利用含有硼葡萄糖酸鈣絡合物的培養基生產胸膜炎肺炎放線桿菌毒素ApxI的方法

2023-08-13 14:20:46

專利名稱：利用含有硼葡萄糖酸鈣絡合物的培養基生產胸膜炎肺炎放線桿菌毒素ApxI的方法
利用含有硼葡萄糖酸鈣絡合物的培養基生產胸膜炎肺炎放線桿菌毒素Apx I的方法本發明涉及一種通過在能夠支持細菌生長的液體培養基中培養胸膜炎肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)生產RTX-毒素ApxI的方法，其中在所述培養基中加入鈣鹽以在培養基中生成鈣離子。豬胸膜肺炎是豬的一種主要的呼吸系統疾病，已經蔓延到全世界範圍，由於高急性死亡、治療急性病豬和銷售慢性感染動物的延誤，給養豬業帶來嚴重的經濟損失。豬胸膜肺炎的病原體是胸膜炎肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae) 0其主要通過動物間直接接觸傳播，這種感染在病程上有急性和慢性的不同。此疾病的病症主要是呼吸道感染，臨床表現為高燒、嚴重的呼吸窘迫、咳嗽和厭食。此疾病發病很快，發病率和死亡率很高。控制胸膜炎肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)(以下稱之為APP) 感染的方法之一是疫苗接種程序。過去曾接種菌苗，但公知的是這種方法具有嚴重的副作用。現在通常使用的是基於APP病毒的亞單位疫苗。APP產生的所謂RTX毒素(RTX指的是重複子毒素)。正是由於這些RTX-毒素的存在才在很大程度上導致了這種細菌的致病性。RTX-毒素過去被廣為綜述，文獻中也多有描述。眾所周知，並不是每種APP的血清型都能產生全部RTX-毒素，如1、5、9和11血清型產生ApxI和ΑρχΙΙ，2、3、4、6和8血清型產生ApxII和ApxIII，10血清型只產生ApxI，7和 12血清型只產生ApxII。現在市場上用於抗APP的疫苗是基於ΑρΧΙ、ΑρΧΙΙ和ApxIII毒素的。新近發現所有的APP血清型都產生第四種RTX-毒素，現在這種毒素被稱之為ApxIV (參見 EP 0 875574)。如何在添加了鈣鹽(即基於酸的一種化合物，通過一個或多個鈣離子完全或部分替換酸中的氫離子形成)的培養基中，通過培養胸膜炎肺炎放線桿菌生成RTX-毒素ApxI 已經很清楚了。特別是在專利ΕΡ0453 0 中已經闡述了此種方法(見「Example 2」，第2段 「溶血素的純化和鑑定」，子段落「Methods」)。需要注意，ApxI過去被稱之為溶血素(「HLY」) (Frey 等，在 J Gen Microbiol，1993 年 8 月；139 (8) :1723-8)。從這項 EP 專利可以知道， 培養基中加入鈣化合物(CaC12)。的確，在Microbiol Pathogenesis 37 (2004)四_33中已經提到，在生長培養基中加入鈣可以增強ApxI操縱子的轉錄活性。如此以來，可以獲得高含量的ApxI。培養基應支持APP細菌的生長。已經公知如何去構建支持細菌生長的培養基。傳統的培養基最初在上世紀五六十年代由fegle、Ham等人研製，他們發現能夠滿足細菌基本生長需要的培養基應含有無機鹽、氮源(例如肽或蛋白質等含氮化合物)、碳源和維生素。培養基有利地被緩衝，以防止培養基酸性過強或者鹼性過強。根據此基本配方，很多不同的組合方式都是可用的。例如，可以選擇動物來源成分提供胺基酸，也可以選擇化學限定的胺基酸。對於其他化合物，也可有多種不同的選擇。的確，構建能夠支持細菌生長基本要求的培養基相對來說比較簡單。然而，(構建能)優化生長和(或)代謝產物(的培養基)需要一定的研製時間，特別是當一種培養基首選的是不含血清或其它動物源成分時。 在該技術領域內，提高發酵培養基性能的方法是公知的，並在文獻中有詳細的闡述(例如見 Kennedy 和 Krouse 在 Journal of IndustrialMicrobiology & Biotechnology (1999),23,456-475)中的綜述)。在發酵實驗室，這種優化(培養基)構成了常規實驗的一部分。 培養APP時，因為APP是NAD (煙醯胺腺嘌呤二核苷酸)依賴型的，所以從本質上說NAD屬於培養基的一部分。培養基中若不含NAD，則不能支持胸膜炎肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)的生長，因此從本申請和所附權利要求意義上來說，也不能認為是支持 APP生長的液體培養基。支持細菌生長的培養基，或者組成這些培養基的成分，可從很多公司如 Sigma Aldrich、Quest International、Oxoid、Becton Dickinson、Pharmacia、VGD Inc、Mediatech，、Invitrogen,、MarcorΛ Irvin Scientific 等購得。儘管從經濟角度來看，現有技術方法足夠可以獲得相關產量的Apx I毒素，但是申請人認為有對方法實施改進的可能。發酵過程中培養基會變渾濁。申請人的貢獻在於認識到這可能是由於一種(或多種)鈣鹽形成的沉澱。APP產生二氧化碳的同時，即會導致培養基中含有碳酸根離子。碳酸鈣是一種溶解度非常低的鹽，因此可能會造成一些問題。首先， 可以肯定的是鈣離子參與沉澱，進而無法被APP細菌利用。第二，沉澱的鈣鹽會給下遊工序帶來問題。具體而言，過濾器將變得淤積。因此，申請人在培養基中添加不同的絡合劑來考察其是否能夠阻止鹽的沉澱。以添加EDTA為例，(加入絡合劑)的確可以使培養基仍能保持或多或少的透明度，但是ApxI毒素的產量卻因使用EDTA絡合劑而降低。因此這種前提可能是錯誤的或者不成功的。畢竟，提高ApxI毒素的產量是人們不懈的追求。令人驚訝的是，已經發現，與現有的不添加絡合劑或依賴其他絡合劑的技術方法相比，添加硼葡萄糖酸(分子式2，3- 二羥基-3-[2-羥基-5-(羥甲基)-1，3，2- 二氧硼戊烷(dioxaborolan)-4-基]丙酸，參見莫裡登研究所的Herbert Taylor MacPherson和 James Stewart於1937年11月16日被《生物化學雜誌》接收的「硼葡萄糖酸鈣的性質研究」)絡合鈣離子，可以獲得高含量的ΑρχΙ。顯然，使用這種特殊的絡合劑，培養基中會含有硼葡萄糖酸鈣絡合物(如可用D-葡萄糖酸，具有硼酸的環狀4，5-酯，鈣鹽2 1)，阻止了鈣離子與其他陰離子結合生成牢固的沉澱，與此同時，鈣離子仍可以用來提高胸膜炎肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)的ApxI操縱子轉錄活性。顯然，鈣離子會「嵌合」在鹽絡合物裡。一方面，這種「嵌合力」足夠強到可以阻止鈣離子與碳酸鹽或其他陰離子形成沉澱，另一方面，不妨礙細菌自身猶如鈣離子游離在溶液中(即，只與水分子結合)那樣利用鈣離子。很明顯，硼葡萄糖酸使得APP生產ApxI的臨界平衡得以完全實現。在一具體實施方式
中，硼葡萄糖酸的濃度應低於60mmol/L。超過這個濃度時ApxI 產量會下降。儘管仍可以用，但優選濃度應低於這個值，濃度在25-45mmol/L之間比較適合，特別是當濃度為40mmol/L時，看起來對一些培養基是最佳的。培養基最好不要含有動物源成分，儘管這對本發明不是必要的。很多現行技術方法的一個缺點是他們依賴於使用含有的動物源成分的培養基，比如Columbia肉湯。其他動物源成分在現行方法中也被提到，比如Columbia Broth modified或者Brain Heart hfusion肉湯。眾所周知，使用動物成分有一些缺點。第一，不同產品批次間的化學組成可能會變化很大。第二，提供動物的產地可能被傳染性病原體汙染。一個主要的擔心就是可能會含有能引發人或動物TSE的朊病毒。選擇不含動物成分的培養基(一般稱之為ACF 培養基)很簡單。這裡所謂「動物成分」是指動物中存在的任何組分(如血液、蛋白質)或者從此類組分中衍生的組分(如從血液中衍生的修飾的血清，從蛋白質中衍生的胺基酸)。 然而申請人發現，即使鈣濃度含量足夠充分，ACF培養基的ApxI生產效率也遠遠低於含有
4動物源成分的培養基的ApxI生產效率。不受限於理論，可以使用血清，由於含有形成可溶性鈣離子絡合物的試劑，鈣鹽沉澱的問題不是非常嚴重。在任何情況下，使用硼葡萄糖酸絡合鈣離子都可顯著增加這些培養基中的ApxI產量。在另一具體實施方式
中，鈣鹽為硼葡萄糖酸鈣。儘管仍可以使用氯化鈣作為鈣源， 添加硼葡萄糖酸鹽絡合鈣離子，但將鈣以硼葡萄糖酸鹽的形式添加是優選的。這樣的話，就不需要等待培養基中的各種物理反應(沉澱、溶解、絡合-解絡合、絡合-形成)的平衡，可以節省時間，在經濟上更為有利。在另一具體實施方式
中，是在培養過程中通入空氣到液體培養基中，空氣中二氧化碳濃度高於大氣二氧化碳濃度。令人意想不到的是，二氧化碳可以進一步提高ApxI的生產率。在平板上培養細菌克隆的過程中，一般都知道採用提高二氧化碳的濃度(參見US 6，019，984:實例「菌株和生長條件」)。可是，這隻關係到培養用來接種發酵的菌群。在此階段，生產RTX毒素不是主要的，更應注意到Apx最大產量發生在發酵罐中高細胞密度階段 (參見Microbial Pathogenesis 37 (2004) 29-33)，也就是指數生長期末期。在這個時期， 二氧化碳被認為不再是一個相關的刺激因素。因此，之前一直沒有通過增加二氧化碳濃度來增加Apx產量的嘗試。特別是申請人發現當空氣中含有5%的二氧化碳時ν/ν (純二氧化碳佔到普通空氣的體積比)時，ApxI產量將維持在一個很高的水平。值得注意的是，在這一具體實施方式
中，很多對培養基通氣的技術都可以使用，通常是通過一個設備讓氣泡在培養基裡面的某些位置(培養基的表層下面)釋放。本發明中「空氣」指的是含有一種或者多種通常存在於大氣中的氣體組分，如氧氣、氮氣、二氧化碳、氦氣、氖氣、氬氣、氙氣、氡氣等的氣態介質。本發明將通過以下非限制性的示例進行進一步的解釋。材料和方法菌株和培養基本研究選用產ApxI的胸膜炎肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumnoiae )，10血清型，以下稱之為APP 10。每個試驗均採用Columbia Blood Agar BASE(BAB)平板(獲自美國Becton Dickinson公司)對菌株的工作種子進行活化。液體培養基可採用 Columbia肉湯(獲自美國Becton Dickinson公司)，用氫氧化鈉和乙酸(調節)使pH值保持7. 3，也可才採用不含動物組分培養基(稱為ACF培養基)。後面一種培養基中，含 MgSO4(0. 75g/l)，半胱氨酸·鹽酸(0. lg/Ι)，氯化鐵(0. lg/Ι)，硝酸鈉(0. lg/Ι)，氯化鉀 (0. lg/Ι)，微量元素(如2. 5ml 的 SL-IO 溶液，如在 Handbook of MicrobiologicalMedia, 3rd edition, Ronald Atlas, CRC Press，2004 所述)，10ml50% 的葡萄糖溶液，IOmM 的胺基酸溶液(含色氨酸除外的全部20種胺基酸)，HEPES緩衝液(6g/l，例如獲自Sigma Aldrich 公司)，以及酵母提取物(濃度為10g/l，例如獲自Becton Dickinson公司)。這些培養基用來進行預培養和發酵，NAD(0. 01% )和鈣(不同濃度)用於預培養和發酵，所有培養基都經過0. 22 μ m的膜過濾除菌。用於發酵前，培養基要在85°C下加熱一分鐘。培養將APP 10菌株的工作種子塗布在Columbia BAB平板上，37°C溫育約M小時。將一些菌落接種到裝有75ml的Columbia肉湯的500ml瓶中，37°C振蕩預溫育約6小時。利用預培養物進行發酵。其中一部分發酵在500ml的瓶中進行，在這種情況下，75ml的培養基接種Iml的預培養物，在37°C下震蕩溫育。另外一部發酵在含有約400mL培養基的SIXF0RS 發酵罐(Infors AG公司，瑞士)中進行，此發酵罐接種預培養物20ml，培養溫度同樣也是 37 °C。分析通過測定菌液在660nm的光密度值(0D值)來測定細胞生長，通過常規的 ELISA (免疫學方法)方法測定ApxI抗原濃度。結果第一個實驗是檢驗在鈣與硼葡萄糖酸絡合的情況下是否仍能被APP菌利用。實驗是在上述的瓶中進行。結果如下表1所示。表 權利要求
1.通過在支持細菌生長的培養基中培養胸膜炎肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)生產RTX-毒素ApxI的方法，所述培養基中加入鈣鹽以在培養基中產生鈣離子，其特徵在於所述培養基含有硼葡萄糖酸來在培養基中生成硼葡萄糖酸鈣絡合物。
2.權利要求1的方法，其特徵在於硼葡萄糖酸的濃度不高於60mmol/l。
3.權利要求2的方法，其特徵在於硼葡萄糖酸的濃度在25 45mmol/l之間，優選濃度為 40mmol/l。
4.前述權利要求任一項所述的方法，其特徵在於鈣鹽為硼葡萄糖酸鈣。
5.前述權利要求任一項所述的方法，其特徵在於在培養過程中，空氣通過液體培養基， 所述空氣中二氧化碳的濃度高於大氣二氧化碳的濃度。
6.權利要求6的方法，其特徵在於空氣中含有5%(V/V)的二氧化碳。
全文摘要
本發明屬於一種在能夠支持細菌生長的液體培養基中培養胸膜炎肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)生產RTX-毒素ApxI的方法。培養基中加入鈣鹽用來產生鈣離子，與培養基中含有的硼葡萄糖酸結合生成硼葡萄糖酸鈣絡合物。
文檔編號C12P21/02GK102171361SQ200980138625
公開日2011年8月31日 申請日期2009年11月25日 優先權日2008年11月27日
發明者B·布盧特, C·T·G·斯米茨, S-J·斯萊格曼 申請人:英特威國際有限公司