在重組大腸桿菌中生產人的類胰島素生長因子-1的方法

2023-09-17 13:59:50 4

專利名稱：在重組大腸桿菌中生產人的類胰島素生長因子-1的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術中的生物醫藥領域，尤其涉及一種應用DNA重組技術，即構 建硫氧還蛋白和hIGF-Ι融合蛋白，利用大腸桿菌宿主菌Rosetta-gami (DE3)來表達製備 hIGF-Ι融合蛋白，並利用腸激酶切割融合蛋白最終得到hIGF-1的方法。
背景技術：
人的類胰島素生長因子-l(hlGF-l)是由70個胺基酸組成的單鏈蛋白，含三個二 硫鍵。它的結構、生物學性質和化學性質與胰島素有相似之處，故稱為類胰島素生長因子。 有關研究表明，hIGF-Ι具有促進生長發育和物質代謝等作用，因此像骨骼生長、細胞複製和 另外一些與生長相關的過程均受IGF-I的影響。為此，IGF-I倍受重視，在治療胰島素抗性 糖尿病、神經損傷、矮小症、骨質疏鬆、分解代謝疾病等方面，具有廣闊的應用前景。到目前為止，包括大腸桿菌，酵母，無細胞體系，轉基因植物和動物在內的一系列 表達體系已經被用於表達hIGF-Ι。在大腸桿菌中hIGF-Ι的產量達到了 8. 5g/L，但是90% 都是以包涵體形式存在的。在酵母中hIGF-Ι的表達量只有55mg/L。相似的，hIGF_l的表達 量在轉基因植物和動物中也很低。最近實驗發現在大腸桿菌無細胞體系中，可溶性hIGF-1 的產量達到了 400mg/L，但是無細胞體系的高昂費用阻止了 hIGF-Ι的大規模生產。因此提 高hIGF-Ι的可溶表達迫在眉睫。

發明內容
本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種在重組大腸桿菌中的高效生產 人的類胰島素生長因子-1的方法，該方法高效可溶表達，穩定存在，分離方法簡單，成本 低，適用於大規模生產hIGF-1。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的一種在重組大腸桿菌中生產人的類 胰島素生長因子-1的方法，該方法包括以下步驟(1)設計和合成hIGF-Ι蛋白相關基因設計上下遊引物，併合成hIGF-Ι基因，合 成的hIGF-Ι基因具有SEQ ID NO. 1所示的基因序列；(2)構建hIGF-Ι融合蛋白表達載體；(3)用表達載體轉化大腸桿菌宿主構建基因工程菌；(4)用基因工程菌表達hIGF-Ι融合蛋白；(5)親和層析分離純化hIGF-Ι融合蛋白；(6)用腸激酶切去hIGF-Ι融合蛋白的融合標籤；(7)陽離子交換分離純化。本發明的有益效果是由於大腸桿菌菌株Rosetta-gami (DE3)攜帶有氯黴素抗性 的質粒，它能夠提供編碼AGG，AGA, AUA, CUA, CCC和GGA稀有密碼子的tRNA，因此可以有效 消除成熟的hIGF-Ι (含有4個AGG，2個CCC和1個CUA稀有密碼子)在大腸桿菌中稀有 密碼子的負面影響；同時該菌株將trxB和gor兩條主要還原途徑雙突變，因此它可以促進hIGF-Ι融合蛋白二硫鍵的形成，提高目標蛋白的可溶表達。本發明採用串聯表達的融合蛋 白，N端為硫氧還蛋白，C端為hIGF-Ι，使表達產物更加穩定，分離方法簡單，價廉。經過發 酵條件優化後，可溶性hIGF-Ι融合蛋白的產量達到了 2. 06g/L。因此，本發明具有廣泛的應 用前景。


圖1是pET32-hIGF_l質粒構建圖；圖2是在Rosetta-gami(DE3)/pET32-hIGF-l中，不同表達溫度對目標蛋白表達的 影響的圖，其中，(a)為可溶蛋白，(b)為不可溶蛋白；圖3是在Rosetta-gami(DE3)/pET32-hIGF-l中，誘導時間對目標蛋白表達的影響 圖，1、3、5分別代表在對數生長期前期、中期、後期和穩定期誘導的可溶蛋白；2、4、6代表相 應的不可溶蛋白；圖4是親和純化後收集的洗脫樣品的SDS-PAGE電泳圖，1為純化前樣品，2為洗脫 樣品，3為純化後的目標蛋白；圖5是腸激酶消化後的SDS-PAGE電泳圖，1為腸激酶切割後的hIGF_l融合蛋白， 2為腸激酶切割前的hIGF-Ι融合蛋白。
具體實施例方式本發明相關基因的結構特點是組成融合蛋白的兩個蛋白分別是硫氧還蛋白和 hIGF-Ι，硫氧還蛋白可以促進hIGF-Ι 二硫鍵形成，並使蛋白以可溶形式和有活性形式出現 的可能性增加；hIGF-Ι基因序列在第69個胺基酸末端連接有兩個終止子順序TAA和TGA， 使得蛋白的表達更有效的得以終止。兩個蛋白之間引入含6個組氨酸標籤，大大方便了該 蛋白的分離純化。本發明人的類胰島素生長因子-1 (hIGF-Ι)的高效生產方法採用基因工程菌發酵 法生產，包括以下步驟1、設計和合成hIGF-Ι蛋白相關基因1.1設計引物根據pET32a(+)(購於Invitrogen)的多克隆位點序列，在5』端和3』端的兩條 引物上分別加上NcoI和XhoI限制性內切酶位點，同時在hIGF-Ι基因序列第69個氨基 酸末端連接有兩個終止子順序TAA和TGA，使得蛋白的表達更有效的得以終止。上下遊引 物分別為 5，-ATCC ATG GGACCGGAGACGCTCTGCGGGCTGAGC-3『和 5，-GGCTCGAG TTATCA AGCTGACTTGGCAGGCTTGAGGGGTGC-3』 (酶切位點用下劃線表示，起始和終止密碼子用粗體表 示)1. 2 合成 hIGF-Ι 基因採用PCR法擴增目的基因，擴增程序如下預變性94°C，IOmin ；變性95°C，30s,復 性60°C，30s ；延伸72°C，lmin，共30個循環，最後一次反應延伸時間為lOmin。取PCR產 物進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，採用膠回收試劑盒提取膠中的PCR產物。連接到克隆載體 PMD19-T (購於寶生工(TAKARA))，得重組質粒「pMD19_hIGF_l 」，再轉到DH5 α中，進行測序， 其基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
2、構建hIGF-Ι融合蛋白表達載體將pMD19-hIGF_l用NcoI和XhoI雙酶切後進行瓊脂糖電泳，回收hIGF_l基因片 段。pET32a(+)空質粒同樣用這兩個酶進行酶切後純化。將回收的hIGF-Ι基因片段和酶切 純化後的載體混合進行連接，構建表達質粒pET-32a-hIGF-l (圖1)。連接產物轉化DH5CI感受態細胞，接種到含氨苄青黴素的瓊脂糖平板上進行抗性 篩選。挑取單菌落，小量擴增後提取質粒，然後用NcoI和XhoI進行雙酶切。酶切產物進行 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗陽性克隆。將陽性克隆的質粒進行DNA序列測定。3、用表達載體轉化大腸桿菌宿主構建基因工程菌將測序結果正確的表達質粒轉化到表達菌株Rosetta-gami (DE3)(購於 Invitrogen)中，然後接種到含氨苄青黴素(Amp)、氯黴素(Chi)、卡那黴素(Kan)和四環素 (Tet)的瓊脂糖平板上進行抗性篩選。挑取單菌落，小量擴增後提取質粒，然後進行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察，含有質粒條帶的為實驗所需的重組大腸桿菌。4、用基因工程菌表達hIGF-Ι融合蛋白4. 1培養細菌和表達蛋白取5ul甘油管中菌液加入到5ml含氨苄青黴素(Amp)、氯黴素(Chi)、卡那黴素 (Kan)和四環素(Tet)的LB培養液中，37°C，200轉/分，搖床培養過夜。次日取Iml菌液， 加入到10倍含相應抗生素的LB培養基中，在37°C下培養至OD = 1. 0，然後加入IPTG至終 濃度為0. ImM 1. OmM，在15°C 40°C下培養2h 10h。4. 2裂解細菌收集菌體，5000Xg離心5min，先用20mM Tris-Cl,pH 8. O洗三次，然後再用20mM Tris-Cl，pH 8. O, ImM EDTA, IOOmM NaCl 重懸，超聲破碎後再以 12000X g 離心 lOmin，取上 清。沉澱用洗液 20mM Tris-Cl, pH 8. 0, ImM EDTA, IOOmM NaCl, 1% Triton X-100 洗滌， 12000Xg離心IOmin後將不溶組分用8M尿素溶解蛋白，再以12000Xg離心lOmin，上清即 為我們處理過後的不溶組分。4. 3分析蛋白使用濃度為5%的濃縮膠和濃度為15%的分離膠進行Tricine-SDS-PAGE電泳，採 用考馬斯亮藍進行染色分析。通過Bradford法來測定總蛋白量。5、親和層析分離純化hIGF-Ι融合蛋白將適量Ni-NIA樹脂置於層析柱內，用上樣緩衝液平衡(50mMNaH2P04-Na2HP04， 300mM NaCl,20mM imidazole,pH 8. 0)。然後加入細菌裂解液的上清並使其在柱內平衡，結 合了 His 標籤的融合蛋白用洗脫液(50mMNaH2P04-Na2HP04，300mM NaCl,250mM imidazole, PH 8. 0)進行洗脫(圖4)。6、用腸激酶切去hIGF-Ι融合蛋白的融合標籤將親和純化後的hIGF-Ι融合蛋白通過凝膠過濾層析將原有緩衝液置換成腸激 酶酶切的緩衝液(50mM Tris, 2mM CaCl2, 50mM NaCl, pH 8.9)。然後將經過緩衝液置換的 hIGF-1融合蛋白在20°C下加腸激酶消化9h (圖5)。7、陽離子交換分離純化hIGF-Ι和hIGF_l活性檢測將適量SP陽離子交換樹脂置於層析柱內，用上樣緩衝液平衡 (30mMKH2P04-Na2HP04, 30mM NaCl, pH 6.7)。然後加入腸激酶酶切後的融合蛋白溶液並使其在柱內平衡，並用5倍體積的上樣緩衝液衝柱，目標蛋白(hIGF-Ι)用洗脫緩衝液(30mM KH2PO4-Na2HPO4, IM NaCl，pH 7. 0)進行洗脫。純化後的hIGF-Ι蛋白用GlO凝膠柱脫鹽後， 經冷凍乾燥得到hIGF-Ι蛋白粉末。通過培養NIH3T3細胞來檢測hIGF_l多肽的生物活性，在無血清培養基中實驗組 加入50 μ g/ml hIGF-1，對照組不加hIGF_l，培養24h後，觀察對照組和實驗組中NIH3T3細 胞的生長情況來測定hIGF-Ι的生物活性。實驗結果表明實驗組的NIH3T3細胞培養狀態較 好，邊界清楚，大小均一；而對照組的NIH3T3細胞基本沒有增值。由此驗證了 hIGF-Ι具有 代替牛血清促進細胞生長的功能。下面根據附圖和實施例詳細描述本發明，本發明的目的和效果將變得更加明顯。實施例1取5ul甘油管中菌液加入到5ml含氨苄青黴素(Amp)、氯黴素(Chi)、卡那黴素 (Kan)和四環素(Tet)的LB培養液中，37°C，200轉/分，搖床培養過夜。次日取Iml菌液， 加入到10倍含相應抗生素的LB培養基中，在37°C下培養至OD = 1. 0，誘導劑濃度為1. OmM, 分別在15°C、25°C下培養過夜，30°C、34°C、37°C和40 V下培養4h。表達的最適溫度為34V， 可溶融合蛋白的表達量達到1. 2g/L(圖2)。實施例2同實施例1，次日接種Iml菌液，加入到10倍含相應抗生素的LB培養基中，確定工 程菌在34°C下的生長曲線，分別取對數生長期前期、中期、後期和穩定期進行誘導，誘導時 培養溫度為34°C，誘導劑濃度為1. OmM，誘導後培養4h。最適誘導時間為對數生長期中期，即接種4h後，可溶融合蛋白的表達量達到 1. 56g/L(圖 3)。實施例3同實施例1，次日接種Iml菌液，加入到10倍含相應抗生素的LB培養基中，於34°C 下培養，在對數生長期中期誘導，誘導劑IPTG濃度分別為0. lmM、0. 25mM、0. 5mM、0. 75mM和 1. OmM，加入誘導劑後於34°C培養4h，結果表1所示。最適誘導劑濃度為0. 25mM，在該誘導濃度下可溶融合蛋白的表達量為1. 83g/L。實施例4同實施例1，培養種子液。次日接種Iml菌液，加入到10倍含相應抗生素的LB培 養基中，於34°C下培養，在對數生長期中期誘導，誘導劑IPTG濃度為0. 25mM，加入誘導劑後 在34°C下分別培養2h、4h、6h、8h和IOh0最適誘導後培養時間為8h，可溶融合蛋白的表達量是2. 06g/L。表IIPTG濃度和誘導後培養時間對可溶性hIGF-Ι融合蛋白表達的影響
權利要求
一種在重組大腸桿菌中生產人的類胰島素生長因子 1的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟(1)設計和合成hIGF 1蛋白相關基因設計上下遊引物，併合成hIGF 1基因，合成的hIGF 1基因具有SEQ ID NO.1所示的基因序列。(2)構建hIGF 1融合蛋白表達載體。(3)用表達載體轉化大腸桿菌宿主構建基因工程菌。(4)用基因工程菌表達hIGF 1融合蛋白。(5)親和層析分離純化hIGF 1融合蛋白。(6)用腸激酶切去hIGF 1融合蛋白的融合標籤。(7)陽離子交換分離純化。
2.根據權利要求1所述在重組大腸桿菌中生產人的類胰島素生長因子-1的方法，其特 徵在於，所述步驟(5)具體為將適量Ni-NIA樹脂置於層析柱內，用上樣緩衝液平衡，然後 加入細菌裂解液的上清並使其在柱內平衡，用結合了 His標籤的融合蛋白用洗脫液進行洗 脫。
3.根據權利要求1所述在重組大腸桿菌中生產人的類胰島素生長因子-1的方法，其特 徵在於，所述步驟(6)具體為將按照步驟(5)親和純化後的hIGF-Ι融合蛋白通過凝膠過 濾層析將原有緩衝液置換成腸激酶酶切的緩衝液，然後將經過緩衝液置換的hIGF-Ι融合 蛋白在20°C下加腸激酶消化9h。
4.根據權利要求1所述在重組大腸桿菌中生產人的類胰島素生長因子-1的方法，其 特徵在於，所述步驟(7)具體為將適量SP陽離子交換樹脂置於層析柱內，用上樣緩衝液平 衡，然後加入腸激酶酶切後的融合蛋白溶液並使其在柱內平衡，並用5倍體積的上樣緩衝 液衝柱，目標蛋白hIGF-Ι用洗脫緩衝液進行洗脫，純化後的hIGF-Ι蛋白用GlO凝膠柱脫鹽 後，經冷凍乾燥得到hIGF-Ι蛋白粉末。
全文摘要
本發明公開了一種在重組大腸桿菌中生產人的類胰島素生長因子-1的方法該方法由hIGF-1蛋白相關基因設計和合成、構建hIGF-1融合蛋白表達載體、用所述表達載體轉化大腸桿菌宿主構建基因工程菌、用所述基因工程菌表達hIGF-1融合蛋白、hIGF-1融合蛋白的分離、用腸激酶切去hIGF-1融合蛋白的融合標籤、通過培養NIH3T3細胞檢測hIGF-1的活性等步驟組成；本發明採用串聯表達的融合蛋白，N端為硫氧還蛋白，C端為hIGF-1，中間添加了6個His標籤，使表達產物更加穩定，分離方法更簡單，價廉，因此，本發明具有廣泛的應用前景。
文檔編號C07K14/475GK101948837SQ20101024383
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月3日 優先權日2010年8月3日
發明者張丹萍, 徐志南, 蔡謹, 黃磊 申請人:浙江大學