基於納米金等離子激元的直接競爭酶免疫分析方法

2023-09-18 03:40:50 6

基於納米金等離子激元的直接競爭酶免疫分析方法
【專利摘要】本發明公開了一種基於納米金等離子激元的直接競爭酶免疫分析方法，可實現小分子化合物的免疫分析可視化檢測，包括：可能含有小分子化合物的測試樣品與過氧化氫酶標記的半抗原可競爭結合固相上包被的小分子化合物抗體，結合的酶標抗原分解過氧化氫，在一定的緩衝條件下，過氧化氫還原氯金酸為納米金，通過觀測顯色液的顏色或光吸收強度，實現對樣品中所含小分子化合物的檢測。本發明方法具有靈敏度高、操作簡便、成本低、可用肉眼分辨結果等優點，彌補了現有的小分子化合物酶聯免疫檢測技術的不足。
【專利說明】基於納米金等離子激元的直接競爭酶免疫分析方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種小分子化合物的檢測方法，特別是一種基於納米金等離子激元的 直接競爭酶聯免疫分析方法，屬於免疫學檢測分析領域。

【背景技術】
[0002] 酶聯免疫分析技術是一種非常成熟的固相免疫分析模式，在臨床診斷分析中已經 獲得了多年的應用，同時，近十年來，也在環境監測、食品安全危害物檢測等領域中獲得了 廣泛的應用。在對小分子化合物的檢測，酶聯免疫分析主要採用兩種模式，間接競爭法和直 接競爭法。在兩種檢測模式中，分別需要酶標記的第二抗體和酶標記的半抗原，它們是作為 免疫吸附分析的信號放大的作用。在環境監測和食品危害物檢測中，酶聯免疫分析最常用 的的酶分子為辣根過氧化物（HRP)酶，其最常用的底物為四甲基聯苯胺（TMB)和過氧化氫 (H 202)，在HRP的催化下，它們轉變為藍色物質，在強酸的作用下，藍色產物可轉變為黃色， 通過酶標儀檢測產物的光吸收強度，可以實現對目標小分子化合物的檢測。
[0003] 目前，在環境監測、食品危害物分析等許多領域，都對更高靈敏度的免疫分析方法 具有迫切的需求，因此，提高傳統的酶聯免疫分析方法的檢測性能，具有重要的應用價值。 許多研究採用新的檢測模式，如化學發光、電化學發光，與傳統酶聯免疫分析方法相比，它 們具有更靈敏的檢測能力，但是這些免疫分析方法需要較昂貴的設備和試劑，因此，檢測成 本顯著提高，這極大地阻礙了其在環境監測、食品危害物分析等許多領域的應用。


【發明內容】

[0004] 針對現有技術的不足，本發明的目的在於提出一種基於納米金等離子激元的直接 競爭酶聯免疫分析方法，以實現對小分子化合物的高靈敏、低成本的檢測。
[0005] 為實現前述發明目的，本發明採用了如下技術方案： 一種基於納米金等離子激元的直接競爭酶免疫分析方法，包括： 將測試樣品與過氧化氫酶標記的半抗原混合，並使所述測試樣品中可能含有的小分子 化合物和過氧化氫酶標記的半抗原與包被在固相載體上的小分子化合物抗體競爭性結合， 移除未與所述小分子化合物抗體結合的小分子化合物及過氧化氫酶標記的半抗原，並 加入過氧化氫、氯金酸及用以形成選定緩衝體系的輔助試劑，再觀察或檢測所形成的混合 反應體系的顏色或光吸收強度，實現對測試樣品中所含小分子化合物的檢測； 其中，在所述選定緩衝體系中，結合於所述小分子化合物抗體上的所述過氧化氫酶標 記的半抗原能夠分解過氧化氫，並且過氧化氫能夠還原所述氯金酸形成納米金粒子。
[0006] 進一步的，所述基於納米金等離子激元的直接競爭酶免疫分析方法具體可包括如 下步驟： (1) 將小分子化合物的抗體溶於包被緩衝液內，並施加到固相載體上，在37°C孵育，再 以封閉液封閉，從而將小分子化合物抗體包被在固相載體上； (2) 將過氧化氫酶標記的半抗原和可能含有小分子化合物的測試樣品於磷酸鹽緩衝液 中混合，施加到經步驟（1)處理後的所述固相載體上，於37°C孵育後洗滌； (3) 在經步驟（2)處理後的所述固相載體上施加過氧化氫； (4) 向經步驟（3)處理後的所述固相載體上施加含有氯金酸的顯色液，在室溫下充分反 應後，再觀察或檢測所形成的混合反應體系的顏色或光吸收強度，實現對測試樣品中所含 小分子化合物的檢測。
[0007] 在一較佳實施方案中，是通過檢測所述混合反應體系對於可見光的光吸收強度， 實現對測試樣品中所含小分子化合物的檢測。
[0008] 其中，所述可見光的波長優選為540 nm。
[0009] 更進一步的，所述基於納米金等離子激元的直接競爭酶免疫分析方法具體可包括 如下步驟： (1) 包被抗體 將小分子化合物的抗體用包被緩衝液分別稀釋後，加入酶標板(亦作為固相載體）的各 個孔中，37°C孵育一段時間(例如2h)，用封閉液封閉； (2) 競爭反應 將酶標抗原(過氧化氫酶標記的半抗原，亦可簡稱CAT酶標抗原)稀釋後，加入酶標板的 各個孔中，再分別加入不同濃度的小分子化合物，37°C孵育一段時間（例如lh)，然後用洗 滌液置洗滌2次以上，用水洗滌一次以上； (3) 加過氧化氫 加入H202, 25°C反應一段時間(例如lh); (4) 顯色 向上述步驟（3)中的酶標板各孔中分別加入顯色液，振蕩混勻，反應一段時間(例如 15min)後，觀測混合反應體系的顏色或檢測可見光吸收強度。
[0010] 進一步的，所述包被緩衝液可以採用濃度為〇. 05 M、pH值為9. 6的碳酸鈉緩衝液。
[0011] 進一步的，所述封閉液可以採用添加〇· 2wt% BSA、濃度為0· 01M的磷酸鹽（PBS) 緩衝溶液。
[0012] 進一步的，所述酶標抗原可以是採用碳化二亞胺法、重氮法、戊二醛法等方法偶聯 過氧化氫酶（CAT)與小分子化合物或其衍生物得到的的複合物。
[0013] 進一步的，在每升前述濃度為0. 01M的PBS緩衝液中，可包含氯化鈉8 g、磷酸二氫 鉀0. 24 g、磷酸氫二鈉3. 62 g、氯化鉀0. 2g。
[0014] 進一步的，所述洗滌液（PBST)可採用添加0. 05wt%吐溫-20的、濃度為0. 01M、pH 值為7. 4的磷酸鹽緩衝液。
[0015] 進一步的，所述顯色液可由過氧化氫溶液、5mM氯金酸溶液、2mM檸檬酸鈉溶液以 及2mM MES (2-(N-嗎啡啉）乙磺酸）溶液等混合形成。
[0016] 進一步的，所述基於納米金等離子激元的直接競爭酶免疫分析方法還包括： a、取一系列不同濃度的小分子化合物標準樣品分別與固定用量的過氧化氫酶標記的 半抗原混合後，與包被在固相載體上的小分子化合物抗體競爭性結合，移除未與所述小分 子化合物抗體結合的小分子化合物及過氧化氫酶標記的半抗原，並加入過氧化氫、氯金酸 及用以形成選定緩衝體系的輔助試劑，再觀察或檢測每一小分子化合物標準樣品最終所形 成的混合反應體系的顏色或光吸收強度，進而依據所述小分子化合物標準樣品的濃度與最 終所獲的相應混合反應體系的顏色或可見光吸收強度之間的對應關係建立標準比色卡或 標準曲線； b、將待測試樣品與過氧化氫酶標記的半抗原混合後，與包被在固相載體上的小分子化 合物抗體競爭性結合，移除未與所述小分子化合物抗體結合的過氧化氫酶標記的半抗原及 可能存在的小分子化合物，並加入過氧化氫、氯金酸及用以形成選定緩衝體系的輔助試劑， 再觀察或檢測最終所形成的混合反應體系的顏色或光吸收強度，並與所述標準比色卡或標 準曲線比對，進而定性或定量測得待測試樣品中所含小分子化合物的濃度。
[0017] 該基於納米金等離子激元的直接競爭酶免疫分析方法是一種基於納米金等離子 激元的酶聯免疫形成的可視化檢測小分子化合物的方法，其依據過氧化氫酶標記的半抗原 (簡稱CAT酶標抗原或酶標抗原)與小分子化合物競爭性結合包被在固相載體上的小分子化 合物抗體(簡稱固相抗體)，其中，在小分子化合物不存在或較少存在時，多數酶標抗原與固 相抗體結合而被固定，並可較多分解後續加入的過氧化氫中，在小分子化合物存在或較多 存在時，較少酶標抗原與固相抗體結合，並僅可分解少量後續加入的過氧化氫，而未被降解 的過氧化氫可還原後續加入的氯金酸形成金納米粒子，因過氧化氫殘留量的不同，可產生 得到顏色不同或深淺不同的金納米粒子，進而，通過觀測顯色液的顏色或光吸收強度，即可 以實現對小分子化合物的定性或定量檢測。
[0018] 與現有技術相比，本發明至少具有如下優點：該基於納米金等離子激元的直接競 爭酶免疫分析方法可實現對樣品中所含小分子化合物的高靈敏檢測，測試結果可採用肉眼 或酶標儀、分光光度計等普通設備檢測，成本低廉，易於操作，彌補了現有的檢測小分子化 合物技術的不足。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1是本發明一典型實施方案中一種基於納米金等離子激元的直接競爭酶免疫 分析方法的工作原理圖； 圖2是本發明實施例1中濃度梯度分別為0 ng/mL，0. 03 ng/mL，0. 1 ng/mL，0. 3 ng/mL, 1 ng/mL，3ng/mL, 10 ng/mL,30ng/mL的甲基睪酮標準品的反應顯色圖； 圖3是本發明實施例1中濃度梯度分別為0 ng/mL, 0· 03 ng/mL，0· 1 ng/mL, 0· 3 ng/mL, 1 ng/mL，3ng/mL，10 ng/mL，30ng/mL的甲基睪酮標準品的反應光吸收強度標準曲線圖。

【具體實施方式】
[0020] 本發明主要提供了 一種基於納米金等離子激元的直接競爭酶免疫分析方法，其技 術方案主要包括：測試樣品可能含有的小分子化合物與過氧化氫酶標記的半抗原（以下簡 稱酶標抗原）可競爭的結合固相載體上包被的小分子化合物抗體(簡稱固相抗體)，固相載 體結合的酶標抗原分解過氧化氫，在一定的緩衝條件下，過氧化氫還原氯金酸為納米金(亦 稱金納米粒子)，通過觀測顯色液的顏色或光吸收強度，實現對測試樣品中所含小分子化合 物的檢測。
[0021] 在一典型實施方案中，一種基於納米金等離子激元的直接競爭酶免疫分析方法可 以包括以下步驟： (1)製備半抗原-CAT酶標抗原； (2) 固相載體(例如微孔板）的小分子化合物抗體包被； (3) 競爭反應； (4) 加過氧化氫； (5) 顯色。
[0022] 其中，所述小分子化合物可選自但不限於甲基睪酮、克倫特羅、慶大黴素等。
[0023] 參閱圖1所示系本發明中一種典型基於納米金等離子激元的直接競爭酶免疫分 析方法的工藝原理圖。
[0024] 進一步的，在一典型實施案例之中，該方法可以包括如下步驟： (1) 包被抗體 將免疫製備的小分子化合物抗體用0.05 M、pH 9.6的碳酸鈉緩衝液分別稀釋至 2-10yg/mL，加入酶標板中，每孔加100yL，37°C孵育2h，用添加有0. 2%牛血清白蛋白 (BSA)的0. 01M、pH7. 4的磷酸鹽緩衝液作為封閉液封閉； (2) 競爭反應 將用碳化二亞胺法、重氮法、戊二醛法偶聯的酶標抗原用酶標稀釋液稀釋，稀釋至 5-20 μ g/mL，加入到酶標板中，每孔加50 μ L，同時加入小分子化合物標準品，如濃度分別 為 0 ng/mL，0. 03 ng/mL，0· 1 ng/mL, 0. 3 ng/mL, 1 ng/mL, 3ng/mL, 10 ng/mL, 30ng/mL，每孔力口 入50 μ L，37°C孵育lh，然後用PBST洗滌液置於搖床上洗滌2次，用超純水洗滌一次，每次 3min ； 所述洗滌液PBST :為含有0. 05%吐溫-20的0. 01M、pH7. 4的磷酸鹽緩衝液； 所述酶標稀釋液：含〇. 1%明膠的PBST溶液； (3) 加過氧化氫 加入濃度為400μΜ的H202，每孔加入100yL，25°C反應lh。
[0025] (4)顯色 向上述（3)中的酶標板各孔中分別加入6yL 5mM氯金酸、6yL 2mM檸檬酸鈉、88yL MES緩衝溶液（2mM)，振蕩混勻，反應15min後，觀察顯色結果，或檢測540 nm處光吸收強度 (A54〇) 〇
[0026] 如下結合前述典型實施案例簡要說明本發明的工作原理： 以相同量的抗體包被到酶標板的各個孔中，加入待測含小分子化合物樣品和酶標記抗 原後，待測樣品中的小分子化合物與酶標抗原相互競爭有限的固相表面包被的抗體，並與 之結合。由於每個孔中的抗體和加入的酶標抗原含量均相同，所以當待測樣品所含的小分 子化合物濃度高時，與固相抗體結合的酶標抗原就會減少。反應達到平衡時，將上清液傾倒 出，並用洗滌液洗滌，故只有與固相抗體結合的酶標抗原和小分子目標物結合在酶標板微 孔中，然後加入過氧化氫，酶標板中的酶標抗原分解過氧化氫，反應後再加入底物(氯金酸、 檸檬酸鈉、MES緩衝液)。當待測物濃度高時，反應顯色較深，呈紅色，用酶標儀檢測540nm處 的吸光值（0D值)，吸光值較高；反之，當待測物濃度低時，反應顯色較淺，呈淺藍色，則所測 的0D值低。根據所作的標準曲線，可以推算出待測樣品中所含小分子化合物的濃度高低。
[0027] 以下結合實施例及附圖對本發明的技術方案作更為詳細的解釋說明。
[0028] 實施例1本實施例涉及甲基睪酮的檢測方法，包括如下步驟： (1)製備甲基睪酮衍生物-CAT酶標抗原 將甲基睪酮通過羧甲基羥胺半鹽酸鹽肟化，得到衍生物3-羧甲基肟-甲基睪酮 (3-CM0-MT)，然後採用碳化二亞胺法將3-CM0-MT與CAT酶偶聯。具體如下： 取 3-CM0-MT 2. 5mg、NHS L 5mg、EDC .HC1 2. 5mg，加入到 lmL DMF 中，室溫避光震蕩 2 h。 另取27mg過氧化氫酶，溶於1. 5mL含20% DMF液的PBS中，4°C預冷。將3-CM0-MT活化液逐 滴加入到CAT溶液中，並不斷攪拌，4°C反應2 h ;反應結束後將反應液先用20% DMF的PBS 透析，最後用〇. 01M PBS透析2天，-20°C冷凍保存。
[0029] (2)包被板的製備 採用0. 05M pH 9. 6的碳酸鹽緩衝液作為包被稀釋液稀釋甲基睪酮抗體，抗體濃度約為 2-10 μ g/mL，然後向包被板的每個孔中加入100 μ L包被液，37°C烘箱放置2h或4°C過夜， 用PBST洗滌液洗滌3min，每次在吸水紙上拍幹，重複3次。然後加入含0. 2% BSA的磷酸 鹽緩衝液作為封閉液封閉，37°C烘箱溫育2h或4°C過夜，取出用上述洗滌液洗滌3次。
[0030] (3)競爭反應 分別將一系列濃度梯度的甲基睪酮標準溶液，如〇 ng/mL，0. 03 ng/mL，0. 1 ng/mL，0. 3 ng/mL，1 ng/mL，3 ng/mL，10 ng/mL，30ng/mL，或經前處理過的樣品溶液分別加入到包被板各 自的微孔中，每孔50 μ L。再將甲基睪酮衍生物-CAT酶標抗原用酶標抗原稀釋液(含0. 1% 明膠、含〇. 05%吐溫-20、pH 7. 4的磷酸鹽緩衝溶液，PBST)分別稀釋至5-20 μ g/mL，加入 酶標板中，每孔加入50 μ L，37°C恆溫箱孵育lh，然後用PBST洗滌液洗滌2次，用超純水洗 漆一次，每次3min。
[0031] (4)加過氧化氫 加入過氧化氫，用2mM pH 6. 5 MES緩衝溶液稀釋至400 μ M，每孔加入100 μ L，置於不透 光恆溫箱25°C中反應lh。
[0032] (5)顯色 向上述（4)中的酶標板各孔中分別加入6yL 5mM氯金酸、6yL 2mM檸檬酸鈉、88yL 2mM MES緩衝溶液，在25°C恆溫振蕩器上振蕩混勻，反應15min後，觀察顯色結果並拍照，或 檢測540 nm處光吸收強度（A54Q)。
[0033] 檢測結果顯示，採用本實施例的方法，肉眼可分辨0. 1 nM的甲基睪酮（圖2)，而利 用分光光度計對甲基睪酮的檢測限可達到〇. 03 nM (圖3)。
[0034] 實施例2本實施例涉及克倫特羅的檢測方法，包括如下步驟： (1)製備克倫特羅-CAT酶標抗原 採用重氮法將鹽酸克倫特羅（CL)與CAT酶偶聯，具體如下： 用0. 1 mol/L HC1溶液溶解2. 5mg鹽酸克倫特羅，放置於4°C冰箱內攪拌。20min以後， 向燒杯內連續三次加入〇. 2mol/L的NaN02溶液，每次20uL，間隔25s。4°C低速攪拌約1小 時至溶液無色。亞硝酸鈉是否過量可用澱粉碘化鉀試紙測試。稱取39. 4mg的CAT溶解於 20mM的硼酸鹽緩衝液中。在冰浴的條件下，將活化好的CL逐滴加入到CAT溶液中，滴加過 程中要不斷攪拌並用lmol/L NaOH調節pH值維持在8. (Γ8. 5之間。滴加完成後於4°C、 300r/min攪拌下反應6小時。最後用0. 01MPBS透析2天。透析完成後，4°C、5000rpm離 心lOmin除去沉澱，將上清分裝保存於-20°C備用。
[0035] (2)包被板的製備 採用濃度為〇. 〇5M、pH 9. 6的碳酸鹽緩衝液作為包被稀釋液稀釋克倫特羅抗體，抗體濃 度約為2-10 μ g/mL，然後向包被板的每個孔中加入100 μ L包被液，37°C烘箱放置a或4°C 過夜，用PBST洗滌液洗滌3min，每次在吸水紙上拍幹，重複3次。然後加入含0. 2% BSA的 磷酸鹽緩衝液作為封閉液封閉，37°C烘箱溫育2h或4°C過夜，取出用上述洗滌液洗滌3次。
[0036] (3)競爭反應 分別將一系列濃度梯度的克倫特羅標準溶液，如〇 ng/mL，0. 03 ng/mL，0. 1 ng/mL，0. 3 ng/mL，1 ng/mL，3 ng/mL，10 ng/mL，30ng/mL，或經前處理過的樣品溶液分別加入到包被板各 自的微孔中，每孔50yL。再將克倫特羅-CAT酶標抗原用酶標抗原稀釋液(含0. 1%明膠、 含0. 05%吐溫-20、pH 7. 4的磷酸鹽緩衝溶液，PBST)分別稀釋至5-20 μ g/mL，加入酶標板 中，每孔加入50 μ L，37°C恆溫箱孵育lh，然後用PBST洗滌液洗滌2次，用超純水洗滌一次， 每次3min。
[0037] (4)加過氧化氫 加入過氧化氫，用2mM pH 6. 5 MES緩衝溶液稀釋至400 μ M，每孔加入100 μ L，置於不透 光恆溫箱25°C中反應lh。
[0038] (5)顯色 向上述（4)中的酶標板各孔中分別加入6yL 5mM氯金酸、6yL 2mM檸檬酸鈉、88yL 2mM MES緩衝溶液，在25°C恆溫振蕩器上振蕩混勻，反應15min後，觀察顯色結果並拍照，或 檢測540 nm處光吸收強度（A54Q)。
[0039] 測試結果與實施例1中類似，證明本實施例方法的靈敏度遠遠高於傳統的酶聯免 疫分析方法。
[0040] 實施例3本實施例涉及慶大黴素的檢測方法，包括如下步驟： (1)製備慶大黴素-CAT酶標抗原 採用戊二醛法將慶大黴素與CAT酶偶聯。具體如下： 取慶大黴素3mg用0. 5 mL 0. 01M PBS溶解，取2. 0%的戊二醛0. 1 mL加入到上述溶液 中，活化反應30min。取CAT 38. 7 mg用1. 2mL 0. 01M PBS溶解後，將活化好的溶液逐滴加入 到CAT溶液中，攪拌反應過夜。最後用0. 01MPBS透析2天。透析完成後，4°C、5000rpm離 心lOmin除去沉澱，將上清分裝保存於-20°C備用。
[0041] (2)包被板的製備 採用0. 05M pH 9. 6的碳酸鹽緩衝液作為包被稀釋液稀釋慶大黴素抗體，抗體濃度約為 2-10 μ g/mL，然後向包被板的每個孔中加入100 μ L包被液，37°C烘箱放置2h或4°C過夜， 用PBST洗滌液洗滌3min，每次在吸水紙上拍幹，重複3次。然後加入含0. 2% BSA的磷酸 鹽緩衝液作為封閉液封閉，37°C烘箱溫育2h或4°C過夜，取出用上述洗滌液洗滌3次。
[0042] (3)競爭反應 分別將一系列濃度梯度的慶大黴素標準溶液，如〇 ng/mL，0. 03 ng/mL，0. 1 ng/mL，0. 3 ng/mL，1 ng/mL，3 ng/mL，10 ng/mL，30ng/mL，或經前處理過的樣品溶液分別加入到包被板各 自的微孔中，每孔50 μ L。再將慶大黴素-CAT酶標抗原用酶標抗原稀釋液(含0. 1%明膠、 含0. 05%吐溫-20、pH 7. 4的磷酸鹽緩衝溶液，PBST)分別稀釋至5-20 μ g/mL，加入酶標板 中，每孔加入50 μ L，37°C恆溫箱孵育lh，然後用PBST洗滌液洗滌2次，用超純水洗滌一次， 每次3min。
[0043] (4)加過氧化氫 加入過氧化氫，用2mM pH 6. 5 MES緩衝溶液稀釋至400 μ M，每孔加入100 μ L，置於不透 光恆溫箱25°C中反應lh。
[0044] (5)顯色 向上述（4)中的酶標板各孔中分別加入6yL 5mM氯金酸、6yL 2mM檸檬酸鈉、88yL 2mM MES緩衝溶液，在25°C恆溫振蕩器上振蕩混勻，反應15min後，觀察顯色結果並拍照，或 檢測540 nm處光吸收強度（A54Q)。
[0045] 測試結果與實施例1中類似，證明本實施例方法的靈敏度遠遠高於傳統的酶聯免 疫分析方法。
[0046] 以上實施例僅用於說明本發明的內容，除此之外，本發明還有其他實施方式，但凡 本領域技術人員因發明所涉及之技術啟示，而採用等同替換或等效形式形成的技術方案均 落在本發明的保護範圍內。
【權利要求】
1. 一種基於納米金等離子激元的直接競爭酶免疫分析方法，其特徵在於包括： 將測試樣品與過氧化氫酶標記的半抗原混合，並使所述測試樣品中可能含有的小分子 化合物和過氧化氫酶標記的半抗原與包被在固相載體上的小分子化合物抗體競爭性結合， 移除未與所述小分子化合物抗體結合的小分子化合物及過氧化氫酶標記的半抗原，並 加入過氧化氫、氯金酸及用以形成選定緩衝體系的輔助試劑，再觀察或檢測所形成的混合 反應體系的顏色或光吸收強度，實現對測試樣品中所含小分子化合物的檢測； 其中，在所述選定緩衝體系中，結合於所述小分子化合物抗體上的所述過氧化氫酶標 記的半抗原能夠分解過氧化氫，並且過氧化氫能夠還原所述氯金酸形成納米金粒子。
2. 根據權利要求1所述基於納米金等離子激元的直接競爭酶免疫分析方法，其特徵 在於具體包括如下步驟： (1) 將小分子化合物的抗體溶於包被緩衝液內，並施加到固相載體上，在37°C孵育，再 以封閉液封閉，從而將小分子化合物抗體包被在固相載體上； (2) 將過氧化氫酶標記的半抗原和可能含有小分子化合物的測試樣品於磷酸鹽緩衝液 中混合，施加到經步驟（1)處理後的所述固相載體上，於37°C孵育後洗滌； (3) 在經步驟（2)處理後的所述固相載體上施加過氧化氫； (4) 向經步驟（3)處理後的所述固相載體上施加含有氯金酸的顯色液，在室溫下充分反 應後，再觀察或檢測所形成的混合反應體系的顏色或光吸收強度，實現對測試樣品中所含 小分子化合物的檢測。
3. 根據權利要求1或2所述基於納米金等離子激元的直接競爭酶免疫分析方法，其特 徵在於包括：通過檢測所述混合反應體系對於可見光的光吸收強度，實現對測試樣品中所 含小分子化合物的檢測，所述可見光的波長為540 nm。
4. 根據權利要求1或2所述基於納米金等離子激元的直接競爭酶免疫分析方法，其特 徵在於還包括： a、 取不同濃度的小分子化合物標準樣品分別與固定用量的過氧化氫酶標記的半抗原 混合後，與包被在固相載體上的小分子化合物抗體競爭性結合，移除未與所述小分子化合 物抗體結合的小分子化合物及過氧化氫酶標記的半抗原，並加入過氧化氫、氯金酸及用以 形成選定緩衝體系的輔助試劑，再觀察或檢測每一小分子化合物標準樣品最終所形成的混 合反應體系的顏色或光吸收強度，進而依據所述小分子化合物標準樣品的濃度與最終所獲 的相應混合反應體系的顏色或可見光吸收強度之間的對應關係建立標準比色卡或標準曲 線. b、 將待測試樣品與過氧化氫酶標記的半抗原混合後，與包被在固相載體上的小分子化 合物抗體競爭性結合，移除未與所述小分子化合物抗體結合的過氧化氫酶標記的半抗原及 可能存在的小分子化合物，並加入過氧化氫、氯金酸及用以形成選定緩衝體系的輔助試劑， 再觀察或檢測最終所形成的混合反應體系的顏色或光吸收強度，並與所述標準比色卡或標 準曲線比對，進而定性或定量測得待測試樣品中所含小分子化合物的濃度。
5. 根據權利要求1、2或4所述基於納米金等離子激元的直接競爭酶免疫分析方法，其 特徵在於所述小分子化合物包括甲基睪酮、克倫特羅、慶大黴素。
【文檔編號】G01N21/31GK104049083SQ201410307017
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月30日 優先權日:2014年6月30日
【發明者】彭池方, 段小慧, 泮秋立, 劉春麗 申請人:江南大學