用於骨髓基質細胞培養的誘導溶液的配方及使用方法

2023-09-17 21:34:50 1

專利名稱：用於骨髓基質細胞培養的誘導溶液的配方及使用方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞培養液的濃度及使用方法，特別是公開一種用於骨髓基質細胞培 養的誘導溶液的配方及使用方法。
背景技術：
臨床上由於各種原因造成的種植體周圍骨缺損、骨量不足，影響種植修復效果，隨著 組織工程技術的發展成熟，組織工程化骨為我們提供了一條新的思路。利用骨組織工程技 術，將生長因子作為重要激活物與種子細胞、支架材料，立體培養等聯繫在一起，成為構 建骨組織再生修復必不可少的要素。細胞生長調節因子(簡稱生長因子)是一類具有控制細胞生長和活性、具有促進或抑制細 胞增殖、分化、遷移和基因的表達等生物效應的多肽類物質。其對細胞增殖、組織或器官 的修復、再生具有重要的促進作用，甚至微克或皮克級的生長因子也能發揮明顯的作用。已有多項實驗證實，成纖維細胞生長因子可促進骨髓基質細胞增殖。目前大部分學者 認為，成纖維細胞生長因子是作用於骨髓基質細胞分化增殖的早期，應與其他多種因素聯 合或序貫使用，才能達到促進骨髓基質細胞分裂增殖，增加細胞數量，同時促進細胞向成 骨細胞分化的目的。在生長因子中，成纖維細胞生長因子對骨髓基質細胞具有最強的促增 殖作用。不僅能提高骨髓基質細胞的增殖速度和壽命，且能在增殖過程中保持其多分化潛 能。骨細胞的微環境存在著多種生長因子，骨組織代謝是通過細胞因子網絡發揮調節作用， 不同的因子作用於成骨的不同階段，且相互可能有協同作用。在不同的濃度，生長因子可 以表現出相反的作用，選擇合適的濃度或比例成為探討熱點。重組人骨形成蛋白-2和成纖 雄細胞生長因子兩種因子成為骨修復重建領域的研究方向之一，但骨形成蛋白-2/成纖維細 胞生長因子最佳濃度和比例尚無定論。發明內容本發明的目的在於提供一種通過重組人骨形成蛋白-2和鹼性成纖維細胞生長因子的最 佳濃度有效促進骨髓基質細胞成骨的促進骨髓基質細胞成骨溶液的配方及使用方法。本發明是這樣實現的 一種用於骨髓基質細胞培養的誘導溶液的配方，包括在成骨條 件基礎培養液中加入的生長因子溶液，所述生長因子溶液包括重組人骨形成蛋白-2溶液50 200ng/ml，鹼性成纖維細胞生長因子溶液25 50ng/ml，所述重組人骨形成蛋白-2溶 液與鹼性成纖維細胞生長因子溶液的最佳濃度比為1: 1 8: 1。所述重組人骨形成蛋白-2與鹼性成纖維細胞生長因子的最佳濃度比例優選l: 1 2: 1。所述重組人骨形成蛋白-2溶液中含有濃度為0. 1 1. 0mg/ml的牛血清白蛋白溶液。 所述鹼性成纖維細胞生長因子溶液中含有濃度為0. 1 1.0mg/ml的三羥甲基氨基甲烷 溶液。所述成骨條件基礎培養液包含DMEM基礎培養液9 10mg/ml、抗生素20 40U/ml、體 積比為溶液總量的10 20%的胎牛血清，所述成骨條件基礎培養液的ph值為7. 2 7. 4。 所述抗生素為青黴素或鏈黴素。一種如上所述用於骨髓基質細胞培養的誘導溶液的使用方法，包括如下步驟(1) 將1 2ml骨髓基質細胞放入濃度為9 10mg/ml、體積為10 15ml的成骨條件 基礎培養液中培養並傳代；(2) 將上述傳代的骨髓基質細胞以1X105 2Xl05個/ml密度接種於培養板，加入濃 度為9 10mg/ml、體積為10 15ml的成骨條件基礎培養液培養24 48小時；(3) 加入重組人骨形成蛋白-2溶液50 100ng/ml、鹼性成纖維細胞生長因子溶液 25 50ng/ml，置於37。C、 5%C02、 100%溼度環境中培養1 6天；所述加入的重組人骨形成蛋白-2溶液與鹼性成纖維細胞生長因子溶液的最佳濃度比為1: 1 8: 1;(4) 吸去培養液，用四甲基偶氮唑鹽比色法測定細胞增殖水平。上述步驟(3)中加入的重組人骨形成蛋白-2溶液與鹼性成纖維細胞生長因子溶液的最佳濃度比優選1: 1 2: 1。所述重組人骨形成蛋白-2溶液的配置方法為將牛血清白蛋白溶於去離子水，配製成濃度為0. 1 1. Omg/ml的牛血清蛋白溶液，將裝有重組人骨形成蛋白-2凍乾粉的小瓶離心 後，加入配好的牛血清白蛋白溶液，餘量為水，最終溶液濃度為50 100ng/ml。所述鹼性成纖維細胞生長因子溶液的配置方法為將三羥甲基氨基甲垸溶於去離子水， 配製成PH8. 5、濃度為0. 1 1. Omg/ml的三羥甲基氨基甲垸溶液，將裝有鹼性成纖維細胞生 長因子凍乾粉的小瓶離心後，加入配好的三羥甲基氨基甲烷溶液，餘量為水，最終溶液濃 度為25 50ng/ml。本發明的有益效果是同時加入最佳濃度和比例的重組人骨形成蛋白-2和鹼性成纖維 細胞生長因子，加快了骨髓基質細胞成骨的增殖和分化，從而有效促進骨髓基質細胞成骨。
具體實施方式
本發明包括在成骨條件基礎培養液中加入的生長因子溶液，所述生長因子溶液包括 重組人骨形成蛋白-2溶液50 200ng/ml，鹼性成纖維細胞生長因子溶液25 50ng/ml，所述重組人骨形成蛋白-2溶液與鹼性成纖維細胞生長因子溶液的最佳濃度比為1: 1 8: 1，優選l: 1 2: 1。所述重組人骨形成蛋白-2溶液中含有濃度為0. 1 1.0mg/ml的牛血清白 蛋白溶液；所述鹼性成纖維細胞生長因子溶液中含有濃度為0. 1 1.0mg/ml的三羥甲基氨 基甲垸溶液。所述成骨條件基礎培養液包含DMEM基礎培養液9 10mg/ml、抗生素20 40U/ml、體積比為溶液總量的10 20%的胎牛血清，所述成骨條件基礎培養液的ph值為 7.2 7.4。所述抗生素為青黴素或鏈黴素。 本發明的使用方法，包括如下步驟(1) 將1 2ml骨髓基質細包放入濃度為9 10mg/ml、體積為10 15ml的成骨條件基 礎培養液中培養並傳代；(2) 將上述傳代的骨髓基質細以lX105 2X105個/ml密度接種於培養板，加入濃度 為9 10mg/ml、體積為10 15ml的成骨條件基礎培養液培養24 48小時；(3) 在步驟(2)完成後，加入重組人骨形成蛋白-2溶液50 100ng/ml、鹼性成纖維 細胞生長因子溶液25 50ng/ml，所述加入的重組人骨形成蛋白-2溶液與鹼性成纖維細胞生長因子溶液的最佳濃度比為.1: 1 8: 1，優選1: 1 1: 2;置於37°C、 5%C02、 100 %溼度環境中培養1 6天；(4) 吸去培養液，用四甲基偶氮唑鹽比色法測定細胞增殖水平。所述重組人骨形成蛋白-2溶液的配置方法為將牛血清白蛋白溶於去離子水，配製成濃度為0. 1 1. Omg/ml的牛血清蛋白溶液，將裝有重組人骨形成蛋白-2凍乾粉的小瓶離心 後，加入配好的牛血清白蛋白溶液，餘量為水，最終溶液濃度為50 100ng/ml。所述鹼性成纖維細胞生長因子溶液的配置方法為將三羥甲基氨基甲垸溶於去離子水， 配製成PH8. 5、濃度為0. 1 1. Omg/ml的三羥甲基氨基甲垸溶液，將裝有鹼性成纖維細胞生 長因子凍乾粉的小瓶離心後，加入配好的三羥甲基氨基甲烷溶液，餘量為水，最終溶液濃 度為25 50ng/ml。所述重組人骨形成蛋白-2溶液與鹼性成纖維細胞生長因子溶液的存儲條件為-2(TC。下面結合實施例對說明書作進一步說明成骨條件基礎培養液的配製①配置100ml濃度為9 10mg/ml的成骨條件基礎培養液將乾粉型培養基溶於雙蒸水中，加入磁性攪棒置於攪拌器上，攪拌均勻；②加入抗生素最終濃度為青黴素100U/ml、鏈黴素100U/ml ;③加入胎牛血清，最終的體積百分比濃度為總溶液的10%;④將成骨條件基礎培養液的PH值調整為7.2 7.4，待用。50 100ng/ml的重組人骨形成蛋白-2溶液與25 50ng/ml的鹼性成纖維細胞生長因子溶液的配製按上述方法配置，並選擇重組人骨形成蛋白-2溶液與鹼性成纖維細胞生長因子溶液最 終濃度梯度比，分別為1: 1， 2: 1， 4: 1， 8: 1。1、 (1)骨髓的採集和骨髓基質細胞原代培養1 3歲普通級比格犬稱重，速眠新Il0.2mL/kg和氯胺酮0.1mL/kg肌注麻醉。將犬以側 臥位，在髂骨體表的位置，常規去毛、消毒、鋪巾後，用18號骨髓穿刺針在無菌條件下穿刺 抽取骨髓2mL，迅速加入含肝素的無菌離心管內，混勻。1: 1的比例加入磷酸鹽緩衝液洗滌， 以1800r/min,離心10分鐘，小心吸棄上清液；加入上述成骨條件基礎培養液10ml，用滴管 吹散細胞團，種於10cm培養皿。置於37匸溫箱，5%C02， 100%溼度環境中培養。5天首次 換液，以後每2 3天換液1次。在倒置顯微鏡下動態觀察細胞形態和生長情況。(2)骨髓基質細胞傳代培養待骨髓基質細胞80%匯合時，吸棄培養皿中的成骨條件基礎培養液，用磷酸鹽緩衝液洗 1次，加入0.25%的胰酶lml消化約1 2分鐘，鏡下見骨髓基質細胞團縮後，加入lml成 骨條件基礎培養液終止消化，用細胞刮仔細刮取尚未脫落的細胞，並轉移至離心管內，吹打 使細胞分散均勻。用血細胞計數器計數，計算細胞數量。將細胞懸液以1000r/min離心5分 鍾，棄上清液，加入10ml成骨條件基礎培養液，調整細胞濃度為lXlS個/ml，吹打使細胞 分散均勻，接種於培養皿內，置於37"溫箱，5%C02， 100%溼度環境中培養。每2 3天換 液一次。倒置顯微鏡下動態觀察細胞形態和生長情況,細胞80%匯合時按上述操作傳代。2、 加入重組人骨形成蛋白-2溶液、鹼性成纖維細胞生長因子溶液將傳至第三代的細胞以5 X 103個/ml密度接種於96孔培養板，使用成骨條件基礎培養液， 每孔20(^1，培養24小時後，棄去培養液及未貼壁的細胞。加入重組人骨形成蛋白-2溶液與鹼性成纖維細胞生長因子溶液，分4組分別加入①重 組人骨形成蛋白-2濃度鹼性成纖維細胞生長因子濃度為1: 1，②重組人骨形成蛋白-2濃 度鹼性成纖維細胞生長因子濃度為2:1，③重組人骨形成蛋白-2濃度鹼性成纖維細胞生 長因子濃度為4:1，④重組人骨形成蛋白-2濃度鹼性成纖維細胞生長因子濃度為8:1。另 設兩組對照組⑤只加入濃度為100ng/ml鹼性成纖維細胞生長因子溶液，⑥只加入濃度為 100ng/ml重組人骨形成蛋白-2溶液。置於37'C溫箱，5%C02，飽和溼度環境中培養。分別在1、 2、 3、 4、 5、 6天用四甲基偶氮唑鹽比色法測定細胞增殖水平，酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定各孔光吸收值。 測定結果表明濃度比為1: 1、 2: 1、 4: 1、 8: 1的重組人骨形成蛋白-2溶液和鹼性成纖維細胞生長因子溶液組均能促進犬的骨髓基質細胞分化'其中濃度比為l: 1、 2: l時，分化速度增長明 顯，隨著時間延長，促進作用增強，且均好於單一重組人骨形成蛋白-2組⑤和單一鹼性成纖 維細胞生長因子組⑥。
權利要求
1.一種用於骨髓基質細胞培養的誘導溶液的配方，包括在成骨條件基礎培養液中加入的生長因子溶液，其特徵在於所述生長因子溶液包括重組人骨形成蛋白-2溶液50～200ng/ml，鹼性成纖維細胞生長因子溶液25～50ng/ml，所述重組人骨形成蛋白-2溶液與鹼性成纖維細胞生長因子溶液的最佳濃度比為1∶1～8∶1。
2. 根據權利要求1所述的用於骨髓基質細胞培養的誘導溶液的配方，其特徵在於所述重 組人骨形成蛋白-2與鹼性成纖維細胞生長因子的最佳濃度比例優選l: 1 2: 1。
3. 根據權利要求1或2所述的用於骨髓基質細胞培養的誘導溶液的配方，其特徵在於所述重組人骨形成蛋白-2溶液中含有濃度為0. 1 1. Omg/ml的牛血清白蛋白溶液。
4. 根據權利要求1或2所述的用於骨髓基質細胞培養的誘導溶液的配方，其特徵在於所 述鹼性成纖維細胞生長因子溶液中含有濃度為0. 1 1. Omg/ml的三羥甲基氨基甲烷溶液。
5. 根據權利要求1所述的用於骨髓基質細胞培養的誘導溶液的配方，其特徵在於所述成 骨條件基礎培養液包含DMEM基礎培養液9 10mg/ml、抗生素20 40U/ml、體積比為10 20%的胎牛血清，所述成骨條件基礎培養液的ph值為7. 2 7. 4。
6. 根據權利要求5所述的用於骨髓基質細胞培養的誘導溶液的配方，其特徵在於所述抗 生素為青黴素或鏈黴素。
7. —種如權力要求1 6中任意一種所述用於骨髓基質細胞培養的誘導溶液的使用方法，其 特徵在於，包括如下步驟(1) 將1 2ml骨髓基質細胞放入濃度為9 10mg/ml、體積為10 15ml的成骨條件基 礎培養液中培養並傳代；(2) 將上述傳代的骨髓基質細胞以lXlS 2X10S個/ml密度接種於培養板，加入濃度 為9 10mg/ml、體積為10 15ml的成骨條件基礎培養液培養24 48小時；(3) 加入重組人骨形成蛋白-2溶液50 100ng/ml、鹼性成纖維細胞生長因子溶液25 50ng/ml，置於37'C、 5%C02、 100%溼度環境中培養1 6天；所述加入的重組人骨形成蛋白-2溶液與鹼性成纖維細胞生長因子溶液的最佳濃度比為1: 1 8: 1;(4) 吸去培養液，用四甲基偶氮唑鹽比色法測定細胞增殖水平。
8. 根據權利要求7所述的用於骨髓基質細胞培養的誘導溶液的使用方法，其特徵在於上述步驟(3)中加入的重組人骨形成蛋白-2溶液與鹼性成纖維細胞生長因子溶液的最佳濃度比優選1: 1 2: 1。
9. 根據權利要求7所述的用於骨髓基質細胞培養的誘導溶液的使用方法，其特徵在於所述重組人骨形成蛋白-2溶液的配置方法為將牛血清白蛋白溶於去離子水，配製成濃度 為0. 1 1. 0mg/ml的牛血清蛋白溶液，將裝有重組人骨形成蛋白-2凍乾粉的小瓶離心後， 加入配好的牛血清白蛋白溶液，餘量為水，最終溶液濃度為50 100ng/ml。 10.根據權利要求7所述的用於骨髓基質細胞培養的誘導溶液的使用方法，其特徵在於所 述鹼性成纖維細胞生長因子溶液的配置方法為將三羥甲基氨基甲烷溶於去離子水，配 製成PH8. 5、濃度為0. 1 1. Omg/ml的三羥甲基氨基甲垸溶液，將裝有鹼性成纖維細胞生 長因子凍乾粉的小瓶離心後，加入配好的三羥甲基氨基甲垸溶液，餘量為水，最終溶液 濃度為25 50ng/ml。
全文摘要
本發明為一種用於骨髓基質細胞培養的誘導溶液的配方。包括在成骨條件基礎培養液中加入的生長因子溶液，所述生長因子溶液包括重組人骨形成蛋白-2溶液50～200ng/ml，鹼性成纖維細胞生長因子溶液25～50ng/ml，所述重組人骨形成蛋白-2溶液與鹼性成纖維細胞生長因子溶液的最佳濃度比為1∶1～8∶1。本發明的優點是本發明同時加入最佳濃度和比例的重組人骨形成蛋白-2和鹼性成纖維細胞生長因子，加快了骨髓基質細胞成骨的增殖和分化，從而有效促進骨髓基質細胞成骨，縮短成骨時間，操作簡單方便。
文檔編號C12N5/077GK101275120SQ20081004332
公開日2008年10月1日 申請日期2008年5月6日 優先權日2008年5月6日
發明者潘可風, 磊 王, 黃遠亮 申請人:上海市東方醫院