海帶遊(胚)孢子的超低溫快速冷凍保存法的製作方法

2023-09-17 19:17:00 1

專利名稱：海帶遊(胚)孢子的超低溫快速冷凍保存法的製作方法
技術領域：
本發明屬於海洋生物技術領域，是涉及一種大型經濟藻類—海帶種質保存技術。
背景技術：
海帶(Laminaria japonica Aresch)是中國重要的經濟藻類，養殖產量和規模連續多年居世界首位，豐富的種質資源是漁業生產的重要物質基礎，保護和利用好海帶種質資源將為提高海帶品種水平、實現海帶良種化生產提供重要保證，海帶生活史分兩個明顯的世代階段孢子體世代和配子體世代，配子體世代是海帶的單倍體階段，遊孢子是配子體世代的開始階段，種海帶成熟後，放散遊孢子，遊孢子經2小時左右的遊動，或附著或懸浮形成胚孢子，胚孢子逐漸萌發成配子體。傳統的保種技術就是在該階段將雌配子體(female gametophyte)和雄配子體(male gametophyte)單個分離培養，形成無性繁殖系(clone)，通過繼代培養無性系的方法保存種質。但是，這種傳統保存技術具有明顯的不足(1)液體培養是唯一的保存途徑，手段單一，限制了保存的規模和效率；(2)液體培養保存一般需要在半月內更新一次培養液，工作量大，操作繁瑣，頻繁操作也增加了種質汙染及混雜的機會；(3)採孢子前無法對種海帶進行無菌處理，整個保存過程都在有菌條件下，不能徹底杜絕微生物尤其雜藻的汙染；(4)培養中細胞形態異常、單性生殖等現象時有發生，培養因子有待進一步優化。因此，目前的保種技術還不能作到種質永久保存，無法完全排除混雜、汙染、變異的可能性。
藻類種質超低溫保存的研究開始於20世紀60年代，80年代以後發展速度較快，從淡水藻類到海水藻類，從微藻類到大型藻類，從非經濟藻類到經濟藻類都給予了較多的關注。藻類超低溫冷凍保存的方法主要是兩步冷凍法(two-step freezing)，該方法首先在保存材料中加入抗凍保護劑，進行預凍，再將預凍過的材料投入液氮中快速冷凍，目前已成為藻類種質冷凍保存的常規方法；超低溫冷凍保存技術的應用受到限制的主要原因在於冷凍操作程序的建立主要靠經驗性的實驗結果，適合一種藻類的保存技術對另一種藻類可能完全不適用。超低溫兩步法凍存在大型經濟藻類中使用的種類有紫菜和裙帶菜，有關海帶遊(胚)孢子超低溫保存的方法目前仍為一個空白。

發明內容
本發明的目的在於改進已有的繼代培養保存無性系技術的不足，而提供一種用於海帶孢子保存、簡便易行、可大量保存種質材料、成活率較高的海帶遊(胚)孢子的超低溫快速冷凍保存法。
本發明的目的是這樣實現的，海帶遊(胚)孢子的超低溫快速冷凍保存法，其特點是該方法包括以下步驟材料處理、平衡、快速凍存和復甦。
材料處理是選擇孢子囊色澤呈墨綠色、表面有白色的薄膜開始脫落的海帶，剪取帶有孢子囊的葉片，用脫紙棉和消毒海水反覆搽洗十餘遍，置於燒杯中，倒入5-10℃低溫消毒海水，放散孢子，孢子濃度達到50/160×以上時，用300目篩絹濾出雜質和黏液獲得孢子懸液。
平衡是將孢子懸液與消毒海水配製的20％DMSO按1∶1比例混合，在0-4℃冰箱中平衡15min。
快速降溫凍存是將平衡後的孢子混合液裝入1.5ml凍存管中，凍存管直接投入液氮。
復甦是超低溫冷凍後，將凍存管從液氮中取出，迅速移到39℃恆溫水浴中快速震蕩，至最後一粒冰晶消失倒入培養液中培養。
本發明與已有技術相比具有以下顯著特點和積極效果本發明採用超低溫快速冷凍保存海帶遊(胚)孢子，改變了一個器皿只能保存一個株系的傳統方法，可以在一個器皿中保存一個品(種)系中的多個株系，提高了效率；海帶遊(胚)孢子在超低溫(-196℃)狀態下代謝完全停止，生命以靜止的形式可以在這種狀態下長期保存，解凍後又可恢復其原有的生物活性和遺傳特性。海帶遊(胚)孢子的超低溫快速冷凍保存法簡單易行，有效地解決了海帶種質保存中汙染、混雜、變異的問題而保持遺傳穩定，可望實現海帶種質的永久保存。本發明方法的最大特點一是可以保持品種的遺傳穩定，二是簡便易行，三是可大量保存種質材料與傳統保存方法相比，遺傳穩定；與遊(胚)孢子逐級冷凍保存法相比簡便易行，冷凍操作只有一步，即投入液氮，沒有中間環節；與無性系超低溫凍存相比可大量保存種質材料，一次操作可保存一個品(種)系中的多個株系，無性系超低溫保存一次操作只能保存一個株系。本發明材料的獲得受季節限制，只有在海帶成熟季節才能獲得。因此海帶遊(胚)孢子超低溫快速冷凍保存法、海帶遊(胚)孢子超低溫逐級冷凍保存法、海帶絲狀體程序降溫冷凍保存法以及海帶絲狀體逐級冷凍保存法四種保存方法各有價值、有同時存在的必要。
四、具體實施方案下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明。
實施例，海帶遊(胚)孢子的超低溫快速冷凍保存法，是通過材料處理、平衡、快速降溫冷凍和復甦來實現的，材料處理是選擇孢子囊色澤呈墨綠色、表面有白色的薄膜開始脫落的海帶，剪取5×5cm帶有孢子囊的葉片，用脫紙棉和消毒海水反覆搽洗十餘遍，置於500ml燒杯中，倒入8℃低溫消毒海水，放散孢子。孢子濃度達到80-100/160×時，用300目篩絹濾出雜質和黏液獲得孢子懸液；平衡是將孢子懸液與消毒海水配製的20％DMSO按1∶1比例混合，在0-4℃冰箱中平衡15min；凍存是將平衡後的孢子與保護劑混合液裝入1.5ml凍存管(cryotubes)中，凍存管直接投入液氮；復甦是超低溫冷凍後，將凍存管從液氮中取出，迅速移到39℃恆溫水浴中快速震蕩，至最後一粒冰晶消失倒入培養液中培養，超低溫凍存的時間可以根據具體情況選取，在需要復甦的時候結束凍存即可，沒有一定的限制。
採用本發明方法保存的海帶遊(胚)孢子，螢光素二乙酸酯(fluorescein diacetate，FDA)活性染色法測定成活率，存活率達到30％左右。
權利要求
1.海帶遊(胚)孢子的超低溫快速冷凍保存法，其特徵是該方法包括以下步驟材料處理、平衡、快速凍存和復甦。
2.根據權利要求1所述的海帶遊(胚)孢子的超低溫快速冷凍保存法，其特徵材料處理是選擇孢子囊色澤呈墨綠色、表面有白色的薄膜開始脫落的海帶，剪取帶有孢子囊的葉片，用脫紙棉和消毒海水反覆搽洗十餘遍，置於燒杯中，倒入5-10℃低溫消毒海水，放散孢子，孢子濃度達到50/160×以上時，用300目篩絹濾出雜質和黏液獲得孢子懸液。
3.根據權利要求1所述的海帶遊(胚)孢子的超低溫快速冷凍保存法，其特徵平衡是將孢子懸液與消毒海水配製的20％DMSO按1∶1比例混合，在0-4℃冰箱中平衡15min。
4.根據權利要求1所述的海帶遊(胚)孢子的超低溫快速冷凍保存法，其特徵快速降溫凍存是將平衡後的孢子混合液裝入1.5ml凍存管中，凍存管直接投入液氮。
5.根據權利要求1所述的海帶遊(胚)孢子的超低溫快速冷凍保存法，其特徵復甦是超低溫冷凍後，將凍存管從液氮中取出，迅速移到39℃恆溫水浴中快速震蕩，至最後一粒冰晶消失倒入培養液中培養。
全文摘要
本發明公開了一種海帶遊(胚)孢子的超低溫快速冷凍保存法，該方法包括以下步驟材料處理、平衡、快速凍存和復甦，本發明改進已有的繼代培養保存無性系技術的不足，提供了一種用於海帶孢子保存、簡便易行、可大量保存種質材料、成活率較高的海帶遊(胚)孢子的超低溫快速冷凍保存法。
文檔編號A01H13/00GK1742553SQ20051004420
公開日2006年3月8日 申請日期2005年8月4日 優先權日2005年8月4日
發明者車軾, 張全勝, 王國文, 曲善村, 楊麗娜 申請人:山東東方海洋科技股份有限公司, 煙臺大學