單子葉植物中油的提高的製作方法

2023-08-13 23:42:26 1

專利名稱：單子葉植物中油的提高的製作方法
單子葉植物中油的提高
背景技術：
本申請根據35 U.S.C. 119 (e)要求2005年5月26日提交的臨時申請 U.S. Serial No. 60/684,809的優先權，通過引用將該申請合併在此。
1. 發明領域
本發明涉及通過磷酸果糖激酶的過量表達提高作物植物種子中的 油水平。
2. 相關的技術
果糖_6-磷酸(F-6-P)向果糖-l,6-二磷酸(F-1,6-BP)的轉化由磷酸 果糖激酶(PFK)催化。ATP依賴性的PFK在大多數有機體和組織中催化 這個步驟，這種酶長期與糖酵解流的調節有關。實際上在許多系統中， 包括植物中，變構酶ATP-PFK和丙酮酸激酶(PK)的組合調節被認為是 對於調節糖酵解起主要作用的。在植物中，ATP-PFK位於質體和胞質液 中。通常地，這些不同的細胞位置中存在的酶具有不同的動力學性質。 除了 ATP-PFK酶之外，存在著涉及這兩種代謝物的相互轉變的兩種其他 的酶焦磷酸鹽依賴性PFK (PPI-PFK),其催化F-6-P和F-l,6-BP的無機 焦磷酸依賴性的可逆相互轉換，以及果糖-l，6-二磷酸酶，其催化葡糖異 生作用的逆反應。
Doehlert等人(1988 )發現，PFK在玉米的胚(embryos,高油組織) 中比在胚乳(低油組織)中更豐富。在涉及籽粒不同部分內碳水化合物 代謝的酶的豐度分布調查中，這些工作者發現，PFK活性與那些沉積了 最多油的籽粒區域相關。存在大量的證據證明PFK在調節糖酵解流中的 重要性(例如，Plaxton， 1996)。雖然已經產生了某些包含異源磷酸果 糖激酶基因的轉基因植物(例如，美國專利7,012，171; Burrell " a/., 1994; Thomas W a/., 1997; WO 99/67392; Wood W , 1999; Wood e/ , 2002),使用PFK來提高單子葉植物植抹和種子中的含油量還未被報導。
為了在發育的單子葉植物種子中產生更高的油水平，這些組織需要 轉化更多的新進碳(主要為蔗糖)成為甘油三酯(TAG)而不是澱粉。 這表明更多的己糖需要通過糖酵解而降解以產生丙酮酸和乙醯CoA作為 脂肪酸合成的底物。發明概述
本發明涉及/7#基因的過量表達，具有提高的糖酵解流和因而提高的 底物供應的預期效果，在例如單子葉植物種子的組織中產生更高的油水
平。更具體i也，這:^步及來自糹田菌Z^"o6(3cz7/ws Je/Z^ewcA"亞種Z w/gancw5 的ATP依賴性/#基因在單子葉植物種子中的過量表達。
本發明提供了產生在其種子中具有提高的油的單子葉植物的方法， 包括步驟種植轉化的單子葉植物來產生種子，所述單子葉植物包含可 操作連接到種子-增強啟動子的編碼磷酸果糖激酶的核酸序列，除非所述 種子-增強啟動子是胚-增強啟動子，所述種子-增強啟動子還任選地可操 作連接到編碼質體轉運肽的核酸序列，從而與缺乏所述核酸序列的同基 因植物的種子相比所述種子的油含量提高。
本發明提供了產生在其種子中具有提高的油的單子葉植物的方法， 包括步驟種植轉化的單子葉植物來產生種子，所述單子葉植物包含可 操作連接到種子-增強啟動子的、不是SEQIDNO: 9或13的編碼磷酸果 糖激酶的核酸序列，除非所述種子-增強啟動子是胚-增強啟動子，所述 種子-增強啟動子還任選地可操作連接到編碼質體轉運肽的核酸序列，從 而與缺乏所述核酸序列的同基因植物的種子相比所述種子的油含量提 南。
在一個實施方式中，所述方法包括產生單子葉植物，其中所述編碼 磷酸果糖激酶的核酸序列選自以下構成的組
a) 包含SEQIDNO: l或ll的核酸序列，和
b) 編碼SEQIDNO: 2或12的核酸序列。
在另一個實施方式中，所述植物進一步包含可操作連接到種子-增強 啟動子的、編碼丙酮酸激酶的笫二核酸序列。在這個實施方式的一種版 本中，所述編碼丙酮酸激酶的第二核酸序列選自以下構成的組
a) 包含SEQIDNO: 3的核酸序列，和
b) 編碼SEQIDNO: 4的核酸序列。
在各種實施方式中，所述單子葉植物選自由玉米(ZeamajAS、)、稻 米((9，a s""va )、 大麥(//o^/ewm vw/g"re )、 粟(屍amcw/w脂7wceww )、 ,擎、麥(5^c"zcw/77 aeWzvww )禾口高梁(Sorg/zwm 6zco/or)構成的組。在各種實施方式中，所述啟動子選自由胚-增強啟動子、胚乳-增強 啟動子以及胚-和胚乳-增強啟動子構成的組。
本發明還提供了轉化的植物細胞、轉化的植物和子代、種子、油和 粗粉。另外，本發明提供了動物飼料和人類食品成分以及生產油的方法。
序列的簡要說明
SEQ ID NO: 1歹寸出了編石馬來自丄"cto6acz〃2^ ^fe/Z^ewchz m/ . Z)w/ganc^的-岸酸果糖激酶的核酸序列。
SEQ ID NO: 2歹寸出了來自Z"cfoZ>ac7.〃i <ie/Z)/-ewh々'm/ . 6w/gancw 的磷酸果糖激酶的多肽序列。
SEQ ID NO: 3歹'J出了編》馬來自 Z"c,oZ)""〃m de/力rewch'z m/ . Zm/gancz^的丙酮酸激酶的核酸序列。
SEQ ID NO: 4歹寸出了來自丄actoZ ac/〃ws fife/Z)rewchz' 6w/g<2ncws 的丙酮酸激酶的多肽序列。
SEQ ID NO: 5-8列出了核酸引物。
SEQ ID NO: 9歹'j出了編石馬來自Sc/"ray"cc/2"row_ycw ;wwZ^的石粦酸 果糖激酶的核酸序列。
SEQ ID NO: 10歹U出了來自5"c/nzo^cc/zarawycw 的石舞酸果 糖激酶的多肽序列。
SEQ ID NO: 11歹ll出了編石馬來自屍ra/ z'om6"c e〃.wm /rew<iew/^/c/2〃' 的磷酸果糖激酶的核酸序列。
SEQ ID NO: 12歹'j出了來自/Vop/om力a"e"wm /rewc/e"rez'c/2h的石壽 酸果糖激酶的多肽序列。
SEQ ID NO: 13列出了編碼來自i^c/zenc/n" co"的石壽酸果糖激酶的 核酸序列。
SEQ ID NO: 14列出了來自Es，c/^r c/"a co/z的石舞酸果糖激酶的多肽序列。
附圖的簡要說明
以下附圖形成了本說明書的部分，被包括在內以進一步說明本發明 的某些方面。通過參考一個或多個這些附圖並結合在此呈現的特定實施 方式的詳細i兌明，可以更好地理解本發明。附

圖1 顯示了分離自丄a"oZ ""〃z^ t/e/^eh'/亞種6w/g"〃'cw5 ATCC菌抹11842的;^基因的編碼序列(SEQIDNO: 1)與公開的/ #基 因序列(EMBL登記號弁—X71403 )的比對。
附圖2 描繪了質粒pMON72008。
附圖3 描繪了質粒pMON79823 。
附圖4 描繪了質粒pMON79824。
附圖5 描繪了質粒pMON79827。
附圖6 描繪了質粒pMON72028 。
附圖7 描繪了質粒pMON79832。
附圖8 描繪了質粒pMON81470。
附圖9 描繪了質粒pMON72029 。
附圖10 描繪了質粒pMON83 715 。
說明性實施方式的說明
提供了以下定義作為對理解本發明的幫助。用語"DNA序列"、"核 酸序列"、"核酸分子"和"核酸片段"是指包含核苷酸的有序排列的物理結 構。DNA片段、序列或核苷酸序列可以含有在大核苷酸分子、載體等等 之內。此外，在這些序列中核酸的有序排列可以以序列表、附圖、表格、 電子媒體等等的形式描繪。
用語"編碼序列"、"編碼區"、"結構序列"和"結構核酸序列"是指其 中核苷酸以各自形成密碼子的 一 系列三聯體排列的DNA序列、核酸序 列、核酸分子的全部或片段。每個密碼子編碼特定的胺基酸。因而，編 碼序列、編碼區、結構序列和結構核酸序列編碼形成蛋白、多肽或肽序 列的一系列胺基酸。編碼序列、編碼區、結構序列和結構核酸序列可以 含有在大的核酸分子、載體等等之內。此外，在這些序列中核苷酸的有 序排列可以以序列表、附圖、表格、電子媒體等等的形式描繪。
術語"cDNA"是指互補於並來自mRNA的雙鏈DNA。
"表達"是指 一種過程，基因的編碼信息通過它被轉變為在細胞中存 在並運作的結構。表達的基因包括被轉錄成RNA、然後被翻譯成蛋白質 的那些，以及被轉錄成RNA但不翻譯成蛋白質的那些(例如，轉運RNA 和核糖體RNA)。
如在此使用的，"基因"是指表達特定蛋白質的核酸片段，包括在編碼序列之前(5'非編碼序列)和之後(3'非編碼序列)的調節序列。"天 然基因"是指在自然中存在具有其自身的調節序列的基因。"嵌合基因" 是指任何基因，其不是天然基因，包含在自然中不在一起存在的調節和 編碼序列。因而，嵌合基因可以包含來自不同來源的調節序列和編碼序 列，或來自相同來源但以不同於自然中存在的方式排列的調節序列和編 碼序列。"內源基因"是指在有機體的基因組中在其自然位置的天然基 因。"外源基因"或"轉基因"是指通過轉化過程導入到基因組中的基因。
轉基因包括通過轉化過程導入的基因組DNA (例如，與其活性啟動子連 接的基因組DNA)。
"異源"是指來自不同來源的兩種或多種核酸或蛋白序列之間的關 系。例如，如果這樣的組合不是自然中通常存在的，啟動子對於編碼序 列是異源的。此外，如果在特定的細胞或有機體中不會天然發生，特定 的核酸序列對於它所插入的細胞或有機體可以是"異源的"。
"序列同源性"是指在兩個或更多核酸或胺基酸序列之間就位置同 一性的百分比而言的相似性水平。術語同源性還用於指出在不同的核酸 或蛋白之間的相似功能性質的概念。
"雜交"是指當兩個核酸鏈具有充分的序列互補性時核酸的第 一鏈 與第二鏈經由氬鍵鹼基配對結合的能力。如在此使用的，如果核酸分子 顯示出完全的互補性，則稱核酸分子是另一個核酸分子的"互補物"。如 此處使用的，當一個分子的每一個核普酸與另一個分子的核苦酸互補 時，稱為分子顯示出"完全的互補性"。因而，當它們的相互雜交具有足 夠的穩定性以允許它們在合適的條件下保持相互的退火時，稱兩個核酸 鏈具有充分的互補性。
促進DNA雜交的合適的嚴格條件是，例如，6.0x氯化鈉/檸檬酸鈉 (SSC)在約45。C,隨後2.0xSSC在20-25。C洗滌，是本領域技術人員公 知的。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以選自低度嚴格的約2.0xSSC、 50°C 到高度嚴格的約0.2xSSC、 65°C。此外，洗滌步驟中的溫度可以從在室 溫下約22。C的低嚴格條件提高到約65溫度的高嚴格條件。溫度和鹽度都 可以變化，或者溫度或鹽濃度之一可以保持恆定，從而核酸將與在此提 供的一種或多種多核苷酸分子在中度嚴格條件下特異性雜交，所述多核 苦酸分子例如在SEQ IDNO: 1、 3或11中列出的、或其互補物，所述中 度嚴格條件例如約2.0x SSC和約65 °C 。用語"分離的"意指已經從其自然環境移除，不考慮它的最終分布。 例如，"分離"自稻米的核酸序列，例如通過從稻米細胞克隆，當被插入 到玉米細胞的基因組時保持了 "分離的"。
用語"可操作連接"是指兩種或多種核酸區域或核酸序列的空間排 列，從而它們發揮它們相互的合適效果。例如，啟動子區域可以相對於 核酸序列放置，從而所述核酸序列的轉錄^^皮所述啟動子區域指導。該啟 動子區域和該核酸序列是"可操作連接的"。
術語"磷酸果糖激酶"是指能夠將果糖-6-磷酸(F-6-P)轉化成果糖
-1,6-二磷酸(F-1,6-BP)的酶。這包括來自國際生物化學聯合會和分子 生物學酶術語分類EC 2.7.1.ll和EC 2.7.1.90的酶。
術語"丙酮酸激酶"是指能夠將磷酸烯醇丙酮酸轉化成丙酮酸的酶。
這包括來自國際生物化學聯合會和分子生物學酶術語分類2.7丄40的酶。 術語"質體"是指藻類和植物細胞的自我複製性細胞質細胞器，例如
葉綠體或色質體。"轉運肽"是指蛋白的N-末端的胺基酸序列，其將所述
多肽從它在胞質液中的合成耙向質體，並促進它通過質體膜的轉位。在
多肽進入質體之後，轉運肽從所述多肽上裂解。
"上遊"和"下遊"是對於核苷酸序列的位置以及編碼序列的轉錄或翻
譯方向所使用的位置術語，其通常在5'到3'方向上進行。
術語"啟動子"或"啟動子區域"是指核酸序列，通常存在於編碼序列
的上遊(5'),其能夠指導核酸序列成為RNA分子的轉錄。啟動子或啟
動子區域一般提供了 RNA聚合酶的識別位點以及適當的轉錄起始所必
需的其他因素。如在此期待的，啟動子或啟動子區域包括通過插入或刪
除調節區、使啟動子經歷隨機或定點誘變等等所衍生的啟動子變體。啟
動子的活性或強度可以通過就它產生的RNA數量、或在細胞或組織中積
累的蛋白質數量，相對於類似測量的第二啟動子來定量。
用語"3'非編碼序列"是指位於編碼序列的下遊的核苦酸序列，包括
多聚腺苷酸識別序列和編碼能夠影響mRNA加工或基因表達的調節信號
其他序列。這些通常被成為3'非翻譯區域或3'-UTR。多腺苷酸化信號通
常以影響多聚腺苷酸l殳向mRNA前體的3'末端的添加為特徵。不同的3'
非編碼序列的作用由Ingelbrecht等(1989 )例證。
"翻譯前導區序列"或"5'非翻譯區"或"5'UTR"都是指位於基因的啟
動子序列和編碼序列之間的核苷酸序列。5'-UTR存在於完整加工的翻i奪起始序列的mRNA上遊。5'-UTR可以影響向mRNA的主要轉錄的加工、 mRNA穩定性或翻譯效力。已經描述了翻譯前導序列的實例(Turner and Foster, 1995 )。
"RNA轉錄產物"是指由RNA聚合酶催化的DNA序列轉錄產生的產 物。當RNA轉錄產物是DNA序列的理想互補拷貝時，它^L稱為原始轉錄 產物。來自原始轉錄產物的轉錄後加工的RNA序列被稱為成熟RNA。"信 使RNA" (mRNA)是指沒有內含子並且可以被細胞翻譯成多肽的RNA。
"重組載體"是指任何試劑，通過它或在它之中，目標核酸被擴增、 表達或保存，例如質粒、粘粒、病毒、自主複製序列、噬菌體或線性單 鏈的、環形單鏈的、線性雙鏈的、或環形雙鏈的DNA或RNA核苦酸序列。 重組載體可以被合成，或來自於任何來源，並能夠基因組整合或自主復 制。
"調節序列"是指位於編碼序列或內含子的上遊(5')、之中或下遊 (3')的核苷酸序列，它的存在或缺乏影響所述編碼序列的轉錄和表達。 "基本上同源的"是指在序列上至少約90%相同的兩個序列，如通過例如 DNAStar ( Madison, WI)中的CLUSTAL W算法所測量的。
"基本上純的"是指從在其天然狀態中通常與其相關的基本上所有 其他分子在分離的分子。更優選的，基本上純的分子是在制品中存在的 優勢種。基本上純的分子可以是大於約60%地沒有、優選的約75%地沒 有、更優選的約90%地沒有、以及最優選的約95。/。地沒有天然混合物中 存在的其他分子(不包括溶劑)。用語"基本上純的"不意圖涵蓋以它們 的天然狀態存在的分子。優選的，本發明的核酸分子和多肽是基本上純 的。
術語"轉化"是指核酸導入接受者宿主中。術語"宿主"是指細菌細胞、 真菌、動物或動物細胞、植物或種子、或任何植物部分或組織，包括植 物細胞、原生質體、愈傷組織、根、塊莖、種子、莖、葉、幼苗、胚和花粉。
如在此使用的，"轉基因植物"是具有被穩定導入其基因組，例如核 或質體基因組中的外源核酸的植物。
術語"同基因的"作為具有或缺乏轉基因的植物或植物系之間的比 較性術語，是指除了所討論的轉基因之外植物或抹系具有相同或相似的
遺傳背景。例如，代表來自親本F2群體的表型相似或相同選集的所謂的姐妹系被認為是"同基因的"。當使用未轉化的親本作為回交親本、使穩 定的轉化植物的子代與未轉化的親本株系雜交或回交，同時針對型(通 過分子標記物分析的基因型，或通過田間觀察的表型，或兩種)和轉基 因來選擇時，產生的轉基因林系被認為是與其未轉化的親本系是高度 "同基因的"。
術語"種子"、"籽粒"和"穀粒"被理解為在含義上是等價。術語籽粒 通常用於描述玉米或稻米植物的種子。在所有植物中，種子是由種皮、 胚、糊粉和胚乳組成的成熟的胚珠。
編碼磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的核酸
本發明提供了，尤其是，使用編碼磷酸果糖激酶(國際生物化學聯
合會和分子生物學酶術語分類EC 2.7.1.ll和EC 2.7.1.90;更具體地，SEQ ID NO: l和ll )以及丙酮酸激酶(EC 2.7.1.40;更具體地，SEQ ID NO: 3)的核酸分子的方法。
在一個實施方式中，這些核酸分子在本發明的上下文中被用於改變 單子葉植物種子中的油含量。
這些核酸分子可以使用cDNA、 mRNA或基因組DNA作為模板和合 適的寡核苷酸引物根據標準PCRTM擴增技術來擴增。做為選擇，它們可 以使用標準的合成技術，例如自動化的DNA合成儀來合成。
如果希望，編碼磷酸果糖激酶或丙酮酸激酶的核酸的序列可以被修 改而不改變表達的蛋白質的最終胺基酸序列，使得所述序列在植物宿主 中更易於表達。編碼序列可以是人工的DNA。如在此使用的人工DNA 是指非天然發生的DNA多核普酸分子。人工DNA分子可以通過各種方法 來設計，例如，基於取代笫一多核苷酸的密碼子來產生等效物的本領域 中已知的方法，乃至改進的、第二代人工多核苦酸，其中這種新的人工 多核苷酸對於轉基因植物中增強的表達是有用的。設計方面通常採用密 碼子利用率表，該表格通過編選分離自植物、植物型、科或屬的編碼序 列集合中密碼子出現頻率來產生。其他設計方案包括降低多腺苷酸化信 號、內含子剪接位點、或序列的長的AT或GC延伸的出現(美國專利
法從人工DNA產生。表達載體和盒
植物表達載體可以包含與上述核酸分子可操作連接的天然的或非 天然的啟動子。啟動子的選擇，例如，可被描述為強表達、弱表達、可 誘導表達、組織增強表達(即，在組織中特異地或優先地表達)、器官 增強表達(即，在器官中特異地或優先地表達)和發育增強表達(即， 在發育的特定階段特異地或優先地表達)的啟動子，在本領域技術人員 的能力範圍內。類似地，如上所述的核酸分子與啟動子的組合也在本領
域技術人員能力範圍內(參見，例如Sambrook Wa/., 1989)。
在本發明的一個實施方式中，上述核酸分子與種子-增強啟動子可操 作連接，引起足以提高單子葉植物種子中的油的表達。本發明的啟動子 一般包括，但不限於，在細菌、噬菌體或植物細胞中起作用的啟動子。 用於細菌表達的有用啟動子有lacZ、 Sp6、 T7、 T5或五.co/z glgC啟動子。 對於植物細胞有用的啟動子包括球蛋白啟動子L (參見，例如Belanger and Kriz( 1991 )、 gamma zein Z27啟^力子(參見，例^口Lopes " a/. 0995 )、 L3oleosin啟動子(美國專利No. 6,433,252 )、大麥PER1啟動子(Stacey "a/. ( 1996) 、 CaMV35S啟動子(Odell " a/. H985 ) ) 、 CaMV 19S (Lawtone/"/" 1987 )、歸(Ebert " a/" 1987 )、Adh( Walker "《1987)、 蔗糖合酶(Yang " "/., 1990 )、肌動蛋白(Wang " a/" 1992 )、 c"M Sullivan 1989 ) 、 PEPCase啟動子(Hudspeth " a/., 1989),或與R基因復 合物相關的那些啟動子(Chandler" a/. ， 1989 )。玄參花葉病毒(FMV) 啟動子(Richms"a/., 1987) 、 arcelm、番茄E8、 patatin、遍在蛋白、 mannopine合成酶(mas)和微管蛋白啟動子是有用啟動子的其他實例。 在玉米中表達的啟動子包括來自編碼玉米蛋白(zeins)的基因的啟 動子，玉米蛋白是在玉米胚乳中發現的一組儲存蛋白質。玉米蛋白基因 的基因組克隆已經被分離(Pedersen W 1982 )和Russell "a/., 1997)， 可以使用來自這些克隆包括15kD、 16kD、 19kD、 22kD和27kD基因的啟 動子。已知在玉米中和在其他植物中起作用的其他種子表達增強啟動子 包括以下基因的啟動子,"cy(微粒結合的澱粉合酶)、份W/e和S/^朋fe" 2 ( ADP葡萄糖焦磷酸化酶)、幼r麗fe" 1 (蔗糖合酶)、分支酶I和II、 澱粉合成酶、脫支酶、oleosms、谷蛋白和Betll (基礎胚乳轉移層)。 本領域技術人員已知的在本發明的實踐中有用的其他啟動子也是本發 明預期的。此外，轉錄增強子或增強子的複製物可以用於提高來自特定啟動子
的表達。這種增強子的實例包括但不限於Adh內含子l (Callis W a/., 1987 )、稻米肌動蛋白內含子(McElroy " "/.， 1991;美國專利No. 5,641，876)、蔗糖合酶內含子(Vasile"/" 1989)、玉米HSP70內含子 (也稱為Zm.DnaK )(美國專利No.5,424,412 Brown, " )、 TMV omega 元件(Gallieef"/" 1999)、 CaMV 35S增強子(美國專利Nos.5,359,142 & 5,196,525, McPherson " )或章魚鹼合成酶增強子(美國專利No. 5,290，924, Last W a/.)。由於轉錄起始位點和編碼序列的起點之間的DNA 序列，即，非翻譯前導序列可以影響基因表達，人們也可以希望採用特 定的前導序列。可以採用本領域技術人員可獲得的任何前導序列。優選 的前導序列指導連接的基因的最佳表達水平，例如，通過提高或維持 mRNA穩定性和/或通過防止不適當的翻譯起始(Joshi, 1987)。這種序
列的選擇處於本領域技術人員的處理能力之內。來自特別是在玉米、稻 米和單子葉植物中高度表達的基因的序列是期待的。
本發明的表達盒還將包括靠近所述盒的3'末端的序列，其充當信號 來終止異源核酸的轉錄，並指導產生的mRNA的多聚腺苷酸化。這些通 常被成為3'非翻譯區域或3'-UTR。可以充當轉錄終止信號的某些3'元件包 4舌來自jgra6a"enwm wme/a"e似的月因月旨石鹹合成酶基因的那些(Bevan " "/., 1983 )、 napm 3，非翻譯區域(Kndl " 1991 )或球蛋白3'非翻 譯區域(Belanger肌d Kriz, 1991 )或來自玉米蛋白基因，例如Z27的元 件(L叩es Wa/.， 1995 )。本領域已知的其他3'調節元件也可以用於本發 明的載體中。
本發明的表達載體也可以包括與異源核酸序列融合的編碼轉運肽 的序列。葉綠體轉運肽(CTP)被工程化來融合到蛋白的N-末端以指導 蛋白進入植物葉綠體。許多葉綠體本地化蛋白作為前體從核基因中表 達，並通過在輸入過程中被除去的葉綠體轉運肽被靶向到葉綠體。其他 這樣的葉綠體蛋白的實例包括核酮糖-1 , 5-二磷酸羧化酶的小亞基 (SSU)、鐵氧化還原蛋白、鐵氧化還原蛋白氧化還原酶、光收穫複合 物蛋白I和蛋白II，和石危氧還蛋白F。淨爭別；也，可以^吏用^Vzco""wa/^Z^c'wm 核酮糖l，5-二磷酸羧化酶小亞基chor叩last轉運肽(SSU-CTP ) ( Mazur, W a/., 1985 )。已經在體內和體外證明了通過使用與CTP的蛋白融合物， 非葉綠體蛋白可以被耙向葉綠體，並且CTP序列足以將蛋白草巴向葉綠體。適合的葉綠體轉運肽，例如爿ra6^fo戸w Aa/w朋EPSPS CTP ( Klee W 1987 )和屍咖腹EPSPS CTP ( della-Cioppa " "/., 1986 )的摻入 已經證明了在轉基因植物中將異源EPSPS蛋白序列靶向葉綠體。
本發明進一步提供了包含上述核酸分子的載體。如上所述的核酸分 子可以被克隆到任何適合的載體中，並可以用於轉化或轉染任何適合的 宿主。載體的選擇和構建它們的方法是本領i4熟知的，在4支術文獻中一 般地描述了 (一般參見，"Recombinant DNA Part D" ( 1987))。所述 載體將優選地包含調節序列，例如轉錄和翻譯起始密碼子以及終止密碼 子，其特異於載體將要導入其中的宿主類型，視情況地並考慮該載體是 DNA還是RNA。
可以製備環形或線形的載體構建體，含有連接到在原核或真核宿主 細胞中有功能的複製系統的如上所述的完整核酸序列或其部分。複製系 統可以來自ColEl、 2m^質粒、X喧菌體，fl絲狀噬菌體、土i裡桿菌物種 (例長口, A. tumefaciens禾口A. rhizogenes )等等。
除了複製系統和插入的核酸序列之外，所述構建體可以包括容許選 擇轉化或轉染的宿主的一種或多種標記基因。標記基因包括抗生抗性， 例如，對抗生素、重金屬、除草劑等等的抗性，在營養缺陷宿主中的補 足來提供原養，等等。
本發明提供了包含上述核酸分子、任選的以載體形式的核酸分子的 宿主細J包。適合的宿主包括:才直物、細菌和酵母細胞，包括五sc/ze/7'c/na
cerevwzae，禾口A^w;-c^/7on2 cnxwa。
co/z國宿主包4舌TB隱1 、 TG-2、 DH5ot、 XL-Blue MRF， ( Stratagene, La Jolla, CA ) 、 SA2821、 Y1090和TG02。植 物細胞包括單子葉植物，包括但不限於玉米、小麥、大麥、燕麥、黑麥、 粟、高粱和稻米的細胞。
多肽
本發明提供了有上述核酸分子編碼的磷酸果糖激酶，以及在某些情 況下，丙酮酸激酶。所述多肽優選的包含氨基末端和羧基末端。所述多 肽可以包含D-胺基酸、L-胺基酸，或D-與L-胺基酸的混合物。
對天然胺基酸序列產生變體多肽的改變可以通過本領域普通技術 人員已知的各種方法來進行。例如，通過在合成時改變核酸分子的序列可以方便地將胺基酸替換引入所述多肽中。通過將包含修飾的序列的合 成寡核苷酸連接到表達載體中，也可以引入位點特異性突變。作為選擇，
可以使用寡核苷酸指導的、位點特異性誘變步驟，例如在Walder " a/. (1986) ;Bauer""/. ( 1985 );和美國專利Nos.4,518，584和4,737,462中公開的。
在本領域普通技術人員能力範圍內的是選擇合成的和天然發生的 胺基酸，其作為對任何特定的天然發生胺基酸的保守性或中性替換。普 通技術人員理想地將考慮進行任何特定胺基酸替換的環境，還考慮側鏈 的疏水性或極性、側鏈的一般大小、在生理條件下具有酸性或鹼性的側 鏈的pK值。例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸通常適合相互替換，更通常 地是精氨酸和組氨酸。本領域已知的是，這是因為所有三個胺基酸都具 有鹼性側鏈，而賴氨酸和精氨酸的側鏈的pK值相互之間比組氨酸(約6 ) 更接近(約10和12)。類似地，甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異 亮氨酸通過適當地相互取代，條件是甘氨酸通常不適合替代該組的其他 成員。這是因為當摻入到多肽中時這些胺基酸的每一個都是相對疏水性 的，但是甘氨酸缺乏a碳容許了旋轉的phi和psi角(在a碳周圍)有這樣 大的構象自由度，從而甘氨酸殘基可能觸發在其他胺基酸相互替換時通 常不發生的構象或二級結構中的改變。通常適合相互替換的其他胺基酸 組包括但不限於，由穀氨酸和天冬氨酸構成的組；由苯丙氨酸、酪氨酸 和色氨酸構成的組；以及由絲氨酸、蘇氨酸和任選的酪氨酸構成的組。 另外，普通技術人員可以容易地分類合成胺基酸和天然發生的胺基酸。
如果期望，所述多肽可以被修飾，例如，通過糖基化、醯胺化、羧 化作用或磷酸化，或通過加酸鹽、醯胺、酯、特別是C-末端酯以及本發 明的多肽的N-醯基衍生物的生成。通過根據本領域已知的方法與其他部 分形成共價或非共價複合物，所述多肽還可以被修飾來產生蛋白衍生 物。共價結合的複合物可以通過將化學部分連接到多肽包含的胺基酸的 側鏈的功能基團上，或連接到N-或C-末端來製備。理想地，這種修飾和 結合不會有害地影響多肽(和其變體)的活性。雖然這種修飾和結合可 能具有更大或更小的活性，所述活性期望地不是消極的，並且是未改變 的多肽的特徵。
所述多肽(和片段、變體和融合蛋白)可以通過多種常規技術的任 何一種來製備。所述多肽可以是從天然發生的來源或從重組來源分離的或基本上純化的。例如，對於重組蛋白來說，編碼期望的蛋白質的DNA
片段可以使用公知的分子遺傳技術(參見，例如，Mamatis"a/., 1989) 和在此處的"實施例"中引用的其他參考文獻)亞克隆到合適的載體中。 片段可以被轉錄，蛋白隨後在體外翻譯。也可以採用商業上可獲得的試 劑盒(例如,由Clontech, Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, IL; Invitrogen等等生產的)。任選的可以在核酸的操作中採用聚合酶鏈 式反應。
這種多肽也可以根據本領域已知的方法使用自動化肽合成儀來合 成。作為選擇，所述多肽(和片段、變體和融合蛋白)可以使用本領域 普通技術人員公知的標準肽合成技術(例如，如Bodanszky, 1984中概述 的)來合成。特別地，所述多肽可以使用固相合成的步驟來合成(參見， 例如，Memfield, 1963; Barany "a/., 1987;和美國專利No. 5,424,398)。 如果期望，這可以使用自動化肽合成儀來進行。t-丁氧基羧基(t-BOC) 或9-藥曱氧羰基(Fmoc)胺基酸保護基團的去除以及蛋白從樹脂上的分 離可以伴隨著例如在降低的溫度下的酸處理。含多肽的混合物任何可以 被提取，例如，使用二乙醚，來除去非肽有機化合物，合成的蛋白質可 以從樹脂粉未中提取(例如，使用約25% w/v乙酸)。在多肽的合成之 後，任選地可以進行進一步的純化(例如，使用HPLC)來消除任何不 完整的蛋白質、多肽、肽或游離胺基酸。胺基酸和/或HPLC分析可以對 合成的多肽進行來驗證其身份。對於根據本發明的其他應用，優選的是 產生所述多肽來作為更大的融合蛋白的部分，通過化學結合，或通過本 領域已知的遺傳學方法。就此來說，本發明還提供了包含所述多肽(或 其片段)或其變體以及具有任何期望的性質或效應物功能的一種或多種 其他多肽/蛋白的融合蛋白。
對於特定蛋白質的生產和鑑定的分析是基於各種物理-化學的、結構 的、功能的性質，或蛋白質的其他性質。獨特的物理-化學或結構性質容 許通過電泳步驟，例如天然或變性凝膠電泳或等電聚焦，或者通過層析 技術，例如離子交換或凝膠排阻層析來分離和鑑定。單獨蛋白質的獨特 結構提供了使用特異性抗體來以例如ELISA分析的形式檢測它們存在的 機會。方法的組合可以用於實現更高的特異性，例如Western印跡，其中 抗體被用於定位已經通過電泳技術分離的單獨基因產物。其他技術可以 用於確切地確認目標產物的身份，例如通過純化後的胺基酸測序來評估。雖然這些是最常見的，但也可以使用其他步驟。
分析過程可以通過蛋白質的功能來鑑定蛋白質的表達，特別是當表 達的蛋白質是能夠催化涉及特定底物和產物的化學反應的酶時。例如，
在植物提取物中，這些反應可以通過物理和/或化學過程通過提供和測定 反應的底物損失和產物生成來測量。
磷酸果糖激酶或丙酮酸激酶的活性可以使用這種分析在體外測量。
這種分析的實例包括LeBras "a/. ( 1991 )和LeBras "a/. ( 1993 )。代謝
放射示蹤研究可以測量體內不同產物庫的產生。在這種研究中，向完整 的組織提供放射性標記的前體，監視前體被代謝時放射性標記的結局。
在很多情況下，基因產物的表達通過評估其表達的表型結果來確 定。這種評估可以僅僅是視覺觀察，或可以包括分析。這種分析可以採 取許多形式，例如，分析植物的化學成分、形態學或生理性質方面的改 變。通過表達編碼酶或儲存蛋白質的基因，或通過改變澱粉數量的酶， 可以改變化學組成，所述儲存蛋白質改變胺基酸組成並且這種改變可以 通過胺基酸分析來檢測，所述澱粉數量可以通過近紅外反射光譜來分 析。形態改變可以包括更大的身材或更厚的莖杆。
本發明的核酸分子、載體和多肽可以用於農業方法和各種篩選分析 中。例如，核酸分子可以用於在宿主細胞中經由載體表達磷酸果糖激酶， 用於檢測生物樣品中編碼磷酸果糖激酶的mRNA,用於經由Southern印 跡來檢測編碼磷酸果糖激酶的基因中的遺傳改變，用於抑制磷酸果糖激 酶，或用於增量調節磷酸果糖激酶。所述多肽可以用於在植物中補償磷 酸果糖激酶的缺失，或補償具有降低的活性或無活性的突變磷酸果糖激 酶的存在，或用於在植物中處理磷酸果糖激酶的過多的底物水平，不管 是直接還是間接的。做為選擇，所述多肽可以用於根據調節它們活性的 能力來篩選試劑。抗體可以用於才全測和分離相應的多肽，以及降4氐這種 多 肽在體內的可用性。
方法
技術領域：
本發明提供了與具有相似遺傳背景的未轉化植物的種子相比，提高 單子葉植物種子中的油的方法。在一個實施方式中，所述提高油的方法 包括種植轉化的單子葉植物來產生種子的步驟，所述單子葉植物具有可 操作連接到種子-增強啟動子的、不是SEQIDNO: 9或13的編碼磷酸果糖激酶的核酸序列，除非所述種子-增強啟動子是胚-增強啟動子，所述 種子-增強啟動子任選地可操作連接到編碼質體轉運肽的核酸序列。
在另 一個實施方式中，所述提高油的方法包括向單子葉植物的細胞
中導入選自由以下構成的組、編碼磷酸果糖激酶的核酸序列
a) 包含SEQIDNO: l或ll的核酸序列，和
b) 編碼SEQIDNO: 2或12的核酸序列。
在另一個實施方式中，所述提高油的方法包括用可操作連接到種子 -增強啟動子、編碼丙酮酸激酶的第二核酸序列轉化所述植物的進一步的 步驟。在又一個實施方式中，所述提高油的方法包括向植物中導入選自 由以下構成的組、編碼丙酮酸激酶的第二核酸序列的進一步的步驟
a) 包含SEQIDNO: 3的核酸序列，和
b) 編碼SEQIDNO: 4的核酸序列。
在各種實施方式中，所述單子葉才直物選自由玉米(Z^wa，)、稻 米((9r_yz<3 )、 大麥(//oniewm vw/g"re )、 粟(屍a n'cwm wz'/^aceww )、
,繁、麥(5"ec'"/e cerea/e ) 、 'J、麥(7>#z.cwm aeWz.vww )禾口高梁(5V 廠g/zww ^'co/or)構成的組。
在各種實施方式中，所述啟動子選自由胚-增強啟動子、胚乳-增強 啟動子以及胚-和胚乳-增強啟動子構成的組。
植物轉化
在本發明的一個實施方式中，產生表達期望的蛋白質的轉基因植 物。向植物細胞中導入編碼期望的蛋白質的期望的多核苦酸序列的各種 方法是本領域已知的，包括(l)物理方法，例如顯微注射、電穿孔和 微粒介導的遞送(biolistics或基因槍技術)；(2)病毒介導的遞送；和 (3) 土壤桿菌介導的轉化。
植物細胞轉化的最常用的方法是土壤桿菌介導的DNA轉移過程，以 及biolistics或微注射微粒轟擊介導的過程。 一般地，核轉化是期望的， 但當專門地轉化質體，例如葉綠體或澱粉體是期望的時，可以利用期望 的多核苷酸的微粒介導的遞送來轉化植物質體。
土壤桿菌介導的轉化通過使用屬於土壤桿菌屬的遺傳工程化的土 ^裡糹田菌來實王見。帶有Ti或Ri質4立的jgn9/6(3"erzwm ^we/"cz.e似,口 爿gra^cfe〃wm /7nzoge"M的許多野生型和解除的菌4朱可以用於才直物的基因轉移。經由稱為"T-DNA"的特定DNA的轉移來進行向許多植物品種中 的基因轉移，所述特定DNA可以被遺傳工程化來攜帶任何期望的DNA 片段，如在例如Bidney等的美國專利6,265,638中進一步詳細描述的，通 過引用將其公開內容合併在此。
土壤桿菌介導的植物的遺傳轉化涉及幾個步驟。第一步，其中強毒 土壤桿菌和植物細胞首先相互接觸， 一般稱為"接種"。接種優選地伴隨 著某些對 一 些植物細胞的損傷方法，其釋放活化土壤桿菌中的致病因子 的植物細萬包成分，例如coumaryl醇類、sinapinate (其^皮還原為乙醯丁香 酮)、芥子醇和松柏醇。在接種之後，允許土壤桿菌和植物細胞/組織在 適合生長和T-DNA轉移的條件下 一起生長几小時到幾天或更久的 一段 時間。這個步驟稱為"共培養"。在共培養和T-DNA遞送之後，用殺細菌 或抑細菌試劑處理植物細胞來殺死保持與外植體接觸的和/或在含有外 植體的器亞中的土壤桿菌。如果在缺乏任何選擇性試劑的情況下進行這 個步驟，以促進轉基因植物細胞相對於非轉基因植物細胞的優勢生長， 則這一般稱為"延遲"步驟。如果在存在偏愛轉基因植物細胞的選擇壓力 的情況下進行這個步驟，則它被稱為"選擇"步驟。當使用"延遲"時，一 般跟隨著一個或多個"選擇"步驟。
對於微粒轟擊(美國專利No. 5,550,318 (Adams " );美國專利No. 5,538,880 (Lundqmst et. al.)、美國專利No. 5,610,042 ( Chang W a/.); 和PCTV^開WO 95/06128 ( Adams a a/.);通過完全引用將它們每一個特 別地合併在此)，用核酸包一皮微粒子，並通過推力遞送到細胞中。示範 性的顆粒包括由鴒、賴和優選的金組成的那些。
通過加速將DN A遞送到植物細胞中的方法的說明性實施方式是 Biolistics顆粒遞送系統(BioRad, Hercules, CA ),其可以用於將包被有 DNA或細胞的顆粒通過篩子，例如不鏽鋼篩或Nytex篩推進到用懸浮液 中培養的單子葉植物細胞覆蓋的過濾器表面上。
微粒轟擊技術是廣泛可用的，可以用於轉化實際上任何植物物種。 已經通過微粒轟擊轉化的物種的實例包括單子葉植物物種，例如玉米 (國際公開NO. WO 95/06128 (Adams "q/.))、大麥、小麥(美國專 利NO. 5,563,055 ( Townsend W a/.),通過完全引用合併在此)、稻米、 燕麥、黑麥、甘蔗和高粱；以及許多雙子葉植物，包括菸草、大豆(美 國專利NO. 5，322,783( Tomes)，通過完全引用合併在此)、葵花、花生、棉花、番茄和一般的豆莢(美國專利No. 5,563,055 (Townsend" a/.),通過完全引用合併在此)。
為了對轉化的植物細胞進行選擇或記分而不考慮轉化方法，被導入 細胞中的DNA含有基因，其在可再生的植物組織中起作用來產生為植物 組織賦予對其他有毒化合物的抗性的化合物。用作可選擇、可篩選或可 記分標記物的目標基因將包括但不限於P-葡糖醛酸酶(GUS)、綠色熒 光蛋白(GFP)、螢光素酶(LUX)、抗生素或除草劑耐受性基因。抗 生素抗性基因的實例包括青黴素、卡那黴素(和新黴素、G418、博來黴 素)；氨甲蝶呤(和三曱氧千二氨嘧啶)；氯黴素；卡那黴素和四環素。 編碼涉及除草劑耐受性的蛋白質的多核苷酸分子是本領域已知的，包括 但不限於關於草甘膦耐受性的美國專利No. 5,627，061 (Barry, " W.)、 美國專利No 5,633,435 (Barry, " )和美國專利No 6,040,497 ( Spencer,
)中描述的編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的多核 苷酸分子和美國專利No. 5,094，945 ( Comai)中描述的aroA;關於溴苯 腈耐受性的美國專利No. 4,810,648 ( Duerrschnabel " a/.)中描述的編碼 溴苯腈水解酶(Bxn )的多核苷酸分子；關於達草滅耐受性的在Misawa " a/. ( 1993 )和Misawa W a/. ( 1994)中描述的編碼八氳番茄紅素脫飽和 酶(crtl)的多核苷酸分子；以及各自提供了草銨膦和雙丙氨膦耐受性 的Wohlleben ef a/. ( 1988 )中描述的PAT基因和DeBlock " a/. ( 1987) 中描述的bar基因。
來自各自轉化的外植體的植物的再生、發育和培養是本領域中充分 記載了的。這種再生和生長過程一般包括選擇轉化的細胞和培養那些個 體化的細胞的步驟，從一般的胚胎發育階段到生根的植物苗階段。類似 地再生轉基因胚和種子。然後將產生的轉基因的生根的芽種植到合適的 植物生長培養基，例如土壤中。在對選擇性試劑的暴露下倖存的細胞， 或在篩選分析中記分為陽性的細胞，可以在支持植物再生的培養基中培 養。在轉移到溫室或生長箱發育成熟之前，將發育的植物苗轉移到少土 的植物生長混合物中，並鍛鍊得耐寒。
本發明可以4吏用任何可轉化的細胞或組織。在此使用的可轉化是指 細胞或組織能夠進一步增殖來產生植物。本領域技術人員認識到，許多 植物細胞或組織是可轉化的，其中在外源DNA的插入和合適的培養條件 之後，植物細胞或組織可以形成分化的植物。適合於這些目的的組織可以包括但不限於不成熟的胚、鱗片組織、懸浮細胞培養物、不成熟的花 序、芽分生組織、結節外植體、愈傷組織、胚軸組織、子葉、根和葉。
以上引述的Tomes "'783專利描述了 一種方法，用細胞分裂素處理、 隨後孵育 一段時期，足以允許子葉節組織中的未分化細胞分化成分生組 織細胞，並允許細胞進入發育的G1和分裂期之間的階段，聲稱其改善了 轉化的敏感性。
可以使用任何適合的植物培養基。適合的培養基包括但不限於，基 於MS的培養基(Murashige and Skoog, 1962 )或基於N6的培養基(Chu " a/., 1975 ),補充有植物生長調節劑，包括但不限於發育素、細胞分裂 素、ABA和赤黴素。本領域技術人員熟悉組織培養基的變化，當適當地 補充時，其支持了植物組織生長和發育，並適合於植物轉化和再生。這 些組織培養基可以作為商業產品購買，或常規地製備或修改。本領域技 術人員知道，用於轉化和再生的培養基和培養基添加劑例如營養物和生 長調節劑，以及其他培養條件，例如孵育期間的光強度、pH值和孵育溫 度，可以根據特定的目標品種來優化。
在表達盒被穩定地摻入到轉基因植物中並被確認是可操作的之後， 它可以通過有性雜交導入到相同其他植物或另 一種有性相容的物種中。
取決於要雜交的物種，可以使用許多標準育種技術的任一種。
種子、粗粉、油以及包含種子、粗粉和油的產品
本發明還提供了超過約1000、更優選的約20，000、再更優選的約 40,000個種子的容器，其中超過約10%、更優選的約25%、更優選的約 50%、再更優選的約75%，或更優選的約90%的種子是來自本發明的植 物的種子。
本發明還提供了超過約10kg、更優選的約25kg、再更優選的約50kg 種子的容器，其中超過約10%、更優選的約25%、更優選的約50%、再 更優選的約75%,或更優選的約90%的種子是來自本發明的植物的種子。
飼料、粗粉或油產品。為這個目的的特別優選的植物部分是收穫的穀粒， 但可以收穫其他植物部分並用於乾草或青貯料。在一個實施方式中，所 述飼衝+、粗粉或油產品一皮配製用於反芻動物。在這種配方中，本發明所 允許的穀粒和粗粉中提高的油含量提供了 "旁路脂肪"，其為產犢後的奶 牛提供提高的熱量攝入是特別有用的，具有降低的酸毒症風險。產生祠料、粗粉和油產品的方法是本領域已知的。參見，例如，美國專利
4,957，748; 5,100,679; 5,219,596; 5,936,069; 6,005，076; 6,146,669;和 6,156,227。本發明的穀粒或粗4分可以與其他穀粒或粗4分混合。在一個實
構成了任何產品的粗粉成分按體積或按重量的大於約0.5%、約1%、約 5%、約10%、約25%、約50%、約75%或約90%。在另一個實施方式中， 所述粗粉產品可以被混合，並且可以構成混合物按體積的大於約10%、 約25%、約35%、約50%或約75%。
根據本發明產生的玉米油和/或玉米粉可以與各種其他成分組合。包 括在產品中的特定成分將根據產品的最終用途來確定。示範性的產品包 括動物飼料、化學^f務飾的原料、可生物降解的塑料、混合的食物產品、 食用油、烹調油、潤滑劑、生物柴油、快餐食品、化妝品和發酵加工原 料。包括在此描述的粗粉的產品還包括完全或部分完全的豬、家禽和牛 飼料，寵物飼料和人類食物產品，例如擠壓的快餐食品、麵包、食物結 合試劑、水產業飼料、可發酵的混合物、食品添加劑、運動飲料、營養 食物條、多維生素體積僅為、膳食飲料和穀類食物。
所述玉米粉任選地經歷分離澱粉和蛋白質成分的常規方法。這種方 法包括，例如，幹磨、溼磨、高壓泵、或低溫過程。這些和其他適合的 步驟在Watson ( 1987)中公開，其公開內容通過引用合併在此。
本發明的其他單子葉植物穀粒，包括小麥、大麥、高粱和稻米可以 類似地加工或碾磨來產生本領域公知的飼料、粉、澱粉、粗粉、糖漿、 穀物產品和發酵飲料。
在以下實施例的上下文中進一步描述了本發明。這些實施例用來進 一步例示本發明，而不是意圖限制本發明的範圍。
實施例
本領域技術人員將理解本發明提供的方法和組合物的許多益處。以 下實施例被包括進來以說明本發明的實施方式。本領域的技術人員應當 理解，在根據本發明人公開的當前技術的實施例中所公開的技術在本發 明的實踐中良好地運作。然而，本領域的技術人員根據當前公開的內容 應當理解，可以在公開的具體方案中進行許多變化，在不背離本發明的 精神和範圍的情況下仍獲得相似的或類似的結果。在此引證的所有參考文獻通過引用合併在此，達到它們補充、解釋、提供背景、或教導在此 採用的方法、技術或組合物的程度。
實施例1
丄a"oZ)"cz〃船rewcA7'/亞種6w/gan'cws的和pyA:基因的克隆 ^acfo6acz7/ws t/e/6/-ewch/ swZ 乎6w/g"/7'cw《(ATCC菌林11842 )獲自 ATCC ( Manassas, VA ),在ATCC 416肉湯中生長。丄.t/e/Z^ewch', w^/ . Zw/g"ncw5 /^基因從裂解的培養物等分量中PCRTM擴增為967 bp產物， 使用5'引物(〇ligo.#—17166) (SEQIDNO: 5 )來引入/#開放閱讀框
(ORF)上遊的AycI克隆位點,用3'引物(01igo. #_ 17167) (SEQIDNO: 6)來引入緊靠ORF下遊的幼/I克隆位點。類似地，戶:^:基因從裂解的培 養物等分量中PCRTM擴增為1777bp產物，使用5'引物(Ohgo.#—17168)
(SEQ ID NO: 7)來引入緊靠p， ORF上遊的AcI克隆位點，用3'引物
(01igo.#—17169) (SEQIDNO: 8 )來引入ORF下遊的幼/I克隆位點。 通過Topo TA克隆(Invitrogen, Carlsbad, CA )將/^和; j^ PCR產物各
自克隆到pCR2.l中。使用早先描述的寡聚物通過PCRTM根據適合的插 入物篩選克隆。對於/#或/^:基因為PCR陽性的克隆通過限制性分析才全 查來確認通過PCRTM導入的側翼克隆位點的存在，然後測序。附圖l顯示 了分離自丄a"o6ac/〃船fife/^ewch'z亞種Zw/g(3r/cw《ATCC菌4朱11842的/ # 基因的編碼序列(SEQIDNO: 1)與公開的/^基因序列(EMBL登記號 #— X71403 )的比對。在以上獲得的序列和7>開的序列之間存在一個差 異；公開的序列在編碼殘基261處具有A,而如上所述分離的基因在該位 置是G。預測的PFK蛋白序列(例如，SEQIDNO: 2)的比對揭示了它 力']是沖目同的。還獲4尋了Z""o6"c/〃w5 t/e/Z^ewc/h '亞種6w/g"〃cz^ / >^基因
(SEQIDNO: 3)的DNA序列，與公開的序列(EMBL登記號l X71403 ) 是相同的。因而預測的蛋白序列(SEQ ID NO: 4)與爿^開的預測PYK 蛋白序列是相同的。 表l
Oligo. # 17166 5' AGGCGCGCCACCATGAAACGGATTGGT 3'(SEQ ID NO:5) Oligo # 17167 5' CGCCTGCAGGCTATCTTGATAAATCTG 3'(SEQ ID NO:6) Oligo. # 17168 5' AGGCGCGCCACCATGAAAAAAACAAAG 3'(SEQ ID NO:7) Oligo. # 17169 5' CGCCTGCAGGTTACAGGTTTGAAAC 3，(SEQ ID NO:8)實施例2 胚-靶向的轉化載體的構建
pMON72008
將實施例1中描述的967 bp AcI/幼/1 基因克隆到E co/zA4grc 6<3"erziW2 /^me/"c/ews 二元#爭載體pMON71055中6々玉米L3 oleosm啟動子(P-Zm丄3)和稻米肌動蛋白內含子(I-Os.Act)序列的 v^cl/5^83871位點下遊，來形成pMON72004。類似地，將實施例l中描 述的1777 bp/7#基因克隆到￡. co"". aw7e/ac,era二元轉化載體 pMON71055中的P-Zm丄3和I-Os.Act序列的AvcI/5^8387I位點下遊，來 形成pMON72005 。通過從含有盒的pMON72004分離7165 bp 屍mel/ZMI片段，使用Pfu聚合酶平端化該片段，然後克隆該平端化的片 段到pMON72005的位點中，來製備雙基因構建體 (pMON72008)。最終的構建體pMON72008 (附圖2)通過限制性分析 和DNA測序來確認。
pMON79823
來自pMON72004的3616 bp屍md/A7)al被用於替換來自胚芽表達載 體pMON71273的2145 bp屍weIAYS"I片段，來產生pMON79823 (附圖
3) ,含有由具有I-Os.Act的P-Zm丄3驅動的/^基因。
pMON79824
來自pMON72005的4426 bp屍mel/X^I被用於替換來自胚芽表達載 體pMON71274的2145 bp屍wel/X^I片段，來產生pMON79824 (附圖
4) ,含有由具有I-Os.Act的P-Zm丄4驅動的/7)^基因。
pMON79827
來自pMON79824的6809屍附d/KspI片段蜂皮用於替換來自 pMON79823的2358 bp Smal/Kspl片段，來產生pMON79827 (附圖5 ), 含有/tA和/ ;^基因，各自由具有I-Os.Act的P-Zm丄3驅動。
實施例3胚乳耙向載體的構建
pMON72028
將以上實施例1中描述的967 bp AcI/幼/1 /7#基因克隆到 pMON68203中的Zea wa， Z27啟動子(P-Zm.Z27 )和Z wa，Hsp70內含 子(I-Zm.DnaK)序列的^^1/&683871位點下遊，來產生pMON72012。 類似地，將以上實施例1中描述的1777 bp A^cI/幼/1 ; ;^基因克隆到 pMON68203中的P-Zm.Z27和I-Zm.DnaK序列的^^1/&683871位點下遊， 來產生pMON72013。通過從pMON72012分離含有/ ,表達盒的3256 bp PweL^coRI片段、用Pfu聚合酶平端化該片段、並將它克隆到pMON72013 的屍wel位點中(附圖5)來得到pMON72015,製備用於/#和/ #基因的 共表達的載體。為了改善j.化we/"c,era轉化期間/ ,々 3^載體的穩定性， 通過用pMON72021的5496 bp屍wd/五coRI載體主幹片段替換
量，產生最終的雙基因轉化載體pMON72028 (附圖6) 。 ^ ' ^
pMON79832:
將以上實施例l中描述的973 bp A^I/&e8387I /#基因克隆到 pMON71274中的P-Zm.Z27和I-Zm.DnaK序列的^^1201/&6 83871位點下 遊，來產生pMON79832 (附圖7),含有由具有I-Zm.DnaK的P-Zm.Z27
驅動的/#基因。
pMON81470:
將以上實施例1中描述的1783 bp M^I/&e8387I ; )^基因克隆到 pMON71274中P-Zm.Z27和I-Zm.DnaK序列下遊的7VortZ&e8387I位點中。 產生的載體的/ >^基因盒然後使用Ad/^yi剪切，並連接到以上描述的 pMON79832的M/wI/Sr/I位點中來產生pMON81470 (附圖8)，含有/ #和 ;^A基因，各自由具有I-Zm.DnaK的P-Zm.Z27驅動。
pMON72029
^1奪含有與來自pMON72006的/7A基因融合的A^coOtma to6"cwm小 亞基chor叩last轉運肽(SSU-CTP )的]199 bp JwI/&e8387I DNA片段 克隆到pMON68203的A cI/&e8387I位點中來形成pMON72017。類似地，將含有與來自pMON72007的p，基因融合的M tak^'ww SSU-CTP 的2041 bp」^I/&、e8387I片段克隆到pMON68203的』^I/&e8387I位點 來形成pMON72019。通過從pMON72017分離含有/#表達盒的3204 bp 屍wd/EcoRIDNA片段、用Pfu聚合酶平端化該DNA片段、並將它克隆 到pMON72019的位點中來得到pMON72020,製備用於p#和戶3;^ 基因的共表達的載體。為了改善JgraZ ac&nww w附e/a"e朋4爭1匕期間這 種雙基因載體的穩定性，通過用pMON72021的5496bp 屍附d/五coRI載體主幹片段替換pMON72020的7135 bp屍weIAEcoRI載體 主幹片段，來降低重複元件的數量，產生最終的雙基因轉化載體 pMON72029 (附圖9 )。
pMO簡715
含有融合到/ #基因的jVzco"""" 小亞基choroplast專爭運肽
(SSU-CTP )的來自pMON72017的1.2 kb A^I/&e8387I DNA片段被克隆 到草甘膦選捧質粒pMON93102的AAort/&e8387I位點中ZM Z27啟動 子(P-Zm.Z27)和Z w""Hsp70內含子(I-Zm.DnaK)的下遊，來產生 pMON83715 (附圖IO)。
實施例4 玉米的轉化
Elite玉米系(Com States Hybrid Serv., LLC, Des Momes, IA ) #皮用於 與本發明相關的轉化。這些包括LH59 (用pMON72008、 pMON72028、 pMON72029轉化的)、LH172 (用pMON72008、 pMON72028 )轉化的， 和LH244 (用pMON79823、 pMON79824、 pMON79827、 pMON79832、 pMON81470轉化的)。除了pMON72029之外對於所有的構建體通過 Jgro/)ac/en.i做 fwwe/n似介導的'化來獲《尋淨爭"f匕的夕卜才直體, pMON72029通過微粒轟擊獲得。從轉化的組織再生植物。然後對溫室生 長的植物分析目標基因表達水平以及油和蛋白質水平。
實施例5
胚乳表達的胞質液耙向PFK和PK構建體的分析
pMON72028設計構建體pMON72028來產生在胚乳中胞質液輩巴向的; A和/7，基 因表達。來自第一代的成熟籽粒通過PCRTM分析/ ,和/^A轉基因。通過 單籽粒NMR和PCRtm分析了 67個事件。64個事件對於/ #轉基因是PCR 陽性的，這些中的7個對於/ ^轉基因也是陽性的。含有這兩個基因的兩 個事件展現了 PCR陽性的籽粒，與PCR陰性籽粒相比在整體籽粒油水平 上其是統計學上更高的(0.73%的最大提高，P=0.05)。
對於兩個轉基因都是陽性的7個事件被種植在田地中。NIT (近紅外 透光率)油分析揭示了，對於3個事件，對於來自分離的卡那黴素陽性 和陰性抽穗的集中籽粒來說，在平均總體籽粒油％上存在顯著差異。這 些事件，62221、 71907和73131，在陽性抽穗中在油水平上分別具有統 計學上顯著的提高(1.2%、 0.8%、 0.5%， P-0.05)。在已知含有兩個轉 基因的其餘4個事件中油水平提高，但是在P-0.05處提高不是顯著的。
含有/ ，和/ )^轉基因的構建體pMON72028的五個事件和它們的陰 性分離種被雜交成兩種不同的測試物。第 一測試物是常規的硬杆自交， 第二種是具有更高油表型的硬杆測試物(7.5%的本身油)。Fl雜交種子 在設計中種植在6個位置，所述設計通過一 系列的雄性不育雜交產生了 帶有轉基因的系與無轉基因系的分離。在每個位置，項目被不同地隨機 化。手工從每個地塊的中性收集六個抽穗，脫殼，通過近紅外透光率 (NIT)分析籽粒的油、蛋白質和澱粉。在兩個測試這中，在所有5個事 件中油百分比從+0.5%提高到+ 1.1% (p<0.005 )。
pMON79832, Fl
對來自LH244中的26個pMON79832事件的Fl籽粒的NMR油分析揭 示了 ，來自所測試的26個事件中的9個p, PCR陽性籽粒在總體籽粒油o/0 上顯著更高(PK).05),最大提高為0.95%。 一同考慮所有的事件，students t-測驗揭示了PCR陽性籽粒的平均籽粒油。/。 (3.85%)顯著高於(0.19%) (PO.0001 ) PCR陰性籽粒的平均值(3.66%)。對解剖的胚乳組織的分 析揭示了，來自8個事件的PCR陽性籽粒比陰性籽粒具有顯著(P=0.05) 更高的胚乳油％ (最大提高為0.48%) , 7個事件在mg/籽粒基礎上具有 顯著(P=0.05)更高的總胚乳油(最大提高為0.48mg/籽粒)，儘管總胚 乳乾重顯著地(P=0.05)降低(平均降低8mg/籽粒，最大降低41mg/籽 粒)。pMO應470,Fl
對來自LH244中的20個pMON79832事件的Fl籽粒的NMR油分析揭 示了 ，來自所測試的20個事件中的9個/# PCR陽性籽粒在總體籽粒油0/。 上顯著更高(P-0.05)，最大提高為1.1%。 一同考慮所有的事件，students t-測驗揭示了PCR陽性籽粒的平均籽粒油。/。 (4.47%)顯著高於(0.4%, PO.0001 ) PCR陰性籽粒的平均值(4.07%)。對解剖的胚乳組織的分析 揭示了，來自9個事件的PCR陽性籽粒比陰性籽粒具有顯著(P=0.05)更 高的胚乳油％ (平均提高0.3%,最大提高為0.62%) ， 6個事件在mg/籽 粒基礎上具有顯著更高的總胚乳油(平均提高，0.28mg/籽粒；最大提高， 0.48mg/籽粒)(P=0.05 )，儘管總胚乳乾重顯著地降低(平均降低30 mg/ 籽粒)(P-0.05)。比較這些數據和來自; #單獨構建體(pMON79832 ) 的數據，看起來雙基因構建體pMON81470的油差異的量更大，存在著高 頻率的事件具有油水平的提高。
實施例6
胚乳表達的質體靶向構建體的分析
設計構建體pMON72029來產生在玉米胚乳中質體靶向的/ #和/ >^ 基因表達。在含有pMON72029的轉基因植物和非轉基因LH59之間進行 正反雜交，從62個獨立的事件中收穫成熟籽粒。
單獨的籽粒分析揭示了 ，在通過PCR發現含有兩個轉基因的13個事 件中的9個中，平均胚乳油濃度顯著提高(平均提高為0.94%，最大提高 為1.7%, P-0.05)。僅含有/^A基因的3個事件都沒有提高的胚乳油。/。。 就整體籽粒油％而言，含有兩個轉基因的13個事件中的IO個具有顯著 (P=0.05)提高的整體籽粒油％ (平均提高1.75。/。，最大提高2.9%)。就 油/籽粒的絕對數量而言，具有兩個轉基因的13個事件中的4個具有顯著 提高的油/籽粒毫克數(平均提高為1.5mg/籽粒，最大提高為2.5mg/籽粒)。
實施例7
胚芽表達的力包質液靶向PFK和PK構建體的分析 pMON79823,Fl
在來自pMON79823的20個事件的解剖的/ #基因PCR陽性和負電F1籽粒中油水平的NMR分析揭示了 ，所分析的20個事件的7個具有陽性籽 粒中顯著(P-0.05)更高的胚芽油(germ oil)% (平均才是高為1.7%,最大 提高為5.8%)。並且，在陽性籽粒中7個事件具有顯著(P-0.05)更高 的胚乳油％ (平均提高為0.14%,最大提高為0.34%),其中4個是具有 胚芽油％提高的相同事件。
pMON79824, Fl
來自pMON79824的24個事件的pj^基因PCR陽性和陰性F1籽粒的 NMR油分析揭示了，在除了l個事件的所有事件中胚芽油％是不變的， 類似地，在除了1個事件的所有事件中整體籽粒油％是不變的。具有改變 的油水平的事件的l/24的頻率沒有超過隨機變化所預期的。因而，看起 來在這些條件下單獨的pyA轉基因不影響油水平。
pMON79827, Fl
首先根據/#轉基因篩選/ A/; j^事件。在來自pMON79827的24個事 件的/#基因PCR陽性和陰性F1籽粒的NMR油分析揭示了 ， 20個事件中的 IO個具有顯著(PK).05)提高的胚芽油％ (平均提高為2.23%,最大提高 為5.39%)。並且，儘管啟動子是胚芽-增強的，在20個事件中的5個中 胚乳油％提高了。
pMON72008
在良種變體LH172中轉化構建體pMON72008。通過來自32個事件的 解剖成熟胚芽組織的NMR分析所測定的平均胚芽油％的students t-測驗 比較揭示了 ，在所有事件中所有的/^A基因PCR陽性籽粒的平均值高於陰 性籽粒的平均值達2.59 %的絕對值，這種差異是統計學上顯著的 (p-0.05)。所見的最大提高是3.5%。在所有事件中/^基因PCR陽性籽 粒的總籽粒油%的平均值(2.89% )稍微低於陰性籽粒的平均值(3.01 % ), 而這種差異在P-0.05處不是顯著的。
雖然轉基因的表達通過在胚芽組織中優先地表達的L3 oleosm啟動 子指導，在所有的事件中與陰性籽粒比較，對於/7,基因PCR陽性籽粒存 在著小的但是統計學上顯著的平均胚乳油％提高(平均提高0.07%,最 大提高0.24%)。通過Western印跡分析測試蛋白質表達以及通過酶分析，進行了來自 pMON72008事件的發育籽粒中;^和p，基因的轉基因表達分析。Western 印跡分析揭示了，所有30個/^基因PCR陽性事件被發現表達PK蛋白，而 30個中的29個被發現表達PFK蛋白。與PFK蛋白相比，PK蛋白總是以更 高的水平表達。酶活性結果與Western印跡蛋白表達結果很好地相符。 PK活性的提高大於PFK活性的提高，與蛋白表達結果相符。
實施例8
表達屍ro/ /o"^)(3c/^riw/ 2 ^^W(ie"rCc/z〃石岸臥臾果4唐;敫酵^;
轉化載體的構建
他種^特異性構建體。對於胚乳細胞胞漿表達，擴增了屍./rez^e;ezcln》; 基因(Genbank登記號存—M67447) ( SEQ ID NO: 11)，並在設計用於玉 米轉化的載體中克隆到玉米玉米蛋白Z27啟動子的下遊，任選地跟隨玉米 DnaK內含子作為增強子。對於胚乳plastidial表達，擴增了屍./rewfifew^c/n7 p,基因(SEQIDNO: 11),並在設計用於玉米轉化的載體中克隆到玉米 玉米蛋白Z27啟動子的下遊，隨後是與/^基因融合的M taMcwwSSUCTP。 對於胚芽細胞胞漿表達，擴增了屍./rew^ewezc/z";#基因(SEQ ID NO: 11 )， 並在設計用於玉米轉化的載體中克隆到大麥PER1啟動子的下遊，任選地跟 隨玉米DnaK內含子作為增強子。對於所有的構建體，通過轉化獲得轉化的 外植體。從轉化的組織再生植物。然後對溫室生長的植物分析目標基因表 達水平以及油和蛋白質水平。
氺 承 承
在此7〉開和在此要求權利的所有組合物和方法可以才艮據當前的公 開來製造和#丸行而不需過度的實驗。雖然已經就上述說明性實施方式而 言描述了本發明的組合物和方法，對於本領域技術人員顯而易見的是，
變體、變化、 <務飾和改變可以:故應用於在此描述的組合物、方法，和方 法的步驟和步驟的順序中，而不背離本發明的真實概念、精神和範圍。 更具體地，顯而易見的是，可以用化學上和生理學上都相關的某些試劑 替換在此描述的試劑，而達到相同的或相似的結果。對於本領域的技術 人員顯而易見的是所有這種相似的替換和修改都認為處在由附隨的權 利要求所定義的本發明的精神、範圍和概念之內。參考文獻
以下參考文件通過引用特別地合併在此，達到提供示範性程序或對 在此闡述的那些補充的其他細節的程度。
美國專利4，518,584;美國專利4,737,462;美國專利4,810,648;美國 專利4,957,748;美國專利5，094，945;美國專利5,100,679;美國專利 5,196,525;美國專利5,219，596;美國專利5,290,924;美國專利5,322,783; 美國專利5,359,142;美國專利5,424,398;美國專利5,424,412;美國專利 5,500,365;美國專利5，538,880;美國專利5,550,318;美國專利5,563,055; 美國專利5,610,042;美國專利5,627，061;美國專利5，633,435;美國專利 5,641,876;美國專利5,936,069;美國專利6,005,076;美國專利6，040，497; 美國專利6，146，669;美國專利6,1S6,227;美國專利6,265,638;美國專利 6,433,252;美國專利7,012,171
formula see original document page 31Ingelbrecht " 屍/腦/ Ce〃， 1:671-680， 1989. Joshi, M/c/.爿"t/i^" 15:6643, 1987. Klee Mo/. G飢210:437-442, 1987.
Kridl Wa/., Seec/Sc,. Wt &， l:209陽2]9, 1991. Lawton屍/耐她/. 9:31F, 1987.
LeBms " 腸c/ 醒e.， 75:797-802， 1993. LeBms " a/.' E, /腸c/z亂，198:683-687, 1991. Lopes "a/" M /. G飢247:603-613, 1995. Lopes efA/o/.Gewe[， 247:603-613, 1995. Maniatis, " a/., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
Mazur, "a/.，油c/"c」c油L, 13 ( 7) :2373-2386, 1985.
McElroy e/"/.， A/o/. Ge". Ge/ C， 231 ( 1 ) :150-160, 1991.
Memfidd,丄爿w. C/ze肌Soc., 85:2149-2154， 1963.
Misawa " a/,屍/朋"，4:833-840, 1993.
Misawa "a/，屍/朋"，6:481-489, 1994.
Murashige and Skoog,屍—W.屍/贈，15:473-497, 1962.
Odell W "/.,淑騰，313:810, 1985.
PCTAppln. WO 95/06128
PCT Appln. WO 99/67392
Pedersen Q 〃， 29:1015-1026， 1982.
Plaxton, 乂4ww. Aev. P/"w/屍/zja^。/. P/aw/A/o/. Bw/., 47:185-214, 1996.
Recombinant DNA Part D, Methods in Enzymology, Vol. 153, Wu and Grossman, eds., Academic Press, 1987.
Richins " a/., AWwL， 20:8451, 1987.
Russell""/" 7y親，,d., 6 ( 2 ) :157-168, 1997.
Sambrook o/., iV/o/ecw/ar c/cwmgz o / 6on3tory mawwa/, 2nd Ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Sathasiivan " a/.， iVwc/. ^c油版，18:2188-2193, 1990.
Staceyefa/.,A/o/. Szo/.， 31:1205-1216, 1996.
Sullivan Wr//.， A/o/. Gew. Ge W.， 215:431, 1989.
Thomas " a/.， B oc'/zew. ,/. 322:111—117, 1997.Turner and Foster, M)/ecw/w說o化c/z., 3:225, 1995. Vasil "a/.，屍/痕屍/z戸/., 91:5175, 1989. Walder " a/., G纏，42:133, 1986.
Walker " a/"A^/. S".84:6624, 1987.
Wang W"/.， Mo/. Ce〃.說o/., 12:3399, 1992.
Watson and Ramstad, In:Conr C/zem/Wr} awt/ rec/wo/ogy, Ch. 11-12, Amer. Assoc. Cereal Chemist, Inc.， St. Paul,畫，1987. Wohlleben G匿，70:25-37， 1988.
Wood</. .艇50:16, 1999. Wood ""/.,C朋.《/. SW. 80:993-1001, 2002. Yang W a/" /Voc. M^/.爿cac/. Sd. [/&4, 87:4144, 1990.
權利要求
1. 一種產生在其種子中具有提高的油的單子葉植物的方法，包括向所述植物中導入編碼磷酸果糖激酶的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地連接到種子-增強啟動子，從而與缺乏所述核酸序列的同基因植物的種子相比，所述種子的油含量被提高。
2. 權利要求1的方法，其中所述編碼磷酸果糖激酶的多核苷酸包含 不同於SEQIDNO: 9或SEQ ID NO: 13的序列。
3. 權利要求l的方法，其中除非所述種子-增強啟動子是胚-增強啟 動子時，所述編碼磷酸果糖激酶的多核苷酸可操作地連接到編碼質體轉 運肽的多核苷酸。
4. 權利要求l的方法，其中所述多核苷酸包含選自以下構成的組的 核酸序列(a)SEQIDNO: 1或SEQ ID NO: ll的核酸序列，和(b )編碼SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 12的多肽序列的核酸序列。
5. ;f又利要求4的方法，其中所述多核苷酸包含在約0.2xSSC和65°C 的高度嚴格條件下與(a)或(b)的序列或其互補物雜交的核酸序列。
6. 權利要求4的方法，其中所述植物進一步包含與種子-增強啟動子 可操作連接的、編碼丙酮酸激酶的多核苷酸。
7. 權利要求6的方法，其中所述編碼丙酮酸激酶的多核苷酸包含選 自以下構成的組的核酸序列(a)包含SEQIDNO: 3的序列的核酸序列；和 (b )編碼SEQ ID NO: 4的多肽序列的核酸序列。
8. 權利要求7的方法，其中所述多核苷酸包含在約0.2xSSC和65。C 的高度嚴格條件下與(a)或(b)的序列或其互補物雜交的核酸序列。
9. 權利要求l的方法，其中所述植物是選自由玉米(Zeam"，)、 稻米 (CV_yz<3 sWv(2 )、 大麥 (//oniewm vw/gare )、 粟 (Pamcwm wz/^3C'ew附)、，繁麥(iSecfl/e cerea/e ) 、 d、麥(7V"zcwm aesfzvww )禾口高 粱(Sorg/zww 6,co/or )構成的糹且的單子葉才直物。
10. 權利要求l的方法，其中所述啟動子選自由胚-增強啟動子、胚 乳-增強啟動子以及胚-和胚乳-增強啟動子構成的組。
11. 一種單子葉植物，包含與種子-增強啟動子可操作連接的編碼磷酸果糖激酶的多核苷酸。
12. 權利要求11的植物，其中所述編碼磷酸果糖激酶的多核苦酸包含不同於SEQIDNO: 9或SEQIDNO: 13的序列。
13. 權利要求ll的植物，其中除非所述種子-增強啟動子是胚-增強 啟動子時，所述編碼磷酸果糖激酶的多核苷酸連接到編碼質體轉運肽的 多核苷酸。
14. 一種單子葉植物細胞，包含與種子-增強啟動子可操作連接的編 碼磷酸果糖激酶的多核苦酸。
15. 從權利要求ll的植物產生的種子，包含根據權利要求7的編碼磷 酸果糖激酶的多核苷酸。
16. 從權利要求15的種子產生的粗粉，包含根據權利要求ll的編碼 磷酸果糖激酶的多核苷酸。
17. 從權利要求15的種子產生的動物飼料組合物，包含根據權利要 求11的編碼磷酸果糖激酶的多核苷酸。
18. 從權利要求15的種子產生的人類食物組合物，包含根據權利要 求11的編碼磷酸果糖激酶的多核苷酸。
19. 一種動物飼料組合物，包含權利要求16的粗粉，所述粗粉包含 根據權利要求ll的編碼磷酸果糖激酶的多核苷酸。
20. —種生產單子葉植物油的方法，包括步驟a) 種植轉化的單子葉植物來產生種子，所述單子葉植物包含與種 子-增強啟動子可操作連接的編碼磷酸果糖激酶的多核苷酸；和b) 加工所述種子來獲得所述油。
21. 權利要求20的方法，其中所述編碼磷酸果糖激酶的多核苷酸包 含不同與SEQIDNO: 9或SEQIDNO: 13的序列。
22. 權利要求20的方法，其中除非所述種子-增強啟動子是胚-增強 啟動子時，所述編碼磷酸果糖激酶的多核苷酸連接到編碼質體轉運肽的 多核苷酸。
全文摘要
提供了通過過量表達編碼磷酸果糖激酶的核酸提高糖酵解流來產生在它們的種子中具有更高油水平的作物植物的方法。本發明可以進一步包括過量表達編碼丙酮酸激酶的核酸，來改變用磷酸果糖激酶，或磷酸果糖激酶以及丙酮酸激酶轉基因轉化的植物種子、單子葉植物細胞和植物中的油含量。
文檔編號C12N15/54GK101442903SQ200680027543
公開日2009年5月27日 申請日期2006年5月25日 優先權日2005年5月26日
發明者D·克, D·瓦爾 申請人:孟山都技術有限公司