢光試劑monobromobimane，隨後將得到的反應溶液進行二維電泳分離；和(4)將得到的電泳凝膠用紫外光照射，隨後檢測獲得的對應於變應原蛋白質的螢光斑點。
本方法與常規方法相比尤其具有以下益處。
.能夠使用螢光標記檢測甚至以極小量存在的變應原蛋白質。
.二維電泳的分離帶來蛋白質的較高分析解析度。
.不需要轉移到膜而且損失以極小量存在的蛋白質的危險低。
在本發明的另一個實施方案中，可能通過利用以上檢測變應原蛋白質的方法檢測待測樣品是否具有變應原性。在這種情況下，如果在待測樣品中檢測到變應原蛋白質，待測樣品就確定為具有變應原性。
在另一個實施方案中，通過利用以上檢測變應原蛋白質的方法，能夠進行來自待測樣品中的變應原蛋白質的篩選。在這種情況下，在待測樣品中檢測的變應原蛋白質的分離步驟中能夠篩選包含在待測樣品中的變應原蛋白質。在以上具有二硫鍵的蛋白質的分離中通過普遍公知的方法能夠進行蛋白質的分離。
對於如上所述分離的變應原蛋白質，通過特徵描述的鑑定能夠以一種類似於具有二硫鍵的蛋白質所用方式的方式進行。具體是，對分離的變應原蛋白質進行特徵描述，隨後將由此顯示的特徵與已知變應原蛋白質的特徵相比，從而發現在該蛋白質與已知變應原蛋白質之間的共同特徵。「共同特徵」和「特徵描述」的意思與對於以上具有二硫鍵的蛋白質所述的意思相同。
關於變應原蛋白質特徵的信息也可以從資料庫等獲得(例如，GenBank，PIR，PRF，EMBL，SwissProt、PDBSTR，以及Farrp變應原資料庫(http//www.allergenonline.com))。例如，將本發明中分離的變應原蛋白質的特徵在這些資料庫中進行檢索，從而能夠從這些資料庫中提取具有共同特徵的已知變應原蛋白質。當一種具有與分離的變應原蛋白質特徵相同的特徵的已知變應原蛋白質從這些資料庫中提取出來時，分離的變應原蛋白質被鑑定為該已知蛋白質。當一種具有與分離的變應原蛋白質的特徵相似特徵的已知變應原蛋白質從這些資料庫中提取出來時，分離的蛋白質被分類為與該已知變應原蛋白質相同類別的變應原蛋白質。
在變應原蛋白質的鑑定中，本領域一般使用下列方法。具體是，通過Edman降解法測定目標蛋白質的內部胺基酸序列(部分序列)，隨後將部分序列作為查詢序列在胺基酸資料庫中進行檢索。如果一種變應原蛋白質的部分序列由資料庫中提取出來，所述部分序列與目標蛋白質的部分序列完全相同，目標蛋白質就鑑定為這種由資料庫提取的變應原蛋白質。類似地，如果一種與目標蛋白質的部分序列具有同源性的變應原蛋白質的部分序列由資料庫中提取出來，該蛋白質就鑑定為與由資料庫中提取的變應原蛋白質屬於相同類別的變應原蛋白質。在本發明中，還優選在分離的變應原的鑑定中利用這種方法。
6.除檢測方法之外的實施方案如本發明所提供的分析蛋白質的任何方法都利用以上「檢測具有二硫鍵的蛋白質的方法」。優選使用一種包含用作檢測具有二硫鍵的蛋白質的SH基保護劑和一種SH基檢測物質的試劑盒以實施根據本發明的檢測具有二硫鍵的蛋白質的方法，根據本發明的檢測變應原蛋白質的方法，以及任何利用這些方法分析蛋白質的方法。一種檢測具有二硫鍵的蛋白質或變應原蛋白質的試劑盒，它包含一種SH基保護劑和一種SH基檢測物質，也包含在本發明的範圍中。優選地，該試劑盒包含碘乙醯胺和monobromobimane並用於檢測具有二硫鍵的蛋白質或變應原蛋白質。該試劑盒可以進一步包含一種還原劑，優選二硫蘇糖醇。
附圖簡述圖1圖示了在本發明的檢測具有二硫鍵的蛋白質的方法所進行的一般步驟。具有二硫鍵的蛋白質顯示於左側而不具二硫鍵的蛋白質顯示於右側。每個白圈(○)表示用SH基保護劑進行的SH基的修飾而每個實圈(●)表示用一種SH基標記物質進行的SH基的修飾。[A]蛋白質的游離SH基與SH基保護劑的反應。[B]游離SH基受保護的蛋白質與還原劑的反應。[C]蛋白質的暴露的SH基與SH基標記物質的反應。
圖2顯示了展現利用水稻種子提取物作為待測樣品根據本發明的方法獲得的二維電泳的結果照片。照片A顯示通過考馬斯藍染色對所有包含的蛋白質進行顯現的結果。照片B顯示蛋白質螢光檢測的結果，其中SH基根據本發明的方法進行了暴露並且隨後以monobromobimane進行螢光標記。1-8表示其內部胺基酸序列進行了測定的蛋白質的斑點。
圖3顯示了展現利用花粉提取物作為待測樣品根據本發明的方法獲得的二維電泳的結果照片。作為螢光檢測的結果用白色表示以monobromobimane進行螢光標記的蛋白質。1-6表示其內部胺基酸序列進行了測定的蛋白質的斑點。
圖4顯示了展現利用蟎提取物作為待測樣品根據本發明的方法獲得的二維電泳的結果照片。作為螢光檢測的結果用白色表示以monobromobimane進行螢光標記的蛋白質。1-3表示其內部胺基酸序列進行了測定的蛋白質的斑點。
圖5顯示了展現利用大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)和肌紅蛋白(Mg)作為待測樣品根據本發明的方法獲得的二維電泳的結果照片。照片A顯示通過考馬斯藍染色對包含在待測樣品中的蛋白質進行顯現的結果。照片B顯示蛋白質螢光檢測的結果，其中顯露的SH基以monobromobimane進行螢光標記。
實施發明的最佳方式下面將通過參考實施例對本發明進行詳細描述。但是，這些實施例並不限制本發明的範圍。
實施例1在水稻提取物中具有二硫鍵的蛋白質的檢測使用研缽研磨20克的水稻種子。將粉末放入400ml的1M氯化鈉溶液中並且隨後攪動1小時，從而在緩衝液中由種子提取蛋白質。將溶液於14,000g離心5分鐘以沉澱不溶性組分後，收集上清液。通過透析將上清液脫鹽並隨後進行冷凍乾燥。將1/80量的冷凍乾燥產品(等價於0.25克的水稻種子)溶於緩衝液中以進行等電聚焦(8M尿素、0.5％CHAPS和0.1％Bio-Lytes)。將碘乙醯胺作為SH基保護劑加入到溶液中(終濃度5mM)，並隨後將溶液於室溫溫育1小時。接下來，將二硫蘇糖醇作為還原劑加入到溶液中(終濃度5mM)，並隨後將溶液於室溫溫育1小時。另外，將monobromobimane作為SH基標記物質加入到溶液中(終濃度10mM)，並隨後將溶液於室溫溫育15分鐘。
將如上所述獲得的反應溶液進行二維電泳，由此分離在反應溶液中的蛋白質。
使用PROTEAN IEF Cell System(Bio-Rad Laboratories Inc.)根據生產商的說明進行一維電泳。電泳在上限8,000V和電壓-時間積分值35,000VH的條件下進行6小時。電泳後，將得到的凝膠浸入在含有62.5mM Tris-HCl緩衝液、5％巰基乙醇、2％SDS和5％蔗糖的緩衝液中10分鐘，隨後進行二維電泳。
根據Laemmli’s技術進行二維電泳(Laemmli，U.K.，Nature，227，680-685(1970))。使用含有375mM Tris/甘氨酸緩衝液和具有從10％到20％的濃度梯度的丙烯醯胺凝膠。使用含有0.1％SDS的25mMTris/甘氨酸緩衝液作為運行緩衝液。電泳於250V進行3小時。
對於由此獲得的電泳凝膠，使用螢光檢測器(FAS-2525，TOYOBO)檢測螢光信號。在凝膠上螢光檢測的斑點對應於以monobromobimane螢光標記的蛋白質(圖2B)。在圖2B中，發現了例如表示為1-6的螢光斑點。
此外，在該實施例中，所有蛋白質由考馬斯藍染色進行檢測(圖2A)以作為對照實驗。在圖2A中，發現了例如表示為1-8的染色斑點。
當比較圖2A和圖2B時，圖2B中的每個染色斑點1-6都被發現位於相應於圖2A中所示的每個染色斑點1-6的位置上。即，顯示了相應於斑點1-6的蛋白質是具有二硫鍵的蛋白質。這些結果提示存在於斑點1-6上的蛋白質為變應原蛋白質。
另一方面，對於圖2A中的染色斑點7和8，在圖2B的相應位置上沒有發現螢光斑點。因而，提示相應於斑點7和8的蛋白質不是變應原蛋白質。
實施例2包含在水稻提取物中的變應原蛋白質的分析將圖2B中檢測到螢光信號的斑點1-6從凝膠上切下並且隨後用胰蛋白酶在凝膠內進行消化，從而使斑點中的蛋白質片段化。在將片段化的蛋白質進行HPLC分離之後，通過Edman法測定內部胺基酸序列。由此測定的每個斑點中的蛋白質的內部胺基酸序列顯示於表1中。顯示於表1中的內部胺基酸序列中的「CmRRr」表示具有以monobromobimane經標記的SH基的半胱氨酸殘基。接下來，在胺基酸序列資料庫(GenBank和PIR)中利用FASTA程序和BLAST程序將每個內部胺基酸序列作為查詢序列進行同源性檢索。檢索結果顯示來自每個斑點的蛋白質的內部胺基酸序列都與一種已知的變應原蛋白質的部分胺基酸序列相同或具有高度同源性(表1)。
表1

如表1中所示，相應於斑點2-6的蛋白質的內部胺基酸序列與已知變應原蛋白質的部分胺基酸序列100％匹配，所述已知變應原蛋白質作為與其具有高度同源性的蛋白質由資料庫中提取。因此，斑點2-6的蛋白質鑑定為已知的變應原蛋白質。同時，斑點1的一個內部胺基酸序列與一種已知為變應原蛋白質的胰蛋白酶/澱粉酶抑制物的部分胺基酸序列(SEQ ID NO1)具有77.8％的同源性，所述胰蛋白酶/澱粉酶抑制物作為與其具有高度同源性的蛋白質由資料庫中提取。另外，對於相應於斑點的1的另外兩個內部胺基酸序列(SEQ ID NO2和SEQ ID NO3)，沒有與其具有高度同源性的蛋白質由資料庫中提取出來(在表1中以n.d.表示)。因此，據推理斑點1的蛋白質屬於與胰蛋白酶/澱粉酶抑制物相同類別的變應原蛋白質，但為一種未知的變應原蛋白質。
如上所述，在水稻提取物中含有的具有二硫鍵的蛋白質已經根據本發明的方法進行了螢光檢測並能夠鑑定為未知的變應原蛋白質(斑點1)或已知的變應原蛋白質(斑點2-6)，所述未知的變應原蛋白質屬於與已知變應原蛋白質類別相同的變應源蛋白質。
實施例3花粉提取物中具有二硫鍵的蛋白質的檢測用研缽將豚草(三裂葉豚草(Ambrosia trifida))花粉在含有1mMPASF和1mM EDTA的100mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)中研磨，並且隨後將產物於14,000g離心30分鐘。離心後，收集上清液，過濾通過Ultrafree-Cl離心濾器(Millipore)，並且隨後通過MicroconYM-10離心濾器進行脫鹽。將脫鹽後的殘餘物溶於緩衝液中進行等電聚焦(8M尿素、0.5％CHAPS和0.1％Bio-Lytes)。將碘乙醯胺作為SH基保護劑加入到溶液中(終濃度5mM)，隨後將溶液於室溫溫育1小時。另外，將二硫蘇糖醇作為還原劑加入(終濃度5mM)並與溶液混合，隨後將溶液於室溫溫育1小時。另外，將monobromobimane作為SH基標記物質加入(終濃度10mM)並與溶液混合，隨後將溶液於室溫溫育15分鐘。將由此獲得的反應溶液進行二維電泳，以與實施例1中相似的方式分離反應溶液中的蛋白質，隨後利用螢光檢測器檢測螢光信號(圖3)。
實施例4包含在花粉提取物中的變應原蛋白質的分析將圖3中檢測到螢光信號的斑點1-6從凝膠上切下，並且隨後以與實施例2相似的方式測定蛋白質的內部胺基酸序列。隨後，以與實施例2相似的方式對內部胺基酸序列進行同源性檢索。檢索結果顯示來自每個斑點的蛋白質的內部胺基酸序列都與已知的變應原蛋白質的部分胺基酸序列具有高度同源性(表2)。
表2

如表2中所示，相應於斑點1的蛋白質的內部胺基酸序列與一種富含半胱氨酸的抗真菌蛋白質的部分胺基酸序列具有81.8％的同源性，所述富含半胱氨酸的抗真菌蛋白質作為具有高度同源性的蛋白質由資料庫中提取。另外，相應於斑點的2的蛋白質的內部胺基酸序列與一種花葯特異性蛋白質SF18的部分胺基酸序列具有87.5％的同源性，所述花葯特異性蛋白質SF18作為具有高度同源性的蛋白質由資料庫中提取。已知富含半胱氨酸的抗真菌蛋白質和花葯特異性蛋白質SF18都屬於變應原的防衛素家族。因此，顯示斑點1的蛋白質和斑點2的蛋白質分別與富含半胱氨酸的抗真菌蛋白質和花葯特異性蛋白質SF18屬於相同類別。而且，相應於斑點3的蛋白質的內部胺基酸序列與變應原ABA-1的部分胺基酸序列具有66.7％的同源性，所述變應原ABA-1作為與其具有高度同源性的蛋白質由資料庫中提取。因此，顯示斑點3的蛋白質是與變應原ABA-1屬於相同類別的變應原蛋白質。對於分別相應於斑點4-6的蛋白質的內部胺基酸序列，沒有與其具有高度同源性的蛋白質由資料庫中提取出來(在表2中以n.d.表示)。這提示斑點4-6的蛋白質是新的變應原蛋白質。
實施例5蟎提取物中的具有二硫鍵的蛋白質的檢測用研缽將屋塵蟎在含有1mM PASF和1mM EDTA的100mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)中研磨。將產物於14,000g離心30分鐘。離心後，收集上清液，過濾通過Ultrafree-Cl離心濾器(Millipore)，並且隨後通過Microcon YM-10離心濾器進行脫鹽。將脫鹽後的殘餘物溶於緩衝液中進行等電聚焦(8M尿素、0.5％CHAPS和0.1％Bio-Lytes)。將碘乙醯胺作為SH基保護劑加入到溶液中(終濃度5mM)，隨後將溶液於室溫溫育1小時。另外，將二硫蘇糖醇作為還原劑加入(終濃度5mM)，隨後將溶液於室溫溫育1小時。隨後，將monobromobimane作為SH基標記物質加入(終濃度10mM)，隨後將溶液於室溫溫育15分鐘。將由此獲得的反應溶液進行二維電泳，以與實施例1中相似的方式分離反應溶液中的蛋白質，隨後利用螢光檢測器檢測螢光信號(圖4)。
實施例6包含於蟎提取物中的變應原蛋白質的分析將圖4中檢測到螢光信號的斑點1-3從凝膠上切下，並且隨後以與實施例2相似的方式測定蛋白質的內部胺基酸序列。隨後，以與實施例2相似的方式對內部胺基酸序列進行同源性檢索。檢索結果顯示來自每個斑點的蛋白質的內部胺基酸序列都與每種已知的變應原蛋白質的部分胺基酸序列具有高度同源性(表3)。
表3

如表3中所示，相應於斑點1和2的蛋白質的內部胺基酸序列與一種已知變應原蟎變應原DER P2的部分胺基酸序列具有100％同源性，所述蟎變應原DER P2作為與其具有高度同源性的蛋白質由資料庫中提取。另外，相應於斑點3的蛋白質的內部胺基酸序列與一種已知變應原蟎變應原GLY D2的部分胺基酸序列具有80％同源性，所述蟎變應原GLY D2作為與其具有高度同源性的蛋白質由資料庫中提取。因此，顯示斑點3的蛋白質是一種屬於與蟎變應原GLY D2相同類別的變應原蛋白質。
如上所述，在蟎提取物中含有的具有二硫鍵的蛋白質已經通過本發明的方法進行了螢光檢測，並能夠鑑定為已知的變應原蛋白質(斑點1和2)或未知的變應原蛋白質(斑點3)，所述未知的變應原蛋白質屬於與已知變應原蛋白質類別相同的變應原蛋白質。
實施例7利用模式蛋白質檢測將50pmol的大豆胰蛋白酶抑制物(STI)、具有一個自由半胱氨酸殘基(即，一個游離SH基)和兩個分子內二硫鍵的變應原蛋白質以及250pmol的無二硫鍵並具有一個自由半胱氨酸殘基(即，一個游離SH基)的肌紅蛋白(Mg)蛋白質，分別與10μl含有62.5mM Tris-HCl緩衝液(pH6.8)和2％SDS的溶液混合。將碘乙醯胺作為SH基保護劑加入到溶液中(終濃度5mM)，隨後將溶液於室溫溫育1小時。接下來，將二硫蘇糖醇作為還原劑加入到溶液中(終濃度5mM)，隨後將溶液於室溫溫育1小時。另外，將monobromobimane作為SH基標記物質加入到溶液中(終濃度10mM)，隨後將溶液於室溫溫育15分鐘。將由此獲得的反應溶液進行SDS-PAGE以分離反應溶液中的蛋白質。根據Laemmli’s的方法以與實施例1相似的方式進行SDS-PAGE。
當通過考馬斯藍染色對所有的蛋白質進行檢測時，STI和Mg蛋白質都以與每種蛋白質的量一致的方式進行檢測(STI50pmol而Mg250pmol)(圖5A)。相反地，當檢測通過以螢光物質monobromobimane標記蛋白質進行時，只檢測到具有分子內二硫鍵的變應原STI，而只具有自由半胱氨酸殘基卻沒有二硫鍵的Mg則沒有檢測到(圖5B)。據認為，如果不僅形成二硫鍵的SH基而且自由半胱氨酸殘基的SH基都一起以monobromobimane通過本發明的方法進行標記，那麼應該以相同的螢光強度檢測出兩種類型的SH基。因此，通過本發明的方法只有STI蛋白質被檢測到的結果提示只有形成STI蛋白質中的分子內二硫鍵的SH基以monobromobimane進行了標記。
由以上結果，顯示具有二硫鍵的蛋白質(即，變應原蛋白質)能夠通過本發明的方法進行特異性地檢測。
工業實用性本發明提供了一種以高度靈敏性檢測待測樣品中具有二硫鍵的蛋白質的方法以及一種以高度靈敏性檢測待測樣品中變應原蛋白質的方法。根據本發明的方法，具有二硫鍵的蛋白質或變應原蛋白質不僅能夠進行特異性地檢測、分離和/或鑑定，也能夠以高度靈敏性進行分析而不會損失以極小量存在的蛋白質。
本文引入所有在此引用的出版物、專利和專利申請的全部內容作為參考。
序列表序列表110國家農業研究組織120檢測變應原蛋白質的方法130PH-1779-PCT140PCT/JP2003/0086681412003-08-07150JP 2002-2360481512002-08-1316018170PatentIn Ver.2.021012119212PRT213水稻220
223發明人Yano，Hiroyuki；Kuroda，Shigeru4001Cys Asp Ala Leu Ser Val Leu Val Arg1 521022118212PRT213水稻4002Gln Leu Leu Glu Pro Cys Cys Arg1 5210321118212PRT
213水稻4003Cys Asn Leu Gln His Thr Gly Phe Phe Gly Cys Pro Met Phe Gly Gly1 5 10 15Gly Met210421112212PRT213水稻4004Leu Ser Glu Ala Leu Gly Val Ser Ser Gln Val Ala1 5 1021052118212PRT213水稻4005Leu Gln Ala Phe Glu Pro Ile Arg1 5210 62118212PRT213水稻4006Asp Phe Leu Leu Ala Gly Asn Lys1 5210721112212PRT213水稻
4007Ser Gln Ala Gly Thr Thr Glu Phe Phe Asp Val Ser1 5 10210821112212PRT213水稻4008Val Glu Pro Gln Gln Cys Ser Ile Phe Ala Ala Gly1 5 10210921111212PRT213水稻4009Val Ile Gln Pro Gln Gly Leu Leu Val Pro Arg1 5 102101021111212PRT213三裂葉豚草220
221不清楚2229223不清楚40010Leu Cys Glu Lys Pro Ser Leu Thr Xaa Ser Gly1 5 10210112118212PRT
213三裂葉豚草40011Cys Ile Glu Trp Glu Gly Ala Lys1 5210122119212PRT213三裂葉豚草40012Val Asp His Ile Val Gly Glu Glu Lys1 52101321110212PRT213三裂葉豚草40013Gly Asp Phe Pro Val Phe Tyr Val Thr Lys1 5 102101421112212PRT213三裂葉豚草40014Gln Ile Ala Gln Gly Asp Glu Leu Val Phe Asn Tyr1 5 102101521111212PRT213三裂葉豚草40015Gln Ile Val Gln Gly Asp Glu Leu Val Phe Lys
1 5 10210162117212PRT213屋塵蟎40016Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys1 52101721112212PRT213屋塵蟎40017Gly Lys Pro Phe Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala1 5 102101821110212PRT213屋塵蟎40018Phe Ile Asp Cys Gly His Asn Glu Val Lys1 5 10權利要求
1.一種檢測具有二硫鍵的蛋白質的方法，包括通過化學修飾保護待測樣品中的蛋白質的游離SH基；斷裂游離SH基受保護的蛋白質的二硫鍵以暴露SH基；和檢測暴露的SH基。
2.權利要求1的方法，其中通過將暴露的SH基與SH基標記物質反應並檢測經標記的SH基而對暴露的SH基進行檢測。
3.權利要求2的方法，其中在檢測經標記的SH基之前，通過二維電泳分離待測樣品中的蛋白質。
4.權利要求2或3的方法，其中通過碘乙醯胺的烷基化作用進行化學修飾並且SH基標記物質為monobromobimane。
5.一種檢測變應原蛋白質的方法，包括通過化學修飾保護待測樣品中的蛋白質的游離SH基；斷裂游離SH基受保護的蛋白質的二硫鍵以暴露SH基；和檢測暴露的SH基。
6.權利要求5的方法，其中通過將暴露的SH基與一種SH基標記物質反應並檢測經標記的SH基而對暴露的SH基進行檢測。
7.權利要求6的方法，其中在檢測經標記的SH基之前，通過二維電泳分離待測樣品中的蛋白質。
8.權利要求6或7的方法，其中通過碘乙醯胺的烷基化作用進行化學修飾並且SH基標記物質為monobromobimane。
9.權利要求5-8任一項的方法，其中待測樣品為來自禾本科植物的種子、花粉、蟎或家塵的蛋白質提取物。
10.一種檢測具有二硫鍵的蛋白質或變應原蛋白質的試劑盒，其包含一種SH基保護劑和一種SH基檢測物質。
11.一種檢測有二硫鍵的蛋白質或變應原蛋白質的試劑盒，其包含碘乙醯胺和monobromobimane。
12.權利要求10或11的試劑盒，還包含一種還原劑。
全文摘要
本發明涉及一種檢測具有二硫鍵的蛋白質或變應原蛋白質的方法，包括通過化學修飾保護待測樣品中的蛋白質的游離SH基；斷裂SH基被保護的蛋白質的二硫鍵以暴露SH基；和檢測暴露的SH基。
文檔編號G01N27/447GK1688886SQ0382416
公開日2005年10月26日 申請日期2003年7月8日 優先權日2002年8月13日
發明者矢野裕之, 黑田秧 申請人:獨立行政法人農業.生物系特定產業技術研究機構